CHƯƠNG II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2 Phương pháp nghiên cứu
Thông qua việc so sánh trình tự hoàn chỉnh của 181 gene bont/E bằng phần mềm Bioedit, đoạn gene đích có độ tương đồng cao nhất chứa trình tự mã hoá cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E được lựa chọn có kích thước 1367bp.
2.2.2 Thiết kế mồi mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E
Trình tự mồi xuôi đƣợc lựa chọn chứa mã mở đầu ATG để thuận tiện cho việc biểu hiện BoNT/E. Đoạn gene sau khi khuếch đại mang trình tự mã hoá cho chuỗi nhẹ của độc tố botulinum serotype E.
Các yếu tố quan trọng trong quá trình thiết kế mồi bao gồm: độ dài của mồi, đầu 3‟ và 5‟ của mồi, nhiệt độ nóng chảy Tm, nhiệt độ gắn mồi Ta, hàm lƣợng GC và cấu trúc thứ cấp.v.v.
- Độ dài của mồi: Độ dài của mồi cần đƣợc xác định sao cho đủ dài để đảm bảo độ chính xác của phản ứng khuếch đại, nhƣng cũng không quá dài để tránh sự cạnh tranh với các mục tiêu khác.
- Nhiệt độ nóng chảy: là nhiệt độ mà tại đó có thể phá vỡ liên kết hidro, tách sợi DNA thành 2 mạch đơn, có chiều dài bằng nhau. Nhiệt độ nóng chảy cũng thể hiện độ bền của sợi DNA. Tm được ước tính bằng phương pháp Nearest- Neighbor.
Phương pháp này cho giá trị gần với giá trị thực. Giá trị Tm được tính toán dưới sự phối hợp những điều kiện thí nghiệm chẳng hạn nhƣ nồng độ muối và nồng độ oligo. Nhiệt độ nóng chảy của mồi nằm trong khoảng 55 ˚C - 59˚C sẽ cho kết quả
26 tốt nhất. Nhƣ vậy, có thể kết luận bộ mồi thiết kế đƣợc có nhiệt độ nóng chảy đạt yêu cầu
Công thức tính Tm:
Tm=4°C x (G + C) + 2°C x (A + T) Công thức tính Tm chứa muối:
Tm = 81,5+16,6x(log10[Na+]) + 0.41x(%(G+C)) – 675/n Trong đó: [Na+] là nồng độ phân tử muối, n là số base của mồi.
- Đầu 3‟ và 5‟ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3‟ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngƣợc và đầu 3‟ của mồi ngƣợc sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi đƣợc gắn vào 2 mạch bổ sung. Mồi cần đƣợc thiết kế sao cho phù hợp với chuỗi mục tiêu để đảm bảo mạch đôi của DNA có thể được mở rộng đúng hướng khi phản ứng khuếch đại diễn ra.
2.2.3 Khuếch đại gene mã hóa chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR được sử dụng để khuếch đại đoạn gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố loại E bằng mồi BoNT/E Fw và BoNT/E Rv thiết kế, sản phẩm sau đó
đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 1% bằng cách pha 1g agarose với mỗi 100mL đệm TAE 1X, sử dụng 0.5μL RedSafe/12,5mL gel. Mỗi giếng trên gel đƣợc tra 5 μL sản phẩm PCR, gel đƣợc đặt trong bể điện di chứa đệm TAE 1X, điện di trong điều kiện 90V, 30 phút. Bản gel sau điện di được quan sát dưới tia UV và được chụp ảnh lại.
Bảng 2.2: Thành phần phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)
Master mix 2x 6 l
Mồi xuôi (0,417 M) 0,5 l Mồi ngƣợc (0,417 M) 0,5 l
Nước 4 l
Khuôn DNA 1 l
Tổng 12 l
27
2.2.4 Tối ƣu chu trình nhiệt cho phản ứng PCR
Phản ứng tối ƣu chu trình nhiệt của phản ứng khếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E đƣợc thử nghiệm với các điều kiện gắn mồi (Tm) thay đổi với dải nhiệt độ từ 50 ˚C – 54 ˚C với chu trình nhƣ bảng 2.3
Bảng 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng PCR
Nhiệt độ Thời gian Số chu kỳ
95 ˚C 5 phút 1
95 ˚C 1 phút
30
Tm 1 phút
72 ˚C 1 phút 30 giây
72 ˚C 10 phút 1
2.2.5 Tạo dòng vector pLUG mang gene mã hóa cho chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E 2.2.5.1 Phản ứng ghép nối đoạn gene mã hóa độc tố BoNT/E vào vector pLUG
Vector và đoạn gene chèn (sản phẩm PCR) đƣợc nối với nhau thông qua hoạt động của enzyme ligase T4 (giúp xúc tác sự hình thành liên kết photphodiester giữa đầu 5 'photphat và đầu 3' hydroxyl termini trong DNA). Các thành phần của phản ứng ligation được liệt kê trong bảng 2.4. Phản ứng được thực hiện theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Bảng 2.4: Thành phần phản ứng ligation
Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng) Ligation buffer A 10x 1 ul
Ligation buffer B 10x 1 ul TA – Cloning vector II 2 ul
T4 DNA ligase 1 ul
Sản phẩm PCR 3 ul
Nước 1 ul
Tổng phản ứng 10 ul
28 Hỗn hợp sản phẩm nối đƣợc biến nạp vào các tế bào khả biến E. coli Top 10
và đƣợc cấy trải lên đĩa thạch LB có chứa kháng sinh ampicillin 50mg/mL, X - Gal 20 mg/mL và IPTG 20 mg/mL để sàng lọc trắng xanh.
2.2.5.2 Biến nạp vào tế bào khả biến E. coli Top 10
Ống chứa 50-100 àL dung dịch tế bào khả biến đƣợc làm tan trờn đỏ. Sau đú, cho sản phẩm ligase vào dịch tế bào khả biến, trộn bằng cách búng nhẹ và ủ trên đá 30 phút. Chuyển mẫu vào bể ổn nhiệt ở 42˚C trong vòng 45 giây sau đó nhanh chóng để mẫu trở lại hộp đá (tạo phản ứng sốc nhiệt). Ủ ống tế bào trên đá 5 phút trước khi bổ sung 800mL môi trường LB lỏng. Nuôi lắc ống tế bào ở 37˚C, 180 vòng/phút trong 1 tiếng. Ly tâm ống tế bào ở 3000 vòng trong 1 phút. Hút bỏ 600mL dịch nổi. Hòa tan tủa tế bào bằng pipette với phần dung dịch còn lại và cấy trải trờn đĩa thạch gồm 25mL LB cú bổ sung khỏng sinh ampicillin, trải thờm 25àL X-Gal 20mg/mL và 25àL IPTG 20mg/mL. Bọc đĩa bằng paraffin và ủ ở 37˚C trong 16 tiếng.
2.2.5.3 Sàng lọc trắng xanh để chọn vector tái tổ hợp.
Lựa chọn khuẩn lạc riêng rẽ rồi đem đi PCR sử dụng cặp mồi M13 trên vector nhằm xác nhận sự có mặt của đoạn gene chèn. Khuẩn lạc xác định có chứa đoạn chèn sẽ được nuôi trong môi trường LB lỏng có bổ sung kháng sinh ampicillin, lắc ở 180 vòng/phút trong 16 tiếng. Sản phẩn sau nuôi lỏng đƣợc tách chiết để thu plasmid tái tổ hợp. Mẫu plasmid sau đó đƣợc định lƣợng nồng độ bằng máy đo Nanodrop.
2.2.6 Khuếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ cho độc tố BoNT/E sử dụng cặp mồi bont/EB3, bont/EF3 bằng phương pháp real - time PCR
Phản–ứng real - time PCR khuếch đại đoạn gene mã hoá chuỗi nhẹ độc tố BoNT/E có kích thước 202 bp sử dụng cặp mồi bont/EF3 (5‟GGAGGGATTTTAT TAGAAGAACTG3‟), bont/EB3 (5‟GAGAAATATTGGAACTGTTAGTTTC3‟) với các master mix khác nhau. Tuỳ thuộc vào từng loại master mix của các hãng sản xuất khác nhau nên có thành phần phản ứng khác nhau (bảng 2.5). Kết quả đọc đƣợc ngay khi phản ứng kết thúc.
29
Bảng 2.5: Thành phần phản ứng real - time PCR
Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)
Luna universal qPCR master mix 2x 6 l
Mồi xuôi (0,417 M) 0,5 l
Mồi ngƣợc (0,417 M) 0,5 l
Nước 4 l
Khuôn DNA 1 l
Tổng 12 l
Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng)
Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 2x 6 l
Mồi xuôi (0,417 M) 0,5 l
Mồi ngƣợc (0,417 M) 0,5 l
Nước 4 l
Khuôn DNA 1 l
Tổng 12 l
Thành phần phản ứng Thể tích (1 phản ứng) Platinum™ SuperFi™ PCR Master Mix 2x;
Taq Master Mix (Dye Plus) 2x;
Taq DNA Polymerase Master Mix RED 2x;
Phanta Plash Master mix 2x
6 l
Mồi xuôi (0,417 M) 0,5 l
Mồi ngƣợc (0,417 M) 0,5 l
LAMP dye 50x 0.24 l
Nước 3.76 l
Khuôn DNA 1 l
Tổng 12 l
30