Kết quả giải trình tự

3.2 Nhân dòng đoạn gene mã hóa độc tố botulinum serotype E vào vector pLUG

3.2.2 Kết quả giải trình tự

Kết quả xác định và so sánh trình tự gene quan tâm với trình tự gene của các loài vi sinh vật đƣợc công bố trên ngân hàng gene thế giới cho thấy plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gene đích có độ tương đồng cao (96% – 100%) với trình tự gene

bont/E của chủng Clostridium botulinum và chủng Clostridium butyricum.

Hình 3.10: Kết quả so sánh trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự các chủng được

công bố trên NCBI

Gene bont/E có thể đƣợc tạo ra bởi các chủng C. botulinum thuộc nhóm phát sinh chủng loại II và các chủng không điển hình của Clostridium butyricum gây độc

(1) (2)

1000 bp 3000 bp

39 thần kinh (nhóm phát sinh chủng loại VI) [12, 21]. BoNT/E là một trong những loại BoNT khác nhau về mặt kháng nguyên gây ngộ độc ở người, thường được tổng hợp bởi các chủng C. botulinum serotype E nhƣng cũng có thể đƣợc sản xuất bởi các

chủng C. butyricum loại E gây độc thần kinh không điển hình. Ở Ý, nơi các chủng

C. butyricum loại E gây độc thần kinh lần đầu tiên đƣợc phân lập từ trẻ sơ sinh bị

ngộ độc thịt, những chủng này phù hợp về mặt lâm sàng hơn các chủng C.

botulinum loại E [3]. Hơn nữa, C. butyricum gây độc thần kinh loại E có liên quan

đến bệnh ngộ độc ở người tại Châu Á, Anh và Hoa Kỳ góp phần vào sự tái xuất hiện của vi sinh vật này nhƣ một tác nhân gây bệnh ngộ độc.

Hình 3.11: Kết quả so sánh trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự mã CP001078.1

40 Nhƣ vậy, nhóm nghiên cứu có thể khẳng định rằng đã nhân dòng thành công đoạn gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E và trình tự đoạn gene thu thập từ mẫu tại Việt Nam có trình tự tương đồng với chủng BoNT/E3 trên thế giới.

Sau khi xác định đƣợc sự có mặt và trình tự gene bont/E, nghiên cứu tiếp tục tìm hiểu về trình tự axit amin tương ứng. Kết quả so sánh trình tự axit amin từ trình tự plasmid tái tổ hợp với trình tự trên ngân hàng gene thế giới NCBI cho thấy không có bất kỳ sai khác, độ tương đồng đạt 100% và có mã mở đầu Methionin.

Hình 3.12. Kết quả so sánh trình tự axit amin suy diễn từ trình tự plasmid tái tổ hợp

với trình tự trên NCBI

Một số công cụ tin sinh học đã đƣợc sử dụng để xác định trình tự axit amin suy diễn và phân tích đặc điểm cấu trúc của protein suy diễn tương ứng. Kết quả cho thấy protein suy diễn có 336 axit amin, bắt đầu từ methionine (M) và kết thúc ở glutamic (E). Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng dựa trên phân tích so sánh trình tự axit amin suy diễn với trình tự trên NCBI cho kết quả trình tự từ mẫu tại Việt Nam có quan hệ gần gũi với chủng Clostridium botulinum type E trên thế giới (hình 3.13)

41

Hình 3. 13: Cây phát sinh dựa vào trình tự axit amin mã hoá cho BoNT/E với các

trình tự trên NCBI

3.3 Kết quả tối ƣu điều kiện phản ứng real-time PCR khuếch đại đoạn gene có kích thước 202bp mã hóa độc tố BoNT/E

Trong một xét nghiệm nói chung hay một phản ứng khuếch đại nói riêng thì thời gian cho ra kết quả luôn là vấn đề luôn được quan tâm. Đối với phương pháp khuếch đại DNA sử dụng phản ứng PCR thường mất khoảng 2 giờ sau đó đọc kết quả bằng phương pháp điện di dẫn đến tổng thời gian thực hiện thường kéo dài từ 3 đến 4 giờ. Tuy nhiên, phản ứng real - time PCR có thể đọc kết quả ngay khi phản ứng khuếch đại kết thúc, giúp rút ngắn thời gian phản ứng. Real-time PCR là một phiên bản cải tiến của PCR, cho phép theo dõi quá trình khuếch đại DNA ngay khi nó diễn ra. Điều này đƣợc thực hiện thông qua việc sử dụng chất phát huỳnh quang gắn vào sản phẩm PCR hoặc probe để ghi nhận tín hiệu gia tăng liên tục khi phản ứng diễn ra.

Trong nghiên cứu này, với mong muốn lựa chọn, tối ƣu master mix cho phản ứng real - time PCR nhằm giảm thời gian cần thiết cho mỗi chu kỳ, từ đó tăng cường hiệu suất và tiết kiệm thời gian trong cả quá trình của phản ứng . Đoạn gene đích có kích thước 202 bp mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotype E được khuếch đại sử dụng cặp mồi bont/EF3, bont/EB3 (phần 2). 6 loại master mix và

42 thành phần phản ứng đã mô tả ở phần 2 đƣợc sử dụng và ký kiệu nhƣ sau: Luna universal qPCR master mix – (1); Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix – (2);

Taq Master Mix Dye Plus – (3); Taq DNA Polymerase Master Mix RED – (4);

Phanta Plash Master mix 2x – (5); Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix – (6).

1: Luna universal qPCR master mix Chu kỳ phát hiện: 11.08

2: Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix Chu kỳ phát hiện: 12,42

3: Taq Master Mix (Dye Plus) Chu kỳ phát hiện: 16,13

4: Taq DNA Polymerase Master Mix RED Chu kỳ phát hiện: 15,58

5: Phanta Plash Master mix 2x Chu kỳ phát hiện: 18,43

6: Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix Chu kỳ phát hiện: 10,74

Hình 3.14: Kết quả phản ứng real- time PCR khuếch đại đoạn gene mã hoá độc tố BoNT/E

43 Chu trình luân nhiệt cho master mix số (1), (2), (3), (4) gồm 3 bước: bước 1:

biến tính DNA ở nhiệt độ 94°C trong 4 phút; bước 2: khuếch đại đoạn gene trong 30 chu kỳ, mỗi chu kỳ gồm 3 giai đoạn ((1): 94°C: 30 giây, (2): 57°C : 45 giây, (3):

72°C: 45 giây); bước 3: 72°C trong 5 phút. Master mix số (5) và (6) sử dụng chu trình nhiệt theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Cụ thể, Phanta Plash Master mix 2x gồm 3 bước: bước 1: 98˚C trong 40 giây; bước 2 gồm 3 giai đoạn: (98˚C: 10 giây, 57˚C: 5 giây, 72˚C: 3 giây) x 30 chu kỳ; bước 3: 72˚C: 1 phút. Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix gồm 2 bước luân nhiêt: bước 1: biến tính ở 95˚C: 40 giây, bước 2 gồm 2 giai đoạn: ((1): 98˚C: 10 giây, 60˚C:5 giây) x 30 chu kỳ. Kết quả 6 phản ứng đƣợc thể hiện trong hình 3.12.

Dựa vào kết quả khuếch đại đoạn gene mã hoá độc tố botuliunm serotype E bằng phương pháp real – time PCR sử dụng cặp mồi boNT/E B3, boNT/E F3 sau 3 lần chạy lặp lại, nhận thấy có sai số giữa các lần chạy là nhỏ (<10%). Trong 6 loại master mix lựa chọn, master mix “Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix” của hãng Vazyme Biotech cho tín hiệu phát hiện sớm nhất (chu kỳ phát hiện: 10,74), 5 loại còn lại có tín hiệu phát hiện muộn hơn lần lƣợt theo thứ tự sau:

Hình 3.15: Thứ tự giá trị tín hiệu phát hiện của 6 loại master mix

Các loại master mix khác nhau đến từ các hãng khác nhau cho tín hiệu phát hiện ở các giá trị khác nhau có độ sai khác lớn (từ 1 đến 8 chu kỳ). Trong khi chu kỳ phát hiện (Ct) đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá kết quả của phản ứng real-time PCR, cung cấp thông tin về số lƣợng bản sao DNA đích, hiệu quả phản

1 Taq Pro Universal SY BR qPCR Master Mix (Ct: 10, 74) 2 L una universal qPCR master mix (Ct: 11, 08)

3 Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix (Ct: 12,42) 4 Taq DNA Polymerase Master Mix RED (Ct: 15,58) 5 Taq Master Mix (Dye Plus) (Ct: 16,13)

6 Phanta Plash Master mix 2x (Ct: 18,43)

44 ứng. Trong nghiên cứu này, hai loại enzyme chính đƣợc sử dụng đó là Taq polymerase có trong 4 loại master mix bao gồm: Luna universal qPCR master mix,

Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix, Taq Master Mix Dye Plus, Taq DNA Polymerase Master Mix RED (ký hiệu từ (1) đến (4)) và enzyme thế hệ mới (theo nhà sản xuất công bố) có trong 2 loại gồm: Phanta Plash Master mix 2x, Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix (ký hiệu (5) và (6)). Sự khác biệt về thành phần enzyme là yếu tố chính dẫn đến tốc độ nhân bản gene đích. Trong khi Taq polymerase có khả năng kéo dài 1000 nucleotide trong vòng 1 phút thì enzyme thế

hệ mới có thể kéo dài 200 nucleotide trong vòng 3 giây (theo nghiên cứu của nhà sản xuất công bố). Tốc độ kéo dài của các loại enzyme khác nhau cũng gây ra ảnh hưởng lớn đến tổng thời gian phản ứng diễn ra. Đối với phản ứng nhằm phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh, ngoài sự chính xác của kết quả, người ta cũng rất chú trọng đến yếu tố thời gian. Tuỳ thuộc vào enzyme có trong thành phần master mix để có chu trình nhiệt phù hợp, các master mix sử dụng Taq polymerase từ (1) đến (4) có tổng thời gian phản ứng là 1 giờ 37 phút, master mix số (5) có tổng thời gian phản ứng là 41 phút, trong khi đó master mix số (6) chỉ cần 37 phút để phản ứng diễn ra. Nhƣ vậy, trong nghiên cứu này “Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix” của hãng Vazyme Biotech cho tín hiệu sớm nhất và nhanh nhất, là sự lựa chọn tốt để có thể sử dụng cho các phản ứng phát hiện nhanh các tác nhân gây bệnh.

Trong phản ứng real - time PCR, ngoài chu kỳ phát hiện (Ct) thì tín hiệu huỳnh quang cũng như đường cong khuếch đại là những yếu tố quan trọng để đánh giá kết quả sau phản ứng. Tín hiệu huỳnh quang trong phản ứng real – time PCR đƣợc phát ra từ liên kết giữa chất nhuộm huỳnh quang với DNA. Có hai loại chất nhuộm huỳnh quang phổ biến đó là SYBR Green (liên kết với bất kỳ DNA sợi đôi nào) và TaqMan probe (chỉ liên kết với DNA đích). Trong nghiên cứu này, SYBR Green đƣợc sử dụng trong tất cả các phản ứng. Tuy nhiên, master mix số (1) và số (6) đã có sẵn SYBR Green trong thành phần, các master mix còn lại không có sẵn SYBR Green nên cần bổ sung chất gắn huỳnh quang LAMP dye (50x) của hãng Vazyme . Kết quả sau phản ứng, master mix sử dụng enzyme Taq polymerase có

45 đường cong khuếch đại gồm 3 phần điển hình đặc trưng cho 3 giai đoạn gồm: giai đoạn khởi đầu, giai đoạn khuếch đại và giai đoạn bình nguyên. Hai phản ứng sử dụng master mix số (5) và (6) chứa enzyme thế hệ mới có đường cong khuếch đại mang hình dáng tương tự tuy nhiên không điển hình (các giai đoạn của phản ứng không rõ ràng). Điều này có thể do ảnh hưởng bởi tốc độ phản ứng diễn ra nhanh, đoạn gene đích ngắn nên phần nào ảnh hưởng đến cơ chế ghi nhận tín hiệu huỳnh quang. Bên cạnh đó, do SYBR Green có thể phát ra tín hiệu huỳnh quang khi gắn vào bất kỳ liên kết hidro nào, cho nên nhóm nghiên cứu đã thực hiện điện di kiểm tra lại sản phẩm PCR để có thể khẳng định rằng phản ứng diễn ra là đặc hiệu.

Hình 3.16: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng real- time PCR khuếch đại đoạn

gene mã hoá độc tố botuliunm serotype E Trong đó: (1) - Marker 100bp; (2) - PC mix 1; (3) - NC mix 1; (3) - PC mix 2; (4) -

NC mix 2; (5) - PC mix 3; (6) - NC mix3; (7) - PC mix 4; (8) - NC mix 4; (9) - PC

mix 5; (10) - NC mix 5; (11) - PC mix 6; (12) - NC mix 6.

Kết quả sau phản ứng, các giếng đối chứng dương đều xuất hiện 1 băng duy nhất, đúng với kích thước tính toán lý thuyết (xấp xỉ 200bp). Tuy nhiên, phản ứng sử dụng master mix Luna universal qPCR master mix; Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix; Taq Master Mix Dye Plus; Taq DNA Polymerase Master Mix RED chứa Taq polymerase cho băng sáng rõ và rõ nét hơn phản ứng sử dụng master mix

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)

200 bp 500 bp

~200 bp

46 chứa enzyme thế hệ mới. Điều này phù hợp với hình ảnh kết quả đường cong khuếch đại đã nêu ở trên. Các giếng đối chứng âm trong cả 6 phản ứng đều không xuất hiện băng đích, không xuất hiện tình trạng mồi thừa, từ đó có thể một lần nữa khẳng định lại kết quả phản ứng real – time PCR là đặc hiệu.

BÀN LUẬN

Vi khuẩn Clostridium botulinum serotype E tạo ta độc tố botulinum serotype E gây ngộ độc ở người. Trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về gene, cụm gene và kiểu huyết thanh loại E từ vi khuẩn Clostridium botulinum, tuy nhiên ở Việt Nam có rất ít công bố về hướng nghiên cứu này. Điển hình là kết quả từ nhóm nghiên cứu của TS. Phạm Bảo Yên năm 2022 về nghiên cứu đoạn gene mã hoá độc tố botulinum serotype A và B. Xuất phát từ thực tế nhằm muốn hiểu rõ hơn về trình tự gene bont/E, chúng tôi lựa chọn đối tƣợng nghiên cứu là đoạn gene đích mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố botulinum serotype E để thiết kế cặp mồi khuếch đại đƣợc toàn bộ trình tự gene mã hoá chuỗi nhẹ BoNT/E và tạo dòng, sử dụng plasmid để tối ƣu cho phản ứng real – time PCR và ứng dụng làm đối chứng dương cho các phản ứng phát hiện nhanh đoạn gene gây bệnh khi cần. Tuy nhiên, luận văn này chỉ mới dừng lại ở phần nghiên cứu trình tự gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E và bước đầu lựa chọn, tối ƣu các thành phần có trong phản ứng phát hiện đoạn gene mã hoá độc tố bằng phương pháp real – time PCR. Đây là một trong những nghiên cứu đầu tiên tại Việt Nam về trình tự gene mã hoá độc tố botulinum serotype E. Định hướng tiếp theo nhóm nghiên cứu tối ƣu, đƣa ra độ nhạy phân tích và thử nghiệm đánh giá hiệu quả của phương pháp trên nền mẫu thật (mẫu thực phẩm đóng hộp), đồng thời tiến hành nghiên cứu song song cùng với các serotype khác cùng loài.

Xuất phát từ thực tế, ngày càng nhiều vụ ngộ độc trên thế giới đƣợc xác định có liên quan đến độc tố botulinum, năm 2022 các nhà khoa học tại Ba Lan đã nghiên cứu 70 mẫu cá đóng hộp có hiện tƣợng phồng rộp vỏ để xác định nguy cơ chứa BoNT. Mục đích thứ hai là đánh giá tác động của vi khuẩn Clostridia này đối với sự an toàn của sản phẩm trên toàn dây chuyền sản xuất bằng cách sử dụng

47 phương pháp real – time PCR để xác định sự có mặt của gene NTNH, phát hiện các chủng Clostridium bằng khuếch đại gene 16S rDNA sau đó giải trình tự Sanger [29]. Trước đó, Kimura và nhóm nghiên cứu của ông đã theo dõi sự phục hồi của các tế bào C. botulinum trên nền mẫu hải sản. Kết quả này cho thấy việc định lƣợng DNA BoNT/E bằng phương pháp PCR định lượng là một phương pháp tốt để đánh giá độ nhạy về nguy cơ ngộ độc botulinum trong các mẫu hải sản đƣợc thử nghiệm.

Trong thực tế, xác định đúng vị trí và trình tự gene đích rất cần thiết trong nghiên cứu đoạn gene quan tâm, giúp chúng ta hiểu rõ hơn về chức năng của gene và cách thức điều khiển các đặc điểm sinh học của sinh vật. Năm 2022, Tao Li và cộng sự đã chỉ ra rằng 4 chủng C.butyricum thu đƣợc từ mẫu thực phẩm tại Trung

Quốc có trình tự giống 100% với trình tự gene bont/E5 của chủng C. butyricum sinh độc tố loại E đã được công bố trước đó, độ bao phủ cao (>99%) với 51 trình tự nghiên cứu, trong đó 48 trình tự là từ các chủng C. botulinum loại E và ba trình tự còn lại là từ các chủng C. butyricum đã đƣợc ghi nhận là sinh độc tố loại E (CDC 51208, BL 5256 và Cbu 5521) [39]. Năm 1991 Nobuhiro Fujii và cộng sự đã có những công bố đầu tiên về nhân bản đoạn DNA mã hóa gene độc tố botulinum loại E từ chủng Clostridium butyricum BL6340 và chủng Clostridium botulinum loại E

[16]. Năm 2009, Karen K Hil và đồng nghiệp đã nhân dòng thành công plasmid tái tổ hợp các gene phức hợp độc tố thần kinh botulinum ở các chủng Clostridium botulinum loại A, B, E, F và Clostridium butyricum. Nghiên cứu này chỉ ra rằng

giữa các chủng phân giải protein (nhóm I) hoặc các chủng không phân giải protein (nhóm II) có sự tổng hợp gene trong cùng 1 vector mà không ghi nhận sự tổng hợp gene giữa hai nhóm và gene phức hợp bont trong các chủng đƣợc kiểm tra không

nằm ở vị trí ngẫu nhiên mà đƣợc tìm thấy trong ba vùng của nhiễm sắc thể hoặc ở vị trí cụ thể trong plasmid. Bên cạnh đó, các chủng C. botulinum loại E và C.

butyricum ghi nhận vị trí của cụm gene bont/E một cách độc lập tại cùng một vị trí

ở cả hai loài [26].

Trong lĩnh vực sinh học phân tử, tính chính xác và độ nhạy của phản khuếch đại đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong chẩn đoán bệnh và nghiên cứu biểu hiện gene.

48 Các phương pháp khuếch đại khác nhau được lựa chọn để có thể cho kết quả, hiệu quả tốt nhất. Năm 2022, Gao và cộng sự đã chỉ ra rằng phương pháp Microdrop Digital PCR nhằm phát hiện trình tự gene của vi khuẩn C. botulinum serotype loại A và B có độ nhạy phân tích nhỏ hơn so với phương pháp Quantitative PCR, cụ thể giới hạn phát hiện (LOD) lần lƣợt là 0,84 và 0,88 bản sao/μl đối với gen bont/A và

bont/B bởi phương pháp Microdrop Digital PCR trong khi Quantitative PCR có

LOD tương ứng là 5,04×10 2 và 6,91×10 2 bản sao/μl [18]. Ngoài giới hạn của từng phương pháp, việc lựa chọn thành phần master mix là một phần không thể thiếu trong quy trình tối ƣu phản ứng. Trong nghiên cứu này đã đề xuất thử nghiệm với các loại DNA polymerase có trong các loại master mix khác nhau để đánh giá và so sánh hiệu suất của từng loại trong quá trình khuếch đại đoạn gene đích thông qua phản ứng real - time PCR. Bao gồm sử dụng các enzyme có tốc độ phản ứng nhanh, hiệu quả, khả năng kéo dài chính xác. Kết quả lựa chọn đƣợc master mix

“Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix” của hãng Vazyme Biotech sử dụng enzyme thế hệ mới cho khả năng phát hiện nhanh, chính xác, tổng thời gian phản ứng ngắn (dưới 40 phút). Có rất nhiều công trình nghiên cứu trên thế giới về so sánh hiệu quả của DNA ploymerase trong phản ứng khuếch đại nhƣ công bố của Hong-Wei Zhou và đồng nghiệp đã lựa chọn hai loại polymerase để đánh giá hiệu quả cho phản ứng khuếch đại. Kết quả nhận thấy PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase có độ chính xác cao hơn các loại Taq thông thường trên thị trường (cao

gấp 20 lần) và tốc độ kéo dài tốt. Ex Taq (Takara) có chính xác thấp hơn, tuy nhiên vẫn cao gấp 4 lần so với Taq thông thường [73]. Năm 2013, nhóm tác giả Masashi Miura, Chihiro Tanigawa, Yoshito Fujii và Satoshi Kaneko đã so sánh hiệu quả phản ứng PCR Nested sử dụng sáu loại DNA polymerase gồm KOD FX, Mighty Amp, Hemo KlenTaq, Phusion Blood II, KAPA Blood và BIOTAQ nhằm khếch đại vùng Plasmodium falciparum từ mẫu máu. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng KOD FX và BIOTAQ có khả năng kháng chất ức chế có trong máu và hiệu suất PCR của chúng tốt hơn so với các DNA polymerase còn lại. Ngoài ra phản ứng sử dụng KOD FX DNA polymerase không ảnh hưởng bởi chất ức chế trong quá trình lọc rửa mẫu