3.1.1 Kết quả lựa chọn vùng gene đích.
Trong nghiên cứu về độc tố botulinum serotype E, việc thiết kế mồi khuếch đại đoạn gene mã hoá cho chuỗi nhẹ đóng vai trò quan trọng trong việc xác định và phân tích sự có mặt của gene. Việc thiết kế mồi nhằm khuếch đại gene bont/E đƣợc lựa chọn dựa trên kết quả so sánh trình tự gene bont đã đƣợc công bố và sử dụng
các công cụ phần mềm để đảm bảo tính chính xác và đặc hiệu của mồi.
Để lựa chọn trình tự gene thích hợp cho việc thiết kế mồi, 181 trình tự gene
bont/E đã công bố (phụ lục) đƣợc so sánh bằng phần mềm Bioedit nhằm chọn vùng
trình tự có độ bảo thủ cao nhất mã hoá cho chuỗi nhẹ của độc tố BoNT/E. Đây là phần hoạt động chính và đặc trƣng cho từng loại độc tố BoNT. Đồng thời, trình tự mồi xuôi để khuếch đại đoạn gene đích có chứa mã mở đầu ATG để thuận tiện cho việc biểu hiện khi cần cấu trúc chuỗi nhẹ độc tố tái tổ hợp.
Hình 3.1: 181 gene bont/E tham chiếu được so sánh bằng phần mềm Bioedit
31 Đoạn gene được lựa chọn có kích thước 1367bp, (từ vị trí nucleotide 214 đến 1559) chứa đoạn gene mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E ( vùng LC BoNT/E có vị trí từ nucleotide thứ 228 đến 1494) (hình 3.2).
Hình 3.2: Hình ảnh minh hoạ vùng gene lựa chọn
3.1.2 Trình tự và thông số cặp mồi.
Sau khi xác định đƣợc trình tự đoạn gene đích, tiến hành thiết kế cặp mồi để khuếch đại đoạn gene mục tiêu. Tuy nhiên, trình tự gene lựa chọn mã hoá chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotye E có kích thước lớn (xấp xỉ 1300 bp) và chứa nhiều trình tự AT, điều này do trong quá trình chọn lọc tự nhiên, mã di truyền có tính thoái hoá nên những đột biến không gây hại từ G/C thành A/T có xu hướng tăng mạnh vì quá trình tổng hợp cần ít năng lƣợng hơn [6, 23]. Đồng thời đoạn gene lựa chọn chứa nhiều chuỗi poly A, ảnh hưởng đến độ bền của sợi đôi nên gây nhiều khó khăn trong việc thiết kế mồi và phản ứng khuếch đại sau. Vì vậy, nhiều phần mềm tin sinh khác nhau đã đƣợc sử dụng để thiết kế cặp mồi một cách tối ƣu nhất. Cặp mồi sau đó đƣợc kiểm tra độ đặc hiệu phân tích bằng phần mềm in silico PCR, khả năng tự bắt cặp bằng phần mềm Integrated DNA Technologies.v.v.
Bảng 3.1: Trình tự mồi
Trình tự 5‟ – 3‟ Độ dài của mồi (bp)
BoNT/E Fw AGGAGATGCTGTATATGCCA 20
BoNT/E Rv TCGGAAGCCACAAAAAATAACTC 23
32 Các yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi bao gồm: độ dài của mồi, đầu 3‟ và 5‟ của mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm, hàm lƣợng GC và cấu trúc thứ cấp.v.v.
- - - - - - - - - - - - - Độ dài của mồi: cặp mồi BoNT/E Fw, BoNT/E Rv có kích thước lần lượt là 20bp và
23bp cho thấy đều thỏa mãn điều kiện chiều dài mỗi mồi nằm trong khoảng 18bp - 25bp để có thể đảm bảo độ chính xác của phản ứng khuếch đại đồng thời tránh sự cạnh tranh với DNA khuôn trong phản ứng.
- Hàm lƣợng GC: Theo khuyến cáo, mồi đƣợc thiết kế sao cho hàm lƣợng GC nằm trong khoảng từ 40% đến 65%, vì hàm lƣợng GC xác định tính ổn định của sợi DNA và do đó quyết định nhiệt độ nóng chảy [38]. Tuy nhiên, cặp mồi trong nghiên cứu này đƣợc thiết kế có tỉ lệ phần trăm AT lớn nên cặp mồi thiết kế có tỉ lệ GC không quá cao .
- Nhiệt độ nóng chảy: là nhiệt độ mà tại đó có thể phá vỡ liên kết hidro, tách sợi DNA thành 2 mạch đơn, có chiều dài bằng nhau. Nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 55˚C - 59˚C sẽ cho kết quả tốt nhất. Dựa trên công thức tính Tm bằng phương pháp Nearest- Neighbor cặp mồi BoNT/E Fw, BoNT/E Rv có nhiệt độ nóng chảy lần lƣợt là 58˚C và 64˚C, theo đó cặp mồi nhóm nghiên cứu thiết kế có Tm tương đối cao so với Tm lý tưởng. Tuy nhiên, để đánh giá lựa chọn chính xác nhiệt độ gắn mồi cho hiệu quả, cho hiệu suất cao nhất cần đƣợc kiểm tra trên thực tế bằng việc sử dụng phản ứng PCR với dải gradient nhiệt độ bước gắn mồI từ 50˚C – 54˚C.
3.1.3 Kết quả kiểm tra khả năng đoạn mồi tự bắt cặp của đoạn mồi
Trong quá trình thiết kế mồi cho phản ứng PCR, một trong những thách thức lớn là hiện tƣợng bắt cặp không mong muốn giữa các mồi. Hiện tƣợng này có thể xảy ra khi mồi không chỉ gắn vào khuôn DNA đích mà còn có khả năng tự gắn vào mồi ngƣợc hoặc gắn bổ sung trong chính nó. Khi mồi hình thành các dimer nội phân tử dẫn đến giảm lƣợng mồi có sẵn để bắt cặp với khuôn DNA đích. Do lƣợng mồi thêm vào phản ứng thường lớn hơn nhiều so với DNA khuôn, việc tạo ra các dimer nội phân tử này khiến cho một phần lƣợng mồi không thể tham gia vào quá trình khuếch đại, thậm chí gây ức chế phản ứng PCR [10].
33 Hiện tƣợng tự dimer của cặp mồi đƣợc kiểm tra bằng phần mềm IDT (hình 3.3) cho thấy cặp mồi thiết kế có năng lƣợng tự do thấp nên không có hiện tƣợng bắt cặp giữa mồi xuôi và mồi ngược, không gây ảnh hưởng đến phản ứng khuếch đại.
A)
B)
C)
Hình 3.3: Khả năng tự bắt cặp của cặp mồi BoNT/E (sg.idtdna.com)
Hiện tƣợng tạo cấu trúc kẹp tóc: Cấu trúc này xảy ra khi một phần trình tự mồi tự gấp lại tạo thành cấu trúc hairpin, dẫn đến sự cạnh tranh giữa việc liên kết với DNA khuôn mẫu và tự liên kết. Trình tự mồi BoNT/E có điều điện Tm để có thể tạo cấu trúc kẹp tóc từ 17,8˚C đến 24,8˚C (hình 3,4 A, B), nhiệt độ này thấp hơn rất nhiều so với Tm của cặp mồi. Vì vậy, cặp mồi đƣợc thiết kế không thể tự tạo ra dạng cấu trúc kẹp tóc cũng nhưng không ảnh hưởng đến hiệu suất của phản ứng khuếch đại.
34 A)
B)
Hình 3.4: Khả năng tự bắt cặp tạo cấu trúc dạng kẹp tóc (sg.idtdna.com).
3.1.4 Khuếch đại cặp mồi bằng phần mềm in silico PCR
Phần mềm in silico PCR đƣợc sử dụng với mục đích kiểm tra tính đặc hiệu
của cặp mồi. Kết quả khuếch đại ảo trên phần mềm cho thấy xuất hiện một băng có kích thước khoảng 1400 bp (hình 3.5), điều này khớp hoàn toàn với tính toán lý thuyết và cho thấy sự thành công trong việc thiết kế mồi. Ngoài ra, cặp mồi đặc hiệu cho việc phát hiện chủng C. botulinum serotype E và không bị bắt cặp chéo với các loài khác hay các serotype khác cùng loài C. botulinum nhƣ A, B, F. Có thể thấy rằng cặp mồi thiết kế hoàn toàn đặc hiệu để phát hiện C. botulinum serotype E. Tuy nhiên, trên phần mềm in silico PCR không có thông tin dữ liệu đầy đủ của tất cả các chủng C. botulinum nói chung và các chủng C. botulinum serotype E nói riêng nên không thể chắc chắn bộ mồi đƣợc thiết kế hoàn toàn đặc hiệu 100% cho phát hiện tất cả C. botulinum loại E.
Hình 3.5: Kết quả in silico PCR (http://insilico.ehu.es)
35
3.1.5 Tối ƣu phản ứng PCR
Nhiệt độ gắn mồi đƣợc xác định dựa trên tính chất của các đoạn mồi và đặc điểm của chuỗi DNA đích quyết định đến khả năng phát hiện và khuếch đại một cách chính xác của phản ứng PCR. Ở đây, việc tối ƣu phản ứng PCR đƣợc tập trung dựa trên việc lựa chọn nhiệt độ gắn mồi thích hợp. Cụ thể, chu trình nhiệt trong phản ứng PCR đƣợc thực hiện nhƣ mô tả ở bảng 2.3 phần II. Thông qua việc điều chỉnh nhiệt độ ở mỗi giai đoạn, điều kiện phản ứng đạt đƣợc kết quả tốt nhất, thể hiện trong hình 3.6.
Hình 3.6: Hình ảnh điện di DNA sản phẩm PCR với cặp mồi BoNT/E
Trong đó: (1) - marker 1kb;(2) - đối chứng âm;
(3) đến (7) – sản phẩm PCR tại các điều kiện gắn mồi 50˚C, 51˚C, 52˚C, 53˚C, 54˚C
Kết quả điện di hình 3.6 cho thấy trong dải nhiệt độ khảo sát, phản ứng có nhiệt độ gắn mồi tại 51˚C cho một băng sáng, rõ nét nhất, nồng độ cao gấp ~1,5 lần so với các điều kiện còn lại, có kích thước xấp xỉ 1400 bp, phù hợp với kích thước tính toán lý thuyết của đoạn gene đích, không xuất hiện các băng phụ và mồi thừa sau phản ứng. Nhƣ vậy cặp mồi sử dụng trong phản ứng khuếch đại có độ đặc hiệu cao và sản phẩm PCR có thể đƣợc sử dụng trực tiếp cho các thí nghiệm tiếp theo.