Nghiên cứu Đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ Độc tố thần kinh bont e từ mẫu thực phẩm thu thập tại việt nam và tối Ưu phản Ứng real time pcr xác Định sự có mặt của gene

Nghiên cứu Đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ Độc tố thần kinh bont e từ mẫu thực phẩm thu thập tại việt nam và tối Ưu phản Ứng real time pcr xác Định sự có mặt của gene

TỔNG QUANVi khuẩn Clostridium botulinum

1.1.1 Đặc điểm vi khuẩn C botulinum Đặc điểm hình thái

Clostridium botulinum (C botulinum) là vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có khả năng sinh nội bào tử khi môi trường sống bất lợi Những thay đổi hình thái cần thiết cho quá trình hình thành bào tử vẫn chƣa có nghiên cúu chính xác, nhƣng các nhà khoa học cho là do điều kiện môi trường có hại cho môi trường sống của vi khuẩn chẳng hạn nhƣ nhiệt độ cao, oxy, bức xạ tia cực tím.v.v đe dọa sự tồn tại của các tế bào không thể duy trì sự tăng trưởng sinh dưỡng [71] C botulinum có mặt nhiều nơi trong tự nhiên đặc biệt những nơi như đất vườn, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm hay trong thực phẩm Vi khuẩn C botulinum đƣợc tìm thấy trong ruột của các vật nuôi trong nhà, trong ruột cá, đôi khi có cả trong ruột người và vùng nước bị ô nhiễm.v.v

Do vi khuẩn có trong tự nhiên nên thực phẩm dễ bị nhiễm trong quá trình sản xuất chế biến, vận chuyển và bảo quản Đặc biệt C botulinum có khả năng lây nhiễm và phát triển mạnh trong các loại thực phẩm nhƣ thịt cá ƣớp muối, ƣớp lạnh, hun khói, đồ hộp, xúc xích, lạp xưởng, phomat bị đóng kín Vì các loại thực phẩm này là môi trường thuận lợi về các điều kiện kỵ khí, nhiệt độ, độ pH và có đầy đủ chất dinh dưỡng cần thiết cho vi khuẩn sinh trưởng C botulinum có khả năng sinh độc tố botulinum gây độc trong điều kiện thường hay ở dạng nội bào tử [22] Botulinum là độc tố thần kinh, gây tê liệt các bó cơ thần kinh và là nguyên nhân gây tử vong cho con người và nhiều động vật Các nhóm thuộc chi Clostridium này bao gồm các chủng gây bệnh đáng chú ý khác nhƣ Clostridium difficile (hiện đƣợc phân loại lại là Clostridioides difficile), Clostridium tetani và Clostridium perfringenes Những vi khuẩn này lần lƣợt là nguyên nhân gây ra các bệnh nhƣ tiêu chảy mãn tính, uốn ván và hoại tử [20, 44]

Clostridium botulinum có trong thực phẩm có thể có hoặc không có khả năng gây ngộ độc do vi sinh vật không phát triển thì không có độc tố đƣợc tạo ra Mặc dù

2 nhiều loại thực phẩm đáp ứng nhu cầu dinh dƣỡng cho sự phát triển của C botulinum nhƣng không phải tất cả đều cung cấp các điều kiện kỵ khí mà vi khuẩn cần thiết Các biện pháp ngăn sự tăng trưởng của C botulinum trong các loại thực phẩm nhƣ chọn kiểu đóng gói phù hợp, sản phẩm đóng hộp có tính axit (độ pH thấp), có hoạt độ nước thấp, nồng độ NaCl cao, hoặc sử dụng thêm chất bảo quản khác hay kết hợp các điều kiện này lại với nhau Nhiệt độ tối ƣu cho sự phát triển và sinh độc tố của các chủng phân giải protein là 35°C, các chủng không phân giải protein là 26°C - 28°C C botulinum type B, E và F không phân giải protein có thể sinh độc tố ở nhiệt độ thấp (3°C - 4°C) Tuy nhiên việc hạ thấp nhiệt độ để bảo quản sẽ không ngăn chặn đƣợc sự phát triển và hình thành độc tố của các chủng không phân giải protein trừ khi nhiệt độ đƣợc kiểm soát chính xác và giữ ở mức dưới 3°C Độc tố của các chất không phân giải protein không biểu hiện độc tính tiềm ẩn tối đa cho đến khi chúng đƣợc kích hoạt bằng trypsin, độc tố của chất phân giải protein thường xuất hiện ở dạng được kích hoạt hoàn toàn (hoặc gần như hoàn toàn) Những khác biệt này có ý nghĩa quan trọng trong việc xem xét dịch tễ học và xét nghiệm về sự bùng phát bệnh ngộ độc Chẩn đoán lâm sàng bệnh ngộ độc hiệu quả nhất bằng cách xác định lƣợng độc tố botulinum trong máu, phân hoặc dịch nôn của bệnh nhân, khi đó bệnh phẩm phải được thu thập trước khi bệnh nhân được tiêm thuốc kháng độc tố botulinum Đặc điểm cấu trúc

C botulinum là một loại trực khuẩn gram dương, kỵ khí bắt buộc, hình thành nội bào tử [2, 11, 64] C botulinum có thể di động do có tiên mao và lông nhung, hỡnh dỏng thẳng, dài 2-10 àm, bào tử hỡnh bầu dục hoặc hỡnh dựi trống (hỡnh 1.1)

Hình 1.1: Vi khuẩn Clostridium botulinum dưới kính hiển vi Nguồn: http://www.tumblr.com/tagged/clostridium

Tác nhân gây bệnh của vi khuẩn C botulinum là do chất độc thần kinh botulinum (BoNT) [5, 29] BoNT là một metalloprotease, có khả năng cắt các thụ thể protein chứa vùng N-Ethylmaleimide (SNARE) hòa tan trong các đầu dây thần kinh sau khớp thần kinh, ngăn chặn sự giải phóng chất dẫn truyền thần kinh và ngăn chặn sự truyền thần kinh đến các cơ tác động [62] BoNT có kích thước 150-kDa mang hoạt tính kẽm-endopeptidase [50] bao gồm hai tiểu đơn vị: chuỗi nặng 100 kDa chịu trách nhiệm liên kết và dịch chuyển các chất qua màng khớp thần kinh thông qua các thụ thể cụ thể, chuỗi nhẹ 50 kDa có nhiệm vụ phân cắt các protein liên quan đến túi acetylcholine, lắp ghép và hợp nhất với màng trước synap [49]

Hình 1.2: Cấu trúc độc tố botulinum Nguồn: Botulinum Toxin Therapy pp 11–33

BoNT được sản sinh từ vi khuẩn C botulinum dưới dạng độc tố tiền thân gồm phần chất độc thần kinh và phần không gây độc, phần không gây độc này bảo vệ chất độc thần kinh ở điều kiện môi trường tự nhiên, hỗ trợ hấp thu chất độc thần

4 kinh khi độc tố đi vào cơ thể [17] và độc tố gây độc khi tiểu đơn vị đƣợc giải phóng Điều này đƣợc cho là có liên quan đến sự phân cắt của phân tử độc tố [8, 51]

1.1.2 Phân loại vi khuẩn C botulinum

Dựa vào đặc điểm huyết thanh, BoNT đƣợc chia thành 7 loại huyết thanh độc tố từ A đến G (hình 1.3) với các biến thể phân nhóm đƣợc chỉ định trong mỗi loại độc tố có cấu trúc tương tự nhau nhưng khác nhau về mặt kháng nguyên [25] Họ chất độc thần kinh này có liều gây chết ở người ước tính từ 1 đến 3 ng/kg Do BoNT độc tính cao, dễ sản xuất và trong lịch sử đã đƣợc sử dụng làm vũ khí sinh học nên BoNT đã đƣợc Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) chỉ định là tác nhân đe dọa loại A (các tác nhân loại A đƣợc CDC định nghĩa là những tác nhân dẫn đến tỷ lệ tử vong cao và có khả năng tác động lớn đến sức khỏe, có thể gây hoang mang trong cộng đồng, cần có hành động đặc biệt để chuẩn bị cho sức khỏe mọi người) Mặc dù hiện tại có 7 loại huyết thanh kháng nguyên đƣợc biết đến của BoNT nhƣng chỉ có 3 loại huyết thanh là A, B và E liên quan chủ yếu đến tình trạng nhiễm độc ở người Các loại kháng nguyên của C botulinum đƣợc xác định qua việc trung hòa hoàn toàn độc tố bằng cách sử dụng kháng độc tố tương đồng Sự trung hòa chéo của một loại độc tố cụ thể bằng các kháng độc tố khác loại sẽ không xảy ra hoặc xảy ra ở mức tối thiểu Ngoài ra có một số chủng tiết ra hai loại độc tố, tức là Ba, Ab, Bf và Af (chữ in hoa biểu thị loại độc tố chính) Các kiểu huyết thanh loại A, B, E có liên quan đến các trường hợp ngộ độc lâm sàng ở người, trong số 7 kiểu huyết thanh thì A và B là độc nhất [43]

Dựa vào kiểu gene và kiểu hình C botulinum đƣợc chia làm 4 nhóm riêng biệt đánh số từ I – IV (hình 1.3)

 Các chủng C botulinum nhóm I là nhóm phổ biến nhất, có khả năng phân giải protein, đường hóa và sản xuất BoNT loại A, B và F [7]

 Các chủng C botulinum nhóm II không phân giải protein, có mô hình chuyển hóa carbohydrate khác với các nhóm phân giải protein Bên cạnh đó C botulinum nhóm II có mức độ phổ biến ít hơn so với C botulinum nhóm I [25]

 Các chủng C botulinum nhóm III không phân giải protein gồm các chủng sản xuất BoNT loại C và D có ở lòng trắng trứng đông tụ hoặc thịt và có một mô hình trao đổi chất chung khiến chúng khác biệt với các loại khác Trong đó độc tố loại C chủ yếu gây ngộ độc ở chim, độc tố loại D có thể gây ngộ độc ở các loài động vật khác nhau [68]

 Các chủng nhóm IV đƣợc xác định là vi khuẩn Clostridium argenetinense tạo ra BoNT loại G, độc tố này thường không gây bệnh và Clostridium argenetinense đƣợc báo cáo là ít phổ biến hơn cả trong 4 nhóm [68]

 Các Clostridia khác, cụ thể là C butyricum và C baratii cũng đƣợc biết là sản sinh ra độc tố loại E và F tương ứng (hình 1.3)

Hình 1.3: Phân loại Clostridium botulinum theo kiểu gene và đặc điểm huyết thanh [60]

C.botulinum có thể tìm thấy ở nhiều nơi, nhƣng bản chất C botulinum là vi khuẩn hoại sinh trong đất Nó xuất hiện rất phổ biến mặc dù sự phân bố địa lý

6 không đồng nhất Tại Hoa Kỳ ở giai đoạn năm 1950-1975, khi 85% những người ở phía tây sông Mississippi bị ngộ độc do loại độc tố loại A và 63% những người ở phía đông bị ngộ độc do độc tố loại B Ngƣợc lại, tại Châu Âu C botulinum loại B xuất hiện phổ biến hơn loại A C botulinum loại E tìm thấy ở vùng có khí hậu lạnh nhƣ Bắc Mỹ, Nhật Bản và các vụ ngộ độc đƣợc phát hiện tại đây đa số do cá là động vật lây nhiễm Các chủng tạo ra kiểu huyết thanh BoNT/C và BoNT/D thường có liên quan đến xác chết của các loài chim và động vật khác ở nhiều khu vực trên toàn thế giới Độc tố F và G đã được phát hiện trong trầm tích đất và nước, tuy nhiên xuất hiện rất ít so với các loại khác.

Vi khuẩn C botulinum serotype E

1.2.1 Đặc điểm của vi khuẩn C botulinum serotype E và độc tố thần kinh BoNT/E

Clostridium botulinum loại E thuộc nhóm II - nhóm không phân giải protein, được tìm thấy nhiều trong môi trường nước, trầm tích Mặc dù dạng bào tử của vi khuẩn C botulinum loại E dễ bị bất hoạt bởi nhiệt hơn so với các loại C botulinum khác và có thể tồn tại trong các điều kiện xử lý nhiệt nhẹ nhƣ hấp nóng truyền thống, khi đó nhiệt độ bên trong thực phẩm thường chỉ đạt 65°C – 85°C [28] Thực tế là C botulinum loại E có thể phát triển và hình thành độc tố ở nhiệt độ thấp (3°C) làm tăng nguy cơ gây độc, đặc biệt đối với các sản phẩm chế biến đông lạnh có thời hạn sử dụng dài

Trình tự nucleotide của BoNT/E bao gồm chuỗi nhẹ (∼50 kDa) và chuỗi nặng (∼100 kDa) đƣợc liên kết với nhau bằng liên kết disulfide BoNT đƣợc tạo ra bởi các loại C botulinum khác nhau có những đặc điểm tương đồng về trình tự và cấu trúc [35, 51] Chuỗi nhẹ là một metalloprotease trong khi nửa đầu C và N của chuỗi nặng lần lƣợt liên quan đến sự liên kết đặc hiệu thần kinh và chuyển vị trí vào bào tương của tế bào thần kinh Bất kỳ sự thay đổi nào trong trình tự axit amin tại các vùng chức năng này đều ảnh hưởng đến cấu trúc, chức năng và đặc tính kháng nguyên của phức hợp BoNT [34] Độc tố botulinum serotype E đƣợc chia thành 12 loại subtype khác nhau, ký hiệu từ E1 đến E12 Trong đó BoNT/E9 có trình tự gene khác biệt nhất so với các

7 loại subtype còn lại, đẫn đến sự khác biệt về axit amin, cụ thể BoNT/E9 khác với BoNT/E1-8, BoNT/E10 và BoNT/E11 ở mức từ 10,1% – 11,8% [59] Trong khi BoNT/E1, BoNT/E2 và BoNT/E3 có sự phân loại thành các nhánh phát sinh gene riêng biệt nhƣng có liên quan chặt chẽ với nhau [41, 44], phân tích axit amin trong trình tự của chúng cho thấy sự khác biệt rất nhỏ, nằm trong khoảng từ 0,9% – 1,8%

So sánh toàn bộ bộ gene của chủng vi khuẩn Clostridium butyricum loại E từ Ý và Hoa Kỳ với các chủng C botulinum loại E khác nhau đã đƣợc công bố trên ngân hàng gene cho thấy bont/E có thể đƣợc chuyển giao giữa hai loài Clostridia thông qua chuyển vị Dựa trên trình tự của bont/E, các chủng C butyricum loại E của Ý và Trung Quốc đƣợc dự đoán sẽ tạo ra hai phân nhóm BoNT/E khác nhau, lần lƣợt là E4 và E5

Chất độc thần kinh botulinum đƣợc liên kết với các protein phụ trong các phức hợp khác nhau Những độc tố thần kinh được tạo ra dưới dạng phức hợp tiền thân bao gồm BoNT, hemagglutinin (HA), non-HA không độc (NTNH) và có thể thêm các thành phần không đặc trƣng khác nhƣ P47 và OrfX [31, 32] Các gen mã hóa các protein này đƣợc liên kết thành một cụm và khác nhau về thành phần cũng nhƣ cấu trúc giữa các chủng huyết thanh và chủng khác nhau Nhìn chung, các gen ntnh và bont nằm liên kết và sắp xếp ở vùng cuối của cụm gen, trong khi các vùng đầu khác nhau giữa các loại và phân nhóm khác nhau của C botulinum Các gene mã hoá độc tố thần kinh loại E và F thường nằm trên nhiễm sắc thể (nhưng đối với một phần nhỏ các chủng, gene độc tố thần kinh loại E hiện diện trên một plasmid sao chép đơn) [54-58]

Hình 1.4: Vị trí cụm gene mã hoá độc tố botulinum loại E [59]

C botulinum loại E chiếm ưu thế trong môi trường nước Nó khác với các kiểu độc tố trên cạn của C botulinum ở cách sắp xếp cụm gen độc tố thần kinh

Cụm gene độc tố thần kinh ở các chủng C botulinum loại E có cấu trúc chung gồm

8 3 gene: Bont, orfx, NTNT, các gene orfx2 , orfx1 và p47 thuộc cụm gene orfx đƣợc sắp xếp tuần tự ở khu vực đầu của cụm gene độc tố thần kinh loại E Một phần orfx2 (676 bp) được tìm thấy ở khu vực đầu của cụm gene có cùng hướng với orfx1, trong khi p47 (chƣa ghi nhận rõ chức năng) nằm ngay phía trên của NTNH và có hướng ngược lại với orfx2và orfx1 Trong thực tế, để có thể hiểu rõ hơn hoạt động của gene, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu khả năng biểu hiện của từng gene cụ thể Trên thế giới có nhiều công bố về nghiên cứu dựa trên xét nghiệm miễn dịch bằng liên kết enzyme (ELISA) để phát hiện BoNT/E Điển hình là nghiên cứu của Sarita và đồng nghiệp năm 2018 [63] Tại Việt Nam, đến nay chƣa có công bố nào về vấn đề này

1.2.2 Phân bố và thực trạng nhiễm BoNT/E

C botulinum serotype E đƣợc phân bố rộng rãi trên thế giới Các chủng hình thành chất độc thần kinh loại E tìm thấy nhiều trong trầm tích ở vùng Bắc Cực và cận Bắc Cực Vì vậy, bệnh ngộ độc độc tố botulinum serotype E tại đây được người dân rất chú trọng, đặc biệt trong việc sử dụng thực phẩm

Serotype E là loại huyết thanh sản sinh từ vi khuẩn C botulinum, tỷ lệ mắc bệnh đã được xác định từ trầm tích biển vùng nước ven biển của các nước như Canada, Alaska, Greenland và Nga Khu vực biển Baltic có mức độ ô nhiễm cao nhất trong thế giới với 81% đến 100% các mẫu trầm tích dương tính với C botulinum loại E Các trầm tích nước ngọt ở các khu vực khác nhau của thế giới, chẳng hạn nhƣ Hoa Kỳ, Nhật Bản, Thụy Điển và Phần Lan, cũng đƣợc phát hiện chứa độc tố serotype E Các nghiên cứu đƣợc thực hiện ở Đức, Đan Mạch và Phần Lan đã cho thấy ở đáy trại nuôi cá hồi bị nhiễm trầm tích ở mức 29% đến 68% Vi khuẩn C botulinum loại E đƣợc ghi nhận phát triển trong xác cá, động vật có vú, động vật không xương sống ở biển và những sinh vật này cũng mang bào tử trong ruột của chúng Nước là một yếu tố quan trọng khác ảnh hưởng đến phân bố bào tử qua môi trường biển [2] Có ý kiến cho rằng bào tử của vi khuẩn

C botulinum serotype E trong môi trường biển có nguồn gốc lục địa và phát tán ra biển theo dòng nước thải ra từ các vùng đất rộng lớn Tuy nhiên, người ta vẫn kết

9 luận rằng C botulinum serotype E là một sinh vật sống dưới nước thực sự, vì rất ít bào tử loại E đƣợc tìm thấy trong đất trên cạn

Một số nghiên cứu trên thế giới đã chỉ ra rằng tỷ lệ phân bố vi khuẩn C botulinum loại E tại những vùng khảo sát rất cao Trong các cuộc khảo sát đƣợc thực hiện ở Phần Lan, tỷ lệ nhiễm C.botulinum serotype E trong cá sống chiếm từ

10% đến 40% tùy thuộc vào loài cá đƣợc nghiên cứu Tại các khu vực bán lẻ hải sản, người ta phát hiện 5% sản phẩm thủy sản đóng gói hút chân không và 3% sản phẩm thủy sản đóng gói không hút chân không đều dương tính với bào tử C botulinum loại E Các phương pháp chế biến cá hiện tại không đủ để loại bỏ các bào tử khỏi cá sống là một trong những nguyên nhân gây ra hàng loạt các đợt bùng phát ngộ độc gần đây ở Bắc Âu Bởi vì các sản phẩm sau chế biến có thời hạn sử dụng dài, nhiều sản phẩm đƣợc phân phối trên toàn quốc và quốc tế đã tạo điều kiện cho sự lây lan của mầm bệnh đến nhiều nơi, do đó làm phức tạp việc điều tra khả năng bùng phát ngộ độc thực phẩm

Tại Canada, tỷ lệ mắc bệnh C botulinum serotype E tại khu vực đất ven biển dọc theo bờ biển là 87,5%, trong số các mẫu đƣợc thử nghiệm ở các khu vực eo biển Hudson, vịnh Hudson và vịnh Ungava Các bào tử chứa độc tố đƣợc phát hiện trong nước biển hoặc bề mặt đá ven biển chiếm 17,6% ở phía Nam vịnh Ungava C botulinum serotype E đƣợc tìm thấy gần các địa điểm giết mổ nằm dọc theo bờ biển vịnh Ungava cao hơn so với bờ biển của eo biển Hudson và vịnh Hudson Khu vực sông Koksoak ghi nhận hàm lƣợng C botulinum loại E cũng rất cao với nồng độ trung bình cao nhất (270ng/kg) Sự đa dạng sinh học các chủng C botulinum loại E cũng đã đƣợc nghiên cứu tại 21 địa điểm giết mổ và khu vực xung quanh dọc theo bờ biển Nunavik với 83% các chủng phân lập (44/53) Nhiều nguồn lây nhiễm C botulinum loại E có thể liên quan đến việc giết mổ hải cẩu bị nhiễm bẩn ở khu vực này nhưng nguy cơ ô nhiễm dường như cao hơn nhiều từ các nguồn môi trường dọc theo bờ biển phía nam vịnh Ungava và trầm tích của sông Koksoak [37] Độc tố C botulinum serotype E cũng là nguyên nhân gây tử vong trên diện rộng cho chim và cá ở Great Lakes Gene mã hoá độc tố bont/E đã đƣợc khuếch đại

10 bằng phương pháp PCR định lượng cho 150 mẫu tảo (chủ yếu là loài Cladophora) đƣợc thu thập năm 2012 từ 10 bãi biển Great Lakes ở 5 bang, đồng thời 74 mẫu trầm tích và 37 mẫu nước cũng được phân tích Nồng độ gene bont/E trong tảo cao hơn so với trong nước và trầm tích, cho thấy thảm tảo cung cấp môi trường vi mô tốt hơn cho C botulinum Gene bont/E cũng đƣợc phát hiện có trong tảo ở các bãi biển Jeorse Park và Portage Lake Front (hồ Michigan) và bãi biển khu giải trí bang Bay City trên Vịnh Saginaw (hồ Huron) Nồng độ bont/E cao nhất đƣợc phát hiện tại Bay City (1,98 × 10 5 bản copy/ml tảo hoặc 5,21 × 10 6 g [trọng lƣợng khô]

Tháng 4 năm 2021 tại Kon Tum xảy ra một vụ ngộ độc thực phẩm, nguyên nhân được xác định là do ăn phải măng rừng Vụ ngộ độc này khiến 6 người phải nhập viện cấp cứu, trong đó 1 người tử vong Theo kết quả phân tích từ Viện Kiểm nghiệm vệ sinh an toàn thực phẩm Quốc gia, các mẫu thực phẩm người dân ăn phải đều mang gene mã hoá độc tố BoNT/E Đây là trường hợp rất hiếm gặp tại Việt Nam, tuy nhiên cũng là một lời cảnh tỉnh cho người dân về nguy cơ ngộ độc do ăn phải thức ăn bị nhiễm độc Cần nâng cao nhận thức của người dân về cách phòng ngừa ngộ độc thực phẩm nói chung hay ngộ độc BoNT nói riêng.

Độc tố botulinum

1.3.1 Đặc điểm của độc tố botulinum

Chất độc thần kinh botulinum (BoNT), tác nhân gây bệnh ngộ độc ở người, đƣợc sản xuất bởi vi khuẩn Clostridium botulinum và một số loài Clostridia khác

[1, 51, 63] BoNT có công thức phân tử là C6760 H10447N1743O2010S32, là chất độc gây tử vong ở người mạnh nhất từng được biết, với liều gây chết trung bình ở người khoảng 1,3-2,1 ng/kg tiêm tĩnh mạch hoặc tiêm bắp và 10-13 ng/kg khi hít vào [2, 36]

BoNT hình thành phức hợp độc tố tiền thân với các protein liên quan đến độc tố thần kinh không gây độc Non-hemagglutinin (NTNH) bảo vệ chất độc khỏi môi trường axit trong dạ dày Các phức hợp độc tố tiền thân từ các kiểu huyết thanh BoNT loại B, D, G và trong một số chủng BoNT/A chứa protein hemagglutinin

11 (HA) NTNH và HA có kích thước khác nhau từ 300 kDa đến 900 kDa Những protein phụ này bảo vệ chất độcthần kinh và có thể giúp độc tố dễ dàng đi qua hàng rào biểu mô ruột [19]

Hình 1.5: Ví dụ về cụm gene mã hoá độc tố botulinum loại A, B (hình minh hoạ)

1.3.2 Các dạng ngộ độc botulinum

Các dạng ngộ độc thịt ở người bao gồm: gồm ngộ độc thực phẩm, ngộ độc trẻ sơ sinh, ngộ độc vết thương.v.v

Ngộ độc thực phẩm là do ăn phải thực phẩm bị nhiễm BoNT, chỉ cần một vài miligam thực phẩm nhiễm độc cũng đủ gây ra các triệu chứng điển hình và có thể tử vong nếu không được điều trị kịp thời [53] Các triệu chứng thường xuất hiện sau 12–72 giờ sau khi ăn phải thực phẩm có nhiễm độc [1] Ngộ độc thực phẩm trước đây là dạng ngộ độc phổ biến nhất ở người và thường liên quan đến thực phẩm chưa nấu chín hoặc quá trình chế biến thực phẩm không đúng cách trong thương mại hay chế biến tại nhà Các kỹ thuật bảo quản nhƣ lên men hoặc ngâm chua sau đó đóng hộp hoặc đóng chai thực phẩm mà không xử lý nhiệt trước là nguyên nhân lớn nhất tạo ra các điều kiện kỵ khí cần thiết cho sự phát triển của bào tử và vi khuẩn [70]

Việc sử dụng các biện pháp kiểm soát thực phẩm nhƣ nấu chín (xử lý nhiệt 121°C trong 3 phút), cấp đông và làm lạnh (dưới 3°C) khi áp dụng đã làm giảm đáng kể các đợt bùng phát do ngộ độc thực phẩm [41, 43, 55, 54] C botulinum nhóm I và II có liên quan đến sự bùng phát bệnh ngộ độc thực phẩm ở người, các kiểu huyết thanh độc tố BoNT/A và BoNT/B là phổ biến nhất và các trường hợp do BoNT/E và BoNT/F hiếm khi được báo cáo Chủng nhóm I được phát hiện thường liên quan đến các đợt bùng phát liên quan đến thực phẩm đóng hộp được chế biến thương mại

12 có thời hạn bảo quản ổn định, do bào tử của chúng có khả năng chịu nhiệt cao và có nhiệt độ tăng trưởng tối thiểu là 12°C [53] Tuy nhiên, các chủng nhóm II không phân giải protein có thể phát triển ở nhiệt độ thấp tới 3°C liên quan đến các thực phẩm đƣợc làm nóng hoặc làm lạnh ở mức tối thiểu điển hình là sản phẩm từ cá hay các sản phẩm từ biển [52]

1.3.2.2 Ngộ độc trẻ sơ sinh

Các bào tử C botulinum có trong môi trường khi xâm nhập vào hệ thống tiêu hóa của con người không gây ảnh hưởng xấu vì ruột người trưởng thành khỏe mạnh, không có lợi cho sự nảy mầm của bào tử [70] Tuy nhiên, đường tiêu hóa của trẻ sơ sinh chƣa hoàn thiện (trẻ từ 1 đến 6 tháng tuổi) nên dễ bị C botulinum xâm nhập hơn sau khi nuốt phải bào tử Điều này dẫn đến việc vi khuẩn sản xuất chất độc thần kinh nội sinh, hấp thu từ thành ruột và đƣợc gọi là hiện tƣợng “trẻ sơ sinh mềm” khiến trẻ không thể nuốt hoặc bú với các triệu chứng thường bắt đầu từ 18 đến 36 giờ sau khi nhiễm độc tố [15]

Ngộ độc vết thương là dạng ngộ độc hiếm gặp, nguyên nhân là do BoNT hấp thụ vào máu sau khi vết thương bị nhiễm bào tử vi khuẩn C botulinum [9] Môi trường kỵ khí trong vết thương áp xe cung cấp điều kiện cần thiết cho sự phát triển và xâm chiếm của bào tử Biểu hiện các triệu chứng lâm sàng thường mất nhiều thời gian hơn so với các dạng ngộ độc lâm sàng khác, thường xuất hiện từ 4 ngày đến 14 ngày [45] Đa số các vụ ngộ độc vết thương được ghi nhận thường liên quan đến bệnh nhân bị chấn thương và những người nghiện chích ma túy do sử dụng kim bị nhiễm bẩn hoặc bạch phiến không tinh khiết Bệnh nhân mắc ngộ độc viết thương được điều trị hỗ trợ hô hấp, một số trường hợp cần phẫu thuật, dùng kháng sinh và sử dụng thuốc kháng độc tố

1.3.2.4 Một số dạng ngộ độc độc tố hiếm gặp khác

Ngoài 3 dạng ngộ độc thường gặp trên, người ta ghi nhận một số trường hợp ngộ độc ở đường ruột người trưởng thành, xảy ra khi bị vi khuẩn C botulinum xâm nhập vào đường tiêu hóa do hệ vi sinh vật đường ruột bị suy giảm Ngộ độc thường

13 gặp sau khi bệnh nhân phẫu thuật đường tiêu hóa hoặc mắc bệnh viêm ruột [19]

Các trường hợp ngộ độc hiếm gặp khác xảy ra do sử dụng BoNT không đúng cách cho mục đích điều trị và thẩm mỹ đƣợc gọi là ngộ độc latrogene Một dạng nhiễm độc phi tự nhiên khác cực kỳ hiếm gặp do hấp thụ BoNT qua niêm mạc đường hô hấp nên đƣợc đƣa ra giả thuyết về khả năng xảy ra sự kiện khủng bố khi sử dụng BoNT làm vũ khí sinh học [27]

1.3.3 Thực trạng ngộ độc botulinum 1.2.3.1 Thực trạng ngộ độc botulinum trên thế giới

So với những bệnh lây truyền từ thực phẩm hoặc do các mầm bệnh khác thì ngộ độc thịt do thực phẩm gây ra tương đối hiếm Theo Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Mỹ (CDC), từ năm 2001 đến năm 2015, Mỹ xuất hiện 278 ca ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn Clostridium botulinum và khiến 23 người thiệt mạng Trong đó, độc tố loại A phổ biến nhất chiếm tỉ lệ 64 %, độc tố loại B và E ít gặp hơn với tần suất tương đương nhau gần 18 %, loại F rất hiếm gặp nên chỉ chiếm tỉ lệ chưa tới 1 % Tương tự, ngộ độc loại A và B cũng chiếm phần lớn số vụ ngộ độc ở Pháp lần lƣợt là 59 % và 31 %, còn lại là các dạng ngộ độc khác hiếm gặp ở người Một nghiên cứu tại Đức cho thấy, vi khuẩn C botulinum phát hiện ở 20% trẻ em tử vong do hội chứng đột tử ở trẻ sơ sinh (SIDS – Sudden Infant Death Syndrome)

1.3.3.2 Thực trạng ngộ độc botulinum tại Việt Nam

Trên thế giới, vấn đề ngộ độc thực phẩm và các tác nhân liên quan đã đƣợc chú trọng từ lâu Trong khi đó ở Việt Nam, vấn đề này rất ít đƣợc quan tâm Ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam chƣa đƣợc thống kê đầy đủ do thói quen tự điều trị các triệu chứng thường gặp như đau bụng tiêu chảy, liệt tạm thời.v.v Vì quá trình diễn biến nhanh, bệnh nhân có thể tử vong với kết luận không rõ nguyên nhân, không đƣợc chẩn đoán hay điều trị không đúng bệnh Chính vì vậy, việc tổng kết số vụ và ca bệnh còn hạn chế

Tháng 8 năm 2020, Việt Nam ghi nhận các ca bệnh đầu tiên do ngộ độc liên quan đến vụ “Pate Minh Chay” Thống kê đến ngày 4 tháng 9 năm 2020, tại các địa

14 phương trên cả nước ghi nhận 14 trường hợp ngộ độc Mẫu bệnh phẩm và mẫu pate đƣợc xét nghiệm tại Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn thực phẩm Quốc gia cho thấy các mẫu đều dương tính với vi khuẩn C botulinum Tháng 3 năm 2021, tại

Bình Dương ghi nhận chùm ca ngộ độc khiến 1 người tử vong và 5 người phải nhập viện trong tình trạng nguy kịch Theo Sở Y tế tỉnh Bình Dương, các ca bệnh này đều sử dụng sản phẩm pate chay tại một quán bún riêu và đều có kết quả xét nghiệm dương tính với vi khuẩn C botulinum Tháng 5 năm 2023, tại thành phố Hồ Chí Minh ghi nhận 6 ca ngộ độc botulinum do ăn bánh mì, chả lụa, mắm ủ lâu ngày

Các phương pháp phát hiện độc tố botulinum

Việc phát hiện độc tố của vi khuẩn Clostridium botulinum là cần thiết và quan trọng trong chẩn đoán và điều trị Xuất phát từ thực tế, ngộ độc do độc tố thần kinh của vi khuẩn C botulinum mang tính cấp tính, diễn biến nhanh chóng và có tỷ lệ tử vong cao Triệu chứng thường xuất hiện trong vòng vài giờ sau khi ăn thức ăn bị nhiễm độc bao gồm: yếu cơ, khó nuốt, khó nói, khó thở, liệt toàn thân, có thể dẫn đến suy hô hấp và tử vong Tuy nhiên, các phương pháp cận lâm sàng như nuôi cấy

16 phân lập vi khuẩn, phương pháp phát hiện gene bont hay phương pháp phát hiện

BoNT đều chƣa đƣợc thực hiện đại trà tại các bệnh viện hay các đơn vị xét nghiệm

Vì vậy, một phương pháp phát hiện nhanh là cần thiết, là điều kiện tiên quyết để các bác sỹ có thể chẩn đoán bệnh chính xác giúp người bệnh có thể điều trị đúng bệnh kịp thời

Cơ sở của các phương pháp phát hiện độc tố thường dựa trên hoạt tính của protein, nuôi cấy vi khuẩn hay những trình tự DNA đặc trƣng

1.4.1 Các phương pháp phát hiện dựa trên chuỗi polypeptide 1.4.1.1 Thử độc trên chuột

Xét nghiệm khả năng gây chết trên chuột vẫn là thử nghiệm tiêu chuẩn để phát hiện độc tố thần kinh botulinum và đã có những bước tiến trong việc phát triển các thử nghiệm thay thế trong suốt thập kỷ qua [65] Thí nghiệm dựa trên việc tiêm vào màng bụng chuột mẫu đƣợc pha loãng trong dung dịch đệm phosphate Nếu mẫu chứa độc tố, chuột sẽ xuất hiện các dấu hiệu điển hình của bệnh ngộ độc thịt như yếu cơ và suy hô hấp Thông thường, các triệu chứng này biểu hiện trong vòng một ngày sau khi tiêm nhưng cũng có trường hợp có thể mất vài ngày

Việc xác định loại độc tố dựa vào khả năng trung hòa độc tố của kháng huyết thanh đặc hiệu Phương pháp này rất nhạy và có thể xác định được bất kỳ loại độc tố nào trong 7 loại độc tố, chỉ cần 5-10 pg có thể gây chết 50% chuột và giới hạn phát hiện trong mẫu là 0,1 ng/mL mẫu [72] Trong phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng, thử nghiệm này đƣợc dùng cho mẫu phân, huyết thanh, dịch dạ dày, mẫu vết thương và mẫu thức ăn cũng như phần nổi của dịch vi khuẩn Tuy nhiên xét nghiệm này giá thành đắt, tốn nhiều thời gian và công sức, bên cạnh đó còn gây tranh cãi đến vấn đề y đức do sử dụng động vật làm thí nghiệm sống Một loại thử nghiệm khác trên chuột là làm tê liệt cơ cục bộ do tiêm dưới da để kiểm tra hiệu lực của độc tố thần kinh botulinum nhằm mục đích trị liệu [57]

Cho đến nay, nhiều nghiên cứu đã đƣợc thực hiện để thay thế thử nghiệm trên chuột bằng các phương pháp dựa trên miễn dịch như xét nghiệm kháng thể

17 huỳnh quang, khuếch tán miễn dịch, cảm biến sinh học sợi quang, ELISA, khuếch đại streptavidin-biotin Tuy nhiên phương pháp này có độ nhạy và độ đặc hiệu kém Một hạn chế đối với thử nghiệm miễn dịch là kháng thể có chất lƣợng tốt thường không có sẵn Thêm vào đó hoạt tính sinh học của độc tố thần kinh (bất hoạt sau khi xử lí với nhiệt độ) có thể cho kết quả dương tính giả Hơn nữa, sự khác nhau về kiểu gene ở những kiểu huyết thanh khác nhau của độc tố thần kinh có thể dẫn đến làm giảm ái lực đối với kháng thể đơn dòng gây ra kết quả âm tính giả [69]

Kỹ thuật ELISA là phương pháp xét nghiệm miễn dịch được sử dụng phổ biến nhất trong việc phát hiện độc tố thần kinh botulinum ELISA có thể kiểm tra độc tố tinh khiết hoặc chủng C botulinum sinh độc tố hoặc thức ăn nhiễm độc hay những mẫu bệnh phẩm từ người bị ngộ độc [61] Một nghiên cứu hợp tác giữa 11 phòng thí nghiệm cho thấy kĩ thuật ELISA có độ tái lặp cao khi kiểm tra thức ăn nhiễm độc tố ngộ độc thịt Có ít báo cáo về việc sử dụng kĩ thuật ELISA trên mẫu lâm sàng nhƣ huyết thanh, phân Kĩ thuật ELISA từ mẫu phân có độ nhạy giảm nhiều hơn so với các loại mẫu còn lại ELISA đƣợc đề xuất thử nghiệm trên mẫu lâm sàng phức tạp nhƣ máu và chất thải nhƣng cho đến nay chƣa có bài báo công bố

Nuôi cấy vi khuẩn là phương pháp kinh điển dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong các môi trường thích hợp Tuy nhiên việc phân lập vi khuẩn C botulinum rất khó do cần điều kiện kỵ khí nghiêm ngặt để phát triển, điều này tạo ra thách thức rất lớn để đưa vào xét nghiệm thường quy Việc phát hiện và phân lập C botulinum thông thường dựa trên việc nuôi cấy trong môi trường lỏng và sau đó phát hiện độc tố BoNT trong dịch nuôi cấy bằng phương pháp xét nghiệm sinh học trên chuột [33] Các mẫu lâm sàng nhƣ huyết thanh và phân, có thể đƣợc nuôi cấy trực tiếp hoặc xử lý trước bằng ethanol để loại bỏ vi khuẩn sinh dưỡng trong khi phục hồi bào tử vi khuẩn (theo Ủy ban Bắc Âu về phân tích thực phẩm, 1991) Độ phổ biến của vi khuẩn C botulinum trong các mẫu ở môi trường tự nhiên tương đối thấp (10 đến 1.000 bào tử/kg) và do không có sẵn môi trường thích hợp

18 nên việc định lƣợng vi khuẩn C botulinum trong mẫu bằng cách sử dụng quy trình đếm khuẩn lạc rất khó khăn Vì vậy, các quy trình làm giàu trong môi trường lỏng thường được ưu tiên sử dụng Số lượng ống nuôi cấy càng nhiều thì ước tính thu đƣợc càng chính xác C botulinum trong các ống nuôi cấy có thể đƣợc xác định chính xác bằng thử nghiệm sinh học trên chuột hoặc các phương pháp sinh học phân tử [24]

Tuy nhiên, do đặc điểm sinh lý khác nhau của các chủng nhóm I và nhóm II nên điều kiện nuôi cấy của các chủng này cũng có sự khác biệt, đặc biệt là nhiệt độ ủ Các chủng nhóm I phát triển tối ƣu ở nhiệt độ từ 35°C đến 37°C, trong khi các chủng nhóm II phát triển tốt nhiệt độ thấp hơn từ 25°C đến 30°C [62] Có nghiên cứu đã sử dụng điều kiện ủ ở 30°C nhƣng khi tiến hành lặp lại thí nghiệm kiểm tra các mẫu người ta thấy rằng ở nhiệt độ 26°C đến 30°C và 35 đến 37°C là thích hợp hơn để đảm bảo sự tăng trưởng tối ưu cho cả hai nhóm Thời gian ủ tối ưu tùy theo loại mẫu và phương pháp được chọn để xác định sự hiện diện của vi khuẩn C botulinum trong ống nuôi cấy

1.4.3 Phương pháp phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum dựa trên DNA

Các phương pháp phát hiện dựa trên DNA với nhiều nghiên cứu dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc công bố nhằm phát hiện vi khuẩn C botulinum như PCR, real - time PCR, LAMP.v.v Các phương pháp này có độ nhạy phân tích và độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn hơn rất nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy hay xét nghiệm thử độc trên chuột Tuy nhiên, các kỹ thuật này chỉ dựa trên việc phát hiện gene độc tố thần kinh botulinum trong mẫu mà không đánh giá đƣợc hoạt động của gene cũng nhƣ độc tố, đây là một điểm bất lợi nhƣng kỹ thuật sinh học phân tử lại không yêu cầu sử dụng động vật thí nghiệm nên đây vẫn là công cụ thích hợp để sàng lọc vi khuẩn, cho biết có hay không sự hiện diện của C botulinum và các Clostridia sản sinh độc tố khác

Phương pháp PCR thông thường

19 Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa trên nguyên lý di truyền sinh học Chỉ sau vài giờ, một phân tử DNA có thể đƣợc khuếch đại lên hàng triệu lần nhờ phản ứng PCR Kể từ khi đƣợc công bố lần đầu tiên năm 1985, kỹ thuật này đã có những đóng góp to lớn cho sự phát triển y sinh học phân tử [60] Trong phản ứng PCR, một đoạn DNA mục tiêu đƣợc nhân bản đặc hiệu bằng cách sử dụng một enzyme polymerase và các cặp primers phản ứng với DNA khuôn Sau vài giờ khuếch đại, các sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng các phương pháp như điện di trên gel agarose hoặc sequencing để xác định sự hiện diện và định danh của vi khuẩn

PCR có thể phát hiện vi khuẩn C botulinum đều dựa trên việc phát hiện một trong bảy loại gene độc tố Một số nghiên cứu cho thấy PCR đa mồi có thể phát hiện đồng thời các gene botA, botB, botE và botF trong một phản ứng duy nhất Điều này làm giảm đáng kể thời gian xét nghiệm, nhân công và chi phí thuốc thử Các sản phẩm PCR đa mồi đƣợc phát hiện bằng cách điện di trên gel agarose hoặc bằng cách lai trên màng đƣợc phủ đầu dò cDNA với các sản phẩm PCR

Phương pháp real - time PCR

Real-time PCR là một biến thể của PCR truyền thống, đƣợc sử dụng để nhân bản và định lƣợng một đoạn DNA cụ thể trong một mẫu Quá trình PCR diễn ra trong các ống nghiệm chứa các thành phần cần thiết bao gồm DNA mẫu, enzyme polymerase, nucleotide, chất phát huỳnh quang và cặp primers phản ứng với DNA khuôn Trong đó, quá trình nhân bản đƣợc theo dõi theo thời gian thực Điều này có nghĩa là sự khuếch đại của sản phẩm PCR (DNA mục tiêu) đƣợc đo tín hiệu và ghi lại sau mỗi chu kỳ nhân bản Kết quả được hiển thị trên phần mềm dưới dạng một đường cong đặc trưng được gọi là "đồ thị" Đường cong này thể hiện sự tích tụ của sản phẩm PCR theo thời gian và thường được biểu diễn trên một đồ thị có trục hoành là thời gian và trục tung là độ sáng hoặc nhiệt độ

Real-time PCR đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong phát hiện C botulinum nhờ vào những ƣu điểm sau:

20 - Độ nhạy và độ đặc hiệu phân tích: real-time PCR cho phép phát hiện DNA từ C botulinum ở nồng độ rất thấp, thậm chí là trong các mẫu chỉ chứa một lƣợng nhỏ vi khuẩn Điều này giúp xác định sự hiện diện của C botulinum một cách chính xác và tin cậy

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUVật liệu

1 mẫu DNA tổng số của chủng Clostridium có chứa đoạn gene mã hoá độc tố botulinum serotype E, được kiểm tra bằng phương pháp PCR bởi Viện Kiểm nghiệm Vệ sinh An toàn thực phẩm Quốc gia

Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Hóa chất dùng cho phản ứng PCR và real - time PCR bao gồm: nước đề ion khử trùng (dds H2O), master mix; cặp mồi đặc hiệu nhân lên đoạn gene mã hóa độc tố BoNT/E quan tâm

Bảng 2.1: Danh sách các master mix

STT Tên Master Mix Nhà cung cấp

1 Luna universal qPCR master mix (M3003S) New England Biolabs – Anh 2 Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific – Mỹ 3 Taq Master Mix (Dye Plus) (P222-04) Vazyme Biotech – Trung Quốc 4 Taq DNA Polymerase Master Mix RED Apex Bioresearch Products – Mỹ 5 Phanta flash Master mix 2x (P510) Vazyme Biotech - Trung Quốc 6 Taq Pro Universal SYBR qPCR Master

- Hóa chất điện di: gel agarose (Cleaver- Anh), RedSafe, marker 1kb DNA (New England Biolabs – Mỹ), marker 100 bp (Biofact – Hàn Quốc) đệm TAE 1X

Hóa chất dùng cho phản ứng biến nạp: kháng sinh ampicillin, tế bào khả biến E coli Top10, XGal, IPTG, LB Kit tách chiết plasmid TopPURE® PLASMID DNA

EXTRACTION KIT hãng ABT Hóa chất dùng cho phản ứng Ligase: kit pLUG-Prime® TA-cloning Vector Kit II - cat.no:11063, (Intronbio- Hàn Quốc), DNA (sản phẩm của phản ứng PCR)

Hình 2.1: Cấu trúc, trình tự và vị trí các điểm tham chiếu trên Vector pLUG

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm: máy nhân gene PCR GeneAtlas (Astec, Nhật Bản), máy real-time PCR CFX96 oplus (Bio Rad, Mỹ), bộ điện di ngang (Bio-Rad, Mỹ), máy chụp hình Gel Doc (Bio-Rad, Mỹ), tủ ấm Memmert (Đức)

Các phần mềm phân tích sử dụng trong nghiên cứu bao gồm:

- Phần mềm Image J: dùng để định lượng nồng độ DNA tương đối dựa vào độ sáng của các băng điện di trên ảnh chụp gel

- Phần mềm Microsoft Excel để tổng hợp phân tích kết quả, phần mềm phần mềm Microsoft Powerpoint dùng để vẽ hình minh hoạ cụm gene

- Phần mềm Blast NCBI (Basic Local Alignment Search Tool): giúp tìm kiếm trình tự tương đồng phổ biến, trong đó cung cấp các tham số khác nhau cho các trình tự đƣợc đƣa vào và đối với từng cơ sở dữ liệu Ví dụ, khi đƣa vào một trình tự truy vấn, dữ liệu này đƣợc chuyển đến để xử lí tại máy chủ của NCBI sau đó kết quả sẽ đƣợc trả về là thông tin trình tự các chuỗi DNA gần giống nhất từ cơ sở dữ liệu DNA mà người dùng chỉ định

- Phần mềm Bioedit: so sánh trình tự

- Phần mềm Oligo Analyzer (IDT), phần mềm Multiple Prime Analyzer (Thermo Scientific): phân tích và so sánh đồng thời nhiều trình tự mồi với Tm (°C), chiều

25 dài mồi, thành phần, tỷ lệ mỗi nu (A, T, C và G), khả năng dimer-primer của mồi.v.v

- Phần mềm in silico PCR: cho phép tính toán kết quả dự kiến của phản ứng PCR trên lý thuyết, dựa trên việc sử dụng một tập hợp các đoạn mồi (đầu dò) đƣợc thiết kế trước để khuếch đại chuỗi DNA từ một trình tự gene hoặc hệ phiên mã đã biết giúp tiết kiệm thời gian và chi phí, đồng thời giảm nguy cơ thiếu sót và lỗi trong quá trình thiết kế mồi Bằng cách sử dụng thông tin về các đoạn mồi và trình tự gene mục tiêu.

Phương pháp nghiên cứu

Thông qua việc so sánh trình tự hoàn chỉnh của 181 gene bont/E bằng phần mềm Bioedit, đoạn gene đích có độ tương đồng cao nhất chứa trình tự mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E được lựa chọn có kích thước 1367bp.

2.2.2 Thiết kế mồi mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E

Trình tự mồi xuôi đƣợc lựa chọn chứa mã mở đầu ATG để thuận tiện cho việc biểu hiện BoNT/E Đoạn gene sau khi khuếch đại mang trình tự mã hoá cho chuỗi nhẹ của độc tố botulinum serotype E

Các yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi bao gồm: độ dài của mồi, đầu 3‟ và 5‟ của mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm, nhiệt độ gắn mồi Ta, hàm lƣợng GC và cấu trúc thứ cấp.v.v

- Độ dài của mồi: Độ dài của mồi cần đƣợc xác định sao cho đủ dài để đảm bảo độ chính xác của phản ứng khuếch đại, nhƣng cũng không quá dài để tránh sự cạnh tranh với các mục tiêu khác

- Nhiệt độ nóng chảy: là nhiệt độ mà tại đó có thể phá vỡ liên kết hidro, tách sợi DNA thành 2 mạch đơn, có chiều dài bằng nhau Nhiệt độ nóng chảy cũng thể hiện độ bền của sợi DNA Tm được ước tính bằng phương pháp Nearest- Neighbor

Phương pháp này cho giá trị gần với giá trị thực Giá trị Tm được tính toán dưới sự phối hợp những điều kiện thí nghiệm chẳng hạn nhƣ nồng độ muối và nồng độ oligo Nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 55 ˚C - 59˚C sẽ cho kết quả

26 tốt nhất Nhƣ vậy, có thể kết luận bộ mồi thiết kế đƣợc có nhiệt độ nóng chảy đạt yêu cầu

Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) Công thức tính Tm chứa muối:

Tm = 81,5+16,6x(log10[Na+]) + 0.41x(%(G+C)) – 675/n Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi

- Đầu 3‟ và 5‟ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3‟ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngƣợc và đầu 3‟ của mồi ngƣợc sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi đƣợc gắn vào 2 mạch bổ sung Mồi cần đƣợc thiết kế sao cho phù hợp với chuỗi mục tiêu để đảm bảo mạch đôi của DNA có thể được mở rộng đúng hướng khi phản ứng khuếch đại diễn ra

2.2.3 Khuếch đại gene mã hóa chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E bằng phương pháp PCR

Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố loại E bằng mồi BoNT/E Fw và BoNT/E Rv thiết kế, sản phẩm sau đó đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% bằng cách pha 1g agarose với mỗi 100mL đệm TAE 1X, sử dụng 0.5μL RedSafe/12,5mL gel Mỗi giếng trên gel đƣợc tra 5 μL sản phẩm PCR, gel đƣợc đặt trong bể điện di chứa đệm TAE 1X, điện di trong điều kiện 90V, 30 phút Bản gel sau điện di được quan sát dưới tia UV và được chụp ảnh lại

Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)

2.2.4 Tối ƣu chu trình nhiệt cho phản ứng PCR

Phản ứng tối ƣu chu trình nhiệt của phản ứng khếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E đƣợc thử nghiệm với các điều kiện gắn mồi (Tm) thay đổi với dải nhiệt độ từ 50 ˚C – 54 ˚C với chu trình nhƣ bảng 2.3

Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR

Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ

2.2.5 Tạo dòng vector pLUG mang gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E 2.2.5.1 Phản ứng ghép nối đoạn gene mã hóa độc tố BoNT/E vào vector pLUG

Vector và đoạn gene chèn (sản phẩm PCR) đƣợc nối với nhau thông qua hoạt động của enzyme ligase T4 (giúp xúc tác sự hình thành liên kết photphodiester giữa đầu 5 'photphat và đầu 3' hydroxyl termini trong DNA) Các thành phần của phản ứng ligation được liệt kê trong bảng 2.4 Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất

Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation

Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng) Ligation buffer A 10x 1 ul

Ligation buffer B 10x 1 ul TA – Cloning vector II 2 ul

28 Hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào các tế bào khả biến E coli Top 10 và đƣợc cấy trải lên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh ampicillin 50mg/mL, X - Gal 20 mg/mL và IPTG 20 mg/mL để sàng lọc trắng xanh

2.2.5.2 Biến nạp vào tế bào khả biến E coli Top 10 Ống chứa 50-100 àL dung dịch tế bào khả biến đƣợc làm tan trờn đỏ Sau đú, cho sản phẩm ligase vào dịch tế bào khả biến, trộn bằng cách búng nhẹ và ủ trên đá 30 phút Chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt ở 42˚C trong vòng 45 giây sau đó nhanh chóng để mẫu trở lại hộp đá (tạo phản ứng sốc nhiệt) Ủ ống tế bào trên đá 5 phút trước khi bổ sung 800mL môi trường LB lỏng Nuôi lắc ống tế bào ở 37˚C, 180 vòng/phút trong 1 tiếng Ly tâm ống tế bào ở 3000 vòng trong 1 phút Hút bỏ 600mL dịch nổi Hòa tan tủa tế bào bằng pipette với phần dung dịch còn lại và cấy trải trờn đĩa thạch gồm 25mL LB cú bổ sung khỏng sinh ampicillin, trải thờm 25àL X-Gal 20mg/mL và 25àL IPTG 20mg/mL Bọc đĩa bằng paraffin và ủ ở 37˚C trong 16 tiếng

2.2.5.3 Sàng lọc trắng xanh để chọn vector tái tổ hợp

Lựa chọn khuẩn lạc riêng rẽ rồi đem đi PCR sử dụng cặp mồi M13 trên vector nhằm xác nhận sự có mặt của đoạn gene chèn Khuẩn lạc xác định có chứa đoạn chèn sẽ được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin, lắc ở 180 vòng/phút trong 16 tiếng Sản phẩn sau nuôi lỏng đƣợc tách chiết để thu plasmid tái tổ hợp Mẫu plasmid sau đó đƣợc định lƣợng nồng độ bằng máy đo Nanodrop

2.2.6 Khuếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ cho độc tố BoNT/E sử dụng cặp mồi bont/EB3, bont/EF3 bằng phương pháp real - time PCR

Phản–ứng real - time PCR khuếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E có kích thước 202 bp sử dụng cặp mồi bont/EF3 (5‟GGAGGGATTTTAT TAGAAGAACTG3‟), bont/EB3 (5‟GAGAAATATTGGAACTGTTAGTTTC3‟) với các master mix khác nhau Tuỳ thuộc vào từng loại master mix của các hãng sản xuất khác nhau nên có thành phần phản ứng khác nhau (bảng 2.5) Kết quả đọc đƣợc ngay khi phản ứng kết thúc

Bảng 2.5: Thành phần phản ứng real - time PCR

Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)

Luna universal qPCR master mix 2x 6 l

Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)

Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 2x 6 l

Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng) Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix 2x;

Taq Master Mix (Dye Plus) 2x;

Taq DNA Polymerase Master Mix RED 2x;

KẾT QUẢThiết kế mồi khuếch đại chuỗi nhẹ mã hóa độc tố BoNT/E (đoạn 1367bp)

3.1.1 Kết quả lựa chọn vùng gene đích

Trong nghiên cứu về độc tố botulinum serotype E, việc thiết kế mồi khuếch đại đoạn gene mã hoá cho chuỗi nhẹ đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân tích sự có mặt của gene Việc thiết kế mồi nhằm khuếch đại gene bont/E đƣợc lựa chọn dựa trên kết quả so sánh trình tự gene bont đã đƣợc công bố và sử dụng các công cụ phần mềm để đảm bảo tính chính xác và đặc hiệu của mồi Để lựa chọn trình tự gene thích hợp cho việc thiết kế mồi, 181 trình tự gene bont/E đã công bố (phụ lục) đƣợc so sánh bằng phần mềm Bioedit nhằm chọn vùng trình tự có độ bảo thủ cao nhất mã hoá cho chuỗi nhẹ của độc tố BoNT/E Đây là phần hoạt động chính và đặc trƣng cho từng loại độc tố BoNT Đồng thời, trình tự mồi xuôi để khuếch đại đoạn gene đích có chứa mã mở đầu ATG để thuận tiện cho việc biểu hiện khi cần cấu trúc chuỗi nhẹ độc tố tái tổ hợp

Hình 3.1: 181 gene bont/E tham chiếu được so sánh bằng phần mềm Bioedit

31 Đoạn gene được lựa chọn có kích thước 1367bp, (từ vị trí nucleotide 214 đến 1559) chứa đoạn gene mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E ( vùng LC BoNT/E có vị trí từ nucleotide thứ 228 đến 1494) (hình 3.2)

Hình 3.2: Hình ảnh minh hoạ vùng gene lựa chọn

3.1.2 Trình tự và thông số cặp mồi

Sau khi xác định đƣợc trình tự đoạn gene đích, tiến hành thiết kế cặp mồi để khuếch đại đoạn gene mục tiêu Tuy nhiên, trình tự gene lựa chọn mã hoá chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotye E có kích thước lớn (xấp xỉ 1300 bp) và chứa nhiều trình tự AT, điều này do trong quá trình chọn lọc tự nhiên, mã di truyền có tính thoái hoá nên những đột biến không gây hại từ G/C thành A/T có xu hướng tăng mạnh vì quá trình tổng hợp cần ít năng lƣợng hơn [6, 23] Đồng thời đoạn gene lựa chọn chứa nhiều chuỗi poly A, ảnh hưởng đến độ bền của sợi đôi nên gây nhiều khó khăn trong việc thiết kế mồi và phản ứng khuếch đại sau Vì vậy, nhiều phần mềm tin sinh khác nhau đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi một cách tối ƣu nhất Cặp mồi sau đó đƣợc kiểm tra độ đặc hiệu phân tích bằng phần mềm in silico PCR, khả năng tự bắt cặp bằng phần mềm Integrated DNA Technologies.v.v

Trình tự 5‟ – 3‟ Độ dài của mồi (bp)

32 Các yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi bao gồm: độ dài của mồi, đầu 3‟ và 5‟ của mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm, hàm lƣợng GC và cấu trúc thứ cấp.v.v

- - - - - - - - - - - - - Độ dài của mồi: cặp mồi BoNT/E Fw, BoNT/E Rv có kích thước lần lượt là 20bp và

23bp cho thấy đều thỏa mãn điều kiện chiều dài mỗi mồi nằm trong khoảng 18bp - 25bp để có thể đảm bảo độ chính xác của phản ứng khuếch đại đồng thời tránh sự cạnh tranh với DNA khuôn trong phản ứng

- Hàm lƣợng GC: Theo khuyến cáo, mồi đƣợc thiết kế sao cho hàm lƣợng GC nằm trong khoảng từ 40% đến 65%, vì hàm lƣợng GC xác định tính ổn định của sợi DNA và do đó quyết định nhiệt độ nóng chảy [38] Tuy nhiên, cặp mồi trong nghiên cứu này đƣợc thiết kế có tỉ lệ phần trăm AT lớn nên cặp mồi thiết kế có tỉ lệ GC không quá cao

- Nhiệt độ nóng chảy: là nhiệt độ mà tại đó có thể phá vỡ liên kết hidro, tách sợi DNA thành 2 mạch đơn, có chiều dài bằng nhau Nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 55˚C - 59˚C sẽ cho kết quả tốt nhất Dựa trên công thức tính Tm bằng phương pháp Nearest- Neighbor cặp mồi BoNT/E Fw, BoNT/E Rv có nhiệt độ nóng chảy lần lƣợt là 58˚C và 64˚C, theo đó cặp mồi nhóm nghiên cứu thiết kế có Tm tương đối cao so với Tm lý tưởng Tuy nhiên, để đánh giá lựa chọn chính xác nhiệt độ gắn mồi cho hiệu quả, cho hiệu suất cao nhất cần đƣợc kiểm tra trên thực tế bằng việc sử dụng phản ứng PCR với dải gradient nhiệt độ bước gắn mồI từ 50˚C – 54˚C

3.1.3 Kết quả kiểm tra khả năng đoạn mồi tự bắt cặp của đoạn mồi

Trong quá trình thiết kế mồi cho phản ứng PCR, một trong những thách thức lớn là hiện tƣợng bắt cặp không mong muốn giữa các mồi Hiện tƣợng này có thể xảy ra khi mồi không chỉ gắn vào khuôn DNA đích mà còn có khả năng tự gắn vào mồi ngƣợc hoặc gắn bổ sung trong chính nó Khi mồi hình thành các dimer nội phân tử dẫn đến giảm lƣợng mồi có sẵn để bắt cặp với khuôn DNA đích Do lƣợng mồi thêm vào phản ứng thường lớn hơn nhiều so với DNA khuôn, việc tạo ra các dimer nội phân tử này khiến cho một phần lƣợng mồi không thể tham gia vào quá trình khuếch đại, thậm chí gây ức chế phản ứng PCR [10]

33 Hiện tƣợng tự dimer của cặp mồi đƣợc kiểm tra bằng phần mềm IDT (hình 3.3) cho thấy cặp mồi thiết kế có năng lƣợng tự do thấp nên không có hiện tƣợng bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, không gây ảnh hưởng đến phản ứng khuếch đại

Hình 3.3: Khả năng tự bắt cặp của cặp mồi BoNT/E (sg.idtdna.com)

Hiện tƣợng tạo cấu trúc kẹp tóc: Cấu trúc này xảy ra khi một phần trình tự mồi tự gấp lại tạo thành cấu trúc hairpin, dẫn đến sự cạnh tranh giữa việc liên kết với DNA khuôn mẫu và tự liên kết Trình tự mồi BoNT/E có điều điện Tm để có thể tạo cấu trúc kẹp tóc từ 17,8˚C đến 24,8˚C (hình 3,4 A, B), nhiệt độ này thấp hơn rất nhiều so với Tm của cặp mồi Vì vậy, cặp mồi đƣợc thiết kế không thể tự tạo ra dạng cấu trúc kẹp tóc cũng nhưng không ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng khuếch đại

Hình 3.4: Khả năng tự bắt cặp tạo cấu trúc dạng kẹp tóc (sg.idtdna.com)

3.1.4 Khuếch đại cặp mồi bằng phần mềm in silico PCR

Phần mềm in silico PCR đƣợc sử dụng với mục đích kiểm tra tính đặc hiệu của cặp mồi Kết quả khuếch đại ảo trên phần mềm cho thấy xuất hiện một băng có kích thước khoảng 1400 bp (hình 3.5), điều này khớp hoàn toàn với tính toán lý thuyết và cho thấy sự thành công trong việc thiết kế mồi Ngoài ra, cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện chủng C botulinum serotype E và không bị bắt cặp chéo với các loài khác hay các serotype khác cùng loài C botulinum nhƣ A, B, F Có thể thấy rằng cặp mồi thiết kế hoàn toàn đặc hiệu để phát hiện C botulinum serotype E Tuy nhiên, trên phần mềm in silico PCR không có thông tin dữ liệu đầy đủ của tất cả các chủng C botulinum nói chung và các chủng C botulinum serotype E nói riêng nên không thể chắc chắn bộ mồi đƣợc thiết kế hoàn toàn đặc hiệu 100% cho phát hiện tất cả C botulinum loại E

Hình 3.5: Kết quả in silico PCR (http://insilico.ehu.es)

3.1.5 Tối ƣu phản ứng PCR

Nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên tính chất của các đoạn mồi và đặc điểm của chuỗi DNA đích quyết định đến khả năng phát hiện và khuếch đại một cách chính xác của phản ứng PCR Ở đây, việc tối ƣu phản ứng PCR đƣợc tập trung dựa trên việc lựa chọn nhiệt độ gắn mồi thích hợp Cụ thể, chu trình nhiệt trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện nhƣ mô tả ở bảng 2.3 phần II Thông qua việc điều chỉnh nhiệt độ ở mỗi giai đoạn, điều kiện phản ứng đạt đƣợc kết quả tốt nhất, thể hiện trong hình 3.6

Hình 3.6: Hình ảnh điện di DNA sản phẩm PCR với cặp mồi BoNT/E

Trong đó: (1) - marker 1kb;(2) - đối chứng âm;

(3) đến (7) – sản phẩm PCR tại các điều kiện gắn mồi 50˚C, 51˚C, 52˚C, 53˚C, 54˚C

Kết quả điện di hình 3.6 cho thấy trong dải nhiệt độ khảo sát, phản ứng có nhiệt độ gắn mồi tại 51˚C cho một băng sáng, rõ nét nhất, nồng độ cao gấp ~1,5 lần so với các điều kiện còn lại, có kích thước xấp xỉ 1400 bp, phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gene đích, không xuất hiện các băng phụ và mồi thừa sau phản ứng Nhƣ vậy cặp mồi sử dụng trong phản ứng khuếch đại có độ đặc hiệu cao và sản phẩm PCR có thể đƣợc sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo.

Nhân dòng đoạn gene mã hóa độc tố botulinum serotype E vào vector pLUG

3.2.1 Kết quả phản ứng nối đoạn gene đích vào vector nhân dòng pLUG

36 Sản phẩm PCR đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotype E từ khuôn là DNA tổng số của vi khuẩn Clostridium sử dụng cặp mồi BoNT/E (thiết kế ở phần 3.1) đƣợc tinh sạch rồi sử dụng làm khuôn cho phản ứng nối vào vector nhân dòng pLUG theo tỉ lệ 1:5 (nồng độ vector: nồng độ DNA khuôn) Sau đó, sản phẩm nối được biến nạp vào tế vào khả biến E coli Top 10 bằng phương pháp sốc nhiệt, sàng lọc trên môi trường LB agar bổ sung kháng sinh ampicillin 50 mg/L, X- Gal 20ml/L và IPTG 1M

Hình 3.7: Kết quả biến nạp sản phẩm nối

Kết quả sau biến nạp trên hình 3.7 đã cho thấy sự xuất hiện của nhiều khuẩn lạc có hình dạng lồi bóng và kích thước nhỏ trên đĩa Tuy nhiên, kích thước của các khuẩn lạc này quá nhỏ, mắt thường không thể nhìn thấy được và có thể có sự tồn tại của các khuẩn lạc vệ tinh mà chúng ta không thể quan sát trực tiếp Sự xuất hiện của các khuẩn lạc như vậy gây ảnh hưởng trong quá trình phân tích và đánh giá kết quả biến nạp Trong quá trình tái tổ hợp vector và gene đích, do kích thước của đoạn gene đích chèn vào vector lớn (1353 bp) nên có thể số lƣợng vector tái tổ hợp thành công ít, dẫn đến việc chủ yếu các plasmid biến nạp thành công vào tế bào khả biến chỉ là vector không mang đoạn chèn Điều này gây khó khăn trong việc xác định sự hiện diện của gene bont/E trên các khuẩn lạc sau quá trình biến nạp Do vậy, một bước kiểm tra bổ sung thêm bằng cách chọn 2 khuẩn lạc tương đối riêng rẽ rồi tiến hành sử dụng phản ứng PCR với cặp mồi M13 có trên vector để kiểm tra sự hiện diện của gene bont/E đã đƣợc chèn vào hay chƣa trên các khuẩn lạc đã đƣợc biến nạp

Hình 3.8: Hình ảnh điện di DNA kết quả PCR khuẩn lạc Trong đó: (1) – marker DNA 1 kb; (2) – đối chứng âm; (3); (4) – sản phẩm PCR

Kết quả của sản phẩm PCR khuẩn lạc (giếng (3), (4)) cho băng sáng, rõ nét, có kích thước khoảng 1500 bp (hình 3.8) Đây là kích thước xấp xỉ với kích thước tính toán lý thuyết khi vector mang đoạn chèn Nếu khuẩn lạc không mang đoạn chèn thì đoạn gene đích có kích thước xấp xỉ 200 bp Kết quả này cho thấy rằng đã biến nạp thành công plasmid tái tổ hợp vào tế bào E coli Top 10 Sau khi biến nạp thành công, tiến hành tăng sinh, thu sinh khối và tách plasmid

Kết quả thu đƣợc một plasmid có chứa đoạn gene bont/E Điều này là cơ sở quan trọng cho việc nghiên cứu và ứng dụng của gene bont/E trong các nghiên cứu tiếp theo Đồng thời, kết quả này cũng thể hiện sự thành công của phương pháp biến nạp plasmid và quy trình tách plasmid mà nhóm nghiên cứu đã thực hiện

Kết quả điện di plasmid hình 3.9 cho thấy giếng số (2) chứa plasmid xuất hiện dải băng dài và sáng, nồng độ plasmid được đánh giá bằng phương pháp đo quang phổ Kết quả cho thấy mẫu plasmid tái tổ hợp có độ tinh sạch của mẫu A260/A280 là 1,87 chứng tỏ mẫu thu đƣợc có độ tinh sạch cao, nồng độ của mẫu là 28,8 ng/mL tương đương với 6.5 x 10 9 bản copy ( Số lượng bản sao của mẫu DNA đƣợc tớnh dƣa theo cụng thức: Số bản sao = (nồng độ DNA (ng/àl) x số Avogadro) / ( độ dài của mẫu (bp) x hệ số chuyển đổi thành ng x trọng lƣợng trung bình của cặp bazơ (Da)) Từ đó có thể một lần nữa khẳng định quá trình tái tổ hợp plasmid đã đƣợc thực hiện thành công

Hình 3.9: Kết quả điện di plasmid Trong đó: (1) – marker 1kb; (2) – plasmid E

3.2.2 Kết quả giải trình tự và phân tích trình tự axit amin suy diễn

Kết quả xác định và so sánh trình tự gene quan tâm với trình tự gene của các loài vi sinh vật đƣợc công bố trên ngân hàng gene thế giới cho thấy plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gene đích có độ tương đồng cao (96% – 100%) với trình tự gene bont/E của chủng Clostridium botulinum và chủng Clostridium butyricum

Hình 3.10: Kết quả so sánh trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự các chủng được công bố trên NCBI

Gene bont/E có thể đƣợc tạo ra bởi các chủng C botulinum thuộc nhóm phát sinh chủng loại II và các chủng không điển hình của Clostridium butyricum gây độc

39 thần kinh (nhóm phát sinh chủng loại VI) [12, 21] BoNT/E là một trong những loại BoNT khác nhau về mặt kháng nguyên gây ngộ độc ở người, thường được tổng hợp bởi các chủng C botulinum serotype E nhƣng cũng có thể đƣợc sản xuất bởi các chủng C butyricum loại E gây độc thần kinh không điển hình Ở Ý, nơi các chủng

C butyricum loại E gây độc thần kinh lần đầu tiên đƣợc phân lập từ trẻ sơ sinh bị ngộ độc thịt, những chủng này phù hợp về mặt lâm sàng hơn các chủng C botulinum loại E [3] Hơn nữa, C butyricum gây độc thần kinh loại E có liên quan đến bệnh ngộ độc ở người tại Châu Á, Anh và Hoa Kỳ góp phần vào sự tái xuất hiện của vi sinh vật này nhƣ một tác nhân gây bệnh ngộ độc

Hình 3.11: Kết quả so sánh trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự mã CP001078.1

40 Nhƣ vậy, nhóm nghiên cứu có thể khẳng định rằng đã nhân dòng thành công đoạn gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E và trình tự đoạn gene thu thập từ mẫu tại Việt Nam có trình tự tương đồng với chủng BoNT/E3 trên thế giới

Sau khi xác định đƣợc sự có mặt và trình tự gene bont/E, nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu về trình tự axit amin tương ứng Kết quả so sánh trình tự axit amin từ trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự trên ngân hàng gene thế giới NCBI cho thấy không có bất kỳ sai khác, độ tương đồng đạt 100% và có mã mở đầu Methionin

Hình 3.12 Kết quả so sánh trình tự axit amin suy diễn từ trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự trên NCBI

Một số công cụ tin sinh học đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự axit amin suy diễn và phân tích đặc điểm cấu trúc của protein suy diễn tương ứng Kết quả cho thấy protein suy diễn có 336 axit amin, bắt đầu từ methionine (M) và kết thúc ở glutamic (E) Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng dựa trên phân tích so sánh trình tự axit amin suy diễn với trình tự trên NCBI cho kết quả trình tự từ mẫu tại Việt Nam có quan hệ gần gũi với chủng Clostridium botulinum type E trên thế giới (hình 3.13)

Hình 3 13: Cây phát sinh dựa vào trình tự axit amin mã hoá cho BoNT/E với các trình tự trên NCBI

3.3 Kết quả tối ƣu điều kiện phản ứng real-time PCR khuếch đại đoạn gene có kích thước 202bp mã hóa độc tố BoNT/E

Trong một xét nghiệm nói chung hay một phản ứng khuếch đại nói riêng thì thời gian cho ra kết quả luôn là vấn đề luôn được quan tâm Đối với phương pháp khuếch đại DNA sử dụng phản ứng PCR thường mất khoảng 2 giờ sau đó đọc kết quả bằng phương pháp điện di dẫn đến tổng thời gian thực hiện thường kéo dài từ 3 đến 4 giờ Tuy nhiên, phản ứng real - time PCR có thể đọc kết quả ngay khi phản ứng khuếch đại kết thúc, giúp rút ngắn thời gian phản ứng Real-time PCR là một phiên bản cải tiến của PCR, cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA ngay khi nó diễn ra Điều này đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng chất phát huỳnh quang gắn vào sản phẩm PCR hoặc probe để ghi nhận tín hiệu gia tăng liên tục khi phản ứng diễn ra

Trong nghiên cứu này, với mong muốn lựa chọn, tối ƣu master mix cho phản ứng real - time PCR nhằm giảm thời gian cần thiết cho mỗi chu kỳ, từ đó tăng cường hiệu suất và tiết kiệm thời gian trong cả quá trình của phản ứng Đoạn gene đích có kích thước 202 bp mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotype E được khuếch đại sử dụng cặp mồi bont/EF3, bont/EB3 (phần 2) 6 loại master mix và

42 thành phần phản ứng đã mô tả ở phần 2 đƣợc sử dụng và ký kiệu nhƣ sau: Luna universal qPCR master mix – (1); Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix – (2);

Taq Master Mix Dye Plus – (3); Taq DNA Polymerase Master Mix RED – (4);

Phanta Plash Master mix 2x – (5); Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix – (6)

1: Luna universal qPCR master mix Chu kỳ phát hiện: 11.08

2: Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix Chu kỳ phát hiện: 12,42

3: Taq Master Mix (Dye Plus) Chu kỳ phát hiện: 16,13

4: Taq DNA Polymerase Master Mix RED Chu kỳ phát hiện: 15,58

5: Phanta Plash Master mix 2x Chu kỳ phát hiện: 18,43

6: Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix Chu kỳ phát hiện: 10,74

Hình 3.14: Kết quả phản ứng real- time PCR khuếch đại đoạn gene mã hoá độc tố BoNT/E

43 Chu trình luân nhiệt cho master mix số (1), (2), (3), (4) gồm 3 bước: bước 1: biến tính DNA ở nhiệt độ 94°C trong 4 phút; bước 2: khuếch đại đoạn gene trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn ((1): 94°C: 30 giây, (2): 57°C : 45 giây, (3):

72°C: 45 giây); bước 3: 72°C trong 5 phút Master mix số (5) và (6) sử dụng chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất Cụ thể, Phanta Plash Master mix 2x gồm 3 bước: bước 1: 98˚C trong 40 giây; bước 2 gồm 3 giai đoạn: (98˚C: 10 giây, 57˚C: 5 giây, 72˚C: 3 giây) x 30 chu kỳ; bước 3: 72˚C: 1 phút Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix gồm 2 bước luân nhiêt: bước 1: biến tính ở 95˚C: 40 giây, bước 2 gồm 2 giai đoạn: ((1): 98˚C: 10 giây, 60˚C:5 giây) x 30 chu kỳ Kết quả 6 phản ứng đƣợc thể hiện trong hình 3.12