Báo cáo công nghệ sinh học dược

Khoa Dược Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Dược BÁO CÁO CUỐI KÌ Thành phố Hồ Chí Minh, 25 tháng 12, năm 2021 MỤC LỤC TÓM TẮT 3 1. GIỚI THIỆU 3 2. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT 4 2.1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 4 2.1.1. Amylase ngoại bào 4 2.1.2. Protease ngoại bào 5 2.2. Kháng sinh 6 2.3. Phương pháp bảo quản giống 7 3. TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT 8 3.1. Tinh chế enzyme từ khoai lang 8 3.1.1. Thu enzyme thô 8 4. TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E. COLI 16 4.1. Biến nạp plasmid vào E. coli 16 4.1.1. Tách plasmid sử dụng spin column 16 4.1.2. Biến nạp plasmid vào E.coli 17 4.2. Cảm ứng biểu hiện protein 18 4.2.1. Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp 18 4.2.2. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu 19 5. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 21 5.1. Sắc ký ái lực ion kim loại - IMAC 21 5.1.1. Vật liệu chuẩn bị 21 5.1.2. Chuẩn bị cột 22 5.1.3. Phá tế bào 22 5.1.4. Tinh chế protein His-tag 23 5.1.5. Xác định hàm lượng protein 23 6. KẾT LUẬN 25 NGUỒN THAM KHẢO 25 TÓM TẮT Bài báo cáo trình bày cách tinh chế protein tái tổ hợp từ những con vi khuẩn có giống tốt, việc này quyết định chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế của quy trình công nghệ sản xuất. Sinh viên cần đạt được những kỹ năng thành thạo sử dụng các thiết bị, máy móc hay pha loãng dung môi cần sử dụng trong quá trình để tinh chế protein tái tổ hợp. Từ thông tin bài báo cáo ta có thể biết cách chọn lọc giống vi sinh vật mong muốn; tinh chế enzyme bằng cách phân lập từ vi khuẩn và xác định được hoạt tính, tốc độ hoạt động của enzyme; biết cách tạo dòng biểu hiện protein trong E. coli để tinh chế protein tái tổ hợp. 1. GIỚI THIỆU Trong những năm gần đây, quy trình tạo ra protein tái tổ hợp được ứng dụng nhiều và rộng rãi trong y học để tinh chế và sản xuất một loại số thuốc công nghệ sinh học. Từ nhiều chủng vi sinh vật có trong tự nhiên, chọn lọc giống bao gồm quy trình phân lập, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào chất chuyển hoá tạo ra: kháng sinh, sắc tố.., enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường, sự thay đổi đặc tính sinh trưởng, hình thái và bảo quản giống trên đĩa thạch đông lạnh và đông khô. Thực hiện tinh chế enzyme amylase bằng sodium alginate để xác định hoạt tính và tốc độ hoạt động của enzyme trong mẫu. Để đánh giá hiệu quả quá trình tinh chế dựa vào hàm lượng protein (cơ chất của enzyme) bằng cách đo độ hấp thu OD. Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli bằng cách cắt nối DNA tạo phân tử tái tổ hợp, đưa vector vào tế bào chủ và tối ưu hóa biểu hiện của gene tái tổ hợp. Thông qua việc tái tổ hợp di truyền để gắn thêm các nhóm chức năng vào protein đích để cải thiện thuộc tính hay giúp cho việc tinh chế dễ dàng hơn,... Hệ thống biểu hiện được sử dụng là pET28b(+) BL21(DE3). Cuối cùng tinh chế enzyme amylase tái tổ hợp trong E. coli bằng phương pháp sắc ký ái lực với ion kim loại. Dựa vào sự gắn kết thuận nghịch mà chỉ có protein đích mang nhóm chức năng đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh, còn các protein khác thì đi ra khỏi cột. Protein đích sau đó được thôi ra bằng một chất cạnh tranh với nó. Từ các quy trình trên đều nhằm mục đích cuối cùng là tạo ra protein tái tổ hợp tạo sản phẩm sinh học ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị bệnh. 2. CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT Phân lập và phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn. Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các sinh vật khác. 2.1. Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 2.1.1. Amylase ngoại bào Môi trường phân lập: thạch tinh bột dùng cho vi khuẩn. Tiến hành: cho vào mẫu đất 10 mL đệm PBS (ống 1), lắc mạnh để phân tán vi sinh vật vào đệm. Để khoảng 15 phút, cho đất lắng xuống đáy. Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10 (ống 2: 0.1 mL ống 1 + 0.9 mL đệm PBS), pha loãng tương tự và đánh số ống theo thứ tự từ 1 đến 6. Hút 100 µL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và 6. Ủ ở nhiệt độ thích hợp (37oC/24 giờ đối với vi khuẩn). Phát hiện: tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch Lugol (iod), khi đó nền môi trường sẽ có màu tím than do màu của iod với tinh bột. Hình ảnh kết quả (a) (b) Hình 1. Dịch huyền phù chứa vi khuẩn cấy vào thạch tinh bột (c) (a) Dịch huyền phù ống 4 (pha loãng 10-4) (b) Dịch huyền phù ống 5 (pha loãng 10-5) (c) Dịch huyền phù ống 6 (pha loãng 10-6) Nhận xét: Có vi sinh vật phát triển nhưng chủng vi sinh vật không sinh amylase ngoại bào nên tinh bột không bị thủy phân, do đó tạo màu với iod và không có vòng sáng xung quanh vi sinh vật 2.1.2. Protease ngoại bào Môi trường phân lập: thạch gelatin dùng cho vi khuẩn. Tiến hành: cho vào mẫu đất 10 mL đệm PBS (ống 1), lắc mạnh để phân tán vi sinh vật vào đệm. Để khoảng 15 phút, cho đất lắng xuống đáy. Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10 (ống 2: 0.1 mL ống 1 + 0.9 mL đệm PBS), pha loãng tương tự và đánh số ống theo thứ tự từ 1 đến 6. Hút 100 µL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và 6. Ủ ở nhiệt độ thích hợp (37oC/24 giờ đối với vi khuẩn). Phát hiện: tráng lên môi trường một ít TCA 50%, khi đó nền môi trường sẽ đục vì gelatin bị kết tủa. Hình ảnh kết quả: (a) (b) (c) Hình 2. Dịch huyền phù chứa vi khuẩn cấy vào thạch gelatin (b) Dịch huyền phù ống 4 (pha loãng 10-4) (b) Dịch huyền phù ống 5 (pha loãng 10-5) (c) Dịch huyền phù ống 6 (pha loãng 10-6) Nhận xét: Có vi sinh vật phát triển, chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào do gelatin đã bị thủy phân nên không bị tủa, tạo vòng sáng trong nhỏ xung quanh vi sinh vật. Đường kính của vòng phân giải gelatin là 0.8 cm. 2.2. Kháng sinh Mục đích: Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các sinh vật khác. Tiến hành • Chủng kiểm tra: chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh. • Cho 1.5 mL huyền dịch vi khuẩn vào eppendorf. • Ly tâm thu dịch môi trường 10 000 rpm trong 5 phút và lấy lớp dưới chứa vi khuẩn chuyển sang eppendorf mới. • Chủng thử nghiệm gây bệnh: 2 chủng vi khuẩn Pseudo và S. aureus. • Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch. • Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60o. • Để hộp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt để ổn định vi khuẩn trên bề mặt môi trường nuôi cấy. • Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng. • Tiến hành song song với một lỗ chứng nhỏ môi trường (không cấy chủng). • Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch. • Ủ hộp thạch trong tủ ấm 37oC trong 16-18 giờ. Hình ảnh (a) (b) Hình 3. Đĩa thạch chủng thử nghiệm cấy chủng kiểm tra và PBS (a) Chủng thử nghiệm Pseudo; (b) Chủng thử nghiệm S. aureus Nhận xét: Chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh ức chế chủng S. aureus, tạo ra vòng kháng sinh đường kính 1.4 cm. Chủng Bacillus không có khả năng sinh kháng sinh ức chế chủng Pseudo nên không xuất hiện vòng sáng. 2.3. Phương pháp bảo quản giống 1. Bảo quản lạnh (Refrigeration): 4oC 2. Laboratory freezers: -20oC đến -40oC 3. Bảo quản đông (Freezing): -80oC 4. Cryogenic freezers: -130oC 5. Sấy đông khô (Freeze Drying) 3. TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT Enzyme amylase thủy phân liên kết α của các polysaccharide như tinh bột và glycogen, tạo ra những cơ chất đơn giản như glucose và maltose, gồm hai nhóm chính: α-amylase (cắt liên kết tạo đường đơn, đôi, đa,...) và β-amylase (chỉ cắt liên kết tạo đường đôi). Enzyme amylase có thể thu từ động vật, vi sinh vật và thực vật được ứng dụng sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền, chuyển hoá tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc khi đã qua bước tinh chế thô. 3.1. Tinh chế enzyme từ khoai lang 3.1.1. Thu enzyme thô Tiến hành Cân 30g khoai lang, gọt bỏ vỏ và mắt khoai. Cắt nhỏ. Nghiền kỹ bằng cối (mục đích: phá vỡ tế bào thu protein). Thêm vào 30 mL dung dịch đệm phosphat. Trộn đều. Dùng rây lọc hỗn hợp vào becher, để yên cho tinh bột lắng xuống. Gạn lấy lớp dịch lọc phía trên, lọc qua giấy lọc lần 2. Cho 20 mL vào eppendorf . Ly tâm 4500 rpm trong 10 phút. Thu dịch lọc chứa enzyme thô. 3.1.2. Tinh chế enzyme thô Tiến hành Cho 10 mL dịch chiết thu được vào 30 mL dung dịch sodium alginate 2% (trong đệm CH3COONa 0.2 M pH = 4.8), dùng đũa thủy tinh khuấy đều. Ủ trong 1 giờ. Cho từ từ 20 mL dung dịch CaCl2 0.7 M vào dung dịch alginat + enzyme, khuấy đều. Sau 1 thời gian → xuất hiện kết tủa. Ly tâm 4500 rpm trong 10 phút. Thu kết tủa. Ngừng enzyme amylase bằng cách cho dung dịch glucose 2% vào (20 mL) để ở 4°C trong 12 giờ. Nộp sản phẩm cho giảng viên. Lấy erlen đã tinh chế enzyme (của nhóm trước), lọc bỏ tủa. Thu được 4 mL enzyme amylase tinh chế. 3.1.3. Xác định hàm lượng protein bằng OD280 Tiến hành Lấy 2 eppendorf chứa 1.5 mL enzyme thô và 1.5 mL enzyme tinh chế, ly tâm 10000 rpm/phút trong 1 phút. Pha loãng enzyme thô 100 lần: hút 0.01 mL enzyme thô + 0. 99 mL dung dịch đệm phosphate. Enzyme tinh không pha loãng. Đo độ hấp thu ở bước sóng 280 nm (A < 2.5), nếu A > 2.5, pha loãng thêm 10 lần. Tính tổng lượng protein trong mẫu và định lượng hoạt tính amylase. Kết quả: Bảng 1. Hàm lượng protein của enzym thô và tinh chế Thể tích (mL) Độ pha loãng (lần) OD280 Lượng protein trong mẫu (mg) Enzyme thô 10 100 0.066 66 Enzyme tinh chế 4 1 0.289 1.156 Nhận xét: sau quá trình tinh chế đã loại đi một lượng protein không chứa enzyme amylase, nhờ đó mà thu được enzyme amylase tinh khiết. 3.1.4. Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel Nguyên tắc Xác định hoạt độ của amylase bằng phương pháp Heinkel thông qua lượng tinh bột bị phân giải dựa trên cơ sở xác định mức độ giảm cường độ màu của hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode. Đơn vị hoạt độ là lượng tinh bột mà enzyme có khả năng phân giải trong một đơn vị thời gian. Tiến hành • Pha loãng ezyme thô 100 lần với đệm phosphate. • Pha loãng ezyme tinh chế 10 lần với đệm phosphate. • Xác định hoạt tính enzyme thô và enzyme tinh chế, thực hiện trên 2 eppendorf, ống thử và ống chứng. Bảng 2. Cách thực hiện mẫu để xác định hoạt tính enzyme amylase Tính hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu chứng và mẫu thử. ΔOD = ODc - ODt Từ ΔOD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột bị thủy phân tương ứng, từ đó tính hoạt tính của enzyme (HTE). • Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase. Bảng 3. Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase Ống thử nghiệm 0 1 2 3 4 5 Tinh bột 1% (mL) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Nước cất 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Hút 0.1 mL từ các ống sang eppendorf mới Dung dịch đệm (mL) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 A. Sulfosalicylic 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 Hút 0.1 mL từ các ống sang eppendorf mới TT Iode 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 0.9 Đo OD 560 nm Kết quả: Hình 4. Mẫu sau khi pha chứa trong eppendorf để thực hiện đường chuẩn tính hoạt độ enzyme Bảng 4. Thông số thể hiện mật độ quang OD560nm để xác định đường chuẩn Ống 0 1 2 3 4 5 Tinh bột (mg) 0 2 4 6 8 10 OD560 0 0.245 0.489 0.750 1.115 1.243 Hoạt tính (U/mL) = Acontrol−Asample A/mg starch x 15 phút x 0.1mL - Acontrol : Độ hấp thụ thu được từ tinh bột mà không cần bổ sung enzyme (Ống chứng) - Asample : Độ hấp thụ đối với tinh bột được phân hủy bằng enzyme (Ống thử) - A/mg starch : Độ hấp thụ đối với 1 mg tinh bột tính theo đường chuẩn - 15 phút: Thời gian ủ của thí nghiệm - 0.1 mL: Thể tích của enzyme được sử dụng trong thí nghiệm Hoạt tính chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE x N x Venzyme thô Hoạt tính chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE x N x Vtinh chế (N: hệ số pha loãng của enzyme). Hoạt tính riêng của enzyme: HTR = HTC/lượng protein (U/A280 nm) Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô Tính toán: Lượng tinh bột phân giải (mg) tính theo đường chuẩn: y = 0.1298x - 0.0087 Thay x = 1 vào phương trình đường chuẩn y = 0.1298x - 0.0087  y = 0.1211  Vậy độ hấp thụ 1 mg tinh bột tính theo đường chuẩn A/mg starch = 0.1211 Hoạt tính enzyme Thô (U/mL) = Acontrol−Asample A/mg starch x 15 phút x 0.1mL = 0.698 0.1211 x 15 x 0.1 =3.843 (U/mL) Hoạt tính enzyme Tinh (U/mL) = Acontrol−Asample A/mg starch x 15 phút x 0.1mL = 0.5 0.1211 x 15 x 0.1 =2.753 (U/mL) Bảng 5. Bảng số liệu thể hiện hoạt tính enzyme amylase Hệ số pha loãng (lần) ODc ODt ΔOD (ODc - ODt) Hoạt tính amylase (U/ml) Enzyme thô 100 1.439 0.741 0.698 3.843 Enzyme tinh chế 10 1.295 0.795 0.5 2.753 HT chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE x N x Venzyme thô = 3.843 x 100 x 10 = 3843 (U) HT chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE x N x Vtinh chế = 2.753 x 10 x 4 = 110.12 (U) HT riêng của enzyme thô: HTR thô= HTC/lượng protein (A280 nm) = 3843/66 = 58.23 (U/mg) HT riêng của enzyme tinh: HTR tinh = HTC/lượng protein (A280 nm) = 110.12/1.156 = 95.26 (U/mg) Hiệu suất cố định tổng protein: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô = (110.12/3843) x 100 = 2.87% Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô = 95.26/58.18 = 1.64 (lần) Bảng 6. Hoạt tính enzym thô và tinh chế Hệ số pha loãng (n) Thể tích dịch enzyme V (mL) Tổng protein A280 Hoạt tính chung (U) Hoạt tính riêng (U/mg) Hiệu suất tổng protein (%) Mức tinh chế (lần) Enzyme thô 100 10 66 3840 58.23 Enzyme tinh 10 4 1.156 110.12 95.26 2.87% 1.64 Nhận xét: Sau khi tinh chế, lượng enzyme tinh thu được thấp hơn so với lượng enzyme thô cho thấy quá trình đã loại bỏ được một lượng lớn protein tạp. Do đó, hoạt tính đặc hiệu và độ tinh khiết của dịch enzyme sau tinh chế tăng lên so với dịch enzyme thô ban đầu. Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất 2.87%. Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng, mức tinh chế đạt 1.64 lần. Như vậy, quá trình tinh chế đã đạt hiệu quả. 4. TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E. COLI Tạo dòng biểu hiện là sự tái tổ hợp gen mong muốn (gen phân lập từ người) để tạo ra dòng tế bào mới mang gen đích và có khả năng biểu hiện được gen đích này. Chuyển biểu hiện gen mong muốn sang một loài thuận lợi hơn về nhiều mặt trong nuôi cấy. Năng suất biểu hiện gen có thể được cải thiện bằng các yếu tố điều hòa quá trình biểu hiện như promoter. 4.1. Biến nạp plasmid vào E. coli 4.1.1. Tách plasmid sử dụng spin column Vật liệu • Sử dụng E.coli trong phương pháp tạo dòng vì E.coli đã được nghiên cứu kỹ, ít gây độc hại cho con người. Gồm có hai chủng E.coli tạo dòng và E.coli biểu hiện. Sử dụng chủng tạo dòng E. coli đã được chèn vector có mang gen mục tiêu. • Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer) dùng để phá vỡ màng tế bào vả rửa giải các chất không cần thiết. • Máy ly tâm. Thực hiện • Cho 500 μL dịch nuôi cấy vào eppendorf sau đó ly tâm thu tế bào . • Thêm 100 μL solution I, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. • Thêm 200 μL solution II, trộn bằng cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. • Thêm 300 μL solution III, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút. Ly tâm mẫu ở 12000 rpm/min, trong vòng 5 phút và thu phần dịch nổi. • Cho dịch nổi vào spin column (giữ DNA trên màng), ly tâm trong 1 phút, bỏ dịch chảy qua. • Cho 500 μL washing buffer (rửa các chất không cần thiết ra ngoài), ly tâm trong vòng 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua. Thực hiện thao tác này trong hai lần. • Ly tâm trong vòng 1 phút để làm khô màng. • Đặt cột vào eppendorf mới. Cho 20 μL TE buffer (dung dịch đệm để hòa tan DNA hoặc RNA đồng thời bảo vệ plasmid không bị thoái hóa) vào giữa cột, ủ 2 phút. Ly tâm trong 2 phút để thu plasmid (thu 10 μL phần dịch phía dưới sau khi ly tâm). • Giữ plasmid trong nước đá. Hình ảnh Hình 5. Tách plasmid sử dụng spin column 4.1.2. Biến nạp plasmid vào E.coli. Vật liệu • Plasmid biểu hiện có gen mục tiêu. • Tế bào khả nạp E. coli BL21(DE3). • Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng. Thực hiện • Mọi thao tác đều phải tiến hành trong đá lạnh (vì protein dễ bị biến tính). • Lấy 50 μL tế bào biến nạp cho thẳng vào plasmid. Dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy ống để trộn, không hút lên xuống vì sẽ giết chết tế bào và làm giảm hiệu quả biến nạp. • Ủ các tế bào khả nạp trong đá 10 phút. • Sốc nhiệt bằng cách đưa mẫu vào máy ủ ở nhiệt độ chính xác 420C trong 30 giây và sau đó làm lạnh trong đá 10 phút. • Cho thêm 1 mL LB vào mỗi eppendorf, ủ tế bào ở 370C (để tế bào phát triển) trong 1 giờ để làm ổn định tế bào và gen đề kháng kháng sinh trên plasmid có thời gian biểu hiện. • Ly tâm 13000 rpm/phút trong 15 giây, thu tế bào. • Đổ bỏ 200-300 μL phần môi trường bên trên, chỉ chừa lại khoảng 200 μL ở đáy eppendorf. • Hút 100 μL ở đáy eppendorf cho vào mỗi đĩa thạch (2 đĩa) đã chuẩn bị. Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn trên mặt thạch. Que gạt được tiệt trùng bằng cách nhúng trong cồn tuyệt đối và chỉ đốt que trước khi sử dụng. • Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 370C, phải lật ngược hộp thạch để tránh sự ngưng đọng hơi nước trên mặt thạch. Nhận xét: Sau khi ủ, các đĩa thạch không có sự xuất hiện của khuẩn lạc vì lượng vi khuẩn ban đầu quá ít hoặc thời gian ủ chưa đủ lâu. 4.2. Cảm ứng biểu hiện protein 4.2.1. Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp • Sau khi ủ đủ thời gian, các tế bào nào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Kan sẽ mọc thành khuẩn lạc. • Dùng micropipet có gắn đầu tip lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào môi trường chứa 3 mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kan, cho luôn phần đầu tip vào thẳng ống nghiệm để lấy lượng vi khuẩn nhiều nhất. Đem vào tủ ủ 370C trong 18 giờ. Nhận xét: Sau 18 giờ, quan sát thấy mẫu không đục chứng tỏ lượng vi khuẩn phát triển không nhiều. Nguyên nhân có thể do chưa đủ thời gian ủ hoặc nồng độ khuẩn lạc quá ít nên tiếp tục đi ủ mẫu cho đến khi môi trường nuôi cấy đục. Hình ảnh Hình 6. Kết quả sau khi ủ vi khuẩn trong môi trường LB lỏng. 4.2.2. Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu Vật liệu • LB Kan 30 μg/mL. • IPTG 100 mM. • Chủng E. coli BL21(DE3) có gen mục tiêu. Tiến hành • Cho vào bình erlen 20mL LB và 2mL chủng E. coli, đậy giấy bạc. • Đem ủ khoảng 6 tiếng ở 37oC trên máy lắc. • Không thêm IPTG (chất cảm ứng biểu hiện promoter để quá trình phiên mã diễn ra tốt) • Lấy 15mL dung dịch đi ly tâm 4500 rpm trong 15 phút. Dự đoán: lượng protein mục tiêu sẽ ít hơn những nhóm có thêm IPTG vào mẫu trong những khoảng thời gian khác nhau. Hình ảnh kết quả: Hình 7. Dung dịch sau khi ly tâm. 5. TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP Do cấu trúc protein đích có thể mã hoá cho 6 đoạn histidine mà histidine có khả năng gắn kết với kim loại Ni nên ta dùng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại để tách nhóm protein. Protein đích sau đó sẽ được thôi bằng đệm thôi có thành phần imidazole - là 1 chất cạnh tranh với nó. 5.1. Sắc ký ái lực ion kim loại - IMAC Đây là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất tinh chế protein. Sắc ký dựa trên nguyên tắc gắn kết thuận nghịch của một nhóm chức năng trên protein với một nhóm chức năng của pha tĩnh sắc ký. 5.1.1. Vật liệu chuẩn bị • Đệm ion 8X (charge buffer) • Đệm chạy 8X (binding buffer) • Đệm rửa 8X (washing buffer) • Đệm thôi 4X (Elution buffer) Trước khi chạy sắc ký, ta cần pha loãng nồng độ các đệm thành 1X với tỉ lệ phù hợp. Sau khi tính toán quá trình, các đệm cần 8ml. • Đệm ion 1X: cần pha 1 mL đệm ion 8X và 7 mL nước cất 2 lần. • Đệm chạy 1X: cần pha 1 mL đệm chạy 8X và 7 mL nước cất 2 lần. • Đệm rửa 1X: cần pha 1mL đệm rửa 8X và 7 mL nước cất 2 lần. • Đệm thôi 1X: cần pha 2 mL đệm thôi và 6 mL nước cất 2 lần. 5.1.2. Chuẩn bị cột Rửa cột rỗng với nước cất vô trùng cho sạch, gắn lên giá sao cho thẳng đứng. Phân tán nhựa sắc ký cho thật đều bằng cách úp ngửa. Cho 2 mL Ni-Sepharose vào cột sao cho đừng dính vào thành cột. Để yên khoảng 1 giờ cho sepharose lắng xuống. Mở cột cho chạy hết dung dịch bảo quản cột, tránh để cột bị khô. Rửa cột lần lượt với các đệm sau: (1 thể tích cột là 0.5 mL). • 2 thể tích (1 mL) nước cất vô trùng • 3 thể tích (1.5 mL) đệm ion 1X • 3 thể tích (1.5 mL) đệm ion 1X • 3 thể tích (1.5 mL) đệm chạy 1X Khoá cột. 5.1.3. Phá tế bào Môi trường nuôi cấy E.coli không thêm chất cảm ứng IPTG. (IPTG: chất cảm ứng promoter giúp cho quá trình phiên mã diễn ra mạnh mẽ hơn). Ly tâm 15 mL môi trường nuôi cấy E. coli, bỏ phần dung dịch lớp trên, lấy cặn lớp dưới. Lúc này cặn ở dưới là các tế bào. Phân tán tế bào trong 2 mL đệm chạy (Binding buffer) 1X, để trên đá giúp protein ổn định nhiệt độ và không bị biến tính (do protein dễ bị biến tính). Tán siêu âm mẫu, đồng thời đặt mẫu trên đá. Quá trình lặp lại 10 lần, mỗi lần thực hiện 10 giây đến khi thu được dịch đồng nhất và không bị nhớt. Lúc này ta phá vỡ được các tế bào. Chuyển 1.25 mL dịch sau tán siêu âm vào 2 eppendorf. Trong đó, 1 ống nạp cột và 1 ống đo quang làm mẫu. Ly tâm 2 ống với 14000 rpm/5 phút, thu phần dịch nổi là các protein. Được dịch A. 5.1.4. Tinh chế protein His-tag Nạp vào cột 1 mL dịch A. Mở cho cột chạy, thu dịch chảy ra (B). Rửa cột với 5 thể tích (2.5 mL) đệm chạy 1X (Binding buffer), thu dịch chảy ra (B1). Rửa cột với mỗi thể tích (0.5 mL) đệm rửa 1X (Washing buffer). Thực hiện quá trình 5 lần, hứng dịch chảy ra, thu được C1-C5 vào 5 eppendorf. Kiểm tra sự hiện diện của protein trong từng dịch Ci sau mỗi thể tích rửa và tiếp tục rủa đến khi sạch protein. Thôi protein bằng cách thêm từng thể tích đệm thôi 1X (Elution buffer). Thực hiện quá trình 6 lần, thu dịch chảy ra D1-D6 vào 6 eppendorf. Kiểm tra các phân đoạn thôi để đảm bảo protein được thôi hết. Tái cân bằng cột bằng 5 thể tích (2.5 mL) đệm chạy 1X (Binding buffer). 5.1.5. Xác định hàm lượng protein Xác định hàm lượng protein trong dịch A, B, B1, C1, C2, C3, C4, C5, D1, D2, D3, D4, D5, D6 bằng phương pháp đo quang OD ở bước sóng 280nm. (Bảng 7). Bảng 7. Bảng đo sự hấp thu của protein ở bước sóng 280nm sau những lần thu dịch. Mẫu A(OD280nm) Ống A 0.323 Ống B 0.109 Ống B1 0.115 Ống C1 0.238 Ống C2 0.084 Ống C3 0.065 Ống C4 0.203 Ống C5 0.234 Ống D1 0.195 Ống D2 0.051 Ống D3 0.289 Ống D4 0.153 Ống D5 0.066 Ống D6 0.054 Nhận xét: Do môi trường không có chất cảm ứng IPTG nên lượng protein có thể sinh ra không nhiều, đa số là các tạp chất còn xót. Tại ống D3, sau khi thôi cột, số liệu cho thấy có thể xuất hiện một lượng protein có cấu trúc histidine. Tuy nhiên số liệu bị biến động do những nguyên nhân như: • Cột sắc kí còn lẫn tạp chất do thao tác rửa cột chưa sạch. • Dung dịch rửa cột trước khi nạp cột vẫn chưa đủ để làm sạch cột. • Dụng cụ đựng khi đo quang của các nhóm trước chưa được rửa sạch. Kết luận: Lượng protein không nhiều do thiếu chất cảm ứng IPTG. 6. KẾT LUẬN Bài báo cáo trên tổng quát cho một quy trình tạo các sản phẩm protein tái tổ hợp dựa vào kỹ thuật tái tổ hợp DNA. Trong đó bao gồm các quy trình cơ bản như là chọn lọc giống vi sinh vật, phân lập gene mục tiêu, tạo dòng biểu hiện chủng vi sinh vật biểu hiện protein tái tổ hợp, thu và tinh chế sản phẩm. Những kỹ thuật này cần được thực hiện trong môi trường vô trùng, người thực tập phải có những kỹ năng cẩn thận và chính xác trong thao tác làm, có kỹ năng tính toán và hạn chế việc sai số để tránh ảnh hưởng đến kết quả của quy trình. Trên thực tế đây là một quy trình ứng dụng nhiều trong khối nghành sức khỏe. Tạo ra các sản phẩm thuốc sinh học có ứng dụng cao trong phòng ngừa, điều trị của con người. Ví dụ như insulin trong điều trị đái tháo đường, vacxin viêm gan B giúp ngăn ngừa bệnh viêm gan B và các hậu quả như xơ gan, ung thư gan, sản xuất interleukin 2 ứng dụng trong điều trị ung thư. Đây là một kỹ thuật có tính ứng dụng cao trong cuộc sống đặc biệt là việc sản xuất thuốc trong y dược, một kỹ thuật rất phổ biến hiện tại và cần được phát triển hơn trong tương lai. NGUỒN THAM KHẢO

Khoa Dược Thí nghiệm Công nghệ Sinh học Dược

BÁO CÁO CUỐI KÌ

Thành phố Hồ Chí Minh, 25 tháng 12, năm 2021

MỤC LỤC

TÓM TẮT 3

1 GIỚI THIỆU 3

2 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT 4

2.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme 4

2.1.1 Amylase ngoại bào 4

2.1.2 Protease ngoại bào 5

2.2 Kháng sinh 6

2.3 Phương pháp bảo quản giống 7

3 TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT 8

3.1 Tinh chế enzyme từ khoai lang 8

3.1.1 Thu enzyme thô 8

4 TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E COLI 16

4.1 Biến nạp plasmid vào E coli 16

4.1.1 Tách plasmid sử dụng spin column 16

4.1.2 Biến nạp plasmid vào E.coli 17

4.2 Cảm ứng biểu hiện protein 18

4.2.1 Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp 18

4.2.2 Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu 19

5 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 21

5.1 Sắc ký ái lực ion kim loại - IMAC 21

5.1.1 Vật liệu chuẩn bị 21

5.1.2 Chuẩn bị cột 22

2 5.1.5 Xác định hàm lượng protein 23

6 KẾT LUẬN 25 NGUỒN THAM KHẢO 25

TÓM TẮT

Bài báo cáo trình bày cách tinh chế protein tái tổ hợp từ những con vi khuẩn có giống tốt, việc này quyết định chất lượng sản phẩm và giá trị kinh tế của quy trình công nghệ sản xuất Sinh viên cần đạt được những kỹ năng thành thạo sử dụng các thiết bị, máy móc hay pha loãng dung môi cần sử dụng trong quá trình để tinh chế protein tái tổ hợp Từ thông tin bài báo cáo ta có thể biết cách chọn lọc giống vi sinh vật mong muốn; tinh chế enzyme bằng cách phân lập từ vi khuẩn và xác định được hoạt tính, tốc độ hoạt động của enzyme; biết cách tạo dòng biểu hiện protein

trong E coli để tinh chế protein tái tổ hợp

1 GIỚI THIỆU

Trong những năm gần đây, quy trình tạo ra protein tái tổ hợp được ứng dụng nhiều và rộng rãi trong y học để tinh chế và sản xuất một loại số thuốc công nghệ sinh học Từ nhiều chủng vi sinh vật có trong tự nhiên, chọn lọc giống bao gồm quy trình phân lập, gây đột biến, phát hiện dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào chất chuyển hoá tạo ra: kháng sinh, sắc tố , enzyme ngoại bào tác động lên cơ chất trong môi trường, sự thay đổi đặc tính sinh trưởng, hình thái và bảo quản giống trên đĩa thạch đông lạnh và đông khô Thực hiện tinh chế enzyme amylase bằng sodium alginate để xác định hoạt tính và tốc độ hoạt động của enzyme trong mẫu Để đánh giá hiệu quả quá trình tinh chế dựa vào hàm lượng protein (cơ chất của enzyme) bằng cách đo độ

hấp thu OD Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp trong E.coli bằng cách cắt nối DNA tạo phân

tử tái tổ hợp, đưa vector vào tế bào chủ và tối ưu hóa biểu hiện của gene tái tổ hợp Thông qua việc tái tổ hợp di truyền để gắn thêm các nhóm chức năng vào protein đích để cải thiện thuộc tính hay giúp cho việc tinh chế dễ dàng hơn, Hệ thống biểu hiện được sử dụng là pET28b(+) BL21(DE3)

Cuối cùng tinh chế enzyme amylase tái tổ hợp trong E coli bằng phương pháp sắc ký ái lực với

ion kim loại Dựa vào sự gắn kết thuận nghịch mà chỉ có protein đích mang nhóm chức năng đặc hiệu mới gắn vào pha tĩnh, còn các protein khác thì đi ra khỏi cột Protein đích sau đó được thôi ra bằng một chất cạnh tranh với nó Từ các quy trình trên đều nhằm mục đích cuối cùng là tạo ra protein tái tổ hợp tạo sản phẩm sinh học ứng dụng trong phòng ngừa và điều trị bệnh

2 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT

Phân lập và phát hiện vi sinh vật có đặc tính mong muốn Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng của nó đối với các sinh vật khác

2.1 Phân lập và phát hiện vi sinh vật có khả năng sinh enzyme

2.1.1 Amylase ngoại bào

Môi trường phân lập: thạch tinh bột dùng cho vi khuẩn Tiến hành: cho vào mẫu đất 10 mL đệm PBS (ống 1), lắc mạnh để phân tán vi sinh vật

vào đệm Để khoảng 15 phút, cho đất lắng xuống đáy Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10 (ống 2: 0.1 mL ống 1 + 0.9 mL đệm PBS), pha loãng tương tự và đánh số ống theo thứ tự từ 1 đến 6 Hút 100 µL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và 6 Ủ ở nhiệt độ thích hợp (37oC/24 giờ đối với vi khuẩn)

Phát hiện: tráng bề mặt môi trường với một ít dung dịch Lugol (iod), khi đó nền môi

trường sẽ có màu tím than do màu của iod với tinh bột

Hình ảnh kết quả

Hình 1 Dịch huyền phù chứa vi khuẩn cấy vào thạch tinh bột

(c)

(a) Dịch huyền phù ống 4 (pha loãng 10-4) (b) Dịch huyền phù ống 5 (pha loãng 10-5)

(c) Dịch huyền phù ống 6 (pha loãng 10-6)

Nhận xét: Có vi sinh vật phát triển nhưng chủng vi sinh vật không sinh amylase ngoại bào

nên tinh bột không bị thủy phân, do đó tạo màu với iod và không có vòng sáng xung quanh vi sinh vật

2.1.2 Protease ngoại bào

Môi trường phân lập: thạch gelatin dùng cho vi khuẩn Tiến hành: cho vào mẫu đất 10 mL đệm PBS (ống 1), lắc mạnh để phân tán vi sinh vật

vào đệm Để khoảng 15 phút, cho đất lắng xuống đáy Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10 (ống 2: 0.1 mL ống 1 + 0.9 mL đệm PBS), pha loãng tương tự và đánh số ống theo thứ tự từ 1 đến 6 Hút 100 µL huyền phù vi sinh vật đã pha loãng, trải lên môi trường phát hiện ống 4, 5 và 6 Ủ ở nhiệt độ thích hợp (37oC/24 giờ đối với vi khuẩn)

Phát hiện: tráng lên môi trường một ít TCA 50%, khi đó nền môi trường sẽ đục vì gelatin

(c) Dịch huyền phù ống 6 (pha loãng 10-6)

Nhận xét: Có vi sinh vật phát triển, chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào do gelatin

đã bị thủy phân nên không bị tủa, tạo vòng sáng trong nhỏ xung quanh vi sinh vật Đường kính của vòng phân giải gelatin là 0.8 cm

2.2 Kháng sinh

Mục đích: Phát hiện vi sinh vật sinh kháng sinh dựa vào khả năng ức chế sự tăng trưởng

của nó đối với các sinh vật khác

Tiến hành

 Chủng kiểm tra: chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh

 Cho 1.5 mL huyền dịch vi khuẩn vào eppendorf

 Ly tâm thu dịch môi trường 10 000 rpm trong 5 phút và lấy lớp dưới chứa vi khuẩn chuyển sang eppendorf mới

 Chủng thử nghiệm gây bệnh: 2 chủng vi khuẩn Pseudo và S aureus

 Dùng que bông vô trùng nhúng vào huyền trọc vi khuẩn đã chuẩn bị, ép que trên thành ống cho ráo nước, sau đó trải đều trên mặt thạch

 Lặp lại 3 lần, mỗi lần xoay hộp 60o

 Để hộp trong tủ ấm 3-5 phút cho ráo mặt để ổn định vi khuẩn trên bề mặt môi trường nuôi cấy

 Đục lỗ đường kính 6 mm trong bản thạch bằng dụng cụ tiệt trùng

 Tiến hành song song với một lỗ chứng nhỏ môi trường (không cấy chủng)

 Để yên khoảng 15 phút cho các chất thử nghiệm khuếch tán vào lớp thạch

 Ủ hộp thạch trong tủ ấm 37o

C trong 16-18 giờ

Hình ảnh

Hình 3 Đĩa thạch chủng thử nghiệm cấy chủng kiểm tra và PBS

(a) Chủng thử nghiệm Pseudo; (b) Chủng thử nghiệm S aureus Nhận xét: Chủng Bacillus có khả năng sinh kháng sinh ức chế chủng S aureus, tạo ra

vòng kháng sinh đường kính 1.4 cm Chủng Bacillus không có khả năng sinh kháng sinh ức chế chủng Pseudo nên không xuất hiện vòng sáng

2.3 Phương pháp bảo quản giống

1 Bảo quản lạnh (Refrigeration): 4oC 2 Laboratory freezers: -20oC đến -40o

C 3 Bảo quản đông (Freezing): -80oC 4 Cryogenic freezers: -130oC 5 Sấy đông khô (Freeze Drying)

3 TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT

Enzyme amylase thủy phân liên kết α của các polysaccharide như tinh bột và glycogen, tạo ra những cơ chất đơn giản như glucose và maltose, gồm hai nhóm chính: α-amylase (cắt liên kết tạo đường đơn, đôi, đa, ) và β-amylase (chỉ cắt liên kết tạo đường đôi) Enzyme amylase có thể thu từ động vật, vi sinh vật và thực vật được ứng dụng sản xuất glucose làm dịch tiêm truyền, chuyển hoá tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược trong bào chế để sản xuất một số thuốc khi đã qua bước tinh chế thô

3.1 Tinh chế enzyme từ khoai lang

3.1.1 Thu enzyme thô

3.1.3 Xác định hàm lượng protein bằng OD280

Độ pha loãng

Lượng protein trong mẫu (mg)

Nhận xét: sau quá trình tinh chế đã loại đi một lượng protein không chứa enzyme amylase,

nhờ đó mà thu được enzyme amylase tinh khiết

3.1.4 Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp Heinkel

Tiến hành

 Pha loãng ezyme thô 100 lần với đệm phosphate

 Pha loãng ezyme tinh chế 10 lần với đệm phosphate

 Xác định hoạt tính enzyme thô và enzyme tinh chế, thực hiện trên 2 eppendorf, ống thử và ống chứng

Bảng 2 Cách thực hiện mẫu để xác định hoạt tính enzyme amylase

Tính hiệu số đọc được trên máy giữa mẫu chứng và mẫu thử ΔOD = ODc - ODt

Từ ΔOD đưa vào đồ thị chuẩn tính được số mg tinh bột bị thủy phân tương ứng, từ đó tính hoạt tính của enzyme (HTE)

 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase

Bảng 3 Cách thực hiện giai mẫu để xác định đường chuẩn tính hoạt độ amylase

Kết quả:

Hình 4 Mẫu sau khi pha chứa trong eppendorf để thực hiện đường chuẩn tính hoạt độ enzyme

Bảng 4 Thông số thể hiện mật độ quang OD560nm để xác định đường chuẩn

Hoạt tính (U/mL) = Acontrol−Asample

y = 0.1298x - 0.0087 R² = 0.9913 1

0.8 0.6 0.4 0.2 0

Hoạt tính amylase (U/ml)

HT chung của enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE x N x Venzyme thô = 3.843 x 100 x 10 = 3843 (U) HT chung của enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE x N x Vtinh chế = 2.753 x 10 x 4 = 110.12 (U) HT riêng của enzyme thô: HTR thô= HTC/lượng protein (A280 nm) = 3843/66 = 58.23 (U/mg) HT riêng của enzyme tinh: HTR tinh = HTC/lượng protein (A280 nm) = 110.12/1.156 = 95.26 (U/mg) Hiệu suất cố định tổng protein: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô = (110.12/3843) x 100 = 2.87% Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô = 95.26/58.18 = 1.64 (lần)

Bảng 6 Hoạt tính enzym thô và tinh chế

Hệ số pha loãng

(n)

Thể tích dịch enzyme V (mL)

Tổng protein

A280

Hoạt tính chung

(U)

Hoạt tính riêng (U/mg)

Hiệu suất tổng protein

(%)

Mức tinh chế (lần)

Quá trình tinh chế amylase bằng alginate đạt hiệu suất 2.87% Sau tinh chế lượng enzym giảm nhiều nhưng hoạt tính chuyên biệt tăng, mức tinh chế đạt 1.64 lần Như vậy, quá trình tinh chế đã đạt hiệu quả

4 TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E COLI

Tạo dòng biểu hiện là sự tái tổ hợp gen mong muốn (gen phân lập từ người) để tạo ra dòng tế bào mới mang gen đích và có khả năng biểu hiện được gen đích này Chuyển biểu hiện gen mong muốn sang một loài thuận lợi hơn về nhiều mặt trong nuôi cấy Năng suất biểu hiện gen có thể được cải thiện bằng các yếu tố điều hòa quá trình biểu hiện như promoter

4.1 Biến nạp plasmid vào E coli 4.1.1 Tách plasmid sử dụng spin column

Vật liệu

 Sử dụng E.coli trong phương pháp tạo dòng vì E.coli đã được nghiên cứu kỹ, ít gây độc hại cho con người Gồm có hai chủng E.coli tạo dòng và E.coli biểu hiện Sử dụng chủng tạo dòng E coli đã được chèn vector có mang gen mục tiêu

 Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer) dùng để phá vỡ màng tế bào vả rửa giải các chất không cần thiết

 Máy ly tâm

Thực hiện

 Cho 500 μL dịch nuôi cấy vào eppendorf sau đó ly tâm thu tế bào

 Thêm 100 μL solution I, trộn đều và ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

 Thêm 200 μL solution II, trộn bằng cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút

 Thêm 300 μL solution III, trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 1 phút Ly tâm mẫu ở 12000 rpm/min, trong vòng 5 phút và thu phần dịch nổi

 Cho dịch nổi vào spin column (giữ DNA trên màng), ly tâm trong 1 phút, bỏ dịch chảy qua

 Cho 500 μL washing buffer (rửa các chất không cần thiết ra ngoài), ly tâm trong vòng 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua Thực hiện thao tác này trong hai lần

 Ly tâm trong vòng 1 phút để làm khô màng

 Đặt cột vào eppendorf mới Cho 20 μL TE buffer (dung dịch đệm để hòa tan DNA hoặc RNA đồng thời bảo vệ plasmid không bị thoái hóa) vào giữa cột, ủ 2 phút Ly tâm trong 2 phút để thu plasmid (thu 10 μL phần dịch phía dưới sau khi ly tâm)

 Giữ plasmid trong nước đá

Hình ảnh

Hình 5 Tách plasmid sử dụng spin column

4.1.2 Biến nạp plasmid vào E.coli

Vật liệu

 Plasmid biểu hiện có gen mục tiêu

 Tế bào khả nạp E coli BL21(DE3)

 Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng

Thực hiện

 Mọi thao tác đều phải tiến hành trong đá lạnh (vì protein dễ bị biến tính)

 Lấy 50 μL tế bào biến nạp cho thẳng vào plasmid Dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy ống để trộn, không hút lên xuống vì sẽ giết chết tế bào và làm giảm hiệu quả biến nạp

 Ủ các tế bào khả nạp trong đá 10 phút

 Sốc nhiệt bằng cách đưa mẫu vào máy ủ ở nhiệt độ chính xác 420

C trong 30 giây và sau

 Cho thêm 1 mL LB vào mỗi eppendorf, ủ tế bào ở 370

C (để tế bào phát triển) trong 1 giờ để làm ổn định tế bào và gen đề kháng kháng sinh trên plasmid có thời gian biểu hiện

 Ly tâm 13000 rpm/phút trong 15 giây, thu tế bào

 Đổ bỏ 200-300 μL phần môi trường bên trên, chỉ chừa lại khoảng 200 μL ở đáy eppendorf

 Hút 100 μL ở đáy eppendorf cho vào mỗi đĩa thạch (2 đĩa) đã chuẩn bị Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn trên mặt thạch Que gạt được tiệt trùng bằng cách nhúng trong cồn tuyệt đối và chỉ đốt que trước khi sử dụng

 Ủ các hộp thạch đã cấy qua đêm ở 370

C, phải lật ngược hộp thạch để tránh sự ngưng đọng hơi nước trên mặt thạch

Nhận xét: Sau khi ủ, các đĩa thạch không có sự xuất hiện của khuẩn lạc vì lượng vi khuẩn

ban đầu quá ít hoặc thời gian ủ chưa đủ lâu

4.2 Cảm ứng biểu hiện protein

4.2.1 Lưu dòng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp

 Sau khi ủ đủ thời gian, các tế bào nào nhận được plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Kan sẽ mọc thành khuẩn lạc

 Dùng micropipet có gắn đầu tip lấy khuẩn lạc trong đĩa thạch đã nuôi cấy cho vào môi trường chứa 3 mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Kan, cho luôn phần đầu tip vào thẳng ống nghiệm để lấy lượng vi khuẩn nhiều nhất Đem vào tủ ủ 370

C trong 18 giờ

Nhận xét: Sau 18 giờ, quan sát thấy mẫu không đục chứng tỏ lượng vi khuẩn phát triển

không nhiều Nguyên nhân có thể do chưa đủ thời gian ủ hoặc nồng độ khuẩn lạc quá ít nên tiếp tục đi ủ mẫu cho đến khi môi trường nuôi cấy đục

Hình ảnh

Hình 6 Kết quả sau khi ủ vi khuẩn trong môi trường LB lỏng

4.2.2 Nuôi cấy và cảm ứng biểu hiện protein mục tiêu

 Cho vào bình erlen 20mL LB và 2mL chủng E coli, đậy giấy bạc

 Đem ủ khoảng 6 tiếng ở 37o

C trên máy lắc

 Không thêm IPTG (chất cảm ứng biểu hiện promoter để quá trình phiên mã diễn ra tốt)

 Lấy 15mL dung dịch đi ly tâm 4500 rpm trong 15 phút

Dự đoán: lượng protein mục tiêu sẽ ít hơn những nhóm có thêm IPTG vào mẫu trong

những khoảng thời gian khác nhau

Hình ảnh kết quả:

Hình 7 Dung dịch sau khi ly tâm

5 TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP

Do cấu trúc protein đích có thể mã hoá cho 6 đoạn histidine mà histidine có khả năng gắn kết với kim loại Ni nên ta dùng phương pháp sắc ký ái lực ion kim loại để tách nhóm protein Protein đích sau đó sẽ được thôi bằng đệm thôi có thành phần imidazole - là 1 chất cạnh tranh với nó

5.1 Sắc ký ái lực ion kim loại - IMAC

Đây là kỹ thuật sắc ký đơn giản và hiệu quả nhất tinh chế protein Sắc ký dựa trên nguyên tắc gắn kết thuận nghịch của một nhóm chức năng trên protein với một nhóm chức năng của pha tĩnh sắc ký

5.1.1 Vật liệu chuẩn bị

 Đệm thôi 4X (Elution buffer) Trước khi chạy sắc ký, ta cần pha loãng nồng độ các đệm thành 1X với tỉ lệ phù hợp Sau khi tính toán quá trình, các đệm cần 8ml

 Đệm ion 1X: cần pha 1 mL đệm ion 8X và 7 mL nước cất 2 lần

 Đệm thôi 1X: cần pha 2 mL đệm thôi và 6 mL nước cất 2 lần