Tài liệu được đánh giá cao và trình bày cụ thể rõ ràng ở các chương Chọn lọc giống vi sinh vật, Tinh chế enzyme amylase bằng alginate, Tạo dòng biểu hiện protein tái tổ hợp, Tinh chế protein tái tổ hợp.
BÁO CÁO THỰC TẬP CÔNG NGHỆ SINH HỌC DƯỢC Thành phố Hồ Chí Minh, năm 2022 LỜI MỞ ĐẦU Báo cáo môn học Công nghệ sinh học Dược gồm thực tập liên quan đến quy trình, kỹ thuật sinh học có vai trị quan trọng môn học, định hướng chuyên ngành sau sinh viên Dược Gồm lĩnh vực phân lập, phát vi sinh vật có tiềm chọn lọc giống vi sinh vật, kỹ thuật tinh chế enzyme alginate, có khả chuyển gene để tạo dòng biểu protein tái tổ hợp E.coli tinh chế protein tái tổ hợp, buổi thực tập tiến hành quy trình thí nghiệm từ đơn giản đến phức tạp Báo cáo gồm phần TỔNG QUAN – MỤC ĐÍCH trình bày khái quát, đặt vấn đề liên quan đến buổi học, mục đích trả lời cho câu hỏi phải tiến hành thí nghiệm Phần VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP trình bày dụng cụ hóa chất cần thiết, nguyên tắc, phương pháp tiến hành thu thập xử lý số liệu KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU trình bày hình ảnh trực quan số liệu thơ thu từ thí nghiệm xử lý tính tốn theo phương pháp trình bày phần Các kết thu đánh giá trình bày phần BÀN LUẬN, giải thích sai sót trình bày cách khắc phục có Cuối phần KẾT LUẬN để tổng kết lại thí nghiệm, thí nghiệm làm ý nghĩa học Bên cạnh học chính, kỹ thuật cịn ơn tập thực hành chun nghiệp từ môn vi sinh học môn học trước Nắm thao tác trải đĩa, chuẩn bị môi trường, nuôi cấy thu vi sinh vật Biết cách pha lỗng dung dịch, tính nồng độ tính tốn xử lý số liệu Thơng thạo sử dụng số thiết bị phổ biến phịng thí nghiệm máy lắc, tủ ủ, máy sốc nhiệt, máy ly tâm… Ngoài ra, kỹ thuật sắc ký đại áp dụng vào để tiến hành trình tinh chế, chọn lọc protein Trang MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU DANH MỤC BẢNG BIỂU DANH MỤC HÌNH ẢNH A CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT B TINH CHẾ ENZYME AMYLASE BẰNG ALGINATE ….16 C TẠO DÒNG BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRONG E coli 25 D TINH CHẾ PROTEIN TÁI TỔ HỢP 32 DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng A Danh sách vật liệu sử dụng nghiên cứu Bảng B Danh sách vật liệu sử dụng nghiên cứu 17 Bảng B Phương pháp pha dung dịch ống thử ống chứng 19 Bảng B Phương pháp pha giải mẫu xác định đường chuẩn tính hoạt động amylase 20 Bảng B Kết đo OD ống thử ống chứng thí nghiệm 21 Bảng B Kết đo OD giải mẫu xác định đường chuẩn 22 Bảng C Danh sách vật liệu sử dụng nghiên cứu 27 Bảng D Danh sách vật liệu sử dụng nghiên cứu 34 Bảng D Số liệu kết tính tốn thơng số thí nghiệm 38 DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình A Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả sinh amylase .8 Hình A Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả sinh protease .8 Hình A Sơ đồ phương pháp phát vi sinh vật có khả sinh kháng sinh Hình A Kết thí nghiệm khả sinh amylase ngoại bào 10 Hình A Kết thí nghiệm khả sinh protease ngoại bào 10 Hình A Kết thí nghiệm vi sinh vật có khả sinh kháng sinh 11 Hình A Sơ đồ phương pháp giữ giống thạch .14 Hình A Sơ đồ phương pháp giữ giống cát 14 Hình B Sơ đồ phương pháp thu enzyme thô 16 Hình B Sơ đồ phương pháp tinh chế enzyme thô .17 Hình B Sơ đồ phương pháp xác định hàm lượng protein OD280 .17 Hình B Biểu đồ đường chuẩn biểu thị khối lượng tinh bột bị thủy phân 21 Hình C Cấu trúc vector pET28b+ 25 Hình C Cấu trúc E coli BL21(DE3) tương tác với vector pET28b(+) 25 Hình C Sơ đồ phương pháp tách plasmid sử dụng spin column 27 Hình C Sơ đồ phương pháp biến nạp plasmid vào E coli 27 Hình C Sơ đồ phương pháp nuôi cấy cảm ứng biểu protein mục tiêu 27 Hình C Kết cấy E coli biến nạp plasmid đĩa thạch .28 Hình C Kết cảm ứng biểu protein 28 Hình D Cơ chế sắc ký lực kim loại (IMAC) 31 Hình D Sơ đồ phương pháp chuẩn bị cột 35 Hình D Sơ đồ phương pháp phá tế bào 35 Hình D Sơ đồ phương pháp tinh chế protein His-tag 36 A CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT I TỔNG QUAN – MỤC ĐÍCH Tổng quan nghiên cứu Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật trình tiến hành phân lập vi sinh vật từ tự nhiên, gây đột biến, phân lập phát dòng với đặc tính mong muốn, khả kháng khuẩn lưu trữ, bảo quản giống Trong thực tập chọn lọc giống vi sinh vật gồm thí nghiệm: - Thí nghiệm 1: Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme (amylase ngoại bào, protease ngoại bào) Thời gian theo dõi 24h, khảo sát hoạt tính sinh enzyme vi sinh vật dựa vào đường kính vịng phân giải - Thí nghiệm 2: Phát vi sinh vật có khả sinh kháng sinh Thời gian theo dõi 18h, ghi nhận kết dựa vào đường kính vùng ức chế xung quanh lỗ thạch Mục đích nghiên cứu - Phân lập phát dòng vi sinh vật với đặc tính mong muốn (khả sinh protease, amylase ngoại bào) - Xác định nghiên cứu khả kháng khuẩn chủng vi sinh vật - Lưu trữ bảo quản giống vi sinh vật II VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP Vật liệu nghiên cứu STT Vật liệu sử dụng Nghiên cứu sử dụng Ghi Đĩa Petri [1] [2] [3] Eppendorf [1] [2] [3] Micropipette [1] [2] [3] Ống nghiệm [1] [2] Tăm cấy [3] Dụng cụ đục lỗ [3] Mẫu đất Các chủng Bacillus [3] Chủng E coli [3] phát vi sinh vật có khả 10 Agar [1] [2] [3] sinh protease ngoại 11 Nước cất [1] [2] [3] bào 12 Môi trường TSA [1] [2] [3] 13 Môi trường TSB [3] [3] Phân lập phát 14 Đệm PBS [1] [2] vi sinh vật có khả 15 Tinh bột [1] 16 Lugol [1] 17 Gelatin [2] 18 TCA 50% [2] [1] [2] [1] Nghiên cứu phân lập phát vi sinh vật có khả sinh amylase ngoại bào [2] Nghiên cứu phân lập sinh kháng sinh Bảng A Danh sách vật liệu sử dụng nghiên cứu Phương pháp nghiên cứu 2.1 Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme Amylase ngoại bào Phương pháp tiến hành: Hình A Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả sinh amylase Phát hiện: Mơi trường chuyển thành màu tím than tinh bột hấp phụ iod Nếu mẫu đất có chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme amylase ngoại bào xung quanh khuẩn lạc có vịng sáng – tinh bột vị trí bị thủy phân amylase Đường kính vịng sáng tỷ lệ thuận với hoạt tính enzyme Protease ngoại bào Phương pháp tiến hành: Hình A Sơ đồ phương pháp phân lập chủng vi sinh vật có khả sinh protease Phát hiện: Môi trường trở nên đục gelatin kết tủa với TCA Nếu mẫu đất có chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme protease ngoại bào xung quanh khuẩn lạc có vịng sáng – gelatin vị trí bị thủy phân protease Đường kính vịng sáng tỷ lệ thuận với hoạt tính enzyme 2.2 Phát vi sinh vật có khả sinh kháng sinh Hình A Sơ đồ phương pháp phát vi sinh vật có khả sinh kháng sinh Phương pháp tiến hành: Phương pháp phân tích kết quả: Trên bề mặt đĩa thạch đục E coli sinh trưởng Nếu chủng B1, B2, B3, B4 có khả sinh kháng sinh xung quanh lỗ cấy có vòng suốt – kháng sinh tiết ức chế sinh trưởng E coli Đường kính vịng sáng tỷ lệ thuận với hoạt tính kháng sinh III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme 1.1 Amylase ngoại bào Hình A Kết thí nghiệm khả sinh amylase ngoại bào 1.2 Protease ngoại bào Hình A Kết thí nghiệm khả sinh protease ngoại bào