BÁO CÁO CÔNG NGHỆ SINH HỌC NHÓM 2 – SÁNG THỨ TƯ THÀNH VIÊN NGUYỄN CHÍ CÔNG HỒ CHÍ CƯỜNG VŨ HẢI ĐĂNG ĐỖ THỊ KIM KHUYÊN TRẦN HỮU HOÀNG CHƯƠNG ĐẶNG CHÍ CÔNG BÀI 1 CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT I) TÓM TẮT LÝ[.]
BÁO CÁO CƠNG NGHỆ SINH HỌC NHĨM – SÁNG THỨ TƯ THÀNH VIÊN: NGUYỄN CHÍ CƠNG HỒ CHÍ CƯỜNG VŨ HẢI ĐĂNG ĐỖ THỊ KIM KHUYÊN TRẦN HỮU HOÀNG CHƯƠNG ĐẶNG CHÍ CƠNG BÀI 1: CHỌN LỌC GIỐNG VI SINH VẬT I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT: Khái quát: - Quá trình chọn lọc giống vi sinh vật bao gồm: phân lập từ tự nhiên, gây đột biến, phát dịng vi sinh vật có đặc tính mong muốn bảo quản giống Việc phát dòng vi sinh vật có đặc tính mong muốn dựa vào: Chất chuyển hóa tạo ra: ví dụ kháng sinh, sắc tố Enzym ngoại bào tác động lên chất môi trường Sự thay đổi đặc tính sinh trưởng vi sinh vật Sự thay đổi hình thái Amylase ngoại bào: Phát hiện: tráng bề mặt mơi trường với dung dịch Lugol (iod), mơi trường có màu tím than Nếu chủng vi sinh vật có sinh amylase ngoại bào xung quanh chỗ vi sinh vật mọc có vịng sáng, tinh bột bị thủy phân nên không tạo màu với iod Đường kính vịng phân giải tinh bột tỷ lệ với hoạt tính Protease ngoại bào Phát hiện: tráng bề mặt mơi trường TCA 50% nên mơi trường đục gelatin bị kết tủa Nếu chủng vi sinh vật có sinh protease ngoại bào xung quang chỗ vi sinh vật mọc có vịng sáng, gelatin bị thủy phân nên khơng bị tủa Kháng sinh Phát vi sinh vật kháng sinh dựa vào khả ức chế tăng trưởng vi sinh vật khác theo phương pháp vạch thẳng vng góc phương pháp khuếch tán Phương pháp bảo quản giống - Giữ giống thạch Giữ giống tầng lớp dầu khoáng Giữ giống cát Đông lạnh đông khô II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN: Phát vi sinh vật có tiềm năng: Tìm thấy chủng mẫu đất: - Chủng 1: khóm lớn, bìa cưa, trắng đục, đường kính 10 mm - Chủng 2: khóm có màu trắng, trịn, đường kính mm - Chủng 3: khóm nhỏ, trịn, trong, có đường kính mm Khả tiết amylase protease ngoại bào: Chủng Amylase ngoại bào mm mm Protease ngoại bào mm mm mm Kết luận: - Chủng 1: có khả sinh amylase (đường kính phân giải mm) protease (đường kính phân giải mm) - Chủng 2: có khả sinh amylase (đường kính phân giải mm) protease (đường kính phân giải mm) - Chủng 3: có khả sinh protease (đường kính phân giải mm) Khả tiết kháng sinh S aureus E coli - - Phương pháp vạch thẳng vng góc (khoảng cách ức chế) B1 B2 B3 B4 17 mm mm mm mm Phương pháp khuếch tán (đường kính phân giải) B1 B2 B3 mm B4 mm Chủng B1: có khả tiết kháng sinh ức chế E coli phương pháp khuếch tán Chủng B2: khơng có khả tiết kháng sinh ức chế E coli S aureus Chủng B3: có khả tiết kháng sinh ức chế E coli ức chế S aureus phương pháp vạch thẳng vng góc; thấy ức chế S aureus phương pháp khuếch tán Chủng B4: có khả tiết kháng sinh ức chế E coli ức chế S aureus phương pháp vạch thẳng vng góc; khơng thấy ức chế E coli S aureus phương pháp khuếch tán III) CÂU HỎI: Kể tên nêu nguyên tắc số phương pháp phát đặc tính mong muốn thực nghiệm? - Tỷ trọng: dựa khác tỷ trọng tế bào để ly tâm tách riêng chủng - Thể khuyết dưỡng: chủng đột biến khả tổng hợp chất phát triển mơi trường có sẵn chất nên nhận biết so sánh hai mơi trường có khơng có chất - Kháng chất ức chế: chủng kháng chất độc, chất ức chế phát triển mơi trường có chất - Nhạy nhiệt: vi sinh vật phát triển nhiệt độ khác nên phát chủng cần quan tâm cách ủ hộp thạch nhiệt độ khác BÀI 3: ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CÓ LỢI CỦA VI KHUẨN PROBIOTIC I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT: Khái qt: Bên cạnh tiêu chuẩn tính an tồn, tính đề kháng kháng sinh chức năng, vi sinh vật lựa chọn làm probiotic phải đáp ứng yêu cầu đặc điểm sinh học khả sống sót qua ống tiêu hóa vật chủ đặc điểm công nghệ ảnh hưởng yếu tố lý hóa tác động đến probiotic Khi sử dụng đường uống, hai yếu tố tác động trực tiếp đến dân số probiotic pH acid dịch vị thành phần muối mật dịch mật Khả chịu dịch vị nhân tạo: Cho chủng vi sinh vật probiotic tiếp xúc với dịch vị nhân tạo có pH khác Đếm số lượng vi sinh vật sống sót sau khoảng thời gian quy định Khả chịu đựng dịch mật nhân tạo: Cho chủng vi sinh vật probiotic tiếp xúc với dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật khác Đếm số lượng vi sinh vật sống sót sau khoảng thời gian quy định Số tế bào/ml = Số khóm x 10 số thứ tự hộp + II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN: Đánh giá khả chịu dịch vị nhân tạo Tế bào sinh dưỡng Thời gian (phút) 60 90 Đơn vị: số tb/ml Đối chứng 380 000 370 000 520 000 pH MT pH MT pH 31 000 340 000 Đơn vị: số tb/ml Bào tử Thời gian (phút) 60 90 Đối chứng 670 000 560 000 370 000 pH MT pH MT pH 104 000 55 000 480 000 163 000 - Nhận xét: Sau 90 phút, mật độ tế bào sinh dưỡng sống sót mơi trường pH 6% môi trường pH 65% Sau 90 phút, mật độ bào tử sống sót mơi trường pH 15% môi trường pH 44% Đánh giá khả chịu muối mật Tế bào sinh dưỡng Thời gian (giờ) Bào tử Thời gian (giờ) - - - Đơn vị: số tb/ml Nồng độ muối mật (%) Đối chứng 0.3 0.5 150 000 480 000 900 600 700 000 900 200 Đơn vị: số tb/ml Nồng độ muối mật (%) Đối chứng 0.3 0.5 290 000 630 000 360 000 250 000 490 000 75 000 68 000 Nhận xét: Sau 90 phút, mật độ tế bào sinh dưỡng sống sót nồng độ muối mật 0.3% 0.8% nồng độ 0.5% 0.6% Sau 90 phút, mật độ bào tử sống sót nồng độ muối mật 0.3% 15% nồng độ 0.5% 14% Kết luận: Tế bào sinh dưỡng bào tử B.subtilis BY79 chịu môi trường dịch vị nhân tạo có pH = tốt mơi trường pH = Và chịu môi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,3% tốt mơi trường dịch mật nhân tạo có nồng độ muối mật 0,5% Thời gian môi trường thí nghiệm lâu, tỷ lệ % sống sót giảm Bào tử B subtilis chịu đựng tốt tế bào sinh dưỡng điều kiện khắc nghiệt dịch vị dịch mật Điều hợp lý bào tử dạng biến đổi vi sinh vật nhằm chống lại điều kiện bất lợi từ môi trường BÀI 4: TINH CHẾ ENZYM AMYLASE BẰNG ALGINAT I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT: Khái quát: - Enzym amylase có ứng dụng quan trọng cơng nghiệp, thực phẩm, y dược Trong năm gần amylase sử dụng nhiều rộng rãi y học để sản xuất gluose làm dịch tiêm truyền, chuyển hóa tinh bột thành dextrin, tinh bột tan làm tá dược bào chế để sản xuất số thuốc - Enzym amylase thu nhận từ động vât, vi sinh vật thực vật, nhiên enzym để ứng dụng y dược cần trải qua bước tinh chế từ enzym thô - II) Nội dung công việc: Thu enzym amylase từ khoai lang Tinh chế amylase Xác định hoạt lực enzym thu phương pháp Heinkel: Xác định lượng tinh bột bị phân giải dựa sở xác định mức độ giảm cường độ màu hỗn hợp phản ứng với dung dịch Iode Một đơn vị hoạt độ tương ứng với khả phân giải mg tinh bột sau 15 phút 300C KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Hàm lượng protein OD280: Enzym Thơ Độ pha lỗng V(ml) OD280 Tổng protein (mg) 20 10 0.877 175.4 Enzym Tinh chế 45 1.393 62.685 Xây dựng đường chuẩn xác định hoạt tính amylase Ống Tinh bột (mg) OD 10 U/ml 0.02 0.202 0.384 0.568 0.742 0.987 (Độ pha loãng 100) 0.04 0.06 0.08 0.1 Đồ thị: 1.2 y = 9.64x - 0.0018 R² = 0.9958 OD 0.8 0.6 OD 0.4 0.2 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 U/ml Ta có đường chuẩn: ∆OD= (U/ml)x9.64-0.0018 Đinh lượng hoạt tính amylase Độ pha lỗng OD560 ∆OD =ODC-ODT Enzym thô Ống thử Ống chuẩn 40000 40000 0.707 0.934 0.227 Enzym tinh chế Ống thử Ổng chuẩn 2000 2000 0.206 0.977 0.771 Dựa vào đường chuẩn: ∆OD= (U/ml)x9.64-0.0018, ta xác định giá trị hoạt tính enzym amylase: Enzym thơ: U/ml = 0.024 x Độ pha loãng= 0.024 x 40000 = 960 Enzym tinh chế: U/ml = 0.080 x Độ pha lỗng= 0.08 x 2000 = 160 Thơng số quy trình tinh chế Dịch thô (V=10ml) Enzym sau tinh chế (V=45ml) Tổng protein (A280nm) 175.4 Tổng hoạt tính (U) 9600 Hoạt tính chuyên biệt (U/A280nm) 54.732 62.685 7200 114.860 Hiệu suất (%) 75% Mức tinh chế (lần) 2.1 III) Nhận xét: - Hiệu suất sau trình tinh chế enzyme đạt 75% cao - Mức tinh chế 2.1 nên hiệu trình tinh chế cao CÂU HỎI: Vẽ quy trình tinh chế enzym? Enzym Thơ dd Alginat Natri 2% (1:3), ủ đệm CH3COOH 0,2M pH 4.8 Phức chất enzym alginat Na Calci clorid Lọc lấy tủa Enzym Tinh chế dd glucose 2%(30ml) để enzym Lọc lấy dịch 4oC 12 Tủa enzym alginat Ca BÀI 5: CỐ ĐỊNH CGTASE LÊN ALGINAT I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT: - Cyclodextrin glucanotranferase (CGTase, EC 2.4.1.19) enzym có khả chuyển hóa tinh bột chất tự thành hỗn hợp cyclodextrin mức độ polymer hóa từ 6, đơn vị glucose (ứng với α-CD, β-CD γ-CD) Việc cố định tận dụng khả tái sử dụng CGTase đắt tiền, tăng cường tính ổn định hoạt tính enzym - Dựa vào chất liên kết chất mang enzym, người ta phân loại phương pháp cố định enzym sau: ❖ Phương pháp vật lý: hấp phụ, liên kết ion… ❖ Phương pháp liên kết cộng hóa trị: dựa vào lực enzym chất mang để tạo phức enzym-chất mang liên kết cộng hóa trị ❖ Phương pháp bắt giữ enzym vào khuôn gel: dựa nguyên tắc bắt giữ enzym vào mạng lưới mà chất sản phẩm qua không cho enzym khuếch tán vào môi trường ❖ Phương pháp tạo vi nang: enzym giữ bao vi thể có màng bán thẩm dày 200 Å (cellulose, polysaccarid) II) KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN: Xây dựng đường chuẩn định lượng protein: Ống nghiệm Nồng độ BSA(µg/ml) OD595 0 10 20 30 40 50 0.146 0.347 0.555 0.628 0.680 Ta có đồ thị: 0.8 y = -0.0002x2 + 0.0232x - 0.0268 R² = 0.9868 0.7 0.6 OD595 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 -0.1 10 20 30 40 Nồng độ BSA(µg/ml) OD= -0.0002C2 + 0.0232C – 0.0268 50 60 Xây dựng đường chuẩn cyclodextrin: STT Nồng độ CD (mg/ml) ∆OD550 0 2 10 0.292 0.589 0.790 0.973 1.081 Ta có đồ thị: 1.4 y = 0.1093x + 0.0745 R² = 0.973 1.2 ∆OD550 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Nồng độ CD (mg/ml) ∆OD=0.1093CCD + 0.0745 Cố định phương pháp bắt giữ - Hàm lượng protein chế phẩm CGTase: ΔOD Nồng độ protein (µg/ml) Độ pha lỗng Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg) - 0.278 15.105 20 0.604 Hàm lượng protein cố định: ΔOD Nồng độ protein (µg/ml) Độ pha lỗng Thể tích (ml) Hàm lượng protein không cố định (mg) Hàm lượng protein cố định (mg) Hiệu suất cố định (%) 0.121 6.584 60 0.395 0.209 34.6% 10 12 - - Xác định hoạt tính CGTase: OD thử = 1.664 OD chứng = 1.890 ∆OD = OD chứng – OD thử = 1.890-1.664 = 0.226 Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD= 1.386 mg/ml= 1386 µg/ml Hoạt tính CGTase ml dung dịch CGTase tính theo cơng thức: 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛 1386×10×40 A= = = 32.56 (U/ml) 𝑀×𝑡 - 1135×15 Hoạt tính riêng CGTase: HTR enzyme tự = - 32.56 0.604 = 53.91 (U/mg protein) 1135×15×600 Hoạt tính riêng enzyme cố định: HTR enzyme CĐ= - 𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = Xác định hoạt tính enzyme cố định: OD thử = 0.938 OD chứng = 1.782 ∆OD = OD chứng – OD thử = 1.782-0.938 = 0.844 Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD = 7.040 mg/ml = 7040 µg/ml Hoạt tính enzym cố định: với enzyme tham gia phản ứng: 600mg tổng lượng enzym cố định gel: 10g 𝐶𝐷 × 10000 × 𝑛 7040×10000 ACĐ= = = 6.892 (U/ml) 𝑀 × 𝑡 × 600 - 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ 𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝐶Đ = 6.892 0.209 = 32.98 (U/mg protein) Tỷ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do: TLHL= 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ 𝐻𝐿 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 32.98 (%)= 53.91 ×100% = 61.2% Cố định phương pháp hấp phụ - Hàm lượng protein chế phẩm CGTase: ΔOD Nồng độ protein (µg/ml) Độ pha lỗng Thể tích (ml) Hàm lượng protein (mg) 0.467 28.08 20 1.123 - Hàm lượng protein cố định: ΔOD Nồng độ protein (µg/ml) Độ pha lỗng Thể tích (ml) Hàm lượng protein không cố định (mg) Hàm lượng protein cố định (mg) Hiệu suất cố định (%) 0.430 25.13 40 1.0052 0.1178 10.5% - Xác định hoạt tính CGTase: ∆OD = OD chứng – OD thử = 0.432 Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD =3.271 mg/ml =3271 µg/ml - Hoạt tính CGTase ml dung dịch CGTase tính theo cơng thức: 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛 3271×10×40 A= = = 76.83 (U/ml) 𝑀×𝑡 - 1135×15 Hoạt tính riêng CGTase: HTR enzyme tự = - - 1.123 = 68.41 (U/mg protein) 0.06 × 1135 × 15 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ 𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 𝐶Đ = 4.232 0.1178 = 35.92 (U/mg protein) Tỷ lệ hoạt tính enzyme cố định so với enzyme tự do: TLHL= - 76.83 Hoạt tính riêng enzyme cố định: HTR enzyme CĐ= - 𝐻𝐿 𝑝𝑟𝑜𝑡𝑒𝑖𝑛 = Xác định hoạt tính enzyme cố định: ∆OD = OD chứng – OD thử = 0.547 Từ ∆OD , dựa vào đồ thị ta có: CD=4.323 mg/ml=4323µg/ml Hoạt tính enzym cố định: với enzyme tham gia phản ứng: 600mg tổng lượng enzym cố định gel: 10g 𝐶𝐷 × 10000 × 𝑛 4323 ACĐ= = =4.232 (U/ml) 𝑀 × 𝑡 × 600 - 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 𝐻𝑇𝐶 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝐶Đ 𝐻𝐿 𝑒𝑛𝑧𝑦𝑚 𝑡ự 𝑑𝑜 (%)= 35.92 68.41 ×100% = 52,5% Nhận xét: Hàm lượng protein cố định phương pháp bắt giữ cao phương pháp hấp phụ Hoạt tính protein cố định phương pháp bắt giữ cao phương pháp hấp phụ III) CÂU HỎI: Nguyên tắc phương pháp xác định hoạt tính CGTase: Hoạt tính CGTase đánh giá thông qua lượng cyclodextrin CGTase tạo điều kiện xác định Dựa vào khả hấp phụ làm màu phenolphthalein cyclodextrin, ta xác định cyclodextrin tạo thành Hoạt tính enzyme định nghĩa số µg tạo thành phút điều kiện thí nghiệm Từ đưa vào đồ thị để tính số µg cyclodextrin tương ứng tạo CGTase Hoạt tính CGTase ml dung dịch CGTase tính theo cơng thức: A= 𝐶𝐷 × 10 × 𝑛 𝑀×𝑡 (U/ml) Sơ đồ quy trình cố định CGTase: Cố định phương pháp bắt giữ + 15ml dung dịch alginate 2% Enzym (V=2ml) Hỗn hợp enzym-alginate Nhỏ từ từ vào 30ml CaCl2 0.2M Gel Rửa Đệm Tris-HCl lần Dịch rửa Gel Ca-alginate-enzym Dịch lọc Cố định phương pháp hấp phụ 15ml alginate 2% + 10 phút 30ml CaCl2 0.2M Gel Ca-alginate +20 ml đệm Tris HCl pH8 +2 ml enzyme CGTase 45 phút Gel Rửa Đệm Tris-HCl Gel enym-alginat-Ca Dịch rửa BÀI 10: TINH CHẾ ENZYM LYSOZYM BẰNG SẮC KÝ TRAO ĐỔI ION I) TÓM TẮT LÝ THUYẾT: Khái quát: - Mỗi protein có giá trị pH mà tổng điện tích âm dương nhau, pH gọi pI (điểm đẳng điện) Khi pH dung dịch lớn pI protein tích điện âm ngược lại - Nhựa sắc ký trao đổi ion gồm chất rắn khơng tan gắn nhóm mang điện tích liên kết cộng hóa trị, nhóm mang điện tích liên kết với đối ion có điện tích trái dấu cách thuận nghịch nhờ tương tác tĩnh điện - Sắc ký trao đổi ion dựa vào trao đổi thuận nghịch điện tích protein với điện tích trái dấu pha tĩnh sắc ký, tùy theo cân ion pH dung dịch mà protein gắn vào nhựa hay bị đẩy khỏi nhựa Nguyên tắc: Dựa vào khác biệt pI lysozym (pI=10) so với protein khác lòng trắng trứng(pI ≤ 6), pH nhựa trao đổi cation lysozym có pI > pH tích điện dương bị giữ lại cột protein khác có pI