1.4 Các phương pháp phát hiện độc tố botulinum
1.4.3 Phương pháp phát hiện độc tố của vi khuẩn C. botulinum dựa trên DNA
Các phương pháp phát hiện dựa trên DNA với nhiều nghiên cứu dựa trên các kỹ thuật sinh học phân tử đã đƣợc công bố nhằm phát hiện vi khuẩn C. botulinum như PCR, real - time PCR, LAMP.v.v. Các phương pháp này có độ nhạy phân tích và độ đặc hiệu cao, thời gian thực hiện ngắn hơn rất nhiều so với kỹ thuật nuôi cấy hay xét nghiệm thử độc trên chuột. Tuy nhiên, các kỹ thuật này chỉ dựa trên việc phát hiện gene độc tố thần kinh botulinum trong mẫu mà không đánh giá đƣợc hoạt động của gene cũng nhƣ độc tố, đây là một điểm bất lợi nhƣng kỹ thuật sinh học phân tử lại không yêu cầu sử dụng động vật thí nghiệm nên đây vẫn là công cụ thích hợp để sàng lọc vi khuẩn, cho biết có hay không sự hiện diện của C. botulinum và các Clostridia sản sinh độc tố khác.
1.4.3.1 Phương pháp PCR
Phương pháp PCR thông thường
19 Phản ứng khuếch đại chuỗi PCR (polymerase chain reaction) là một kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa trên nguyên lý di truyền sinh học. Chỉ sau vài giờ, một phân tử DNA có thể đƣợc khuếch đại lên hàng triệu lần nhờ phản ứng PCR. Kể từ khi đƣợc công bố lần đầu tiên năm 1985, kỹ thuật này đã có những đóng góp to lớn cho sự phát triển y sinh học phân tử [60]. Trong phản ứng PCR, một đoạn DNA mục tiêu đƣợc nhân bản đặc hiệu bằng cách sử dụng một enzyme polymerase và các cặp primers phản ứng với DNA khuôn. Sau vài giờ khuếch đại, các sản phẩm PCR đƣợc phân tích bằng các phương pháp như điện di trên gel agarose hoặc sequencing để xác định sự hiện diện và định danh của vi khuẩn.
PCR có thể phát hiện vi khuẩn C. botulinum đều dựa trên việc phát hiện một
trong bảy loại gene độc tố. Một số nghiên cứu cho thấy PCR đa mồi có thể phát hiện đồng thời các gene botA, botB, botE và botF trong một phản ứng duy nhất. Điều này làm giảm đáng kể thời gian xét nghiệm, nhân công và chi phí thuốc thử. Các sản phẩm PCR đa mồi đƣợc phát hiện bằng cách điện di trên gel agarose hoặc bằng cách lai trên màng đƣợc phủ đầu dò cDNA với các sản phẩm PCR.
Phương pháp real - time PCR
Real-time PCR là một biến thể của PCR truyền thống, đƣợc sử dụng để nhân bản và định lƣợng một đoạn DNA cụ thể trong một mẫu. Quá trình PCR diễn ra trong các ống nghiệm chứa các thành phần cần thiết bao gồm DNA mẫu, enzyme polymerase, nucleotide, chất phát huỳnh quang và cặp primers phản ứng với DNA khuôn. Trong đó, quá trình nhân bản đƣợc theo dõi theo thời gian thực. Điều này có nghĩa là sự khuếch đại của sản phẩm PCR (DNA mục tiêu) đƣợc đo tín hiệu và ghi lại sau mỗi chu kỳ nhân bản. Kết quả được hiển thị trên phần mềm dưới dạng một đường cong đặc trưng được gọi là "đồ thị". Đường cong này thể hiện sự tích tụ của sản phẩm PCR theo thời gian và thường được biểu diễn trên một đồ thị có trục hoành là thời gian và trục tung là độ sáng hoặc nhiệt độ.
Real-time PCR đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong phát hiện C. botulinum nhờ vào
những ƣu điểm sau:
20 - Độ nhạy và độ đặc hiệu phân tích: real-time PCR cho phép phát hiện DNA từ C.
botulinum ở nồng độ rất thấp, thậm chí là trong các mẫu chỉ chứa một lƣợng nhỏ vi
khuẩn. Điều này giúp xác định sự hiện diện của C. botulinum một cách chính xác và tin cậy.
- Tốc độ phản ứng: quá trình phản ứng real-time PCR diễn ra trong thời gian ngắn, thường chỉ mất từ 1-2 giờ. Điều này giúp cung cấp kết quả nhanh chóng, mang ý nghĩa quan trọng trong các trường hợp cấp bách và trong quản lý dịch tễ học.
- Định lƣợng chính xác: khả năng định lƣợng DNA mục tiêu trong mẫu là một trong những ƣu điểm nổi bật của phản ứng của real-time PCR. Điều này cho phép xác định hoặc nồng độ của C. botulinum trong mẫu.
- Tính tùy chỉnh: real-time PCR có thể đƣợc tùy chỉnh để phát hiện và định lƣợng các loài C. botulinum cụ thể hoặc các gene đặc trƣng của chúng, giúp cung cấp
thông tin chi tiết về loài vi khuẩn và sự đa dạng gene.
Trong phản ứng phát hiện vật chất di truyền của vi khuẩn C. botulinum dựa vào trình tự DNA, các cặp mồi đặc hiệu đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại đoạn gene đặc trƣng mã hoá BoNT của từng serotype đã và đang đƣợc nghiên cứu tại nhiều nơi, tuy nhiên tại Việt Nam vẫn chƣa có nhiều nghiên cứu về vi khuẩn và độc tố của
Clostridium botulinum serotype E.
1.4.3.2 Phương pháp LAMP
“LAMP" - viết tắt của phương pháp khuếch đại đẳng nhiệt trung gian vòng lặp, một phương pháp khuếch đại axit nucleic đơn giản, nhanh chóng, cụ thể và hiệu quả về chi phí do Eiken Chemical Co, Ltd. phát triển.
Trong LAMP, chuỗi mục tiêu đƣợc khuếch đại ở nhiệt độ không đổi từ 60°C đến 65°C bằng cách sử dụng hai hoặc ba bộ mồi và polymerase có hoạt động dịch chuyển dải cao bên cạnh hoạt động sao chép. Thông thường, 4 mồi khác nhau được sử dụng để khuếch đại 6 vùng riêng biệt trên gene mục tiêu, làm tăng tính đặc hiệu.
Ngoài cặp mồi thông thường (F3-B3), cặp mồi tạo vòng lặp bên trong (forward và backward loop inner – FIP-BIP) và cặp mồi vòng lặp bổ sung (loop forward và backward – LF-LB) giúp khuếch đại trình tự đích với hiệu quả lên tới 109 bản sao.
21 Ban đầu, sản phẩm LAMP đƣợc phân tích bằng điện di, sau đó phát triển thêm phương pháp đo độ đục, chuyển màu, và gần đây nhất là sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang. Các bước tiến này giúp tăng khả năng phối hợp LAMP giúp phát hiện nhiều tác nhân trong cùng một phản ứng.
LAMP đƣợc biết đến là một kỹ thuật khuếch đại DNA diễn ra ở điều kiện đẳng nhiệt (luôn là 60˚C đến 65˚C) trái ngƣợc hoàn toàn với công nghệ phản ứng khuếch đại chuỗi polymerase, trong đó phản ứng đƣợc thực hiện với một loạt các chu kì nhiệt độ xen kẽ. LAMP là một kĩ thuật tương đối mới song độ nhạy cao và cho kết quả nhanh là một trong những lợi thế lớn mà LAMP mang lại.