(Luận văn thạc sĩ) hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn serratia marcescens HB

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP Hồ Chí Minh, năm 2018 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CƠNG NGHỆ TP.HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỒN THIỆN QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM DIỆT SÂU TỪ DỊCH NUÔI CẤY VI KHUẨN Serratia marcescens HB CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngành: Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hƣớng dẫn : TS NGUYỄN HOÀI HƢƠNG Sinh viên thực : HỒ TRUNG LỘC MSSV: 1411100591 Lớp: 14DSH03 TP Hồ Chí Minh, năm 2018 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Đồ án tốt nghiệp cơng trình nghiên cứu thân dƣới hƣớng dẫn khoa học TS Nguyễn Hoài Hƣơng (Giảng viên Viện Khoa Học Ứng Dụng HUTECH, trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM) Các số liệu, kết nêu đồ án trung thực chƣa đƣợc công bố cơng trình khác Tơi xin chịu trách nhiệm khóa luận tốt nghiệp TP.HCM, ngày 27 tháng năm 2018 Sinh viên thực HỒ TRUNG LỘC Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời nuôi nấng dạy dỗ 22 năm qua, ngƣời trải qua biết khó khăn sống ln quan tâm con, chăm sóc con, ln bên cạnh lúc khó khăn Con xin cảm ơn gia đình ông bà nội ngoại Đặc biệt bà nội, bà ngoại, ba, cô bảy cậu mợ mƣời suốt năm qua tạo điều kiện thuận lợi tốt để đƣợc bƣớc vào giảng đƣờng đại học với tâm thoải mái Em xin cảm ơn quý thấy cô Viện Khoa học Ứng Dụng HUTECH thầy cô giảng viên trƣờng tận tâm dạy bảo truyền đạt kiến thức cho em suốt năm đại học Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành sâu sắc đến Nguyễn Hồi Hƣơng, ngƣời thầy đầy nhiệt huyết, ln định hƣớng cung cấp kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em xuyên suốt q trình thực tốt khóa luận tốt nghiệp Em xin chân thành cảm ơn cô Nguyễn Thị Hai, ngƣời cho em lời khuyên trình ni sâu khoang thí nghiệm cung cấp trứng sâu cho em Em xin chân thành cảm ơn thầy Phạm Minh Nhựt, chị Huỳnh Ngọc Nhi cho em vật liệu thử nghiệm để em tiến hành thí nghiệm khảo sát Em xin chân thành biết ơn anh Trƣơng Hoài Nguyên, anh Nguyễn Phƣớc Sinh, anh Phạm Hoàng Nhân, chị Cao Thị Thanh Thúy truyền đạt cho em kinh nghiệm, lời khuyên bổ ích suốt trình thực đề tài Và em xin cảm ơn tất bạn đồng nghiệp Lê Đình Nhân, Nguyễn Mộng Trâm, Đặng Thị Kim Tuyền, Đào Đặng Phƣơng Dung, Đinh Ngọc Phƣơng Trinh, Võ Lan Hƣơng, Võ Thành Lâm hai em Võ Đình Chiến Nguyễn Đăng Thùy Dƣơng đồng hành giúp đỡ em suốt thời gian qua TP.HCM, ngày 27 tháng 07 năm 2018 HỒ TRUNG LỘC Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT vi DANH MỤC HÌNH ẢNH vii DANH MỤC CÁC BẢNG i MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục đích nghiên cứu: Nhiệm vụ nghiên cứu: Phƣơng pháp nghiên cứu Kết cần đạt đƣợc CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu thuốc trừ sâu sinh học 1.1.1 Khái niệm thuốc trừ sâu sinh học 1.1.2 Những sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học thị trƣờng .3 1.1.3 Những ƣu điểm hạn chế thuốc trừ sâu sinh học 1.2 Giới thiệu vi khuẩn Serratia marcescens 1.2.1 Lịch sử phát 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Đặc điểm Serratia marcescens 1.2.3 Đặc điểm sinh lí Đồ án tốt nghiệp 1.2.4 Đặc điểm sinh hóa 1.2.5 Đặc điểm phân bố 1.3 Giới thiệu Prodigiosin 10 1.3.1 Khái niệm vê Prodigiosin 10 1.3.2 Cấu trúc đặc điểm Prodigiosin 10 1.3.3 Hoạt tính sinh học prodigiosin 13 1.3.4 Cơ chế sinh tổng hợp prodigiosin Serratia marcescens 13 1.4 Enzyme 17 1.5.Yếu tố độc lực Serratia marcescens 17 1.6 Khả diệt sâu vi khuẩn Serratia marcescens 18 1.7 Một số nghiên cứu giới 20 1.7.1 Tình hình nghiên cứu Serratia marcescens 20 1.7.2 Tình hình nghiên cứu Prodigiosin 21 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG, PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 Thời gian, địa điểm nghiên cứu 22 2.1.1 Thời gian 22 2.1.2 Địa điểm 22 2.2 Vật liệu, hóa chất, thiết bị 22 2.2.1 Nguồn vi khuẩn Serratia marcescens 22 2.2.2 Nguồn nấm 22 2.2.3 Nguồn sâu khoang Spodoptera litura 22 2.2.4 Mơi trƣờng ni cấy hóa chất 22 2.2.5 Dụng cụ, thiết bị 23 ii Đồ án tốt nghiệp 2.3 Mục tiêu nghiên cứu 24 2.4 Nội dung nghiên cứu 24 2.5 Phƣơng pháp thí nghiệm 24 2.5.1 Phƣơng pháp luận 24 2.5.2 Bố trí thí nghiệm 27 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu bố trí thí nghiệm 29 2.6.1 Phƣơng pháp chọn lọc chủng seratia marcescens có khả tổng hợp prodigiosin enzyme ngoại bào Protease mạnh 30 2.6.1.1 Phƣơng pháp định tính enzyme 30 2.6.1.2 Phƣơng pháp trích ly thu Prodigiosin 31 2.6.2 Khảo sát phƣơng pháp diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu 33 2.6.2.1 Phƣơng pháp xử lý tế bào acid 33 2.6.2.2 Phƣơng pháp xử lý nhiệt 33 2.6.2.3 Phƣơng pháp xử lý tế bào Formalin 34 2.6.3 Phƣơng pháp định tính enzyme dịch nuôi cấy sau xử lý tế bào 34 2.6.4 Phƣơng pháp khảo sát ảnh hƣởng tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiêu lực diệt sâu chế phẩm công thức phụ gia 37 2.6.4.1 Tỷ lệ chất phụ gia chế phẩm 37 2.6.4.2 Khảo sát hiệu lực diệt sâu khoang phƣơng pháp quét 38 2.6.6 Phƣơng pháp khảo sát khả kháng nấm 40 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 43 iii Đồ án tốt nghiệp 3.1.Chọn lọc chủng vi khuẩn Serratia marcescens sinh tổng hợp enzyme ngoại bào prodigiosin cao 43 3.1.1 Khả tiết enzyme ngoại bào 43 3.1.2 Trích ly thu prodigiosin 45 3.1.3 So sánh hình thái chủng SH1 HB 47 3.2 Kết khảo sát phƣơng pháp tiêu diệt tế bào vi khuẩn Serratia marcescens hiệu 50 3.2.1 Phƣơng pháp xử lý acid 51 3.2.2 Phƣơng pháp xử lý nhiệt 52 3.2.3 Phƣơng pháp xử lý tiêu diệt tế bào dung dịch Formalin 54 3.3 Kết khảo sát hoạt tính enzyme ngoại bào dịch ni cấy Serratia marcescens HB sau xử lý tế bào 57 3.3.1 Thử nghiệm hoạt tính protease 57 3.3.2 Thử nghiệm hoạt tính Chitinase 57 3.5 Khả ảnh hƣởng tia UV từ ánh sáng mặt trời đến hiệu lực diệt sâu chế phẩm nồng độ phụ gia 59 3.6 Kết khảo sát khả kháng nấm có lợi 62 3.8 Quy trình sản xuất chế phẩm chứa dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB …64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 66 4.1 Kết luận 66 4.2 Kiến nghị 66 Tài liệu tiếng Việt 67 iv Đồ án tốt nghiệp Tài liệu nƣớc 68 PHỤ LỤC A THÀNH PHẦN CÁC MÔI TRƢỜNG 72 PHỤ LỤC B HÌNH ẢNH 75 PHỤ LỤC C: BIỂU ĐỒ 82 PHỤ LỤC D: SỐ LIỆU THỐNG KÊ 84 v Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT EPN : Tuyến trùng ký sinh gây bệnh côn trùng (viết tắt tên tiếng Anh: Entomopathogenic nematodes) H-CP16 : Heterorhabditis indica CP16 A.nauplii : Artemia nauplii S.marcescens: Serratia marcescens SH1 : Serratia marcescens SH1 SH4 : Serratia marcescens SH4 SH5 : Serratia marcescens SH5 SB :Serratia marcescens SB HB :Serratia marcescens HB PG :Môi trƣờng Peptone glycerol PGA :Môi trƣờng Peptone glycerol agar CMC :Carboxymethyl cellulose vi Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N NTHUC A A 98.30 0.75%for A A 90.19 0.125%fo B 53.34 1%formol `PROTEASE CON LAI SAU XU LY FORMOL` The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 16LAN 2LAN 32LAN 4LAN 64LAN 8LAN VKSONG ÐC LANPHALOANG Number of Observations Read 24 Number of Observations Used 21 `PROTEASE CON LAI SAU XU LY FORMOL The ANOVA Procedure Dependent Variable: PROTEASE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 561.2380952 93.5396825 Error 14 44.0000000 3.1428571 Corrected Total 20 605.2380952 29.76 F 561.2380952 90 93.5396825 29.76 F Model 278.5714286 46.4285714 Error 14 104.0000000 7.4285714 Corrected Total 20 382.5714286 6.25 0.0023 R-Square Coeff Var Root MSE CHITINASE Mean 0.728155 Source 26.87153 DF LANPHALOANG 2.725541 10.14286 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 278.5714286 46.4285714 6.25 0.0023 `CHITINASE CON LAI SAU XU LY FORMOL` The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for CHITINASE Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 92 14 7.428571 2.14479 4.773 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N LANPHALOANG A 15.333 VKSONG A A 14.333 2LAN A B A 12.667 4LAN B C 8.667 8LAN B C B C B 8.000 16LAN C C 6.667 32LAN C C 5.333 64LAN `TI LE UC CHE NAM PAECILOMYCES LILACINUS` The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values NONGDO 10^4 DACONIL Number of Observations Read Number of Observations Used `TI LE UC CHE NÁM PAECILOMYCES LILACINUS` The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEUCCHE Source Model DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 8766.953372 93 8766.953372 133.53 0.0003 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Error 262.618745 Corrected Total 9029.572118 65.654686 R-Square Coeff Var Root MSE TILEUCCHE Mean 0.970916 Source 13.11659 DF NONGDO 8.102758 61.77489 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 8766.953372 8766.953372 133.53 0.0003 `TI LE UC CHE NAM PAECILOMYCES LILACINUS` The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for TILEUCCHE Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t 65.65469 2.77645 Least Significant Difference 18.369 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A B Mean N NONGDO 100.000 DACONIL 23.550 10^4 94 Đồ án tốt nghiệp `TI LE UC CHE NAM TRICHODERMA SP.` The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 10^4 DACONIL NONGDO Number of Observations Read Number of Observations Used `TI LE UC CHE NAM TRICHODERMA SP.` The ANOVA Procedure Dependent Variable: TILEUCCHE Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 12739.74946 Error 12.17108 Corrected Total 12751.92054 12739.74946 4186.89 F 12739.74946 12739.74946 4186.89 F Model 579.166667 115.833333 Error 12 833.333333 69.444444 Corrected Total 17 1412.500000 1.67 0.2166 R-Square Coeff Var Root MSE tlchet24 Mean 0.410029 Source ctphugia DF 58.82353 8.333333 14.16667 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 579.1666667 115.8333333 96 1.67 0.2166 Đồ án tốt nghiệp TY LE SAU CHET SAU 24H’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tlchet24 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 Alpha 12 Error Degrees of Freedom 69.44444 Error Mean Square 2.17881 Critical Value of t Least Significant Difference 14.825 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N ctphugia 21.667 Reasgant 16.667 CT1 16.667 CT5 16.667 CT4 8.333 CT3 5.000 CT2 A B A B A B A B A B A B A B A B B ‘TY LE SAU CHET SAU 48H’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values 97 Đồ án tốt nghiệp Class Level Information Class Levels Values CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 DC Reasgant ctphugia Number of Observations Read 21 Number of Observations Used 18 ‘TY LE SAU CHET SAU 48H’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tlchet48 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 3740.000000 748.000000 Error 12 1156.000000 96.333333 Corrected Total 17 4896.000000 7.76 0.0018 R-Square Coeff Var Root MSE tlchet48 Mean 0.763889 Source ctphugia DF 30.04578 9.814955 32.66667 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 3740.000000 748.000000 7.76 0.0018 ‘TY LE SAU CHET SAU 48H’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tlchet48 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 Alpha Error Degrees of Freedom Error Mean Square Critical Value of t Least Significant Difference 98 12 96.33333 2.17881 17.461 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping Mean N ctphugia A 54.333 Reasgant A A 50.000 CT5 B 28.333 CT4 B B 25.000 CT2 B B 23.333 CT1 B B 15.000 CT3 ‘TY LE SAU CHET SAU 72H’ The ANOVA Procedure Class Level Information Class Levels Values CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 DC Reasgant ctphugia Number of Observations Read 21 Number of Observations Used 18 ‘TY LE SAU CHET SAU 72H’ The ANOVA Procedure Dependent Variable: tlchet72 Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F Model 6210.277778 1242.055556 Error 12 850.666667 70.888889 Corrected Total 17 7060.944444 99 17.52 F 6210.277778 1242.055556 17.52 F Model 7140.277778 1428.055556 Error 12 566.666667 47.222222 Corrected Total 17 7706.944444 30.24 F 7140.277778 1428.055556 30.24 F 2444.444444 102 488.888889 9.78 0.0007 Đồ án tốt nghiệp Source DF Sum of Squares Mean Square F Value Pr > F 12 600.000000 Corrected Total 17 3044.444444 Error 50.000000 R-Square Coeff Var Root MSE tlchet120 Mean 0.802920 Source ctphugia 8.373633 DF 7.071068 84.44444 Anova SS Mean Square F Value Pr > F 2444.444444 488.888889 9.78 0.0007 ‘TY LE SAU CHET SAU 120H’ The ANOVA Procedure t Tests (LSD) for tlchet120 Note: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise error rate 0.05 Alpha Error Degrees of Freedom 12 Error Mean Square 50 2.17881 Critical Value of t Least Significant Difference 12.579 Means with the same letter are not significantly different t Grouping A Mean N ctphugia 100.000 CT5 A 100.000 Reasgant B 83.333 CT4 76.667 CT3 A B C B 103 Đồ án tốt nghiệp Means with the same letter are not significantly different t Grouping C B C B Mean N ctphugia 76.667 CT1 70.000 CT2 C C 104 ... 2.3 Mục tiêu nghiên cứu Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch ni cấy vi khuẩn Serratia marcescens HB 2.4 Nội dung nghiên cứu Chọn chủng vi khuẩn Serratia marcescens có khả tổng... chƣa hoàn thiện đƣợc sản phẩm thuốc trừ sâu sinh học Dựa sở mà ngƣời thực đề tài chọn hƣớng cho Đồ án tốt nghiệp là: ? ?Hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch ni cấy vi khuẩn Serratia. .. trƣớc đó, để hồn thiện quy trình sản xuất chế phẩm diệt sâu từ dịch nuôi cấy vi khuẩn Serratia marcescens bao gôm nội dung sau: Từ sƣu tập chủng Serratia marcescens đƣợc phân lập từ tuyến trùng