Báo cáo thí nghiệm dược liệu 1 (Tổng hợp COUMARINE, ANTHRAGLYCOSIDE, TANNIN, FLAVONOID) KHOA DƯỢC BÁO CÁO MÔN THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1 ĐỊNH TÍNH COUMARINE THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 10 NĂM 2020 1. Kiểm nghiệm vi học: bột Bạch chỉ Nhựa Mô mềm Mảnh bần 2. Kết quả thí nghiệm 2.1. Chiết xuất Coumarine - Cho 1 g mỗi bột Bạch chỉ vào 1 erlen 50 mL. - Thêm 20 mL ethanol 96% vào erlen. - Đun trên bếp cách thuỷ 5 phút. Sau đó, lọc nóng qua giấy lọc. Dịch chiết thu được cho vào từng ống nghiệm và 1 ít dịch chiết để lại cho sắc ký bản mỏng. 2.2. Phản ứng với dung dịch FeCl3 - Cho vào ống nghiệm chứa 1 mL dịch chiết 2-3 giọt dung dịch FeCl3 1%. Kết quả: ống nghiệm chuyển màu xanh do trong dịch chiết có chứa coumarine có -OH phenol tự do. Hình 1. Ống chứng (phải) và ống chứa dịch chiết sau khi cho FeCl3 1% (trái) 2.3. Phản ứng đóng mở vòng lacton - Ở 2 ống nghiệm, mỗi ống nghiệm chứa 1 mL dịch chiết: + Ống 1 thêm 0,5 mL dd NaOH 10% + Ống 2 làm ống chứng - Đun cách thuỷ đến khi 2 ống nghiệm đều sôi và để nguội: + Ống 1: dịch chiết chuyển sang màu vàng đục + Ống 2 trong - Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống 2 mL nước cất, lắc đều: + Ống 1 trong + Ống 2 xuất hiện tủa đục - Thêm vào ống 1 vài giọt HCl đặc để acid hoá, ống 1 đục trở lại Kết quả: Khi cho NaOH vào thì ống 1 sẽ chuyển sang màu vàng đục. Khi cho HCl đặc vào ống 1 thì ống sẽ đục như ống 2 (ống chứa dịch chiết sau khi đun cách thuỷ, để nguội và thêm nước cất vào). Hình 2. Ống nghiệm khi cho NaOH (trái) và ống chứng chứa dịch chiết Bạch chỉ (phải) Hình 3. Ống nghiệm khi cho HCl đặc (trái) và ống chứng chứa dịch chiết Bạch chỉ sau khi cho 2 mL nước cất (phải) 2.4. Phản ứng diazo hoá - Cho vào ống nghiệm chứa 1 mL dịch chiết vài giọt dung dịch NaOH 10%. Sau đó, đun cách thuỷ đến sôi rồi để nguội. Thêm 1-2 giọt thuốc thử diazo lạnh, lắc đều. Kết quả: dịch chiết chuyển sang màu đỏ gạch. Hình 7. Ống nghiệm khi cho thuốc thử diazo lạnh (trái) và ống chứng chứa dịch chiết (phải) 2.5. Phản ứng tăng huỳnh quang dưới tác dụng của tia UV 2.5.1. Phương pháp: - Chấm 5 lần dịch chiết lên 1 tờ giấy lọc (để khô sau mỗi lần chấm). - Chấm tiếp vài giọt dung dịch NaOH 5%, để khô. - Che 1 nửa diện tích dịch chiết trên giấy lọc bằng giấy bạc rồi chiếu tia UV trong vài phút. - Bỏ giấy bạc ra và quan sát tiếp dưới đèn UV. 2.5.2. Kết quả: phần không che có huỳnh quang sáng hơn phần che. Khi tiếp tục chiếu tia UV thì phần bị che sáng dần lên, vài phút sau sẽ phát quang đều nhau. Hình 10. Miếng giấy lọc sau khi che 1 nửa bên (trái) và sau khi không che và để dưới đèn UV vài phút (phải) 2.6. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.6.1. Phương pháp: - Bản mỏng sắc ký: bản mỏng nền nhôm tráng sẵn silica gel GF254 . - Hệ dung môi khai triển: cyclohexane - ethyl acetate (7,5 : 3,5) - Mẫu thử: dịch chiết Bạch chỉ. - Mẫu chuẩn: dịch chiết Bạch chỉ chuẩn. - Tiến hành: dùng mao quản chấm dịch chấm sắc ký và dung dịch chuẩn trên bản mỏng. Sau khi chạy sắc ký xong, để khô và quan sát UV 254 nm và 365 nm. 2.6.2. Kết quả: xuất hiện vết cùng phát quang Hình 12. Sắc ký khi đem soi UV 365 nm (phải) và sắc ký khi đem soi UV 264 nm (trái) . Kết luận: Dược liệu Bạch chỉ (mẫu thử) có chứa Coumarine. KHOA DƯỢC BÁO CÁO MÔN THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA ANTHRAGLYCOSIDE THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH, THÁNG 10 NĂM 2020 1. Kiểm nghiệm vi học: bột Đại hoàng Hạt nhựa Mảnh mô mềm Mạch vòng Mảnh mô mềm Lông che chở đa bào 2. Kết quả thí nghiệm 2.1. Phản ứng Bortrager - Cho 0,5 g bột Đại hoàng vào túi bằng giấy lọc. Cho túi giấy lọc chứa dược liệu vào buồng chiết Soxhlet. - Cho vào bình cầu 120 mL dichloromethane (DCM). Chiết kiệt bằng hệ thống Soxhlet đến khi dung môi chuyển sang màu vàng nhạt. Ở phần dịch chiết DCM (1): cho 20 mL dịch chiết vào bình lắng gạn có chứa 20 mL dung dịch NaOH 10%, lắc đều. Quan sát màu. Ở phần bã dược liệu: + Cho bã dược liệu vào erlen 100 mL, thêm dung dịch H2SO4 ngập mặt và đun cách thuỷ khoảng 15 phút. + Sau khi đun cách thuỷ, ta thêm 20 mL DCM vào và lắc kỹ, lọc qua bông để thu dịch chiết. + Cho 20 mL dịch chiết vào bình lắng gạn có chứa 20 mL dung dịch NaOH 10%, lắc đều. Quan sát màu. Kết quả: Hình 1. Hệ thống chiết Soxhlet * Ở dịch chiết DCM (1) và dịch chiết DCM từ bã dược liệu: khi cho NaOH vào bình lắng gạn thì thấy lớp NaOH màu đỏ hồng. Hình 2. Lớp NaOH sau khi cho vào bình lắng gạn có chứa dịch chiết DCM (1) và dịch chiết DCM từ bã dược liệu 2.2. Định tính chrysophanic acid - Cho vào bình lắng gạn 20 mL dịch chiết DCM (1) có sẵn 20 mL NH4OH 10%, lắc đều. - Lấy lớp dưới, gọi là dịch chiết DCM (2). Sau đó, cho vào lại bình lắng gạn, thêm tiếp tục 20 mL NaOH 10%, lắc đều. Quan sát màu. Kết quả: Sau khi lắc với NaOH thì lớp NaOH có màu hồng Hình 3. Dịch chiết DCM (1) khi cho vào với NH4OH 10% (trái) và sau khi gạn lớp dưới, lấy dịch chiết DCM (2) cho vào bình lắng gạn và lắc với NaOH 10% (phải) 2.3. Phản ứng vi thăng hoa - Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu cho vào một chén sứ, hơ nóng nhẹ trên bếp hồng ngoại và đảo đều cho bay hết hơi nước. - Sau đó, đậy lên chén sứ một phiến kính và đặt lên phiến kính bông gòn đã thấm nước lạnh rồi đốt mạnh trong 5 phút. - Lấy tấm kính ra soi dưới kính hiển vi. Nhỏ lên tinh thể 1 giọt dung dịch NaOH 10% Kết quả: Khi quan sát dưới kính hiển vi, xuất hiện tinh thể hình kim màu vàng đen. Khi nhỏ dung dịch NaOH 10% lên thì sẽ xuất hiện màu đỏ. Hình 4. Tinh thể hình kim màu vàng sau khi soi kính hiển vi (phải) và phiến kính sau khi nhỏ dung dịch NaOH 10% lên (trái) 2.4. Sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.4.1. Phương pháp: - Bản mỏng sắc ký: bản mỏng nền nhôm tráng sẵn silica gel GF254 . - Hệ dung môi khai triển: ether dầu hoả : ethyl acetate : formic acid (7,5 : 2,5 : 0,1) - Mẫu thử: dịch chiết DCM (1) và (2) - Tiến hành: dùng mao quản chấm riêng biệt trên bản mỏng 10 μL mỗi dung dịch trên. Sau khi triển khai sắc ký, lấy bản mỏng ra, để khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng, phát hiện dưới ánh sáng thường, đèn UV 254 nm và 365 nm, hiện màu bằng KOH/EtOH. 2.4.2. Kết quả: xuất hiện vết anthraquinon màu vàng Hình 5. Sắc ký khi đem hiện màu bằng KOH/EtOH. Kết luận: Dược liệu có chứa Anthraquinon do có vết màu vàng ở cả dịch chiết DCM (1) và (2). BÁO CÁO MÔN THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2020. I) Kiểm nghiệm vi học: soi bột Ngũ Bội Tử Hình 1: Hạt tinh bột (trái) và lông che chở đa bào (phải). Hình 2: Mảnh mô mềm (trái) và hạt nhựa vàng (phải). II) Định tính Quy trình chiết dược liệu Cân khoảng 1 g bột Ngũ Bội Tử, 1g bột Kim ngân hoa, 1 g bột Vỏ măng cụt cho vào 3 erlen có thể tích 50mL theo thứ tự 1,2,3. Thêm 30 mL nước cất vào mỗi erlen, đun cách thủy trong 30’ và lọc nóng. Chia đều dịch lọc của mỗi loại dược liệu trên vào 5 ống nghiệm. 1) Dịch chiết Ngũ bội tử i) Phản ứng kim loại nặng Lần lượt cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm chứa dịch chiết. - Ống 1: 1 giọt FeCl3 1% - Ống 2: 1 giọt chì acetate 1% - Ống 3: 1 giọt đồng acetate 1% Hiện tượng: - Ống 1: có kết tủa xanh đen - Ống 2: có kết tủa trắng - Ống 3: có kết tủa nâu Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol. ii) Phản ứng Protein Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối. Hiện tượng: có kết tủa trắng. Kết luận: có nhóm OH phenol. iii) Phân biệt 2 loại Tannin Cho vào 2 ống nghiệm chứa dịch lần lượt 2 thuốc thử: FeCl3 1% (ống 1) và Stiasny (ống 5), đem ống 5 đun cách thủy 10’. Hiện tượng: ống 1 có tủa xanh đen, ống 2 không tủa. Kết luận: dịch chiết chứa pyrrogallic. Hình 3: Kết quả phản ứng của các ống 1,3,2,4,5 (từ phải sang trái). 2) Dịch chiết Vỏ măng cụt i) Phản ứng kim loại nặng Lần lượt cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm chứa dịch chiết. - Ống 1: 1 giọt FeCl3 1% - Ống 2: 1 giọt chì acetate 1% - Ống 3: 1 giọt đồng acetate 1% Hiện tượng: - Ống 1: có kết tủa xanh rêu - Ống 2: có kết tủa nâu nhạt - Ống 3: có kết tủa nâu đen Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol. ii) Phản ứng Protein Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối. Hiện tượng: có kết tủa vàng nâu. Kết luận: có nhóm OH phenol. iii) Phân biệt 2 loại Tannin Cho vào 2 ống nghiệm chứa dịch lần lượt 2 thuốc thử: FeCl3 1% (ống 1) và Stiasny (ống 5), đem ống 5 đun cách thủy 10’. Hiện tượng: ống 1 có tủa xanh đen, ống 5 có tủa vón đỏ gạch. Kết luận: dịch chiết chứa pyrrocatechic. Hình 4: Kết quả phản ứng của các ống 1,5,4,3,2 (từ trái sang phải) 3) Dịch chiết Kim ngân hoa i) Phản ứng kim loại nặng Lần lượt cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm chứa dịch chiết. - Ống 1: 1 giọt FeCl3 1% - Ống 2: 1 giọt chì acetate 1% - Ống 3: 1 giọt đồng acetate 1% Hiện tượng: - Ống 1: có kết tủa xanh đen - Ống 2: có kết tủa cam - Ống 3: có kết tủa xanh rêu Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol ii) Phản ứng Protein Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối. Hiện tượng: dung dịch trong suốt, không tủa. Kết luận: ít nhóm OH phenol. iii) Phân biệt 2 loại Tannin Cho vào 2 ống nghiệm chứa dịch lần lượt 2 thuốc thử: FeCl3 1% (ống 1) và Stiasny (ống 5), đem ống 5 đun cách thủy 10’. Hiện tượng: ống 1 có tủa xanh đen , ống 5 trong suốt và không có tủa. Kết luận: dịch chiết chứa pyrrogallic. Hình 5: Kết quả phản ứng của các ống 4,5,2,3,1 (từ trái sang phải). III) Sắc ký bản mỏng Bản mỏng: Silicagel GF254 Dung môi: CHCl3-EA-FA (5: 5: 1). Dung dịch thử: lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu thô, thêm 2mL Methanol (TT), siêu âm 15’. Lấy dịch lọc làm dung dịch thử. Dung dịch đối chiếu: lấy 0,5 g bột dược liệu chuẩn, thêm 2mL Methanol (TT), siêu âm 15’. Lấy dịch lọc làm dung dịch đối chiếu (dung dịch chuẩn). Tiến hành chạy sắc ký, soi UV để phát hiện vết tannin ở bước sóng 254nm và hiện màu bằng dung dịch FeCl3. Kết quả thí nghiệm: Hình 6: Bản mỏng sau khi chạy sắc ký và ngâm trong dung dịch FeCl3. Kết luận và giải thích: Mẫu thứ 2 có chứa tannin vì có các vết có Rf tương ứng với dung dịch chuẩn. Tannin có nhiều nhóm OH nên phân cực mạnh. Do đó tương tác tốt với pha tĩnh. Hệ dung môi phân cực nên các chất phân tách nhau rõ. IV) Định lượng Cân 2 gam Ngũ bội tử cho vào bình nón 250 mL, thêm 150mL nước cất và đun cách thủy 30’. Cho dịch chiết vào bình định mức 250 mL và thêm nước đến vạch định mức. Lọc, bỏ 50mL dịch lọc đầu, phần dịch lọc còn lại đem làm dung dịch thử. Xác định chất chiết được trong nước toàn phần: lấy 25mL dung dịch thử đem cô cạn đến cắn, cân được khối lượng T1 (g). Xác định chất chiết được trong nước không liên kết với bột da: lấy chính xác 100 mL dung dịch thử, thêm 6 gam bột da, lắc đều trong 15’, lọc. Lấy chính xác 25 mL dịch lọc đem cô đến cắn, thu được khối lượng T2 (g). Xác định bột da tan trong nước: lấy chính xác 100 mL nước cất, thêm 6 g bột da khô, lắc đều trong 15’, lọc. Lấy chính xác 25 mL dịch lọc đem cô đến cắn. Cân được khối lượng To (g). Kết quả cân:
Phản ứng vi thăng hoa
- Lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu cho vào một chén sứ, hơ nóng nhẹ trên bếp hồng ngoại và đảo đều cho bay hết hơi nước
- Sau đó, đậy lên chén sứ một phiến kính và đặt lên phiến kính bông gòn đã thấm nước lạnh rồi đốt mạnh trong 5 phút
- Lấy tấm kính ra soi dưới kính hiển vi Nhỏ lên tinh thể 1 giọt dung dịch NaOH 10%
Kết quả: Khi quan sát dưới kính hiển vi, xuất hiện tinh thể hình kim màu vàng đen Khi nhỏ dung dịch NaOH 10% lên thì sẽ xuất hiện màu đỏ
Hình 4 Tinh thể hình kim màu vàng sau khi soi kính hiển vi (phải) và phiến kính sau khi nhỏ dung dịch NaOH
Sắc ký lớp mỏng (TLC) 1 Phương pháp
Kết quả: xuất hiện vết anthraquinon màu vàng
Hình 5 Sắc ký khi đem hiện màu bằng KOH/EtOH
Kết luận: Dược liệu có chứa Anthraquinon do có vết màu vàng ở cả dịch chiết DCM (1) và (2).
TANNIN
Kiểm nghiệm vi học: soi bột Ngũ Bội Tử
1: ạt tinh bột (trái) và lông che c ở đa bào (p ải)
2: Mả mô mềm (trái) và ạt ựa vàng (p ải).
Quy trình chiết dược liệu
i) Phản ứng kim loại nặng
1 giọt đồng acetate 1%
có kết tủa xanh đen - Ống 2: có kết tủa trắng
Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol.
ii) Phản ứng Protein
Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối Hiện tượng: có kết tủa trắng
Kết luận: có nhóm OH phenol.
iii) Phân biệt 2 loại Tannin
Dịch chiết Vỏ măng cụt
i) Phản ứng kim loại nặng
Lần lượt cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm chứa dịch chiết
có kết tủa xanh rêu - Ống 2: có kết tủa nâu nhạt
Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol ii) Phản ứng Protein
Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối Hiện tượng: có kết tủa vàng nâu
Kết luận: có nhóm OH phenol iii) Phân biệt 2 loại Tannin
Cho vào 2 ống nghiệm chứa dịch lần lượt 2 thuốc thử: FeCl3 1% (ống 1) và Stiasny (ống 5), đem ống 5 đun cách thủy 10’
Hiện tượng: ống 1 có tủa xanh đen, ống 5 có tủa vón đỏ gạch Kết luận: dịch chiết chứa pyrrocatechic
H nh 4: Kết quả phản ứng của các ống 1,5,4,3,2 (từ trái sang phải)
3) Dịch chiết Kim ngân hoa i) Phản ứng kim loại nặng
Lần lượt cho thuốc thử vào 3 ống nghiệm chứa dịch chiết
có kết tủa xanh đen - Ống 2: có kết tủa cam
Kết luận: dịch chiết chứa hợp chất có nhóm OH phenol ii) Phản ứng Protein
Cho vào ống nghiệm 4 một giọt thuốc thử Gelatin muối Hiện tượng: dung dịch trong suốt, không tủa
Kết luận: ít nhóm OH phenol iii) Phân biệt 2 loại Tannin
Cho vào 2 ống nghiệm chứa dịch lần lượt 2 thuốc thử: FeCl3 1% (ống 1) và Stiasny (ống
5), đem ống 5 đun cách thủy 10’
Hiện tượng: ống 1 có tủa xanh đen , ống 5 trong suốt và không có tủa Kết luận: dịch chiết chứa pyrrogallic
H nh 5: Kết quả phản ứng của các ống 4,5,2,3,1 (từ trái sang phải)
III) Sắc ký bản mỏng
Bản mỏng: Silicagel GF254 Dung môi: CHCl3-EA-FA (5: 5: 1)
Dung dịch thử: lấy khoảng 0,5 g bột dược liệu thô, thêm 2mL Methanol (TT), siêu âm 15’ Lấy dịch lọc làm dung dịch thử
Dung dịch đối chiếu: lấy 0,5 g bột dược liệu chuẩn, thêm 2mL Methanol (TT), siêu âm 15’ Lấy dịch lọc làm dung dịch đối chiếu (dung dịch chuẩn)
Tiến hành chạy sắc ký, soi UV để phát hiện vết tannin ở bước sóng 254nm và hiện màu bằng dung dịch FeCl3.
Kết quả thí nghiệm
gam Ngũ bội tử cho vào bình nón 250 mL, thêm 150mL nước cất và đun
cách thủy 30’ Cho dịch chiết vào bình định mức 250 mL và thêm nước đến vạch định mức Lọc, bỏ 50mL dịch lọc đầu, phần dịch lọc còn lại đem làm dung dịch thử.
Xác định chất chiết được trong nước toàn phần: lấy 25mL dung dịch thử đem
cô cạn đến cắn, cân được khối lượng T1 (g).
Xác định chất chiết được trong nước không liên kết với bột da: lấy chính xác
100 mL dung dịch thử, thêm 6 gam bột da, lắc đều trong 15’, lọc Lấy chính xác
25 mL dịch lọc đem cô đến cắn, thu được khối lượng T2 (g)
Xác định bột da tan trong nước: lấy chính xác 100 mL nước cất, thêm 6 g bột da khô, lắc đều trong
15’, lọc Lấy chính xác 25 mL dịch lọc đem cô đến cắn Cân được khối lượng To (g)
Chú thích
- T 0 : Lượng bột da tan trong nước Một phần bột da tan trong nước, tanin cũng tan trong cả hai nên có thể gelatin và một ít tanin tan trong nó còn tồn tại ở pha H20 của T2
- T 1 : Tổng hàm lượng chất tan trong nước, bao gồm cả tanin Bốc hơi nước, lượng cân được là tanin và các chất khác tan được trong nước
- T 2 : Lượng chất rắn còn lại không phải tanin Do chỉ có tanin liên kết với bột da (gelatin), đã lọc đi ở bước trước
- m n , m n’ : khối lượng chén sứ ban đầu và sau khi cô cạn dung dịch, n tương ứng với 0,1,2
- a: khối lượng chính xác bột dược liệu đã dùng (g).
BÁO CÁO THÍ NGHIỆM DƯỢC LIỆU 1 BÀI 5: KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA FLAVONOID
KIỂM NGHIỆM VI HỌC
Quan sát bột hoa Hòe dưới kính hiển vi:
Lông che chở đơn bào
Lông che chở đa bào
Hạt phấn hoa có 3 lỗ nảy mầm
Mảnh đài hoa mang lông che chở
ĐỊNH TÍNH 3.1 CHIẾT XUẤT FLAVONOID
− Lấy 1 g mỗi bột dược liệu cho vào một erlen 100 ml riêng biệt (Hoè, Đậu đen, Vỏ bưởi, Kim Ngân, Rễ tranh)
ml ethanol 96% vào mỗi bình (Riêng Đậu đen dùng cồn 25%
Đun trên bếp cách thủy trong 5 phút, riêng Đậu đen đun trên bếp điện, thỉnh thoảng lắc nhẹ
Dịch chiết được để nguội, lọc vào các ống nghiệm riêng biệt dùng làm các phản ứng hóa học và dịch chấm sắc ký lớp mỏng
3.3.1 Phản ứng của nhóm OH phenol và nhân thơm (Hoè)
Với mỗi dược liệu, lấy 8 ống nghiệm cho vào mỗi ống 1 ml dịch chiết để làm các phản ứng sau:
3.3.1.1 Phản ứng tăng màu với dung dịch NaOH 1%
giọt thuốc thử NaOH 1% vào mỗi ống nghiệm chứa 1 ml dịch chiết
Cho một ống nghiệm vào bể cách thủy 2-3 phút
Hiện tượng: tạo dung dịch có màu đậm hơn dịch chiết Hiện tượng xảy ra là do phản ứng của nhóm OH phenol và kiềm loãng (NaOH 1%) tạo ra muối phenolat dễ trong nước làm tăng màu của muối này => dung dịch tăng màu
3.3.1.2 Phản ứng tạo phức kim loại
giọt thuốc thử sau vào mỗi ống nghiệm chứa 1 ml dịch chiết, lắc đều, quan sát màu và tủa so với ống chứng
Hiện tượng: dung dịch chuyển dần sang màu nâu đen
Giải thích: Flavonoid tạo phức với FeCl3 tạo dung dịch màu nâu đen
Hiện tượng: phản ứng tạo tủa vàng trong dung dịch
Flavonoid có phản ứng với chì acetat trung tính cho tủa vàng (từ nhạt đến đậm)
3.3.1.3 Phản ứng với thuốc thử diazonium
Kiềm hóa 1 ml dịch chiết bằng vài giọt dung dịch NaOH 10%.
giọt thuốc thử diazonium lạnh
Lắc đều và quan sát màu của dung dịch
Hiện tượng: tạo phức màu cam
3.3.2 Phản ứng Cyanidin trên vòng -pyrone (phản ứng
ml dịch chiết của Hòe, Bưởi và cỏ Tranh vào 3 ống nghiệm có sẵn một ít bột Mg kim loại Đặt 3 ống nghiệm lên
Hiện tượng: Ban đầu khi đưa Mg và dịch chiết chưa có hiện tượng xảy ra Khi cho HCl đậm đặc vào dung dịch hiện tượng xuất hiện mãnh liệt, toả nhiệt Dung dịch sủi bọt khí, chuyển màu dần một cách nhanh chóng
Giải thích: Dung dịch sản phẩm khi tác dụng với dd HCl có thành phần chủ yếu là flavonoid Flavonoid có phản ứng Cyanidin đặc trưng (Mg+HCl) tạo ra dd có màu do có vòng
-pyrone bị khử thành nhân pyrillium
3.3.3 Ðịnh tính các hợp chất anthocyanidin
− Cho vào ống nghiệm lớn 10 hạt đỗ đen và 5 ml nước Ðun sôi trong 5 phút
− Cho vào 3 ống nghiệm nhỏ, mỗi ống nghiệm 1 ml dịch chiết: o Ống nghiệm 1: thêm vài giọt HCl 10% o Ống nghiệm 2: thêm vài giọt NaOH 10%, o Ống nghiệm 3: Để nguyên
− Quan sát màu và so sánh với ống chứng
3.3.4 Định tính các hợp chất Dihydro--pyron:
HCl 2ml dịch chiết + 1 vài giọt NaOH 5% -> cách thuỷ -> quan sát hiện tượng
Bản mỏng sắc ký: Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF254 (Merck), kích thước 7 cm × 2 cm
Hệ dung môi khai triển: EtOAc:Me:H2O (100:17:13) Mẫu thử: Dung dịch chiết Hoè, Bưởi, Kim Ngân
Mẫu chuẩn: Hoà tan rutin trong ethanol 96% để được dung dịch có chứa 1 mg/ml
Cách tiến hành: Dùng mao quản chấm riêng biệt dịch chấm sắc ký và dung dịch rutin chuẩn lên bản mỏng silica gel
Phát hiện: Quan sát dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 365 nm, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng phát
1 2 3 quang màu nâu và cùng giá trị Rf với vết rutin trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu Hiện màu bằng hơi amoniac đậm đặc, trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải có vết cùng màu vàng có cùng giá trị Rf với vết rutin chuẩn (Rf: 0,5 - 0,54) trên sắc ký đồ của dung dịch đối chiếu
UV 365 nm UV 254 nm Hiện màu bằng hơi amoniac.
BÁO CÁO THỰC TẬP DƯỢC LIỆU 1 KIỂM NGHIỆM DƯỢC LIỆU CHỨA TANNIN
NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT Nguyên liệu
- Ngũ bội tử (Galla chinensis), là tổ đã phơi hay sấy khô của ấu trùng sâu Ngũ bội tử (Melaphis chinensis (Bell.) Baker = Schlechtendalia chinensis Bell.) ký sinh trên cây Muối tức cây Diêm phu mộc (Rhus chinensis, Anacardiaceae)
- Kim ngân hoa (Flos Lonicerae), là nụ hoa có lẫn một số hoa phơi hay sấy khô của cây Kim ngân (Lonicera japonica, Caprifoliaceae)
- Lá Bàng, là lá của cây Bàng (Terminalia catappa, Combretaceae)
- Bột da - Chlorform - Ethyl acetate - Acid formic - Dung dịch gelatin muối - Dung dịch FeCl3 1%
- Thuốc thử Stiasny - Nước brom
Mảnh mạch vạch Khối nhựa màu vàng
Lông che chở đa bào
ml nước, đun trên bếp cách thủy sôi 10 phút, lắc đều khi đun
Lọc nóng lấy dịch lọc trong
3.2 PHẢN ỨNG HÓA HỌC 3.2.1 Phản ứng với dung dịch protein
Cho vào ống nghiệm 1 ml dịch chiết, thêm vào 1 giọt thuốc thử gelatin muối Phản ứng dương tính nếu có tủa trắng đục
Ngũ bội tử Kim ngân Măng cụt
Ngũ bội tử Măng cụt
Kết quả: Ống nghiệm chứa dịch chiết Ngũ bội tử có tủa bông trắng đục => Ngũ bội tử có chứa tannin Ống nghiệm chứa dịch chiết Kim ngân không có tủa bông trắng đục => Kim ngân không có chứa tannin Ống nghiệm chứa dịch chiết Măng cụt có tủa bông trắng đục => Măng cụt có chứa tannin
3.2.2 Phản ứng với kim loại nặng
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch chiết Thêm vào lần lượt các thuốc thử
1 giọt thuốc thử chì acetate 1%
Kim ngân chì acetate 1% Măng cụt chì acetate 1%
Ngũ bội tử chì acetate 1%
Ngũ bội tử: ống có thuốc thử FeCl 3 1% có màu xanh đen, ống có thuốc thử chì acetate 1% có tủa trắng ngà
Kim ngân: ống có thuốc thử FeCl 3 1% có màu xanh rêu, ống có thuốc thử chì acetate 1% có tủa vàng nhạt
Măng cụt: ống có thuốc thử FeCl 3 1% có màu xanh rêu, ống có thuốc thử chì acetate 1% có tủa đỏ cam
3.2.3 Định tính phân biệt 2 loại tannin
Cho vào 3 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml dịch chiết Thêm vào lần lượt các thuốc thử:
1 ml TT Stiasny
Kim ngân Ngũ bội tử
Quan sát sự tạo màu, tạo tủa của dung dịch để kết luận loại tannin.
Thuốc thử Tannin pyrogallic Tannin pyrocatechic
Xác định 2 loại tannin trong một dược liệu
Lấy 5 ml dịch chiết của dược liệu chứa 2 loại tannin (theo kết quả mục 3.2.3) vào ống nghiệm, thêm thuốc thử Stiasny, đun cách thủy 10 phút, lọc trong Dịch lọc tiếp túc với 1 ml thuốc thử Stiasny mới:
- Nếu không có tủa thì ngưng - Nếu còn tủa thì tiếp tục lấy dịch trong, tiến hành lặp lại như trên cho đến khi không còn tủa nữa Lấy dịch trong Trung hòa dịch lọc bằng dung dịch NaOH 10% đến pH 5-6 rồi tiếp tục thêm natri acetat cho tới pH trung tính hoặc kiềm nhẹ rồi chia vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 2 ml
Thêm vào ống thứ nhất vài giọt thuốc thử: