Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm bt bacillus thuringiensis dùng trong kiểm soát sâu hại thuộc bộ lepidoptera trên cây cau

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆN NC CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MƠI TRƯỜNG CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ HỒN THIỆN QUI TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM Bt (Bacillus thuringiensis) DÙNG TRONG KIỂM SOÁT SÂU HẠI THUỘC BỘ Lepidoptera TRÊN CÂY RAU (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày ) Chủ nhiệm nhiệm vụ: PGS TS Lê Đình Đơn Cơ quan chủ trì nhiệm vụ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12/2017 MỤC LỤC DANH SÁCH CÁC BẢNG vi DANH SÁCH CÁC HÌNH x CHƯƠNG I MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Thời gian địa điểm thực CHƯƠNG II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Bacillus thuringiensis (Bt) 2.1.1 Phân loại khoa học 2.1.2 Sự phân bố Bt 2.1.3 Môi trường phát triển Bt 2.1.4 Đặc điểm sinh hóa Bacillus thuringiensis 2.1.5 Các nghiên cứu phân lập Bacillus thuringiensis 2.1.6 Tinh thể độc 2.1.7 Tên gọi ký hiệu gene mã hóa Cry Cyt 2.1.8 Phát dòng dựa vào phương pháp sinh học phân tử mức độ genome 2.1.9 Cơ chế tác động Bacillus thuringiensis lên ruột sâu 2.1.10 Những nghiên cứu nước Bacillus thuringiensis 10 2.1.11 Phát triển sản phẩm trừ sâu Bt: 14 2.1.12 Ưu điểm yếu tố giới hạn sản phẩm Bt: 15 CHƯƠNG III PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 3.1 Nội dung 1.Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 17 3.1.1 Thu thập mẫu: 17 3.1.2 Phương pháp thu mẫu: 17 3.1.3 Phương pháp phân lập mẫu 17 3.1.4 Phân lập vi khuẩn Bt môi trường chọn lọc 19 3.1.5 Xác định số đặc điểm vi khuẩn Bacillus thuringiensis 19 3.2 Nội dung 2: Thiết lập hệ thống fermentor 50 lít 21 i 3.3 Nội dung 3: Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt trùng gây hại 22 3.3.1 Xây dựng quần thể sâu xanh da láng Spodoptera exigua phịng thí nghiệm nguồn thức ăn nhân tạo 22 3.3.2 Xây dựng quần thể sâu khoang (Spodoptera litura-Lepidoptera) phịng thí nghiệm nguồn thức ăn nhân tạo 23 3.3.3 Xây dựng quần thể sâu tơ Plutella xylostella phịng thí nghiệm nguồn thức ăn nhân tạo 24 3.3.4 Xây dựng quần thể tuyến trùng ký sinh Meloidogyne incognita cà chua 24 3.3.5 Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang , sâu tơ, sâu xanh da láng tuyến trùng chủng vi khuẩn Bt phân lập 25 3.4 Nội dung Xác định tên loài mẫu Bt có hoạt tính sinh học kỹ thuật sinh học 30 3.4.1 Phân lập DNA tổng số 30 3.4.2 Thực PCR phát cry 30 3.4.3 Thực phản ứng PCR khuếch đại vùng gen Vip3A 31 3.4.4 Kỹ thuật SDS-PAGE 32 3.4.5 Điện di đọc kết 33 3.4.6 Giải trình tự phân tích kết trình tự DNA 34 3.5 Nội dung Xác lập điều kiện tăng sinh khối mẫu phân lập tiềm 34 3.6 Nội dung Xác lập điều kiện tạo sản phẩm Bt dạng bột tan nước 35 3.6.1 Thời gian tồn trữ nguồn mẫu 35 3.6.2 Phụ gia thích hợp (kháng UV): 35 3.6.2.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men bán rắn 35 3.6.2.2 Chọn phụ gia kháng UV 36 3.6.3 Đánh giá thời gian tồn lưu 36 3.6.4 LC50 mơ hình chuột 36 3.6.5 Xác định điều kiện tồn trữ sản phẩm 37 3.7 Nội dung Đánh giá sản phẩm trồng 37 3.7.1 Đánh giá rau vùng Lâm Đồng Tp.Hồ Chí Minh 37 3.7.1 Đánh giá hiệu lực phòng trừ sâu rau Lâm Đồng Tp Hồ Chí Minh 37 ii 3.8 Nội dung Hoàn thiện quy trình sản xuất sản xuất sản phẩm 50 lit fermentor 40 3.8.1 Tối ưu hóa qui trình lên men sinh khối lỏng fermentor 50L 40 3.8.2 Sản xuất sản phẩm: 40 3.8.3 Hoàn thiện sản phẩm dạng thương mại 40 3.9 Phương pháp xử lý thống kê 41 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ THẢO LUẬN 42 4.1 Nội dung 1: Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 42 4.1.1 Thu thập, phân lập mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis 42 4.1.2 Chọn khuẩn lạc Bt dựa vào môi trường chọn lọc, đặc điểm sinh hóa đặc điểm hình thái 42 4.1.3 Thử Gram KOH 3% 44 4.1.4 Nhuộm Gram 44 4.1.5 Nhuộm bào tử 45 4.1.6 Thử hoạt tính Catalase 45 4.1.7 Phản ứng thủy phân tinh bột 46 4.1.8 Phản ứng V.P (Voges – Proskauer) 46 4.1.9 Đo kích thước tế bào vi khuẩn 47 4.1.10 Nhuộm tinh thể 47 4.2 Nội dung 2: Thiết lập hệ thống fermentor 50Lit 50 4.3 Nội dung 3: Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt trùng gây hại rau phịng thí nghiệm 51 4.3.1 Chọn lọc dòng Bt phân lập có hoạt tính sinh học diệt sâu tơ (Plutella xylostella) phịng thí nghiệm 51 4.3.1.1 Nhân nuôi sâu tơ 51 4.3.1.2 Chọn lọc dịng Bt có khả diệt sâu tơ (Plutella xylostella) 51 4.3.2 Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính diệt sâu khoang (Spodoptera litura) phịng thí nghiệm 56 4.3.2.1 Nhân nuôi sâu khoang 56 4.3.2.2 Chọn lọc mẫu Bt có khả diệt sâu khoang Spodoptera litura 56 4.3.3 Chọn lọc mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học diệt sâu xanh da láng Spodoptera exigua 60 iii 4.3.3.1 Chọn lọc mẫu Bt có khả diệt sâu xanh da láng Spodoptera exigua 60 4.3.4 Đánh giá hiệu phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella), Sâu khoang (Spodoptera litura), Sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) vi khuẩn Bacillus thuringiensis điều kiện nhà lưới 65 4.3.4.1 Đánh giá hiệu phòng trừ sâu tơ (Plutella xylostella) nhà lưới 65 4.3.4.2 Đánh giá hiệu phòng trừ sâu khoang (Spodoptera litura) nhà lưới 66 4.3.4.3 Đánh giá hiệu phòng trừ sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) nhà lưới 68 4.3.5 Kết thử nghiệm hiệu lực diệt tuyến trùng 69 4.3.5.1 Đếm mật độ bào tử 69 4.3.5.2 Thử nghiệm hiệu lực diệt tuyến trùng: 70 4.4 Nội dung 4: Xác định tên lồi mẫu phân lập Bt có hoạt tính sinh học kỹ thuật sinh học phân tử 70 4.4.1 Kết SDS-PAGE 70 4.4.2 Kết khuếch đại PCR vùng gen Vip3A 71 4.4.3 Phát gen cry1, cry vi khuẩn Bacillus thuringiensis var kusrtaki 72 4.4.4 Kết giải trình tự 75 4.5 Nội dung 5: Thiết lập điều kiện tăng sinh khối mẫu Bt tiềm 76 4.6 Nội dung 6: Xác lập điều kiện tạo sản phẩm Bt dạng bột tan nước 81 4.6.1 Khảo sát điều kiện nuôi cấy tối ưu môi trường bán rắn 81 4.6.1.1 Khảo sát loại chất lên men môi trường: 81 4.6.1.2 Khảo sát thành phần môi trường chất lên men bán rắn 81 4.6.1.3 Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến tăng sinh khối vi khuẩn 82 4.6.1.4 Kết khảo sát ảnh hưởng độ ẩm đến tăng sinh khối vi khuẩn 83 4.6.1.5 Kết khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến tăng sinh khối vi khuẩn Bt 84 4.6.1.6 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian đến tăng sinh khối vi khuẩn 85 4.6.2 Phối trộn với phụ gia kháng UV : 85 4.6.3 Đánh giá thời gian tồn lưu sản phẩm 86 4.6.4 LC50 mơ hình chuột: 88 4.6.5 Xác định điều kiện tồn trữ nguồn mẫu: 90 iv 4.6.5.1 Khảo sát điều kiện tồn trữ sản phẩm Bt dạng sinh khối lỏng: 90 4.6.5.2 Khảo sát điều kiện tồn trữ sản phẩm Bt dạng sinh khối bán rắn 91 4.7 Nội dung Đánh giá sản phẩm trồng 92 4.7.1 Đánh giá rau khu vực Tp.HCM 92 4.7.2 Đánh giá rau khu vực Lâm Đồng 97 4.7.3 So sánh hiệu lực phòng trừ sâu hại loại trồng chế phẩm vi khuẩn Bt 100 4.8 Nội dung Hồn thiện quy trình sản xuất sản xuất sản phẩm 50 lit fermentor .101 4.8.1 Tối ưu hóa qui trình lên men sinh khối lỏng fermentor 50L 101 4.8.2 Sản xuất sản phẩm dạng bột hòa tan với nước 105 4.8.3 Hoàn thiện sản phẩm dạng thương mại .109 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 111 Kết luận 111 Đề nghị 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO .113 v DANH SÁCH CÁC BẢNG Bảng 2.1 So sánh tên gọi cho cry cyt theo hệ thống tên bậc Bảng 2.2.Tác động ký sinh côn trùng vi khuẩn Bacillus Bảng 3.1 Trình tự nucleotide cặp mồi khuyếch đại gen cry1 cry2 30 Bảng 3.2 Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR thể tích 12 µl 31 Bảng 3.3 Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR 32 Bảng 3.4 Thành phần chất gel polyacrylamide 33 Bảng 3.5 Thành phần môi trường 35 Bảng 4.1 Số mẫu đất phân lập theo nguồn mẫu thu thập 42 Bảng 4.2 Số mẫu Bacillus thuringiensis phân lập theo vùng sinh thái địa lý từ 2014 – 2017 48 Bảng 4.3 Các dạng tinh thể Bacillus thuringiensis từ mẫu phân lập 49 Bảng 4.4 Số sâu tơ ((Plutella xylostella) sống nghiệm thức thí nghiệm 52 Bảng 4.5 Khả gây chết dòng vi khuẩn Bacillus thuringiensis sâu tơ (Plutella xylostella) 53 Bảng 4.6 Số sâu tơ (Plutella xylostella) sống gây hại cải nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 55 Bảng 4.7 Hiệu lực (%) trừ sâu tơ hại cải chế phẩm Bt nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 55 Bảng 4.8 Tỷ lệ (%) bị sâu tơ gây hại cải thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 55 Bảng 4.9 Số sâu khoang ((Spodoptera litura) sống nghiệm thức thí nghiệm 56 Bảng 4.10 Khả gây chết dòng vi khuẩn Bacillus thuringiensis sâu khoang (Spodoptera litura) 58 Bảng 4.11 Số sâu khoang (Spodoptera litura) sống gây hại cải nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 59 Bảng 4.12 Hiệu lực (%) trừ sâu khoang (Spodoptera litura) hại cải chế phẩm Bt nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 60 vi Bảng 4.13 Tỷ lệ (%) bị sâu khoang(Spodoptera litura) gây hại cải nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 60 Bảng 4.14 Số sâu xanh ((Spodopetra exigua) sống nghiệm thức thí nghiệm 61 Bảng 4.15 Khả gây chết dòng vi khuẩn Bacillus thuringiensis sâu tơ (Spodoptera exigua) 62 Bảng 4.16 Số sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) sống gây hại cải nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 64 Bảng 4.17 Hiệu lực (%) trừ sâu xanh da láng hại cải chế phẩm Bt nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 64 Bảng 4.18 Tỷ lệ (%) bị sâu xanh da láng cải nghiệm thức thí nghiệm thời điểm điều tra phịng thí nghiệm 64 Bảng 4.19 Số sâu tơ hại cải thời điểm điều tra (con/ô) 65 Bảng 4.20 Hiệu lực (%) phòng trừ sâu tơ hại cải chế phẩm Bt thời điểm điều tra 66 Bảng 4.21 Tỷ lệ (%) bị sâu tơ gây hại cải thời điểm điều tra 66 Bảng 4.22 Số sâu khoang (Spodoptera litura) gây hại cải thời điểm điều tra (con/ô) 67 Bảng 4.23 Hiệu lực (%) trừ sâu khoang (Spodoptera litura) hại cải chế phẩm Bt thời điểm điều tra 67 Bảng 4.24 Tỷ lệ (%) bị sâu khoang (Spodoptera litura) gây hại cải thời điểm điều tra 68 Bảng 4.25 Số sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) gây hại cải thời điểm điều tra (con/ô) 68 Bảng 4.26 Hiệu lực (%) trừ sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) hại cải chế phẩm Bt thời điểm điều tra 69 Bảng 4.27 Tỷ lệ (%) bị sâu xanh da láng (Spodoptera exigua) gây hại cải thời điểm điều tra 69 Bảng 4.28 Kết giải trình tự số chủng 76 vii Bảng 4.29 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis loại môi trường khác 77 Bảng 4.30 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis khoảng thời gian nuôi cấy 78 Bảng 4.31 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis pH khác 79 Bảng 4.32 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis nhiệt độ khác 80 Bảng 4.33 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis môi trường khác 82 Bảng 4.34 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis pH khác 82 Bảng 4.35 Ảnh hưởng độ ẩm đến mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis 84 Bảng 4.36 Mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis nhiệt độ khác 84 Bảng 4.37 Ảnh hưởng thời gian đến mật độ vi khuẩn Bacillus thuringiensis 85 Bảng 4.38 Kết phân tích diện vi khuẩn Bt tinh thể vi khuẩn Bt mẫu đất trồng cải Tp.HCM 87 Bảng 4.39 Kết phân tích diện vi khuẩn Bt tinh thể vi khuẩn Bt mẫu đất trồng bắp cải Lâm Đồng 88 Bảng 4.40 Tính tốn liều lượng thử nghiệm cá thể chuột thí nghiệm 89 Bảng 4.41 Sản phẩm Bt dạng sinh khối lỏng bảo quản nhiều nhiệt độ khác 91 Bảng 4.42 Sản phẩm Bt dạng sinh khối lỏng bảo quản nhiều nhiệt độ khác 91 Bảng 4.43 Sản phẩm Bt dạng bột bảo quản nhiều nhiệt độ khác 92 Bảng 4.44 Sản phẩm Bt dạng bột bảo quản nhiều nhiệt độ khác 92 Bảng 4.45 Mật số sâu tơ hại cải thời điểm điều tra (con/m2) 93 Bảng 4.46 Hiệu lực (%) trừ sâu tơ hại cải thời điểm điều tra 94 Bảng 4.47 Tỉ lệ bị hại (%) cải thời điểm điều tra 94 Bảng 4.48 Mật số sâu khoang hại đậu phộng thời điểm điều tra 95 Bảng 4.49 Hiệu lực (%) trừ sâu khoang hại đậu phộng lần điều tra 95 Bảng 4.50 Tỉ lệ bị hại (%) đậu phộng thời điểm điều tra 96 Bảng 4.51 Mật số sâu xanh hại dưa leo thời điểm điều tra 96 Bảng 4.52 Hiệu lực (%) trừ sâu xanh hai sọc trắng hại dưa leo thời điểm điều tra 97 Bảng 4.53 Tỉ lệ bị hại (%) dưa leo thời điểm điều tra 97 viii Bảng 4.54 Mật số sâu tơ hại bắp cải thời điểm điều tra (con/m2) 98 Bảng 4.55 Hiệu lực (%) trừ sâu tơ hại bắp cải thời điểm điều tra 98 Bảng 4.56 Tỉ lệ bị hại (%) bắp cải thời điểm điều tra 98 Bảng 4.57 Mật số sâu xanh da láng hại cải thảo thời điểm điều tra (con/m2) 99 Bảng 4.58 Hiệu lực (%) trừ sâu xanh da láng hại cải thảo thời điểm điều tra 100 Bảng 4.59 Tỉ lệ bị hại (%) cải thảo thời điểm điều tra 100 Bảng 4.60 Các thí nghiệm nhằm thiết lập phương trình tối ưu 102 Bảng 4.61 Bảng phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng yếu tố đến hàm mục tiêu 103 ix Bảng 4.60 Các thí nghiệm nhằm thiết lập phương trình tối ưu Std Thời gian pH Nhiệt độ Mật độ (A) (B) (C) log10.CFU/ml Biến mã hóa +1 24 27 7,57 +1 72 27 7,43 +1 24 27 7,33 +1 72 27 7,38 +1 24 33 7,67 +1 72 33 7,34 +1 24 33 7,24 +1 72 33 7,19 -1 72 7,5 30 7,55 10 -1 72 7,5 30 7,58 11 -1 48 30 8,76 12 -1 48 30 8,45 13 -1 48 7,5 27 8,6 14 48 7,5 30 8,82 15 48 7,5 30 8,88 16 48 7,5 30 8,9 17 48 7,5 30 8,85 18 48 7,5 30 8,89 19 72 30 7,26 20 48 7,5 30 8,87 102 Bảng 4.61 Bảng phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng yếu tố đến hàm mục tiêu Nguồn Phương sai Trung bình df bình phương Giá trị p Giá trị F Prob > F Mơ hình 9.65 1.07 193.34 < 0.0001 A-thời gian 0.049 0.049 8.92 0.0136 B-pH 0.17 0.17 29.92 0.0003 C-nhiệt độ 2.177E-003 2.177E-003 0.39 0.5449 AB 0.021 0.021 3.84 0.0783 AC 0.011 0.011 1.90 0.1985 BC 0.011 0.011 1.90 0.1985 A2 2.93 2.93 529.13 < 0.000 B2 0.096 2.93 17.32 0.0019 C2 0.025 0.025 4.44 0.0613 Có ý nghĩa Chạy chương trình tối ưu hóa phần mềm DX10 với kết từ thí nghiệm thu điều kiện tối ưu cho mật độ vi khuẩn cao là: thời gian (A)= 48 giờ, pH (B) = 7,5 nhiệt độ (C) = 30oC Bảng trình bày kết phân tích phương sai (ANOVA) ảnh hưởng yếu tố đến hàm mục tiêu Kết phân tích phương sai mơ hình hình cho thấy thời gian, nhiệt độ pH yếu tố ảnh hưởng đến mật độ vi khuẩn Giá trị F mơ hình 193.34 ứng với p < 0.0001 p < 0,05 cho thấy mơ hình chọn có ý nghĩa phù hợp với thực nghiệm tiến hành thí nghiệm Nhập kết thực nghiệm vào phần mềm DX10, nhận phương trình hồi quy sau: Y = 8,83 - 0,076A - 0,13B - 0,016C + 0,05AB - 0,036AC - 0,036BC - 1,16A2 - 0,19B2 - 0,11C2 Phương trình có hệ số tương quan R2 = 0,9943 Điều chứng tỏ có mối tương quan chặt chẽ biến đầu đầu vào theo phương trình hồi quy tìm Từ phương trình hồi quy thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến đời sống vi khuẩn thông qua việc tác động đến phản ứng sinh hóa hoạt động tế bào pH môi trường 103 ảnh hưởng đến trình trao đổi chất qua màng tế bào vi khuẩn, thời gian ảnh hưởng đến trình sinh trưởng chủng Bt Thời gian, nhiệt độ pH thấp cao sẽ gây ức chế, kìm hãm trình sinh trưởng Do vậy, thời gian, pH nhiệt độ mơi trường đạt tối ưu hiệu suất trình lên men sẽ đạt tối đa tế bào vi khuẩn điều kiện thuận lợi sẽ tăng trưởng mạnh mẽ Xem xét tương tác cặp yếu tố tới hàm mục tiêu mật độ vi khuẩn thấy qua đồ thị 3D - bề mặt đáp ứng Hình 4.19: Tương tác thời gian pH tới mật độ vi khuẩn chủng TG6.2 Kết khảo sát đồng thời thời gian pH có ảnh hưởng đến khả nhân sinh khối Về mặt thực tế, thu thời gian 48 giờ, pH 7,5 cho mật độ vi khuẩn cao Tuy nhiên, mặt lý thuyết thời gian 47 nồng độ pH 7,3 trình bày hình 4.19 cho mật độ vi khuẩn cao so với mặt thực tế Có thể thấy, mặt thực tế lý thuyết có chênh lệch chấp nhận Kết khảo sát đồng thời thời gian nhiệt độ có ảnh hưởng tới khả nhân sinh khối chủng vi khuẩn, điều kiện thực tế với thời gian 48 nhiệt độ 30oC cho mật độ vi khuẩn cao nhất, mặt lý thuyết với thời gian 47 nhiệt độ 29,9oC trình bày hình 4.20 cho mật độ vi khuẩn với điều kiện thực tế, Điều cho thấy mơ hình chọn phù hợp tiến hành thí nghiệm Kết ảnh hưởng nhiều tương tác đồng thời thời gian nhiệt độ, nhiệt độ vi khuẩn cao sẽ làm cho vi khuẩn chết, sống không thực phản ứng sinh hóa, cịn thời gian q dài làm giảm lượng sinh khối thu 104 Hình 4.20: Tương tác thời gian nhiệt độ tới mật độ vi khuẩn chủng TG6.2 Kết khảo sát ảnh hưởng đến trình nhân sinh khối vi khuẩn, điều kiện thực tế với pH 7,5 nhiệt độ 30oC cho mật độ vi khuẩn cao Tuy nhiên, điều kiện lý thuyết với nồng độ pH 7,3 nhiệt độ 29,9 oC trình bày hình 4.21 khả nhân sinh khối so với điều kiện thực tế Vì nồng độ pH nhiệt độ có ảnh hưởng đến khả nhân sinh khối tương tác đồng thời nên thay đổi nhỏ yếu tố sẽ dẫn đến biến đổi đáng kể lượng sinh khối thu Hình 4.21: Tương tác pH nhiệt độ tới mật độ vi khuẩn chủng TG 6.2 4.8.2 Sản xuất sản phẩm dạng bột hòa tan với nước Sản xuất sản phẩm dạng bột hòa tan theo quy trình thiết lập với dịng vi khuẩn Bt có hiệu lực diệt trùng gây hại đánh giá cao phịng thí nghiệm, nhà lưới, đồng ruộng Qui trình sản xuất sản phẩm sau: 105 Bước1: chuẩn bị giống vi khuẩn cấp Bước2: tăng sinh khối vi khuẩn Bt môi trường T3 Bước 3: tăng sinh khối vi khuẩn Bt môi trường lỏng khảo sát Bước 4: tăng sinh khối vi khuẩn Bt môi trường bán rắn khảo sát Bước 5: sấy khô nghiền vi khuẩn Bước 6: Phối trộn phụ gia kháng UV hòa tan Bước 7: đóng gói chế phẩm Kiểm tra bào tử vi khuẩn tinh thể vi khuẩn Kiểm tra bào tử vi khuẩn tinh thể độc Kiểm tra bào tử vi khuẩn tinh thể vi độc Kiểm tra bào tử vi khuẩn tinh thể độc Kiểm tra bào tử vi khuẩn tinh thể độc Bảo quản sản phẩm, kiểm tra bào tử tinh thể độc Sản phẩm Bt- NLU sản xuất theo qui trình trên, sản xuất sinh khối dịng vi khuẩn Bt (BT9.1, BT10.2, TG6.2, TG5.1) khảo sát, lựa chọn từ thí nghiệm Các dịng vi khuẩn khảo sát điều kiện nhân sinh khối đơn yếu tố phịng thí nghiệm tối ưu hóa qui trình qui mơ 50L để sản xuất dạng bột hòa tan, tạo thành chế phẩm hỗn hợp dịng vi khuẩn Qui trình bao gồm cơng đoạn sau: Bước 1: Chuẩn bị giống vi khuẩn cấp Các ống giống dòng vi khuẩn Bt (BT9.1, BT10.2, TG6.2, TG5.1) không tạp nhiễm, bảo quản nhiệt độ 50C Vi khuẩn cấy chuyền từ ống nghiệm chứa sang ống nghiệm có chứa mơi trường T3-agar, đặt nhiệt độ phòng từ 25 – 280 C, ống giống cấy chuyển khoảng 10-20 ống nghiệm giống cấp 1, lần sản xuất 50Lit sử dụng có ống cấp  Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phịng cấy vơ trùng  Thời gian: ngày 106  Nhân sự: cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật, nắm vững thao tác cấy Bước 2:Tăng sinh khối vi khuẩn môi trường T3 Chuẩn bị môi trường T3 lỏng ( thành phần môi trường: tryptone g, dịch chiết nấm men 1,5 g, tryptose g, MnCl2 0,005 g, Na2HPO4 8,9 g, NaH2PO4 6,9 g, nước cất 1000 ml, pH môi trường 7), hấp 1210C, 1atm thời gian 20 phút, mơi trường để bình tam giác, cấy vi khuẩn Bt vào, lắc thời gian 36 giờ, tiến hành đếm mật số vi khuẩn Bt nhuộm,quan sát bào tử kính hiển vi  Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phịng cấy vơ trùng, máy lắc  Thời gian: ngày  Nhân sự: cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật, nắm vững thao tác cấy Bước 3:Tăng sinh khối vi khuẩn môi trường lỏng khảo sát Chuẩn bị môi trường khảo sát từ nội dung MT3 (glucose, pepton, khoáng) ,mỗi dòng vi khuẩn tăng sinh từ MT T3 cho vào mơi trường lỏng với thành phần glucose, pepton, khống với mật số vi khuẩn 107Cfu/mL với tỷ lệ 1%, lắc với thời gian 48 giờ, nhiệt độ 30-350C, phù hợp với dòng vi khuẩn khảo sát tối ưu hóa qui trình 50L, sau thu dịch lỏng vi khuẩn, đếm bào tử quan sát tinh thể độc  Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phịng cấy vơ trùng, máy lắc, nồi lên men  Thời gian: ngày  Nhân sự: cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật, nắm vững thao tác cấy Bước 4:Tăng sinh khối Bt môi trường bán rắn khảo sát Chuẩn bị môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn Bt mơi trường T3 (glucose, pepton, khống) với mật số vi khuẩn đạt 107 cfu/mL có xuất tinh thể độc khoảng 30- 40% so với bào tử vi khuẩn Môi trường bán rắn khảo sát tối ưu cho dòng vi khuẩn MT6 (cám bắp 30% bột gạo 70%) Cấy giống vi khuẩn Bt từ môi trường lỏng sang môi trường bán rắn có pH 7-8 , độ ẩm 50% với tỷ lệ giống 1%, ủ với thời gian 60 giờ, nhiệt độ từ 35-450C Sau thời gian 12 kiểm tra độ ẩm môi trường bán rắn ủ lần đảo trộn khối ủ Sau 60 ủ vi khuẩn, thu nhận sinh khối bán rắn, đếm mật số khuẩn lạc, kiểm tra bào tử tinh thể độc  Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phịng cấy vơ trùng, phịng ủ  Thời gian: ngày 107  Nhân sự: cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật, nắm vững thao tác cấy Bước 5: Sấy sinh khối vi khuẩn Sinh khối vi khuẩn sau ủ 2,5 ngày đổ khay, khay chứa khoảng kg, bóp tơi sinh khối đưa vào phịng kín, tối, khử trùng tia UV, nhiệt độ phòng khoảng 300C, phơi hong thời gian ngày, sau cho vào tủ sấy thời gian 24 Sau sản phẩm khô với độ ẩm khoảng 15- 20%, sinh khối vi khuẩn khoảng 40-50%  Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phịng cấy vơ trùng, phịng sấy có lắp đèn UV, khay sạch, máy sấy với công suất 20kg/1 lần  Thời gian: ngày  Nhân sự: cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật Bước 6: Nghiền sinh khối vi khuẩn: Sản phẩm vi khuẩn sau sấy khô đưa vào mày nghiền có kích cỡ lưới nghiền 0,5mm với công suất 20 kg/1 Sau nghiền, tiến hành đếm mật số vi khuẩn, nhuộm, quan sát bào tử, tinh thể độc  Điều kiện: Phòng sạch, máy nghiền  Thời gian: 2-4  Nhân sự: lao động kỹ thuật cán kỹ thuật hiểu biết Vi sinh vật Bước 7: Phối trộn phụ gia: Sản phẩm sau sấy sẽ tiến hành phối trộn với chất phụ gia kháng UV TiO2, bột talc, bột cao lanh theo tỷ lệ 40% vi khuẩn, 60% chất phụ gia Mỗi lần trộn vòng 10 phút tạo sản phẩm đồng với may trộn 100 kg/ lần  Điều kiện: Phòng sạch, máy trộn  Thời gian: 2-4  Nhân sự: lao động kỹ thuật Bước 8: Đóng gói chế phẩm Bao bì thành phẩm thiết kế cung cấp công ty, lượng thành phẩm 1kg/1 tú định lượng cân hàng miệng túi máy ép  Điều kiện: Phòng sạch, máy ép miệng bao, máy đóng date, cân định lượng  Thời gian: không hạn định  Nhân sự: lao động phổ thông Bước 9: Bảo quản sản phẩm 108 Sản phẩm sau đóng gói, cho vào thùng để vào kho bào quản nhiệt độ 28-320C, phòng rộng rãi, thống mát, khơng ẩm ướt Khơng tồn trữ hàng tháng nhà kho 4.8.3 Hoàn thiện sản phẩm dạng thương mại Đặt tên thương mại sản phẩm, thiết kế nhãn bao bì theo quy định: dạng bột hòa nước, chứa 109 cfu/g Bacillus thuringiensis phụ gia kháng UV, ẩm độ 60%, bảo tồn tháng, hoạt lực diệt sâu ăn lá, ăn tạp, ăn đạt 80% Sản phẩm đặt tên thương mại Bt – NLU gồm hai dạng sinh khối lỏng sinh khối rắn Theo TCCS 09:2010/BVTV, yêu cầu kỹ thuật sản phẩm đạt sau: Dạng sản phẩm Bt nước: có màu nâu đen, mùi thơm, mật độ bào tử 109 CFU/g, xuất tinh thể độc khoảng 21%, không tạo bọt, pH = hiệu lực diệt sâu tơ khoảng 75 - 80%, sâu khoang sâu xanh da láng khoảng 60-65% phịng thí nghiệm Ngoài đồng ruộng, hiệu lực diệt sâu loại khoảng 60-70% Dạng sản phẩm Bt bột màu trắng xám, hạt mịn hòa tan nước khoảng 80-85%, độ thấm ướt 100% vòng 30 giây khuấy trộn thể tích tạo bọt sau 30 giây khoảng 50 mL, tinh thể độc chiếm 24%, hiệu lực diệt sâu tơ khoảng 75 - 80%, sâu khoang sâu xanh da láng khoảng 60-65% phịng thí nghiệm Ngồi đồng ruộng, hiệu lực diệt sâu loại khoảng 60-70% 109 Hình: Nhãn chế phẩm sinh học BT- NLU dạng sinh khối lỏng Hình: Nhãn chế phẩm sinh học BT- NLU dạng sinh khối bán rắn 110 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận Đã phân lập tồn trữ 2200 dòng vi khuẩn thu thập từ mẫu đất 29 tỉnh thành Việt Nam Đã chọn lọc 350 chủng vi khuẩn Bacillus thuringiensis định danh dựa vào đặc điểm sinh hóa, hình thái tinh thể protein.Trong 350 dịng vi khuẩn có 126 dịng vi khuẩn sinh tinh thể hình thoi, 83 dịng vi khuẩn sinh tinh thể hình oval, 85 dịng vi khuẩn có hình cầu chưa xác định hình dạng tinh thể 75 dòng vi khuẩn Mật độ vi khuẩn Bt dùng để phòng trừ sâu cao 109 CFU/ml với thời gian ngày xử lý, dòng vi khuẩn Bt diệt sâu tơ thu thập Bến tre với hiệu lực diệt sâu 80%, dòng vi khuẩn Bt diệt sâu khoang cao 75%với ngày xử lý thu thập Tiền Giang, dòng vi khuẩn Bt diệt sâu xanh da láng cao 75%với ngày xử lý thu thập Tiền Giang.Các dịng vi khuẩn Bt khơng phịng trừ tuyến trùng Sử dụng cặp mồi Un1, Un2 để phát mẫu Bacillus thuringiensis sinh tinh thể với nhiều hình dạng (hình thoi, hình trịn, hình oval) 22 dòng vi khuẩn Xác định số 10 giống nhận để tiến hành thí nghiệm có diện protein nội độc tố Vip3A là: VP9.1; VP10.1; TG5.1; TG6.2 BT 10.2 Giải trình tự dịng vi khuẩn xác định Bacillus thuringiensis với độ tương đồng 90-99% 4.Xác định điều kiện tăng sinh khối cho mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis môi trường lên men, nhiệt độ 350C, pH 7-8, thời gian 48 , thiết lập từ điều kiện 250 ml – 10 L 5.Xác định điền kiện lên men bán rắn cho mẫu vi khuẩn Bacillus thuringiensis nhiệt độ 350 – 450C, pH -8, thời gian 60 giờ, độ ẩm 50% Chọn phụ gia kháng UV bột talc, bột cao lanh TiO2, phối trộn theo tỷ lệ chế phẩm vi khuẩn 40%, bột talc 30%, bột cao lanh 20%, TiO2 10% 7.Sản phẩm Bt sau phun đất khử trùng với thời gian 90 ngày, đất không khử trùng 45 ngày, phun vào trồng, sẽ tồn lưu đất có trồng với thời gian 60 ngày đất không trồng 30 ngày Chuột thí nghiệm khoẻ mạnh, hoạt động bình thường tiêm trực tiếp dung dịch Bt vào dày chuột với nồng độ 2x109 CFU/Kg thể trọng Như 111 liều gây chết 50% số cá thể chuột thí nghiệm phải lớn 2x109 CFU/Kg (LD50>2x109 CFU/Kg thể trọng) Điều kiện tồn trữ sản phẩm Bt dạng sinh khối lỏng : bảo quản với nhiệt độ lạnh 4-8 0C tháng, với nhiệt độ phòng 28-320C thời gian 4tháng, nhiệt độ trưng bày đại lý 35-400 C, thời gian tháng Điều kiện tồn trữ sản phẩm Bt dạng sinh khối rắn: bảo quản với nhiệt độ lạnh 48 0C tháng, với nhiệt độ phòng 28-320C thời gian tháng, nhiệt độ trưng bày đại lý 35-400 C, thời gian tháng 10 Chế phẩm vi khuẩn Bt thời gian bảo quản có hiệu lực tốt từ 60-70% việc phòng trừ sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh da láng đồng ruộng với ngày phun Đề nghị Tiếp tục chọn lọc mẫu Bacillus thuringiensis có đặc tính phù hợp với định hướng sử dụng phòng trừ bệnh sâu xanh, sâu tơ, sâu khoang Tiếp tục hoàn thiện hệ thống liệu Bacillus thuringiensis đặc biệt định danh tên loài mẫu Bacillus thuringiensis Nghiên cứu tiếp phụ gia kháng UV phụ gia hòa tan để tạo sản phẩm sinh học có hiệu lực dài Sản xuất thử nghiệm dịng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có hiệu lực diệt sâu tốt để tạo sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học 5.Đăng ký sở hữu trí tuệ qui trình sản xuất chế phẩm dạng lỏng dạng bột Đăng ký vào danh mục thuốc bảo vệ thực vật sinh học 112 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Bacillus thuringiensis từ rừng ngập mặn Cần Giờ có hoạt tính diệt sâu Tạp chí Hồ Bảo Quốc 2010 Phân lập chủng Bacillus thuringiensis có khả diệt sâu cánh vảy Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh Khoa học Đại học sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh 51: 49 – 57 La Thị Nga, Nguyễn Minh Dương, Trần Duy Minh, Trương Ba Hùng, Võ Thị Nguyễn Thị Hồi Hà Ngơ Giang Liên 2003 Tuyển chọn chủng Bacillus thuirngiensis có khả diệt sâu tơ sâu xanh Tạp chí KHKT Nông nghiệp 1: 260-263 Nguyễn Quý Hùng, Huỳnh Công Hà, Lã Phạm Lân, Lê Trường 1994 Kết nghiên cứu sâu tơ Plutella maculipennis (curt) thành phố Hồ Chí Minh biện pháp phịng trừ tổng hợp Báo cáo khoa học Bộ môn Bảo vệ thực vật, viện khoa học Nông nghiệp phát triển miền Nam Nguyễn Thiện Phú Trần Thanh Thủy 2013 Phân lập, tuyển chọn chủng Phan Thị Thanh Huyền 2009 Nghiên cứu thành phần sâu bọ cánh vảy hại rau họ hoa thập tự sử dụng chế phẩm sinh học Bitadin WP phịng chống số lồi sâu hại vụ xuân 2009 Hà Nội Luận văn thạc sĩ Nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp Hà Nội Thứ 2003 Đa dạng phân tử Bacillus thuringiensis tỉnh bắc bắc trung Tạp chí Di truyền học ứng dụng 10 Trần Thị Như Phương 2009 Đánh giá LC50 hiệu thuốc Sinetoram spinodad hai dòng sâu tơ Plutella xylostella Đà Lạt Hóc Mơn điều kiện phịng thí nghiệm Khóa luận tốt nghiệp kỹ sư ngành Nơng học, Đại học Nơng Lâm Tp Hồ Chí Minh 11 Võ Thị Thứ Nguyễn Kim Thoa, 2000 Đặc điểm phân loại chủng Bacillus thuringiensis israelensis phân lập Việt Nam Tạp chí Sinh học 22: 53 – 58 113 Tài liệu nước Ammouneh H., HARBA M., Idris E., and Makee H 2011 Isolation and characterization of native Bacillus thuringiensis isolates from Syrian soil and testing of their insecticidal activities against some insect pests Turkish Journal of Agriculture and Forestry 35: 421-431 Aramideh S., Saferalizadeh M.H., Pourmirza A.A., Bari M.R., Keshavarzi M., and Mohseniazar M 2010 Characterization and pathogenic evaluation of Bacillus thuringiensis isolates from West Azerbaijan province-Iran African Journal of Microbiology Research 4: 1224-1229 Ben-Dov, E., Wang, Q., Zaritsky, A., Manasherob, R., Barak, Z., Schneider, B., Khamraev, A., Baizhanov, M., Glupov, V and Margalith, Y 1999 Multiplex PCR Screening to Detect Cry9 Gens in Bacillus thuringiensis Strains.Appl Environ Microbiol., 65: 3714-3716 Ben-Dov, S.E., Zaritsky, A., Dahan, E., Barak, Z., Sinai, R., Manasherob, R., Khamraev, A., Troitskaya, E., Dubitsky, A., Berezina, N and Margalith, Y 1997 Extended Screening by PCR for Seven cry group Gens from Field-collected Strains of Bacillus thuringiensis Appl Environ Microbiol., 63: 4883-4890 Berliner, E 1911 Uber die schluffsucht der Mehlmottenraupe Z Gesamte Getreidewes Berlin 3, 63-70 Bietlot H P., Schernthaner J P., Milne R E., Clairmont F R., Bhella R S., and Kaplan H 1993 Evidence that the CryIA crystal protein from Bacillusthuringiensis is associated with DNA J Biol Chem 268:82408245 Bravo A 1997 Phylogenetic relationships of Bacillus thurigiensis dendotoxin family proteins anh their functional domains J Bacteriol., 179, 2793-2801 Burges H D 2001 Bacillus thuringiensis in Pest Control Pesticide Outlook P 9098 Carlson C R., and Kolst A B 1993 A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 Carlson, C R., and Kolsto, A B 1993 A complete physical map of a Bacillus thuringiensis chromosome J Bacteriol 175:1053-1060 10 Carrozi, N.B., Kramer, V.C., Warren, G.W., Evola, S And Koziel, M.G 1991 Predection of insecticidal activity of Baillus thuringiensis strains by polymerase chain reaction product profiles Appl Environ Microbiol 57, 3057-3061 114 11 Cathliya Promdonkoy 2014 Screening and Cloning of Vegetative insecticidal protein (Vip3A) gene from Bacillus thuringiensis Thai Isolates 12 Crickmore N., Wheeler V.C., Ellar D.J 1994 Use of an operon fusion to induce expression and crystallization of a Bacillus thuringiensis dendotoxin encoded by a cryptic gene Mol Gen Genet 242: 365-368 13 Chicott, C N., Wigley, P J 1993 Insecticidal activity of Bacillus thuringiensis crytal protein Proceedings of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting P 43-52 14 Chilcott C.N., and Wigley P.J 1993 Isolation and toxicity of Bacillus thuringiensis from soil and insect habitats in New Zealand Journal of Invertebrate Pathology 61: 244-247 15 DeLucca II A.J., Simonson J.G., and Larson A.D 1981 Bacillus thuringiensis distribution in soils of the United States Canadian Journal of Microbiology 27: 865-870 16 Devendra J., Sumita K., Jain R., Kothari S L 2012 PCR based detection of cry genes in indigenous strains of Bacillus thuringiensis isolated from the soils of Rajasthan Indian Joural Of Biotechnology Vol 11, Octorber 2012, pp 491-494 17 El-kersh T.A., Al-sheikh Y.A., Al-akeel R.A., and Alsayed A.A 2014 Isolation and characterization of native Bacillus thuringiensis isolates from Saudi Arabia African Journal of Biotechnology 11: 1924-1938 18 Martin P.A., and Travers R.S 1989 Worldwide abundance and distribution of Bacillus thuringiensis isolates Applied and Environmental Microbiology 55: 2437-2442 19 Palma L., Hernández-Rodríguez C.S., Maeztu M., Hernández-Martínez P., de Escudero I.R., Escriche B and Caballero P 2012 Vip3C, a novel class of vegetative insecticidal proteins from Bacillus thuringiensis Applied and environmental microbiology 78: 7163-7165 20 Ramalakshmi A., and Udayasuriyan V 2010 Diversity of Bacillus thuringiensis isolated from western ghats of Tamil Nadu state, India Current microbiology 61: 13-18 21 Rampersad J., and Ammons D 2005 A Bacillus thuringiensis isolation method utilizing a novel stain, low selection and high throughput produced atypical 115 results BMC microbiology 5: 22 Renganathan K., Rathinam X., Danial M., and Subramaniam S 2011 Quick isolation and characterization of novel Bacillus thuringiensis strains from mosquito breeding sites in Malaysia Emirates Journal of Food and Agriculture 23: 17 23 Sanahuja G., Banakar R., Twyman R.M., Capell T., and Christou P 2011 Bacillus thuringiensis: a century of research, development and commercial applications Plant biotechnology journal 283-300 24 Santana M.A., Moccia-V C.C., and Gillis A.E 2008 Bacillus thuringiensis improved isolation methodology from soil samples Journal of microbiological methods 75: 357-358 25 Sharif F.A., and Alaeddinoĝlu N.G 1988 A rapid and simple method for staining of the crystal protein of Bacillus thuringiensis Journal of industrial microbiology 3: 227-229 26 Travers R.S., Martin P.A., and Reichelderfer C.F 1987 Selective process for efficient isolation of soil Bacillus spp Applied and Environmental Microbiology 53: 1263-1266 27 Yu X., Zheng A., Zhu J., Wang S., Wang L., Deng Q., and Li P 2011 Characterization of vegetative insecticidal protein vip genes of Bacillus thuringiensis from Sichuan Basin in China Current microbiology 62: 752-757 Tài liệu internet https://www.tes.com/lessons/hz83FaqoPAZbbw/gmos https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi .https://www.researchgate.net/publication/268221340_Using_cry4 http://www.slideshare.net/HngV18/ch-phm-bt-33592888 116