Thí nghiệm công nghệ sinh học dược báo cáo CUỐI kì sản xuất enzyme amylase bằng e coli tái tổ hợp

TRƯỜNG ĐẠI HỌC TƠN ĐỨC THẮNG Khoa Dược Thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Dược BÁO CÁO CUỐI KÌ GVHD: TS Lê Bảo TS Lê Thùy Hương Sinh viên thực hiện: Nguyễn Thúy Thanh – H1900167 Nguyễn Quốc Tựu – H1800350 Lê Kim Nhi – H1900126 Cù Thị Hoàng Yến – H1900222 Bùi Nguyễn Thanh Ngân - H1900289 Nguyễn Ngọc Kim Ngân - H1900290 Lê Ngọc Phương Linh - H1900282 Phạm Thị Ngọc Mỹ - H1900233 Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 12, năm 2021 Mục lục Tóm tắt Giới thiệu Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme 1.1.1 Vật liệu 1.1.2 Thực 1.1.3 Kết thí nghiệm Nhận xét .11 1.2 Kháng sinh 11 1.2.1 Vật liệu 11 1.2.2 Thực 12 1.2.3 Kết thí nghiệm 12 Tinh chế enzym Amylase Alginat 13 2.1 Nguyên vật liệu .13 2.2 Tiến hành 13 2.2.1 Thu enzym thô 13 2.2.2 Tinh chế enzym thô .14 2.2.3 Xác định hàm lượng protein OD280 14 Tạo dòng biểu protein tái tổ hợp E coli 15 3.1 Tách Plasmid dùng Spin Column .15 3.1.1 Vật liệu 15 3.1.2 Thực 15 3.2 Biến nạp plasmid vào E coli .16 3.2.1 Vật liệu 16 3.2.2 Thực 16 3.2.3 Nhận xét 21 3.3 Lưu dịng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp 21 3.3.1 Vật liệu 21 3.3.2 Thực 21 3.3.3 Nhận xét 22 3.4 Nuôi cấy cảm ứng biểu protein mục tiêu .22 3.4.1 Vật liệu 22 3.4.2 Thực 23 3.4.3 Nhận xét 25 Tinh chế protein tái tổ hợp .25 4.1 Khái quát nguyên tắc sắc ký lực 25 4.2 Sắc ký lực ion kim loại – IMAC 25 4.2.1 Vật liệu chuẩn bị 25 4.2.2 Chuẩn bị cột 26 4.2.3 Phá tế bào .26 4.2.4 Tinh chế protein His-tag 27 4.2.5 Xác định hàm lượng protein 27 Kết luận 29 Tóm tắt Vấn đề nghiên cứu: “Sản xuất enzyme amylase E coli tái tổ hợp”, thực phòng thí nghiệm vi sinh Đại học Tơn Đức Thắng TP.HCM 18/12/2021- 19/12/2021 Với mục tiêu nghiên cứu: nắm rõ giai đoạn trình chọn lọc giống vi sinh vật, bước tiến hành tạo dòng biểu protein, quy trình tinh chế amylase, biết cách tính tốn thơng số q trình tinh chế protein, hiểu nguyên tắc sắc ký lực trình thực hành tinh chế protein sắc ký lực với Ni-sepharose, GST-sepharose Giới thiệu Chọn lọc giống vi sinh vật phương pháp phân lập phát chủng vi sinh vật có đặc tính mong muốn từ mẫu vi sinh vật hỗn hợp, sau cải tạo chủng ni cấy bảo quản chúng mơi trường thích hợp Việc chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm bước: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, bảo quản giống Để phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn, ta dựa vào chất chuyển hoá tạo tạo kháng sinh hay tiết sắc tố enzyme ngoại bào tác động lên chất môi trường: amylase – tinh bột, protease – gelatin Chỉ có chất đất sinh chất đối kháng với chủng kiểm định, có tính chất kháng sinh sau ni tạo vùng ức chế đặc hiệu đĩa thạch Tinh chế enzyme amylase alginate thực gel alginate Phương pháp tinh chế phương pháp cố định enzyme, theo chế hấp phụ, amylase xem alginat chất nên bám lên bề mặt hạt gel, lọc lấy amylase dễ dàng Xác định hàm lượng protein (cơ chất enzyme) cách đo độ hấp thu OD 280 Xác định hoạt tính amylase thực phương pháp Heinkel Hoạt độ amylase tính lượng tinh bột bị phân giải dựa mức giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với thuốc thử Iod Sau tinh chế protein sắc ký lực theo nguyên tắc dựa vào gắn thuận nghịch nhóm chức protein với nhóm chức pha tĩnh sắc ký Chỉ protein đích mang nhóm chức đặc hiệu gắn vào pha tĩnh Chọn lọc giống vi sinh vật 1.1 Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme 1.1.1 Vật liệu  Thuốc thử TCA 50%  Dung dịch Lugol  Thạch tinh bột  Thạch Gelatin  Đệm PBS 1.1.2 Thực  Cho vào 1g mẫu đất 10 μL đệm PBS  Vortex để phân tán vi sinh vật vào đệm Để khoảng 15 phút cho đất lắng xuống đáy  Pha loãng dịch huyền phù vi sinh vật cấp 10, đánh số ống từ đến  Hút 100 μL huyền phù vi sinh vật pha loãng, trải lên môi trường phát ống 4, Ủ nhiệt độ 37oC/ 24 nhằm phân lập chủng vi khuẩn có khả sinh enzyme amylase, protease đĩa thạch tinh bột đĩa thạch gelatin Phân lập phát vi sinh vật mẫu đất có khả tiết amylase ngoại bào  Môi trường phân lập: tinh bột  Thuốc thử: dung dịch Lugol Phân lập phát vi sinh vật mẫu đất có khả tiết protease ngoại bào  Môi trường phân lập: thạch gelatin  Thuốc thử: TCA 50% 1.1.3 Kết thí nghiệm 1.1.3.1 Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme Protease ngoại bào (a) (b) (c) Hình 1.1 (a) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào trước nhỏ TCA 50% ống 4; (b) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào trước nhỏ TCA 50% ống 5; (c) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào trước nhỏ TCA 50% ống 6 (a) (b) (c) Hình 1.2 (a) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào sau nhỏ TCA 50% ống 4; (b) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào sau nhỏ TCA 50% ống 5; (c) Đĩa phân lập phát khả sinh protease ngoại bào sau nhỏ TCA 50% ống Bảng Kết phân lập phát vi sinh vật có khả tiết protease ngoại bào TT Mô tả Khả sinh protease ngoại bào Khóm màu vàng nhạt đường kính khoảng 0,3 cm Có Khơng thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không Không thấy vi sinh vật tiết protease ngoại bào Không Nhận xét Chủng vi sinh vật mẫu đất sau phân lập môi trường thạch gelatin ủ 37 oC 24 có khả tiết protease ngoại bào ống (xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vòng sáng, gelatin bị thuỷ phân nên khơng bị tủa) Sau nhỏ TCA 50% có mơi trường tạo vịng sáng quanh chỗ vi sinh vật mọc 1.1.3.2 Phân lập phát vi sinh vật có khả sinh enzyme Amylase ngoại bào (a) (b) (c) Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào trước nhỏ dung dịch Lugol ống 4; (b) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào trước nhỏ dung dịch Lugol ống 5; (c) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào trước nhỏ dung dịch Lugol ống (a) (b) (c) Hình 1.3 (a) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào sau nhỏ dung dịch Lugol ống 4; (b) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào sau nhỏ dung dịch Lugol ống 5; (c) Đĩa phân lập phát khả sinh amylase ngoại bào sau nhỏ dung dịch Lugol ống 10 = 1289 Hoạt tính riêng enzyme tinh: HTR = HTC / lượng protein (U/A280nm) = 136.2 Hiệu suất cố định: HS = HTCenzyme tinh/HTCenzyme thô Mức tinh chế: HTRenzyme tinh/HTRenzyme thô HT (U/ml) = (Acontrol-Asample) / (A/mgStarch x 15 phút x 0.1 ml) Tạo dòng biểu protein tái tổ hợp E coli 3.1 Tách Plasmid dùng Spin Column 3.1.1 Vật liệu  Chủng tạo dòng E coli chèn vector có mang gen mục tiêu  Kit tách plasmid (solution I, solution II, solution III, RNase, Washing buffer)  Máy ly tâm 3.1.2 Thực  Cho 1.5 mL dịch nuôi cấy vào eppendorf -> ly tâm thu tế bào  Thêm 100 μL solution I, trộn ủ nhiệt độ phòng phút  Thêm 200 μL solution II, trộn cách đảo eppendorf lên xuống 4-6 lần, ủ nhiệt độ phòng phút  Thêm 300 μL solution III, trộn đều, ủ nhiệt độ phòng phút  Ly tâm 12,000 rpm/min, phút Thu dịch  Cho dịch vào spin column Ly tâm phút Loại bỏ dịch chảy qua  Cho 500 μL washing buffer, ly tâm phút, loại bỏ dịch chảy qua Lặp lại bước lần  Ly tâm phút để làm khô màng  Đặt cột vào eppendorf Cho TE buffer vào cột, ủ phút Ly tâm phút để thu plasmid 17  Bảo quản Plasmid - 20°C Hình 1: Spin Column trước ly tâm Hình 2: Spin Column sau ly tâm 3.2 Biến nạp plasmid vào E coli 3.2.1 Vật liệu  Plasmid biểu có gen mục tiêu  Tế bào khả nạp E coli BL21 (DE3)  Hộp thạch LB có sẵn kháng sinh chọn lọc tương ứng 3.2.2 Thực  Mọi hoạt động phải tiến hành đá lạnh DNA sử dụng cho trình biến nạp phải làm lạnh trước  Tiến hành biến nạp cho mẫu nước cất phản ứng chứng âm, plasmid chứa amyE mục tiêu vào E coli BL21 (DE3) 18  Để tube chứa plasmid đá Lấy 50 µl tế bào khả nạp cần thiết Hình Tiến hành thao tác đá lạnh  Lấy đủ số tube tế bào khả nạp cần thiết, làm đông đá khoảng phút, khơng làm đơng tay giết chết tế bào  Chuyển toàn plasmid vào tube chứa tế bào khả nạp tương ứng Dùng ngón tay khẩy nhẹ vào đáy ống để trộn, khơng hút lên xuống giết chết tế bào làm giảm hiệu biến nạp Chuẩn bị hộp thạch LB chọn lọc: môi trường LB Agar Ampicillin 30 μL / mL 19 Hình Chuẩn bị mơi trường LB Agar Ampicillin 30 μL / mL  Gây sốc nhiệt cách đặt tube bể cách thuỷ nhiệt độ xác 42°C 30 giây sau làm lạnh đá 10 phút  Cho thêm mL LB vào tube, ủ tế bảo 37°C để làm ổn định tế bào gen đề kháng kháng sinh plasmid có thời gian biểu 20 Hình Ủ tế bào 37°C  Ly tâm 13,000 vòng/ phút 15 giây, thu tế bào  Đổ bỏ phần môi trường bên trên, chừa lại khoảng 100μL đáy tube  Nhẹ nhàng phân tán tế bào vào phần mơi trường cịn lại, chuyển tồn sang hộp thạch chứa mơi trường có kháng sinh Ampicillin 21 Hình Thạch chứa mơi trường có kháng sinh Ampicillin  Dùng que gạt vô trùng để trải vi khuẩn mặt thạch Que gạt tiệt trùng cách nhúng cồn tuyệt đối đốt que trước sử dụng a) b) 22 Hình Quá trình trải vi khuẩn a) Tiệt trùng que trải; b) Trải vi khuẩn lên mặt thạch  Ủ hộp thạch cấy qua đêm 37ºC, phải lật ngược hộp thạch để tránh ngưng đọng nước mặt thạch Hình Ủ hộp thạch cấy qua đêm 37ºC 3.2.3 Nhận xét Sau ủ hộp thạch 37ºC 24 giờ, thấy đĩa thành xuất khuẩn lạc, có nghĩa tế bào nhận plasmid pET28b (+) có mang gen đề kháng kháng sinh Ampicillin 3.3 Lưu dịng tế bào có mang plasmid tái tổ hợp 3.3.1 Vật liệu  Hộp thạch chứa tế bào nhận plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Ampi  Ống môi trường chứa 3mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi 3.3.2 Thực  Sau ủ đủ thời gian, tế bào nhận plasmid pET28b(+) có mang gen đề kháng Ampi mọc thành khuẩn lạc  Chọn 2-5 khuẩn lạc có kích thước lớn để lưu chủng 23  Dùng que cấy vô trùng hay tip vô trùng, chấm vào đỉnh khuẩn lạc  Cấy que vào ống mơi trường chứa mL LB lỏng có bổ sung kháng sinh Ampi (nghiêng ống để môi trường tràn lên gần miệng ống, nhúng que vào để phân tán vi khuẩn vào môi trường)  Ủ 37oC 18 Hình Ống chứa mơi trường LB có bổ sung kháng sinh Ampi cấy que ủ 37oC sau 18 Lưu chủng:  Cho vào eppendorf có nắp đậy 250 μL glycerol 80% mL huyền dịch vi khuẩn nuôi 18 giờ, trộn đều, đậy chặt nắp  Ghi nhãn bảo quản -80oC -20oC 3.3.3 Nhận xét Sau ủ 37oC 18 giờ, tiến hành cho eppendorf 250 μL glycerol 80% tiến hành ghi nhãn bảo quản cần sử dụng nuôi cấy cần lấy kích hoạt trở lại 3.4 Nuôi cấy cảm ứng biểu protein mục tiêu 3.4.1 Vật liệu 24  LB Ampi 30 μg/mL  IPTG 100 mM  Chủng E coli BL21(DE3) có gen mục tiêu 3.4.2 Thực  Lấy khuẩn lạc E coli cấy vào mL LB + Ampi 30μg/mL, ủ qua đêm 37 oC máy lắc  Cấy pha lỗng 1:100 vào bình tam giác chứa 20mL LB + Ampi 30 μg/mL Lắc 37 oC 200 rpm đến đạt OD600 khoảng 0,5-0,6  Chia môi trường nuôi cấy E coli thành chai, chai 10 mL: chai thêm IPTG 100mM để có nồng độ cuối mM IPTG, chai thứ dùng làm chứng khơng cảm ứng Hình Thao tác chia mơi trường ni cấy 25 Hình Bình tam giác chứa môi trường nuôi cấy E coli thêm IPTG 100mM  Tiếp tục lắc thêm 30 phút Hình Bình thêm IPTG 100mM cho vào máy lắc 30 phút 26  Tiến hành thu tế bào cách ly tâm 5,000 rpm 10 phút 4oC  Cho tế bào vào tủ bảo quản -80oC hay -20oC không dùng 3.4.3 Nhận xét Việc lắc thêm vài để giúp cho cảm ứng đủ Tế bào sau ly tâm thu tế bào cảm ứng biểu IPTG, cho bảo quản cần lấy kích hoạt Tinh chế protein tái tổ hợp 4.1 Khái quát nguyên tắc sắc ký lực Nhựa sắc ký (resin) gắn ion kim loại hóa trị II Ni, ion có lực với đoạn peptid gắn kết với 6-8 đoạn histidine Từ dựa vào gắn kết thuận nghịch phương pháp sắc ký lực để tinh chế protein Protein đích thơi đệm có chứa thành phần imidazole, chất có lực mạnh với cột Ni Histidine 4.2 Sắc ký lực ion kim loại – IMAC 4.2.1 Vật liệu chuẩn bị  Đệm chạy 8X (binding buffer)  Đệm 4X (Elution buffer)  Đệm ion 8X (charge buffer)  Đệm rửa 8X (washing buffer)  Đệm bảo quản cột Chuẩn bị dung dịch đệm phù hợp cách pha loãng nồng độ Bảng pha loãng đây: Đệm Stock Tỉ lệ pha Tổng Thể tích cần sử dụng lỗng Đệm 8X 1:7 (ml) chạy Đệm ion Cách pha 1ml đệm chạy 8X + 7ml nước cất 8X 1:7 1ml đệm ion 8X + 7ml nước 27 cất Đệm rửa 8X 1:7 1ml đệm rửa 8X + 7ml nước cất Đệm 4X 1:3 1ml đệm 4X + 3ml nước cất 4.2.2 Chuẩn bị cột Đầu tiên rửa cột rỗng với nước cất vơ trùng, sau gắn lên giá cho cột thẳng đứng Phân tán nhựa sắc ký cách úp ngửa để nhựa sắc ký phân tán cột Tiếp đến cho mL Ni-Sepharose vào cột cẩn thận khơng cho dính vào thành cột Đợi khoảng để sepharose lắng xuống mở cột để dung dịch bảo quản cột chạy xuống hết lưu ý tránh để cột bị khô  Rửa cột với đệm pha (1 thể tích 0.5 ml)  thể tích nước cất vơ trùng  thể tích đệm ion 1X  thể tích đệm ion 1X  thể tích đệm chạy  Khóa cột 4.2.3 Phá tế bào  Sử dụng môi trường nuôi cấy vi khuẩn E coli không thêm chất cảm ứng IPTG IPTG chất cảm ứng promoter cảm ứng cho q trình phiên mã  Lấy 15 mL mơi trường nuôi cấy E coli ly tâm, bỏ phần dung dịch bên thu phần cặn bên Phần tế bào E coli Lấy mL đệm chạy 1X cho vào tế bào E coli Phân tán tế bào đặt cốc mỏ vịt có chứa đá để giúp protein khơng bị biến tính nhiệt độ  Đem hỗn hợp E coli đệm siêu âm (lưu ý đặt đá lúc siêu âm nhiệt độ tăng cao dễ gây biến tính) Lặp lại q trình siêu âm đến hỗn hợp không bị nhớt Lúc tế bào bị phá vỡ để sẵn sàng cho bước 28  Lấy mL dịch tán siêu âm vào eppendorf Một eppendorf nạp cột sắc kí eppendorf đo OD  Ly tâm ống với tốc độ 14.000 vòng/5 phút, thu dịch protein dung dịch A 4.2.4 Tinh chế protein His-tag  Đầu tiên nạp mL dịch A vào cột, mở cho cột chạy thu dung dịch B Lúc dung dịch B chứa protein khơng có lực đối vối cột  Rửa cột 2.5 mL đệm chạy 1X, thu B1 B1 chứa protein có lực thấp cột có chứa lượng protein đích đệm chạy có chứa 40 uL Imidazole  Rửa cột với thể tích đệm rửa 1X lần, thu ống C1-C5 vào ống eppendorf Kiểm tra diện protein cách đo OD  Thôi cột cách cho thể tích đệm thơi 1X thu dịch chảy D1-D6 vào ống eppendorf Kiểm tra diện protein cách đo OD  Tái cân cột 2.5 mL đệm chạy 1X bảo quản cột 4.2.5 Xác định hàm lượng protein Xác định hàm lượng protein dịch A, B, B1, C D1-D6 theo phương pháp đo OD bước sóng 280 nm Bảng Bảng kết đo OD 280 nm Tên mẫu Trị số OD (Abs) Ống A 0,332 Ống B 0,048 Ống B1 0,183 29 Bảng Bảng đo OD 280 nm C1-C5 Tên mẫu Trị số OD (Abs) C1 0,287 C2 0,237 C3 0,281 C4 0,262 C5 0,192 D1 0,280 D2 0,304 D3 0,152 D4 0,338 D5 0,283 D6 0,286 Nhận xét: • Ống B đo OD 0.048 A nên có lượng protein khơng có lực với cột bị chảy  Hàm lượng protein tái tổ hợp có ống C theo phương pháp đo OD 1.259A  Hàm lượng protein tái tổ hợp có ống D theo phương pháp đo OD 1.643A  Trong ống A đo OD có giá trị cao 0.332 nên lượng protein có ống A cao 30 • Giá trị ống D cao không đồng đều, nhiên D4 có nồng độ protein cao bất thường 0,338 A nên lượng protein His-tag có sẵn cột nhóm trước chưa rửa giải hết dẫn đến tăng cao bất thường nồng độ protein Kết luận: Ta nhận thấy hàm lượng protein có ống A cao khơng lượng protein ống sau cộng lại Việc xày cột sắc ký bị nhiễm dung dịch đệm bị nhiễm gây ống có thêm tạp chất khác Kết luận Thơng qua mơn thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thấy mối liên hệ, thống với Mục tiêu mơn học sản xuất amylase E coli tái tổ hợp thông qua quy trình, tiêu đề thực tập: Chọn lọc giống vi sinh vật (Bài 1) cách phân lập, khảo sát tính kháng khuẩn bảo quản giống → Tinh chế enzyme (Bài 2) → Tạo dòng vi khuẩn (Bài 3) → Tinh chế protein tái tổ hợp (Bài 4) phương pháp sắc kí lực Qua đó, ta thấy tầm quan trọng khâu sản xuất thao tác đắn, q trình vơ trùng 31 ... chung enzyme thô: HTCenzyme thô = HTE thô x N x Venzyme thô = 1.289 x 100 x 10 = 1289 (U/ml) Hoạt tính chung enzyme tinh: HTCenzyme tinh = HTE tinh x N x Venzyme tinh (N hệ số pha loãng enzyme) ... protein His-tag 27 4.2.5 Xác định hàm lượng protein 27 Kết luận 29 Tóm tắt Vấn đề nghiên cứu: ? ?Sản xuất enzyme amylase E coli tái tổ hợp? ??, thực phịng thí nghiệm. .. Thơng qua mơn thí nghiệm Cơng nghệ sinh học thấy mối liên hệ, thống với Mục tiêu môn học sản xuất amylase E coli tái tổ hợp thơng qua quy trình, tiêu đề thực tập: Chọn lọc giống vi sinh vật (Bài