Hoàn thiện quy trình sản xuất dung dịch thuốc tiêm stimus hoạt chất darbepoetin alfa công ty cổ phần công nghệ sinh học dược nanogen

CÔNG TY CP CNSH DƢỢC NANOGEN ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ BAN QUẢN LÝ KHU CÔNG NGHỆ CAO BÁO CÁO NGHIỆM THU DỰ ÁN HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT DUNG DỊCH THUỐC TIÊM STIMUS (HOẠT CHẤT DARBEPOETIN ALFA) Chủ nhiệm đề tài: ThS Nguyễn Mai Khôi Cơ quan chủ trì đề tài: Cơng ty cổ phần CNSH Dƣợc Nanogen Đơn vị Quản lý: Ban Quản lý Khu Công nghệ cao TP Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh - 2019 MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC BẢNG xxv DANH MỤC HÌNH xxxii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT xlvi I TỔNG QUAN 1.1 Tình hình nghiên cứu sản xuất thuốc điều trị thiếu máu cho bệnh nhân suy thận mạn tính bệnh nhân ung thƣ 1.2 Tổng quan Darbepoetin 1.3 Tổng quan nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ni cấy để sản xuất Darbepoetin alfa 1.3.1 Sản xuất protein tái tổ hợp tế bào 1.3.2 Cải thiện quy trình ni cấy, sản xuất protein tế bào 1.3.3 Môi trƣờng bổ sung thành phần bổ sung nuôi cấy tế bào đề sản xuất protein 1.3.4 Hệ thống bioreactor nuôi cấy tế bào 1.3.5 Tác động nhiệt độ lên nuôi cấy tế bào 12 1.3.6 Ảnh hƣởng thời gian thu hoạch 13 1.4 Tổng quan nội dung 2: Nghiên cứu hồn thiện quy trình tinh Darbepoetin alfa 14 1.4.1 Tổng quan tinh chế protein 14 1.4.2 Sắc ký lực (affinity chromatography) 16 1.4.3 Sắc ký ion (ion exchange chromatography) 18 1.4.4 Đệm bảo quản nguyên liệu 20 1.5 Tổng quan nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình pha chế đóng gói thuốc 21 1.5.1 Tá dƣợc dung dịch đệm bảo quản 22 1.5.2 Tổng quan đóng gói dƣợc phẩm: 23 1.5.2.1 Tồng quan bơm tiêm 25 1.5.2.2 Chất lƣợng độ 27 1.6 Tổng quan nội dung 4: Nghiên cứu tiêu chuẩn phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu thành phẩm 28 i 1.6.1 Khái niệm tiêu chuẩn chất lƣợng thuốc 28 1.6.2 Giới thiệu phƣơng pháp phân tích 29 1.6.2.1.Phƣơng pháp SDS-PAGE 29 1.6.2.2 Phƣơng pháp Western blot 30 1.6.2.3 Phƣơng pháp IEF 30 1.6.2.4 Phƣơng pháp Peptide mapping 31 1.6.2.5 Phƣơng pháp định lƣợng nồng độ protein tổng số 33 1.6.2.6 Phƣơng pháp xác định nồng độ sialic acid 1mol Darbepoetin alfa 34 1.6.2.7 Phƣơng pháp đánh giá hoạt lực 35 1.6.2.8 Phƣơng pháp đánh giá dimer tạp chất khác 35 1.6.2.9 Phƣơng pháp đánh giá nội độc tố 37 1.6.2.10 Phƣơng pháp đánh giá dƣ lƣợng DNA tế bào chủ dƣ lƣợng protein tế bào chủ 37 1.6.2.11 Phƣơng pháp kiểm tra độ vô khuẩn 38 1.7 Tổng quan nội dung 5: Thử hoạt tính sinh học Darbepoetin alfa EPO38 1.7.1 Bệnh thiếu máu phƣơng pháp điều trị: 38 1.7.2 Ứng dụng Darbepoetin alfa điều trị thiếu máu 40 1.7.2.1 Liều lƣợng tiêm 41 1.7.2.2 Tác dụng phụ 41 1.7.2.3 Tƣơng tác thuốc 42 1.7.3 Dƣợc học DEPO 42 1.7.3.1 Dƣợc động học 42 1.7.3.2 Dƣợc lực học DEPO 44 1.7.4 Lợi ích kinh tế 46 1.7.5 Nghiên cứu lâm sàng 47 1.8 Tổng quan nội dung 6: Sản xuất thử nghiệm lô nguyên liệu DEPO lô thành phẩm Stimus 48 1.9 Tổng quan nội dung 7: Nghiên cứu độ ổn định nguyên liệu DEPO thành phẩm Stimus 48 1.9.1 Đệm bảo quản 48 1.9.2 Điều kiện bảo quản 49 ii 1.9.3 Mục tiêu nội dung 49 1.10 Tổng quan nội dung 8: So sánh tƣơng đƣơng sinh học thuốc Stimus công ty Nanogen thuốc Aranesp Amgen 49 1.10.1 Công nghệ nghiên cứu, thử nghiệm thuốc tƣơng đƣơng sinh học 49 1.10.2 Nghiên cứu tƣơng đƣơng sinh học thuốc Stimus công ty Nanogen Aranesp Amgen: 52 1.11 Tổng quan nội dung 9: Nghiên cứu tiền lâm sàng thuốc Stimus 53 1.11.1 Dƣợc lực học tiền lâm sàng 53 1.11.1.1 Cơ chế tác động 53 1.11.1.2 Liều lƣợng tiêm DEPO 56 1.11.2 Dƣợc động học 57 1.11.2.1 Sự hấp thu 57 1.11.2.2 Sự phân phối 59 1.11.2.3 Sự chuyển hóa 60 1.11.2.4 Sự thải trừ: 61 1.11.2.5 Thông số đƣợc dùng nghiên cứu dƣợc động học: 61 1.11.3 Nghiên cứu tiền lâm sàng – Độ an toàn 65 1.11.3.1 Độc tính cấp (liều đơn) 65 1.11.3.2 Độc tính liều lặp lại 65 1.11.3.3 Độc tính gen 66 II VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 67 2.1 Nội dung 1: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình ni cấy để sản xuất Darbepoetin alfa 67 2.1.1 Vật liệu 67 2.1.1.1 Hóa chất 67 2.1.1.2 Dụng cụ 68 2.1.1.3 Thiết bị 69 2.1.1.4 Chủng tế bào 70 2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 71 2.1.2.1 Chuyên đề 1.1: Nghiên cứu hoan thiện môi trƣờng sản xuất 71 2.1.2.2 Chuyên đề 1.2: Nghiên cứu hồn thiện mơi trƣờng bổ sung 73 iii 2.1.2.3 Chuyên đề 1.3 : Nghiên cứu hoàn thiện thành phần bổ sung 74 2.1.2.4 Chuyên đề 1.4: Nghiên cứu hồn thiện quy trình lên men bioreactor 78 2.1.2.5 Chuyên đề 1.5: Thẩm định quy trình lên men Bioreactor 83 2.2 Nội dung 2: Nghiên cứu hồn thiện quy trình tinh Darbepoetin alfa 88 2.2.1 Thiết bị dùng tinh chế 88 2.2.2 Hóa chất dùng tinh chế 89 2.2.3 Phƣơng pháp 89 2.2.3.1 Lọc xác tế bào 90 2.2.3.2 Chuyên đề 2.1: Hoàn thiện giai đoạn sắc ký lực 91 2.2.3.2.1 Khảo sát khả bám mẫu gel 91 2.2.3.2.2 Khảo sát đệm phân tách mẫu 92 2.2.3.3 Trao đổi dung dịch đệm lần 93 2.2.3.4 Chuyên đề 2.2: Hoàn thiện giai đoạn sắc ký trao đổi ainon 93 2.2.3.4.1 Khảo sát khả bám mẫu gel 94 2.2.3.4.2 Khảo sát đệm phân tách mẫu 94 2.2.3.5 Trao đổi dung dịch đệm lần hai 96 2.2.3.6 Chuyển đề 2.3: Hoàn thiện giai đoạn sắc ký cation 96 2.2.3.6.1 Khảo sát khả bám mẫu gel 96 2.2.3.6.2 Khảo sát đệm phân tách mẫu 97 2.2.3.7 Chuyển đề 2.4: Nghiên cứu bảo quản nguyên liệu Darbepoetin alfa 98 2.2.3.7.1 Đề cƣơng nghiên cứu đệm bảo quản 98 2.2.3.7.2 Phƣơng pháp kiểm tra nguyên liệu DEPO 101 2.2.3.8 Chuyên đề 2.5: Thẩm định quy trình tinh chế 101 2.3.8.1 Đề cƣơng thẩm định quy trình tinh chế DEPO 101 2.3.8.2 Chỉ tiêu chất lƣợng nguyên liệu 104 2.3.8.3 Phƣơng pháp kiểm tra nguyên liệu DEPO 105 2.3 Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình pha chế đóng gói thuốc 105 2.3.1 Vật liệu 105 2.3.1.1 Nguyên liệu darbepoetin alfa 105 2.3.1.2 Hóa chất 106 2.3.1.3 Dụng cụ 107 iv 2.3.1.4 Thiết bị 108 2.3.2 Phƣơng pháp 108 2.3.2.1 Chuyên đề 3.1: Nghiên cứu xác định thành phần thuốc 108 2.3.2.1.1 Nghiên cứu tá dƣợc điều chỉnh ổn định pH 108 2.3.2.1.2 Nghiên cứu tá dƣợc chống oxy hóa 109 2.3.2.1.3 Nghiên cứu tá dƣợc đẳng trƣơng 112 2.3.2.2 Chuyên đề 3.2: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình pha chế 115 2.3.2.2.1 Quy trình kiểm tra trƣớc pha chế thuốc đóng thuốc 115 2.3.2.2.2 Giai đoạn cân nguyên liệu 116 2.3.2.2.3 Quy trình pha chế thuốc 116 2.3.2.2.3 Kiểm tra trình pha thuốc đóng thuốc 117 2.3.2.3 Chun đề 3.3: Nghiên cứu hồn thiện quy trình đóng thuốc (nhập liệu kim tiêm, ép vỉ, đóng thuốc) 130 2.3.2.3.1 Quy trình nhập nguyên liệu kim tiêm, ép vỉ, đóng gói 130 2.3.2.3.2 Quy trình kiểm tra chất lƣợng đóng thuốc 138 2.3.2.3.3 Hồn thiện quy trình ép vỉ, đóng gói 140 2.3.2.3.4 Quy trình bảo quản lƣu kho 142 2.3.2.4 Chuyên đề 3.4: Nghiên cứu hồn thiện quy trình bảo quản thành phẩm 144 2.3.2.4.1 Nội dung nghiên cứu 144 2.3.2.4.2 Các tiêu tần suất kiểm tra điều kiện bảo quản bơm tiêm 146 2.3.2.4.3 Phƣơng pháp kiểm tra 148 2.4 Nội dung 4: Nghiên cứu tiêu chuẩn phƣơng pháp kiểm tra chất lƣợng nguyên liệu DEPO thành phẩm STIMUS 148 2.4.1 Tiêu chuẩn chất lƣợng nguyên liệu DEPO 148 2.4.2 Phƣơng pháp kiểm nghiệm nguyên liệu DEPO 150 2.4.2.1 Cảm quan: 150 2.4.2.2 pH: 150 2.4.2.3 Định tính 150 2.4.2.3.1.SDS-PAGE – Trọng lƣợng phân tử 150 2.4.2.3.2.Western Blot 154 2.4.2.3.3.Điện di điểm đẳng điện 156 v 2.4.2.3.4 Kiểm tra peptid: Sắc ký lỏng 159 2.4.2.4.Độ tinh 160 2.4.2.4.1.Dimers chất liên quan có khối lƣợng phân tử cao hơn: 160 2.4.2.4.2.Dƣ lƣợng DNA tế bào chủ 161 2.4.2.4.3 Dƣ lƣợng protein tế bào chủ: 163 4.2.4.4.Nội độc tố vi khuẩn: 164 2.4.2.5 Định lƣợng 165 2.4.2.5.1 Nồng độ protein tổng số: 165 2.4.2.5.2 Kiểm tra sialic acid 166 2.4.2.5.3 Xác định hoạt lực DEPO 168 2.4.2.6 Độ vô khuẩn 170 2.4.3.Đề cƣơng thẩm định phƣơng pháp phân tích nguyên liệu DEPO 172 2.4.3.1 Giới thiệu 172 2.4.3.2.Phƣơng pháp kiểm nghiệm 174 2.4.3.3.Thẩm định 174 2.4.3.3.1 Phƣơng pháp định tính SDS-PAGE 174 2.4.3.3.2 Phƣơng pháp định tính Western blot 176 2.4.3.3.3 Phƣơng pháp định tính xác định Isoform 177 2.4.3.3.4.Phƣơng pháp đánh giá độ tinh SE-HPLC 178 2.4.3.3.5.Phƣơng pháp đánh giá Dƣ lƣợng DNA tế bào chủ 178 2.4.3.3.6 Phƣơng pháp đánh giá Dƣ lƣợng protein tế bào chủ 180 2.4.3.3.7.Phƣơng pháp đánh giá định lƣợng protein tổng số 181 2.4.3.3.8.Hoạt lực 184 2.4.4 Tiêu chuẩn chất lƣợng thành phẩm STIMUS (Bơm tiêm đóng sẵn thuốc 100mcg/0,5 mL) 186 2.4.4.1 Công thức pha chế cho bơm tiêm 0,5 mL 186 2.4.4.2 Yêu cầu chất lƣợng 186 Chỉ tiêu kiểm nghiệm 186 2.4.5.Phƣơng pháp kiểm nghiệm thành phẩm STIMUS 188 2.4.5.1.Cảm quan: 188 2.4.5.2.Định tính: SDS-PAGE 188 vi 2.4.5.3 Định tính: Western Blot 192 2.4.5.4.pH: 194 2.4.5.5.Giới hạn tiểu phân 194 2.4.5.6 Dimer tạp chất phân tử lớn hơn: phƣơng pháp sắc ký rây phân tử 194 2.4.5.7.Định lƣợng protein tổng số 195 4.5.8.Hoạt lực: 196 2.4.5.9.Độ vô khuẩn: 198 2.4.5.10.Kiểm tra nội độc tố: 200 2.4.6 Đề cƣơng thẩm định phƣơng pháp phân tích thành phẩm STIMUS 201 2.4.6.1 Giới thiệu 201 2.4.6.2.Phƣơng pháp kiểm nghiệm 204 2.4.6.3.Thẩm định 204 2.4.6.3.1 Phƣơng pháp định tính SDS-PAGE 204 2.4.6.3.2.Phƣơng pháp định tính Western Blot 205 2.4.6.3.3 Phƣơng pháp định tính SE-HPLC 205 2.4.6.3.4.Protein tổng số 206 2.4.6.3.5.Hoạt lực 208 2.5 Nội dung 5: Thử nghiệm hoạt tính sinh học Darbepotein alfa EPO 211 2.5.1 Động vật thí nghiệm 211 2.5.2 Vật liệu nghiên cứu 211 2.5.3 Dụng cụ - Thiết bị 212 2.5.4 Hóa chất 212 2.5.5 Phƣơng pháp 213 2.5.6 Nội dung nghiên cứu 213 2.6 Nội dung 6: Sản xuất thử nghiệm lô nguyên liệu DEPO lô thành phẩm Stimus 215 2.6.1 Máy móc thiết bị 215 2.6.2 Hóa chất – Nguyên vật liệu 219 2.6.3 Chuyên đề 6.1: Sản xuất thử nghiệm lô nguyên liệu 221 2.6.4 Chuyên đề 6.2: Sản xuất lô thành phẩm dung dịch tiêm 222 2.7 Nội dung 7: Nghiên cứu độ ổn định nguyên liệu DEPO thành phẩm Stimus223 vii 2.7.1 Phần 1: Nghiên cứu độ ổn định nguyên liệu Darbepoetin alfa dung dịch đệm khác điều kiện bảo quản khác 223 2.7.2 Phần 2: Nghiên cứu độ ổn định thành phẩm Stimus điều kiện bảo quản khác 226 2.8 Nội dung 8: So sánh tƣơng đƣơng sinh học thuốc Stimus công ty Nanogen thuốc Aranesp Amgen 231 2.8.1 Thuốc nghiên cứu: 231 2.8.2 Tiêu chuẩn nghiên cứu 232 2.9 Nội dung 9: Nghiên cứu tiền lâm sàng thuốc Stimus 234 2.9.1 Nguyên vật liệu 234 2.9.1.1 Động vật thí nghiệm: 234 2.9.1.2 Hóa chất – thiết bị 234 2.9.2 Chiến lƣợc nghiên cứu 235 2.9.2.1 Dƣợc động học dƣợc lực học tiền lâm sàng 235 2.9.2.1.1 Dƣợc lực học tiền lâm sàng 235 2.9.2.1.2 Dƣợc động học tiền lâm sàng 236 2.9.2.2 Độ an toàn tiền lâm sàng 239 2.9.2.2.1 Độc tính gen (in vitro) 239 2.9.2.2.1 Độc tính cấp (liều đơn) 240 2.9.2.2.3 Độc tính bán trƣờng diễn (liều lặp lại) 241 2.9.2.2.4 Tính mẫn miễn dịch 244 2.9.2.2.5 Tính kích ứng chỗ tiêm 245 III KẾT QUẢ 247 3.1 Nội dung 1: Nghiên cứu xây dựng hồn thiện quy trình ni cấy để sản xuất Darbepoetin alfa 247 3.1.1 Chun đề 1.1: Nghiên cứu hồn thiện mơi trƣờng sản xuất 247 3.1.2 Chuyên đề 1.2: Nghiên cứu hồn thiện mơi trƣờng bổ sung 250 3.1.3 Chuyên đề 1.3: Nghiên cứu hoàn thiện thành phần bổ sung 251 3.1.4 Chuyên đề 1.4: Nghiên cứu hồn thiện quy trình lên men 256 3.1.4.1 Khảo sát nhiệt độ nuôi cấy 256 3.1.4.2 Khảo sát thời gian nuôi cấy tối ƣu 259 viii 3.1.5 Chuyên đề 1.5: Thẩm định quy trình lên men bioreactor 261 3.1.5.1 Kết số liệu thẩm định giai đoạn nuôi cấy nhỏ 261 3.1.5.2 Kết số liệu thẩm định giai đoạn nuôi cấy tăng sinh 261 3.1.5.3 Kết số liệu thẩm định giai đoạn nuôi cấy chai lắc 2L 261 3.1.5.4 Kết số liệu thẩm định giai đoạn lên men bồn 262 3.1.5.5 Kết số liệu thẩm định giai đoạn ly tâm thu sản phẩm 263 Kết luận chung: 264 3.2 Nội dung 2: Nghiên cứu hoàn thiện quy trình tinh Darbepoetin alfa 264 3.2.1 Lọc xác tế bào 264 3.2.2 Sắc ký lực 264 3.2.2.1 Kết tỷ lệ bám mẫu 264 3.2.2.2 Kết khảo sát đệm phân tách mẫu 265 3.2.3 Trao đổi dung dịch đệm lần 267 3.2.4 Sắc ký trao đổi ainon 267 3.2.4.1 Kết tỷ lệ bám mẫu 267 3.2.4.2 Kết khảo sát đệm phân tách mẫu 268 3.2.5 Trao đổi dung dịch đệm lần 269 3.2.6 Sắc ký lọc cation 270 3.2.6.1 Kết tỷ lệ bám mẫu 270 3.2.6.2 Kết khảo sát đệm phân tách mẫu 270 3.2.7 Tổng kết trình tinh chế 272 3.2.8 Bảo quản nguyên liệu DEPO 273 3.2.9 Kết thẩm định quy trình tinh chế 276 3.2.9.1 Kết thẩm định quy trình tinh chế DEPO qua lơ tinh chế 277 3.2.9.2 Kết thẩm định chất lƣợng nguyên liệu từ lô tinh chế DEPO 279 Kết luận: 280 3.3 Nội dung 3: Nghiên cứu xây dựng quy trình pha chế đóng gói thuốc 280 3.3.1 Chuyên đề 1: Nghiên cứu xác định thành phần công thức thuốc 280 3.3.1.1 Nghiên cứu tá dƣợc điều chỉnh ổn định pH 280 3.3.1.2 Nghiên cứu tá dƣợc chống oxy hóa 281 3.3.1.3 Nghiên cứu tá dƣợc đẳng trƣơng 285 ix Phụ lục 9.24: Hình chụp cắt lớp mô học gan, thận, lách chuột cống thử nghiệm độc tính bán trƣờng diễn Một số hình ảnh minh họa gan, lách, thận khơng có tổn thƣơng chuột nghiên cứu Gan Lách Thận Stimus µg/kg Nhu mô gan không thấy Nhu mô lách không Nhu mô thận không tổn thƣơng thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng HE x 400 PAS x 400 HE x 400 Stimus 25,0 µg/kg Nhu mơ gan khơng thấy Nhu mô lách không Nhu mô thận không tổn thƣơng thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng HE x 400 PAS x 400 PAS x 400 Stimus 50,0 µg/kg Nhu mơ thận không Nhu mô gan không thấy Nhu mô lách không thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng tổn thƣơng HE x 400 HE x 400 942 PAS x 400 Aranes p 25,0 µg/kg Nhu mơ gan khơng thấy Nhu mơ lách không Nhu mô thận không tổn thƣơng thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng HE x HE x 400 HE x 400 400 Chứng Placeb o Nhu mô gan không thấy Nhu mô lách không Nhu mô thận không tổn thƣơng thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng HE x 400 HE x 400 HE x 400 Chứng Sinh học Nhu mô gan không thấy Nhu mô lách không Nhu mô thận không tổn thƣơng thấy tổn thƣơng thấy tổn thƣơng HE x 400 PAS x 400 PAS x 400 943 Một số hình ảnh minh họa gan, lách, thận tổn thƣơng Gan Lách Thận Stimu s µg/kg Tế bào gan thối hóa Mơ lách xơ hóa, xung Mơ thận xung huyết hốc, thối hóa mỡ huyết (quanh vùng trung tâm, HE x 400 HE x 400 tích tụ nhiều Glycogen), tĩnh mạch trung tâm giãn rộng, khoảng cửa xơ hóa HE x 400 Stimu s 25 µg/kg Mơ gan thối hóa, xung Mơ lách xung huyết lan huyết tỏa Mô thận xung huyết, ống HE x 400 HE x 400 thận có hồng cầu HE x 400 944 Stimu s 50 µg/kg Mơ gan thối hóa, xung Mơ lách xung huyết, xơ Mô thận xung huyết lan huyết lan tỏa hóa nhẹ toả HE x 400 HE x 400 HE x 400 Aranes p 25 µg/kg Tế bào gan thối hóa, Mơ lách xung huyết, xơ Mơ thận xung huyết nhân đơng, thối hóa hóa nhẹ mạnh, lan tỏa, ống thận hốc, mỡ, mô kẽ sung HE x 400 thối hóa nhe huyết, phù nề Mơ gan HE x 400 thối hóa, xung huyết lan tỏa HE x 400 945 Phụ lục 9.25: Kết khảo sát biểu sinh lý chuột lang thử nghiệm tính mẫn miễn dịch Động vật Giống Ngày Ngày Ngày 15 Ngày 18/11/2017 825/11/2017 01/12/2017 08/12/2017 (Mũi tiêm 1) (Mũi tiêm 2) (Mũi tiêm 3) (Mũi tiêm 4) 22 Stimus – Liều µg/kg ♂1 ♂2 ♂3 ♀1 ♀2 ♀3 Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Stimus – Liều 50 µg/kg ♂1 ♂2 ♂3 ♀1 ♀2 ♀3 Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Mệt mỏi, ăn Ngứa mũi, giảm bất thƣờng hoạt động bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Mệt mỏi, ăn bất thƣờng Ngứa mũi bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Mệt mỏi, ăn bất thƣờng bất thƣờng Ngứa mũi bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi 946 bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Aranesp – Liều µg/kg ♂1 ♂2 ♂3 ♀1 ♀2 ♀3 Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Chứng âm (Dung dịch pha thuốc ♂1 ♂2 ♂3 ♀1 ♀2 ♀3 Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng bất thƣờng Chứng dƣơng (Ovalbumin) – Liều 2,5 mg/kg ♂1 Khơng có biểu Khơng có biểu Khơng có biểu Chuột mệt mỏi, bất thƣờng bất thƣờng 947 bất thƣờng khó thở, hắt hơi, xù lông, giảm hoạt động sau khoảng 10 phút bình thƣờng Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi Chuột mệt mỏi, bất thƣờng khó thở, giảm bất thƣờng ♂2 hoạt động sau khoảng 10 phút bình Khơng có biểu Khơng có biểu Ngứa mũi Chuột mệt mỏi, bất thƣờng khó thở, hắt hơi, bất thƣờng xù lông, giảm ♂3 hoạt động sau khoảng 10 phút bình thƣờng Khơng có biểu Chuột ngứa mũi Chuột thở gấp, Chuột thở gấp, bất thƣờng sau tiêm, hắt kích động sau kích động sau hơi, kích động khoảng 10 phút khoảng 10 phút ♀1 sau khoảng 10 bình thƣờng bình thƣờng phút Chuột mệt mỏi, bình thƣờng giảm hoạt động, giảm tiêu thụ thức ăn nƣớc uống, giảm cân chết vào ngày 24 Khơng có biểu Khơng có biểu Chuột mệt mỏi, Chuột mệt mỏi, bất thƣờng bất thƣờng ♀2 giảm hoạt động, giảm hoạt động, giảm tiệu thụ giảm tiệu thụ thức ăn nƣớc thức ăn nƣớc uống 948 uống Khơng có biểu Chuột ngứa mũi Chuột co giật, bất thƣờng ♀3 sau tiêm, hắt thở gấp, chết sau hơi, kích động khoảng 10 sau khoảng 15 phút thƣờng 949 bình - Phụ lục 9.26: Kết theo dõi tăng trọng chuột lang thí nghiệm tính mẫn miễn dịch Động vật Thời điểm cân (thứ tự ngày thử nghiệm) Giống 15 16 22 23 29 Stimus – Liều µg/kg ♂1 302 326 374 378 362 358 386 372 408 ♂2 350 352 388 386 356 386 400 386 374 ♂3 304 300 322 316 300 326 314 318 326 ♀1 306 302 344 344 368 348 344 322 316 ♀2 302 300 336 322 342 320 326 328 332 ♀3 304 310 350 332 356 350 374 374 374 311,3 315,0 352,3 Xtb ± SD ± ± ± 19,0 20,7 24,5 346,3 ±29,3 347,3 348,0 357,3 350,0 350,0 ± ± ± ± ± 24,7 23,7 34,5 30,5 35,8 Stimus – Liều 50 µg/kg ♂1 318 328 332 336 368 334 416 420 474 ♂2 320 322 344 336 312 286 252 230 220 ♂3 336 354 400 394 416 392 496 492 562 ♀1 364 360 378 362 356 332 292 286 268 ♀2 309 311 341 337 363 325 307 297 273 ♀3 314 316 346 340 370 352 332 320 306 326,8 331,8 356,8 350,8 364,2 336,8 349,2 340,8 350,5 Xtb ± SD ± ± ± ± ± ± ± ± ± 20,4 20,4 26,3 23,4 33,2 34,7 90,3 96,7 135,5 Aranesp – Liều µg/kg ♂1 302 316 316 330 374 380 422 430 470 ♂2 306 310 332 348 294 306 315 314 338 ♂3 328 338 344 358 362 346 320 318 334 ♀1 304 310 304 314 292 286 302 305 316 ♀2 308 322 362 362 384 392 406 404 440 950 ♀3 Xtb ± SD 308 309,3 ± 9,4 306 342 350 330 362 402 410 436 317,0 333,3 343,7 339,3 345,3 361,2 363,5 389,0 ± ± ± ± ± ± ± ± 11,7 20,8 18,3 40,2 41,8 54,2 56,9 66,8 Chứng Placebo (dung dịch pha thuốc) ♂1 306 312 332 336 360 366 402 384 424 ♂2 300 328 348 354 344 348 382 384 400 ♂3 304 292 324 334 358 374 406 402 452 ♀1 304 294 332 324 326 314 340 336 340 ♀2 314 318 325 328 342 351 373 381 396 ♀3 325 329 342 351 375 384 396 398 421 Xtb ± SD 308,8 ± 9,2 312,2 ± 16,2 333,8 ± 9,5 337,8 350,8 356,2 383,2 380,8 405,5 ± ± ± ± ± ± 12,2 17,1 24,7 24,7 23,5 37,8 Chứng dƣơng (Ovalbumin 2.5 µg/kg) ♂1 300 314 334 332 340 364 384 390 424 ♂2 314 292 316 338 370 344 332 338 378 ♂3 300 290 330 324 356 336 361 352 390 ♀1 327 324 337 330 341 310 301 280 - ♀2 318 302 340 342 354 339 358 330 312 ♀3 320 317 343 350 360 - - - - 298.3 305.7 326.7 334.7 349.3 367.6 385.6 Xtb ± SD ± ± ± ± ± ± ± 21.8 18.6 19.5 18.5 19.7 22.0 23.9 951 372.0 409.0 ± 8.5 ± 4.2 Phụ lục 9.27: Theo dõi tính kích ứng chỗ tiêm thỏ Các biểu độc chỗ toàn thân Động vật Giống Ngày (Giờ) 0,5 Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày Ngày 24 Thuốc thử Stimus – Liều 25 µg/kg ♂1 0 1 1 0 0 ♂2 1 0 0 0 ♂3 1 1 1 0 0 ♀1 0 0 1 0 0 ♀2 1 1 1 0 0 ♀3 0 1 0 0 0 Tổng điểm 3 0 0 Thuốc đối chứng Aranesp – Liều 25,0 µg/kg ♂1 1 1 0 0 0 ♂2 0 1 0 0 ♂3 1 1 0 0 ♀1 0 0 1 0 0 ♀2 1 1 1 0 0 ♀3 0 1 0 0 Tổng điểm 3 0 0 Chứng âm (Placebo) ♂1 0 1 1 0 0 ♂2 1 1 0 0 0 ♂3 0 1 0 0 ♀1 1 1 0 0 ♀2 0 0 1 0 0 ♀3 1 1 0 0 0 Tổng điểm 0 0 Ghi chú: 952 = Khơng có biểu bất thƣờng = Biểu sƣng, đỏ nhẹ vị trí tiêm = Biểu sƣng phồng, đỏ viêm nhiễm vị trí tiêm = Biểu tồn thân: mệt mỏi, giảm hoạt động, giảm ăn uống D = Chết 953 Phụ lục 9.28: Hình chụp tai thỏ thí nghiệm tính kích ứng chỗ Stimus 25 µg/kg Aranesp 25 µg/kg Trƣớc thử nghiệm Ngay sau tiêm Sau tiêm ngày 954 Placebo Sau tiêm ngày Sau tiêm ngày 955 Thời điểm cân Động vật Giống Trƣớc tiêm Ngày 1 Ngày Ngày % tăng Chứng Placebo (Dung dịch pha thuốc) ♂1 2,220 2,268 2,350 2,368 6,67 ♂2 2,174 2,186 2,212 2,220 2,12 ♂3 2,014 2,036 2,066 2,122 5,36 ♀1 2,222 2,252 2,308 2,420 8,91 ♀2 2,400 2,434 2,454 2,540 5,83 ♀3 2,190 2,230 2,240 2,264 3,38 Stimus – Liều 25 µg/kg ♂1 2,250 2,258 2,306 2,318 3,02 ♂2 2,086 2,112 2,130 2,194 5,18 ♂3 2,202 2,290 2,388 2,392 8,63 ♀1 2,310 2,340 2,350 2,424 4,94 ♀2 2,400 2,412 2,486 2,544 6,00 ♀3 2,156 2,184 2,192 2,212 2,60 Aranesp – Liều 25 µg/kg ♂1 2,174 2,196 2,232 2,242 3,13 ♂2 2,180 2,200 2,222 2,302 5,60 ♂3 2,388 2,422 2,478 2,522 5,61 ♀1 2,054 2,096 2,154 2,254 9,74 ♀2 2,272 2,298 2,325 2,326 2,38 ♀3 2,398 2,440 2,452 2,502 4,34 956