Tổng quan về diclofenac epolamin
Công thức hóa học
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Diclofenac epolamin
N-(2-hydroxyethyl)pyrrolidinium(2-((2,6-dichlorophenyl)amino)phenyl)acetat
• Công thức phân tử: C20H24Cl2N2O3
Tính chất vật lý
Diclofenac là một hợp chất acid (pK a 3,80 ở 25 °C) với log P là 4,0 và có độ hòa tan trong nước rất thấp (6 × 10 -5 M ở 25°C) ở dạng liên kết [6], [16] Vì để cải thiện độ hòa tan của diclofenac nên trong dược phẩm, người ta đã kết hợp diclofenac với N-(2-hydroxyethyl)-pyrrolidine (epolamin), là một cation không có hoạt tính dược lý, dẫn đến sự kết hợp cân bằng giữa các gốc thân nước và kỵ nước trong cấu trúc của muối [7], [15], [42] Ngoài ra, diclofenac epolamin còn thể hiện được đặc tính hoạt động bề mặt với khả năng hòa tan N-phenyl-1-naphthylamin ở nồng độ 30 mM trở lên [33] Do đó, diclofenac epolamin có khả năng hòa tan tốt trong cả dung môi hữu cơ cũng như trong nước đồng thời duy trì hoạt động dược lý của thuốc gốc, cải thiện đặc tính dược lý của diclofenac Ngoài ra, đặc tính hoạt động bề mặt của diclofenac epolamine còn giúp cải thiện quá trình hydrat hóa của lớp sừng, từ đó làm giảm sức căng bề mặt ở ranh giới giữa da và chế phẩm dược phẩm dùng tại chỗ, giúp hấp thu thuốc qua da [18]
Từ kết quả của các nghiên cứu trước, muối diclofenac epolamin được chứng minh là có khả năng hòa tan tốt nhất trong cả nước và dung môi hữu cơ khi so với các muối kiềm và amin khác [42] Kết quả độ hòa tan trong nước của diclofenac epolamin và dung môi hữu cơ n-octanol (tương ứng là 1,8 và 8,3 g%) cao hơn nhiều so với muối natri (tương ứng
3 là 0,96 và 0,43 g%) [17] Ngoài ra, ở một thí nghiệm khác, diclofenac epolamin có độ tan trong nước ở 25°C là 46 mM, cao nhất trong các muối diclofenac được nghiên cứu [19] Diclofenac epolamin ở dạng kết tinh có màu trắng hoặc hơi trắng với nhiệt độ nóng chảy là 104°C [36].
Tính chất dược lý
Diclofenac epolamin là một NSAID điển hình với cơ chế tác dụng chính là thông qua ức chế enzym cyclooxygenase, với 2 dạng đồng phân là COX-1 và COX-2 Về mặt hóa sinh, enzym cyclooxygenase đóng vai trò quan trọng trong việc biến đổi acid arachidonic thành thromboxan A2 và prostacyclin Là một sản phẩm chính của COX-1 trong tiểu cầu, thromboxan A2 là một chất có tác dụng làm co mạch và làm tăng kết tập tiểu cầu Sự ức chế COX-1 sẽ làm giảm sự tổng hợp thromboxan trong tiểu cầu, do đó cản trở sự kết tập tiểu cầu từ đó làm tăng nguy cơ chảy máu [26] Ngoài ra, sự ức chế COX-1 ở tế bào biểu mô dạ dày làm suy giảm các prostaglandin bảo vệ tế bào ở niêm mạc, đặc biệt là prostacyclin và prostaglandin E2, các eicosanoid này ức chế sự tiết acid của dạ dày, tăng cường lưu lượng máu đến niêm mạc và thúc đẩy tiết chất nhầy bảo vệ tế bào trong dạ dày, ruột [30] Từ đó làm tăng nguy cơ gặp phải các tác dụng phụ về đường tiêu hóa như loét dạ dày Mặt khác, prostacyclin là sản phẩm chính của COX-2 trong tế bào nội mô mạch máu Ngoài tác dụng ức chế hoạt hóa tiểu cầu, prostacyclin còn là một chất làm giãn mạch hiệu quả Việc ức chế COX-2 sẽ ngăn chặn sự tổng hợp các prostaglandin giãn mạch và tạo ra trạng thái co mạch [26]
Và theo một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng diclofenac epolamin có tính ức chế chọn lọc COX-2 [26]
1.1.4 Dược động học a Hấp thu
Từ các đặc điểm vật lý đã nêu ở trên và qua thực nghiệm cho thấy rằng khi so sánh trực tiếp tốc độ hấp thu trung bình của diclofenac epolamin vào huyết tương với diclofenac natri thì kết quả thu được là diclofenac epolamin được hấp thu nhanh hơn 1,4 lần [32] Trong một nghiên cứu khác, nồng độ trong huyết tương của diclofenac epolamin được so sánh với dạng muối natri của nó Các tình nguyện viên được sử dụng DETP trong
4 ngày, mỗi ngày 2 lần và nồng độ diclofenac trong huyết tương được ghi nhận lại trong hơn 12 giờ sau khi sử dụng Kết quả cho thấy rằng nồng độ diclofenac trong huyết tương ở trạng thái ổn định nhỏ hơn 1 % so với nồng độ sau khi uống một liều diclofenac natri 50 mg duy nhất [45] Ngoài ra, khi đánh giá dược động học của diclofenac kali trong 6 giờ thì
4 sinh khả dụng tương đối của DETP được ước tính là từ 0,9 - 1,7 % của 75 mg diclofenac kali [37], [40]
Các nghiên cứu khác cho thấy rằng nồng độ đỉnh của diclofenac trong huyết tương là khoảng 0,7 - 6 ng/ml được ghi nhận khi bôi DETP ở vùng trên cánh tay và trong khoảng từ 10 đến 20 giờ sau đó [40] Nồng độ diclofenac trong huyết tương trong khoảng 1,3 - 8,8 ng/ml được ghi nhận sau 5 ngày sử dụng DETP hai lần mỗi ngày [40] Mặt khác, nồng độ diclofenac trong máu và hoạt dịch sau khi bôi DETP đã được đánh giá ở 8 bệnh nhân tràn dịch khớp với liều lặp lại 2 lần mỗi ngày trong bốn ngày liên tiếp Kết quả thu được là nồng độ diclofenac trong hoạt dịch bằng 36 % nồng độ tìm thấy trong huyết tương [22] Những nồng độ này cho thấy sự vận chuyển trực tiếp của diclofenac qua da để đến khoang dịch khớp Ngoài ra, tại thời điểm 4 giờ sau lần bôi cuối cùng, nồng độ trung bình của diclofenac trong huyết tương là 3,62 ng/ml [22]
Trong 3 nghiên cứu từ năm 1998 đến năm 2002, các tác giả đã đánh giá nồng độ diclofenac trong huyết tương ở trạng thái ổn định ở những người khỏe mạnh tại thời điểm trước ngày thứ 3 là xấp xỉ 3 ng/ml Và trong 12 giờ bôi DETP, đặc tính dược động học của diclofenac không bị ảnh hưởng khi đạp xe trong vòng 20 phút/giờ [40] Ở một nghiên cứu khác, Gschwend và cộng sự đã đánh giá nồng độ diclofenac trong máu sau ở 24 người tình nguyện khỏe mạnh khi bôi DETP 2 lần mỗi ngày trong 4 ngày liên tiếp Nồng độ đỉnh tối đa trong huyết tương của họ trong khoảng thời gian từ 0 - 12 giờ là 1,55 ng/ml và từ
0 - 24 giờ là 1,57 ng/ml [25] Những kết quả này có thể được so sánh với các nghiên cứu về diclofenac natri đường uống đã được thực hiện trước đấy Trong một nghiên cứu sử dụng liều duy nhất 25 mg diclofenac natri đường uống, nồng độ đỉnh trong huyết tương được báo cáo là 720 - 1100 ng/ml [23] Trong một nghiên cứu khác, những phụ nữ trẻ (tuổi < 22) và lớn tuổi hơn (tuổi > 62) được cho sử dụng một liều duy nhất diclofenac natri 50 mg đường uống lúc đói; nồng độ đỉnh trung bình trong huyết tương được báo cáo trong nghiên cứu này là 1500 - 1600 ng/ml [49]
Thêm vào đó, công thức miếng dán của diclofenac epolamine đã được chứng minh là có sinh khả dụng khoảng 30 % so với công thức gel 1 % sau khi sử dụng liên tục trong 7 ngày Việc sử dụng gel diclofenac epolamine 1 % cho kết quả Tmax trung bình là 3,1 giờ và
Cmax trung bình là 28,1 ng/ml, trong khi dạng miếng dán cho kết quả Tmax và Cmax trung bình lần lượt là 5,4 giờ và 17,4 ng/ml [7] b Phân bố
Diclofenac có tỷ lệ liên kết cao với protein huyết thanh [10] và có ái lực rất cao (> 99 %) với albumin huyết thanh người [9] Thể tích phân bố thấp cho phép diclofenac
Dược động học
phân phối ưu tiên đến vị trí viêm và đạt được mức nồng độ ổn định trong dịch khớp, là nơi mà thông thường sẽ có nồng độ diclofenac cao hơn nồng độ tìm thấy trong huyết tương [29], [43] c Chuyển hóa và thải trừ
Thời gian bán hủy trong huyết tương của diclofenac sau khi sử dụng là khoảng
12 giờ [9] Diclofenac được thải trừ thông qua quá trình chuyển hóa qua gan nhờ cơ chế liên hợp với acid glucuronic và sulfonic trước khi được bài tiết qua nước tiểu và mật ở dạng chất chuyển hóa glucuronide và sulfat [9].
Chỉ định
Hiệu quả giảm đau của diclofenac epolamin đã được chứng minh trong điều trị triệu chứng của nhiều tình trạng đau tại chỗ khác nhau, chẳng hạn như viêm xương khớp đầu gối [11], [12], các bệnh viêm nhiễm cục bộ [44], các bệnh viêm khớp ở quanh và ngoài khớp [20], chấn thương thể thao nhẹ (bong gân, căng cơ, bị dập cơ) [21], [39], viêm khớp và viêm mỏm lồi cầu bên [47].
Tổng quan về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Khái niệm
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa trên cơ sở của sự phân tách các chất trên một pha tĩnh chứa trong cột, nhờ dòng di chuyển của pha động lỏng dưới áp suất cao Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các chất này với pha tĩnh và pha động Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy phụ thuộc vào các yếu tố đó Thành phần pha động đưa chất phân di chuyển qua cột cần được điều chỉnh để rửa giải các chất với thời gian hợp lý [2], [5].
Cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao sẽ có những bộ phận cơ bản sau:
- Hệ thống cấp pha động Pha động được bơm từ bình chứa rồi chảy quan cột với tốc độ được cài đặt sẵn và cuối cùng qua detector
- Bộ phận thu nhận và xử lý dữ liệu [1], [3]
Sơ đồ cấu tạo của máy sắc ký lỏng hiệu năng cao được biểu diễn như hình dưới đây:
Hình 1.2: Sơ đồ cấu tạo của máy HPLC
Sắc ký pha đảo hiệu năng cao
Trong kỹ thuật này pha tĩnh bao gồm các nhóm không phân cực như octadecyl (C18), octyl (C8) hay phenyl (C6H5) [5]
Pha động là những dung môi phân cực như: nước, methanol (MeOH), acetonitril (ACN)
Thành phần đầu tiên của pha động trong sắc ký pha đảo là nước Những dung môi hòa lẫn được với nước methanol, ethanol (EtOH), acetonitril, dioxan, tetrahydrofuran (THF) và dimethylformamid được thêm vào để điều chỉnh độ phân cực của pha động Một số thành phần khác cũng có thể được thêm vào pha động như: các acid, base, đệm, chất diện hoạt
Cặp dung môi được sử dụng phổ biến nhất trong sắc ký pha đảo là: H2O - MeOH và
H2O - ACN Điều dễ nhận thấy, MeOH có nhược điểm là độ nhớt cao của nó có thể làm giảm hiệu lực cột Trong khi ACN có độ nhớt thấp hơn, thích hợp hơn với các chất không phân cực vì thế nó thường được dùng nhiều hơn MeOH Thời gian lưu sẽ ngắn hơn nếu nồng độ ACN bằng nồng độ MeOH [5].
Các thông số đặc trưng trong sắc ký lỏng hiệu năng cao
Tốc độ di chuyển của các chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K
CS là nồng độ mol của chất tan trong pha tĩnh (mol/l)
CM là nồng độ mol của chất tan trong pha động (mol/l)
Hệ số K phụ thuộc vào bản chất của pha động, pha tĩnh và chất hòa tan Trị số K càng lớn, sự di chuyển của chất tan qua pha tĩnh càng chậm Nếu các chất trong hỗn hợp có hằng số K càng nhiều, thì khả năng diễn ra càng dễ dàng [2] b Thời gian lưu tR
Thời gian lưu tR của một chất là khoảng thời gian tính từ lúc tiêm mẫu vào cột đến khi detector ghi nhận được nồng độ tối đa của chất đó và hiển thị trên sắc ký đồ Trong cùng một điều kiện sắc ký, thời gian lưu của mỗi chất là hằng định, điều này làm cơ sở cho phép định tính Thời gian lưu của các chất phụ thuộc vào các yếu tố:
- Bản chất của pha tĩnh
- Bản chất, thành phần, tốc độ của pha động
- Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
- pH của pha động c Hệ số dung lượng k’
Hệ số k’ là một thông số quan trọng mô tả tốc độ di chuyển của chất phân tích A qua cột Hệ số k’ còn được gọi là hệ số phân bố khối lượng giữa hai pha [5]
K là hệ số phân bố
Vs là thể tích pha tĩnh (l)
Vm là thể tích pha động (l) tR là thời gian lưu của chất phân tích (phút) t0 là thời gian để pha động ra khỏi cột phân tích (phút)
Thông thường người ta lựa chọn điều kiện sắc ký sao cho k’ nằm trong khoảng tối ưu: 1 ≤ k’ ≤ 8 d Hệ số chọn lọc α
Hệ số chọn lọc α là đại lượng đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất A và B
Với quy ước ở đây B là chất bị lưu giữ mạnh hơn A nên α ≥ 1 Để tách riêng hai chất thì thường chọn α dao động trong khoảng 1,05 - 2 Nếu α quá lớn thì thời gian phân tích sẽ dài [5] e Hệ số đối xứng của pic F
W là chiều rộng của pic đo ở 1/20 chiều cao pic a là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước tại vị trí 1/20 chiều cao pic f Độ phân giải Rs
Trong đó: tR.B, tR.A là thời gian lưu của hai pic liền kề nhau (B và A)
WB, WA là độ rộng pic được đo ở đáy pic
W1/2.B, W1/2.A là độ rộng pic được đo ở nửa chiều cao pic
Yêu cầu Rs > 1, giá trị tối ưu là 1,5 g Số đĩa lý thuyết
Số đĩa lý thuyết là đại lượng đặc trưng cho hiệu lực của cột sắc ký [5]
𝑊 1/2 2 Trong đó: tR là thời gian lưu
W là chiều rộng đo ở đáy pic
W1/2 là chiều rộng đo ở nửa chiều cao pic
Ứng dụng của sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một phương pháp phân tích rất hiệu quả hiện nay để phân tách, định tính cũng như định lượng các hợp chất có cấu trúc gần như tương tự nhau trong một hỗn hợp Vì thế nên nó được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như: dược phẩm, thực phẩm, môi trường,… và được dùng phổ biến để phân tích các chất có nguồn gốc từ tự nhiên hoặc tổng hợp Các ứng dụng phổ biến của HPLC bao gồm:
Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ phải tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn đối chiếu trên sắc ký đồ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao được sử dụng rất phổ biến để định lượng các chất và xác định giới hạn tạp chất
Tất cả các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: Nồng độ của chất phân tích tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó
Các phương pháp định lượng hay được sử dụng trong HPLC: a Phương pháp chuẩn ngoại (External standard)
Phương pháp chuẩn ngoại là phương pháp mà trong đó cả hai mẫu chuẩn và thử đều được tiến hành sắc ký trong cùng một điều kiện Sau đó, so sánh diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu thử với diện tích (hoặc chiều cao) pic của mẫu chuẩn sẽ tính được nồng độ của các chất trong mẫu thử Có thể sử dụng phương pháp chuẩn hóa một điểm hoặc nhiều điểm:
- Chuẩn hóa một điểm: Chọn nồng độ của mẫu xấp xỉ với nồng độ của mẫu thử Tính nồng độ của mẫu thử theo công thức:
CX là nồng độ của mẫu thử
CS là nồng độ của mẫu chuẩn
SX (HX) là diện tích (chiều cao) của pic mẫu thử
SS (HS) là diện tích (chiều cao) của pic mẫu chuẩn
- Chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn với nồng độ tăng dần rồi tiến hành sắc ký Các đáp ứng thu được là các diện tích hoặc chiều cao pic ở mỗi điểm chuẩn Vẽ đồ thị chuẩn biểu diễn sự tương quan giữa diện tích S (hoặc chiều cao H) pic với nồng độ của chất chuẩn Sử dụng các đoạn tuyến tính của đường chuẩn để tính toán nồng độ của chất cần xác định [2]
10 b Phương pháp chuẩn nội (Internal standard)
Phương pháp chuẩn nội là phương pháp thêm vào cả mẫu thử và mẫu chuẩn những lượng bằng nhau của một chất tinh khiết, rồi tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện Chất được thêm vào gọi là chất chuẩn nội
Có một số yêu cầu đặt ra đối với chất chuẩn nội:
- Trong cùng điều kiện sắc ký, chất chuẩn nội phải được tách hoàn toàn và có thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất cần phân tích trong mẫu thử
- Có cấu trúc hóa học tương tự như chất thử
- Có nồng độ xấp xỉ với nồng độ của chất thử
- Không phản ứng với bất cứ thành phần nào của mẫu thử
- Phải có độ tinh khiết cao và dễ kiếm
Phương pháp chuẩn nội một điểm: Chuẩn nội được thêm vào cả mẫu chuẩn và mẫu thử rồi tiến hành sắc ký
Nồng độ của thành phần trong mẫu thử được tính như sau:
CT, CIS lần lượt là nồng độ của chất thử và chất chuẩn nội
ST, SIS lần lượt là diện tích pic của chất thử và chất chuẩn nội
Phương pháp chuẩn hóa nhiều điểm: Chuẩn bị một dãy chuẩn có chứa những lượng (hoặc nồng độ) chất chuẩn khác nhau nhưng tất cả cùng chứa một lượng (hoặc nồng độ) chuẩn nội Sau khi sắc ký và thu được các dữ liệu diện tích, tiến hành vẽ đường chuẩn [2] c Phương pháp thêm chuẩn (Standard addition)
Nguyên tắc: Thêm vào mẫu thử những lượng đã biết của các chất chuẩn tương ứng với các thành phần có trong mẫu thử rồi lại tiến hành xử lý mẫu và sắc ký trong cùng điều kiện Nồng độ chưa biết của mẫu thử CX được tính theo công thức sau:
SX là diện tích (hoặc chiều cao) của pic mẫu thử
∆C là lượng chất chuẩn thêm vào
∆S là sự chênh lệch giữa diện tích pic (hoặc chiều cao) [2]
11 d Phương pháp thêm đường chuẩn
Nguyên tác: Chuẩn bị một dãy hỗn hợp gồm các lượng mẫu thử giống nhau và các chất chuẩn (tương ứng với các thành phần cân xác định) với lượng tăng dần Xử lý mẫu rổi tiến hành sắc ký Dựng đường chuẩn tương quan giữa diện tích (S) hoặc chiểu cao (H) của pic tổng (thử + chuẩn) với lượng hoặc nồng độ của chất chuẩn thêm (∆C) Giao điểm của đường chuẩn kéo dài với trục hoành chính là nồng độ của chất cần xác định [2].
Thẩm định phương pháp phân tích
Tính thích hợp hệ thống
Khảo sát độ thích hợp hệ thống là phép thử nhằm đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích bao gồm: máy móc thiết bị, cách tiến hành phân tích, mẫu thử Việc khảo sát tiến hành bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một dung dịch chuẩn hỗn hợp vào hệ thống sắc ký theo chương trình đã chọn Độ thích hợp của hệ thống HPLC được biểu thị qua sắc ký đồ, thời gian lưu, diện tích pic Tính giá trị trung bình và RSD của thời gian lưu và diện tích pic [27]
- RSD của thời gian lưu ≤ 1,0 %
- RSD của diện tích pic ≤ 2,0 %.
Tính đặc hiệu
Tính đặc hiệu: Là khả năng phát hiện được chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác như các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tương tự, tạp chất,
Cụ thể, trong phép phân tích định tính đó là phải chứng minh được kết quả là dương tính khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích Trong phép phân tích định lượng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi bị ảnh hưởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hướng đến kết quả chính xác [27].
Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính của một phương pháp phân tích là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Trong một đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính, khoảng tuyến tính là khoảng từ nồng độ thấp nhất đến cao nhất Việc xác định khoảng tuyến tính thường được khảo sát bắt đầu từ giới hạn định lượng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm cao nhất) Để xác định khoảng tuyến tính cần tối thiểu là 6 nồng độ khác nhau
12 Đường chuẩn thường biểu diễn mối quan hệ giữa nồng độ đã biết của chất cần phân tích với đáp ứng đo được [27]
Yêu cầu: Hệ số tương quan tuyến tính: 0,995 ≤ R ≤ 1 hay 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
% Hệ số chắn (so với diện tích tại nồng độ 100 %): % Y ≤ 2,0 %
Công thức tính: % Y = (Hệ số chắn/Diện tích pic chuẩn 100 %) × 100 %.
Độ đúng
Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác, tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu được chấp nhận là đúng (gọi chung là giá trị đúng)
Muốn xác định độ đúng cần phải tìm được giá trị đúng, có nhiều cách khác nhau để xác định độ đúng, bao gồm việc so sánh kết quả thực nghiệm với kết quả thực hiện bởi một phương pháp đối chiếu hoặc sử dụng mẫu đã biết nồng độ (mẫu kiểm tra hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận) và phương pháp xác định độ thu hồi (độ tìm lại) [27] Để xác định độ đúng thông quan độ thu hồi cần thêm một lượng chất chuẩn xác định vào mẫu thử hoặc mẫu trắng, phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu 4 lần bằng phương pháp khảo sát, tính độ thu hồi theo công thức sau:
Cm+c là nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn
Cm là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
Cc là nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết)
Sau đó tính độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại
- Tỷ lệ thu hồi nằm trong khoảng 98,0 % - 102,0 %
- RSD tỷ lệ thu hồi ≤ 2,0 %.
Độ lặp lại
Độ lặp lại là một thông số định tính được sử dụng để kiểm soát các yếu tố sai số ngẫu nhiên trong quy trình gây ra Trong thực nghiệm, độ lặp lại biểu diễn mức độ chính xác của quy trình trên cùng một mẫu thử ở cùng một điều kiện xác định
13 Độ lặp lại có thể được đánh giá trên kết quả của: a, Tối thiểu 9 lần định lượng trong khoảng nồng độ đã được xác định của quy trình (ví dụ 3 nồng độ, mỗi nồng độ được tiến hành 3 lần) b, Tối thiểu 6 lần định lượng ở nồng độ thử 100% [27].
Độ chính xác trung gian
Độ chính xác trung gian biểu diễn sự phân tán kết quả của cùng một quy trình nhưng được thực hiện bởi kiểm nghiệm viên khác nhau trên các thiết bị khác nhau và ở những thời điểm khác nhau Để xác định độ chính xác trung gian cần tiến hành thực nghiệm ở hai thời điểm khác nhau bởi hai kiểm nghiệm viên
- RSD kết quả định lượng của mỗi kiểm nghiệm viên thử nghiệm ≤ 2,0 %
- RSD kết quả định lượng của hai kiểm nghiệm viên thử nghiệm ≤ 1,0 %.
Một số phương pháp định lượng diclofenac epolamin
Bảng 1.1: Một số phương pháp định lượng diclofenac epolamin
STT Đối tượng nghiên cứu Điều kiện sắc ký Tài liệu tham khảo
1 Công thức diclofenac epolamin dạng lỏng
5 àm; BGB Analytik AG, Boeckten, Thụy Sĩ)
KH2PO4 0,05 M (pH 5,5) - Acetonitril (45:55, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 205 nm
Pflaster chứa 180 mg diclofenac epolamin (1,3 %)
5 àm; Kya Technologies Corporation, Nhật Bản)
Acid formic 0,1 % - Methanol (75:25, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 280 nm
1,3 % kl/kl (3,4 mg diclofenac epolamin)
- Pha động: KH2PO4 0,05 M (pH 7,0) - Methanol - Acetonitril
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 205 nm
- Pha động: Acetonitril - Nước - Acid acetic (50:46:4, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1,5 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
5 Flector ® 1.3 % patch - Cột: Agilent Zorbax ® 300SB - C8
- Pha động: Methanol - Hệ đệm Kali phosphat 20 mM (65:35, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 280 nm
5 àm, ID, E Merck, Darmstadt, Đức)
- Pha động: Acetonitril - Hệ đệm phosphat (0,1 %) (35:65, tt/tt)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
- Bước sóng phát hiện: 280 nm
Từ những phương pháp từ các tài liệu đã tìm được, ta có thể thấy đã có những phương pháp định lượng diclofenac epolamin bằng HPLC Phần lớn cột sắc ký được sử dụng là cột C18 Còn thành phần pha động thì khá đa dạng về thành phần và tỷ lệ tùy vào mục đích của nghiên cứu và các chất cần phân tích Tuy nhiên, những thí nghiệm này chủ yếu nhằm mục đích đánh giá nồng độ của diclofenac trong huyết tương và tính thấm của diclofenac epolamin qua da
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Mẫu bột diclofenac epolamin được tổng hợp trên Bộ môn Kỹ thuật Hóa dược và Chiết xuất trực thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội
- Chất chuẩn Diclofenac for system suitability European Pharmacopoeia Reference Standard (chứa tạp A và F), khối lượng: 1 mg, SKS 02559
- Chất chuẩn Diclofenac epolamin, hàm lượng 100,00 %, SKS: 119623-66-4, số lô 1-SM-18-3, nguồn gốc: Toronto Research Chemicals, Canada
- Acid phosphoric 85 %, D = 1,71 g/cm 3 , SKS: 7664-38-2, nguồn gốc Scharlau (Tây Ban Nha)
- Methanol, SKS: 67-56-1, nguồn gốc: Mỹ
- Natri dihydrophosphat dihydrat (NaH2PO4.2H2O), SKS: 72003-83-9, nguồn gốc: Trung Quốc
2.1.3 Thiết bị và dụng cụ
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 kết nối detector DAD
- Hệ thống máy HPLC Shimadzu LC-20 kết nối detector PAD
- Cột sắc ký: Apollo C8 (250 ì 4,6 mm; 5 àm)
- Cân phân tích Mettler Toledor MS105, độ chính xác: 0,01 mg
- Cân phân tích Mettler Toledor GF-244A, độ chính xác: 0,0001 mg
- Pipet chính xác 1 ml, 3 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml
- Bình định mức 20 ml, 50 ml, 1000 ml, 2000 ml
- Màng lọc cellulose acetate 0,45 àm
- Bể rửa siêu âm điều khiển cơ JP-100
- Bộ dụng cụ lọc dùng cho sắc ký
Xây dựng phương pháp định lượng
2.2.1 Lựa chọn một số điều kiện sắc ký a Pha động
Tiến hành thực nghiệm để đánh giá và lựa chọn pha động phù hợp dựa vào khả năng tách diclofenac epolamin, thời gian lưu và hình dáng pic của diclofenac epolamin Pha động được khảo sát và lựa chọn theo Dược điển Châu Âu [14] là dung dịch đệm phosphat pH 2,5
Quy trình chuẩn bị dung dịch đệm phosphat pH 2,5: Cân khoảng 0,8 g NaH2PO4.2H2O vào cốc có mỏ 1000ml rồi cho khoảng 200 ml nước tinh khiết vào cốc Lắc siêu âm cốc trong khoảng 10 phút rồi lấy ra để ổn định ở nhiệt độ phòng Tiếp theo hút khoảng 3 ml dung dịch H3PO4 85 %, tương đương với khoảng 0,5 g (D = 1,71 g/cm 3 ) cho vào cốc rồi khuấy đều Thêm nước tinh khiết đến đủ 1000ml rồi điều chỉnh pH về 2,5 bằng
H3PO4 Lọc dung dịch pha động qua màng lọc 0,45 àm b Cột sắc ký
Thông qua tìm hiểu các tài liệu trong nước [4], nước ngoài [14] cũng như căn cứ tính chất lý hóa của diclofenac epolamin, các nghiên cứu đã công bố về định lượng diclofenac epolamin và điều kiện tại cơ sở thực nghiệm, tiến hành chọn cột sắc ký Apollo C8 (250 × 4,6 mm; 5 àm) c Bước sóng lấy sắc ký đồ
Qua các tài liệu tham khảo và các nghiên cứu được công bố để khảo sát lựa chọn bước sóng phù hợp dùng cho định lượng e Một số điều kiện sắc ký khác
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng diclofenac epolamin được thực hiện dựa trên hướng dẫn của ICH [27] và AOAC International 2016 [28]
2.2.2.1 Tính thích hợp hệ thống
- Dung dịch pha động: Tiến hành chuẩn bị pha động như ở phần a mục 2.2.1
- Dung dịch phân giải: Hòa tan 1 lọ chuẩn Diclofenac for system suitability EPCRS (chứa tạp A và F) khối lượng 1 mg trong 1 ml pha động
Cân chính xác khoảng 50,0 mg diclofenac epolamin chuẩn cho vào bình định mức
50 ml, thêm khoảng 25 ml dung môi pha động rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút Sau đó để dung dịch ổn định ở nhiệt độ phòng rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ khoảng 1000 àg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc, hỳt chớnh xác 1,0 ml và cho vào bình định mức 20 ml rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu dung dịch chuẩn nồng độ khoảng 50 àg/ml
- Ngoại trừ dung dịch phõn giải, lọc tất cả cỏc dung dịch trờn qua màng lọc 0,45 àm Sau đó tiêm 6 lần mẫu chuẩn và 1 lần dung dịch phân giải vào hệ thống HPLC, tiến hành theo điều kiện sắc ký đã chọn Ghi lại kết quả thu được: sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic của diclofenac epolamin chuẩn Tính giá trị trung bình và RSD của thời gian lưu và diện tích pic của diclofenac epolamin chuẩn
+ Độ phân giải giữa pic tạp F và diclofenac không nhỏ hơn 4,0
+ Độ lệch chuẩn tương đối của 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn với thời gian lưu của pic diclofenac epolamin chuẩn không vượt quá 1,0 % và với diện tích pic của pic diclofenac epolamin chuẩn không vượt quá 1,3 %
- Tiến hành thẩm định độ đặc hiệu trên các dung dịch sau:
+ Dung dịch mẫu trắng: Tiến hành chuẩn bị pha động như ở phần a mục 2.2.1 + Dung dịch mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 50,0 mg diclofenac epolamin chuẩn cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml dung môi pha động rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút Sau đó để dung dịch ổn định ở nhiệt độ phòng rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ khoảng 1000 àg/ml Từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác 1,0 ml và cho vào bình định mức 20 ml rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu dung dịch chuẩn nồng độ khoảng 50 àg/ml
+ Dung dịch mẫu thử: Cân chính xác khoảng 50,0 mg mẫu thử diclofenac epolamin cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml dung môi pha động rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút Sau đó để dung dịch ổn định ở nhiệt độ phòng rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu được dung dịch thử gốc nồng độ khoảng 1000 àg/ml Từ dung dịch thử gốc, hút chính xác 1,0 ml và cho vào bình định mức 20 ml rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu dung dịch thử nồng độ khoảng 50 àg/ml
- Lọc tất cả cỏc dung dịch trờn qua màng lọc 0,45 àm Sau đú tiến hành tiờm cỏc dung dịch trên mỗi dung dịch 1 lần vào máy HPLC và tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn
+ Sắc ký đồ của mẫu trắng không được xuất hiện pic ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của diclofenac epolamin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn + Thời gian lưu của diclofenac epolamin trên sắc ký đồ của mẫu chuẩn và mẫu thử phải tương đương nhau
+ Phổ hấp thụ lấy tại đỉnh pic diclofenac epolamin trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải trùng với phổ hấp thụ lấy tại đỉnh pic diclofenac epolamin trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn (Hệ số Match ≥ 0,999)
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách chuẩn bị một dãy các dung dịch chuẩn diclofenac epolamin với các nồng độ lần lượt là 60 %, 80 %, 100 %, 120 %, 140 % so với nồng độ làm việc
- Các dung dịch chuẩn được chuẩn bị như sau:
+ Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 50,0 mg diclofenac epolamin chuẩn cho vào bình định mức 50 ml, thêm khoảng 25 ml dung môi pha động rồi tiến hành lắc siêu âm trong 10 phút Sau đó để dung dịch ổn định ở nhiệt độ phòng rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu được dung dịch chuẩn gốc nồng độ khoảng 1000 àg/ml
+ Dung dịch chuẩn S1 (mức 60 %): Từ dung dịch chuẩn gốc, hút chính xác 3,0 ml và cho vào bình định mức 100 ml rồi thêm dung môi pha động đến vạch, lắc kỹ thu dung dịch chuẩn nồng độ khoảng 30 àg/ml
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát và xác định các điều kiện sắc ký
3.1.1 Lựa chọn cột sắc ký
Dựa theo Dược điển Châu Âu [14], tiến hành lựa chọn được cột sắc ký Apollo C8 (250 ì 4,6 mm; 5 àm) để định lượng diclofenac epolamin
3.1.2 Lựa chọn bước sóng phát hiện
Dựa theo Dược điển Châu Âu [14] tiến hành chọn bước sóng phát hiện ở 254 nm để định lượng diclofenac epolamin.
Dựa theo Dược điển Châu Âu [14], tiến hành chọn pha động sau: Dung dịch đệm phosphat pH 2,5 - Methanol (34:66, tt/tt)
Dung dịch đệm pH 2,5 được chuẩn bị như quy trình ở phần a mục 2.2.1
Tiến hành khảo sát pha động với dung dịch mẫu chuẩn được chuẩn bị như ở mục 2.2.2.1 với các điều kiện sắc ký đã chọn thu được kết quả như trên hình 3.1 sau:
Hình 3.1: Sắc ký đồ khảo sát pha động
Thời gian lưu của diclofenac epolamin trên sắc ký đồ tương đối ngắn (17,955 phút) và hình dáng pic thu được khá cân đối (hệ số kéo đuôi là 1,1) nên có thể chọn pha động là Dung dịch đệm phosphat pH 2,5 - Methanol (34:66, tt/tt) để định lượng diclofenac epolamin.
Thẩm định phương pháp
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng diclofenac epolamin được thực hiện dựa trên hướng dẫn của ICH [27] và AOAC International 2016 [28]
3.2.1 Tính thích hợp hệ thống
Tiến hành chuẩn bị mẫu chuẩn diclofenac epolamin, với lượng cân của chuẩn là 49,99 mg, theo quy trình ở mục 2.2.2.1
Hòa tan một lọ chuẩn Diclofenac for system suitability EPRS (chứa tạp A và F) trong
Sau khi đã tiêm 6 lần mẫu chuẩn với nồng độ làm việc và 1 lần dung dịch phân giải vào hệ thống HPLC và tiến hành theo điều kiện sắc ký đã chọn ở trên Kết quả về tính thích hợp hệ thống được trình bày ở hình 3.2 và bảng 3.1 dưới đây:
Hình 3.2: Sắc ký đồ của chuẩn Diclofenac for system suitability EPRS
Bảng 3.1: Kết quả thẩm định tính thích hợp hệ thống
STT Thời gian lưu (phút) Diện tích pic (mAU.s)
RSD (%) 0,1 0,1 Độ phân giải giữa pic tạp F và pic của diclofenac là 6,75
Nhận xét: Độ phân giải giữa pic tạp F và và pic của diclofenac là 6,75 (> 4) đạt về gới hạn cho phép
25 Độ lệch chuẩn tương đối của các thông số đặc trưng sau khi chạy sắc ký như: thời gian lưu là 0,1 % (≤ 1,0 %) và diện tích pic của diclofenac epolamin là 0,1 % (≤ 2,0 %) đều đạt về giới hạn cho phép
Kết luận: Hệ thống sắc ký lựa chọn đã đảm bảo được tính thích hợp hệ thống đối với việc định lượng diclofenac epolamin
Sau khi chuẩn bị các mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thử theo quy trình ở mục 2.2.2.2 và tiến hành chạy sắc ký theo các điều kiện đã chọn thì thu được kết quả như ở các hình 3.3, 3.4, 3.5, 3.6 sau đây:
Hình 3.3: Sắc ký đồ của mẫu trắng
Hình 3.4: Sắc ký đồ của mẫu chuẩn
Hình 3.5: Sắc ký đồ của mẫu thử
Hình 3.6: Kết quả chồng phổ của mẫu thử và mẫu chuẩn
Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu trắng không xuất hiện pic tại thời gian lưu tương ứng của diclofenac epolamin
Trên sắc ký đồ của dung dịch mẫu thử và mẫu chuẩn, thời gian lưu của diclofenac epolamin là tương đương nhau Hệ số Match của phổ pic của dung dịch thử và dung dịch chuẩn là 0,9999 (> 0,999) thỏa mãn yêu cầu
Kết luận: Phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ đặc hiệu
Sau khi chuẩn bị mẫu chuẩn theo quy trình ở mục 2.2.2.3 và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn, mỗi dung dịch tiêm 1 lần thì ta thu được kết quả về diện tích pic tương ứng với từng dung dịch như ở bảng 3.2 sau:
- Khối lượng cân của chất chuẩn: 50,69 mg
Bảng 3.2: Kết quả thẩm định độ tuyến tính
Tờn mẫu Nồng độ (àg/ml) Diện tớch pic (mAU.s)
Từ các giá trị nồng độ và diện tích pic tương ứng, tiến hành vẽ đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ giữa diện tích pic và nồng độ bằng phần mềm Microsoft Office Excel thu được kết quả như trên hình 3.7 sau đây:
Hình 3.7: Đường chuẩn của phương pháp định lượng
Trong khoảng nồng độ 60 % - 140 %, phương trình đường chuẩn có hệ số tương quan là 0,9997 (R ≥ 0,995) đạt yêu cầu nên có thể khẳng định là có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ của diclofenac epolamin và diện tích pic của nó Ngoài ra, % Hệ số chắn là 1,1 % (% Y ≤ 2,0 %) cũng đạt yêu cầu
Kết luận: Phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ tuyến tính
Tiến hành chuẩn bị các dung dịch thử thêm chuẩn diclofenac epolamin có nồng độ lần lượt là 80 %, 100 %, 120 % so với nồng độ làm việc, mỗi nồng độ gồm 3 mẫu độc lập y = 15919x + 8939.9 R² = 0.9993
Nồng độ (àg/ml) Đường chuẩn
28 theo quy trình ở mục 2.2.2.4 và tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Sau đó tính tỷ lệ thu hồi theo mẫu chuẩn có khối lượng cân 49,99 mg và diện tích pic trung bình là 796811 theo công thức ở phần 2.2.2.4 thu được kết quả ở bảng 3.3 sau:
Bảng 3.3: Kết quả thẩm định độ đúng
Nồng độ dung dịch thử thêm chuẩn
RSD (%) trung bình của 3 nồng độ là 0,3 %
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
Tỷ lệ thu hồi của các dung dịch chuẩn ở 3 mức nồng độ đều nằm trong khoảng giới hạn cho phép từ 98,0 % - 102,0 % Trong đó, tỷ lệ thu hồi của các dung dịch chuẩn với nồng độ 80 %, 100 %, 120 % nằm trong khoảng từ 99,4 % đến 100,5 % Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của của tỷ lệ thu hồi của dung dịch chuẩn với nồng độ 80 % là 0,4 %, dịch chuẩn với nồng độ 100 % là 0,3 %, dung dịch chuẩn với nồng độ
120 % là 0,2 %, đều thỏa mãn yêu cầu không vượt quá 2,0 % Ngoài ra, độ lệch chuẩn tương đối trung bình của 3 nồng độ là 0,3 % cũng thỏa mãn yêu cầu không vượt quá 2,0 % Kết luận: Phương pháp định lượng đạt yêu cầu về độ đúng
Tiến hành chuẩn bị các mẫu thử theo quy trình ở phần 2.2.2.5 rồi tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn trên máy HPLC Agilent 1260 Kết quả thẩm định độ lặp lại được trình bày ở bảng 3.4 dưới đây:
3.2.6 Độ chính xác trung gian
Tiến hành chuẩn bị các mẫu thử theo quy trình ở phần 2.2.2.6 rồi tiến hành sắc ký theo các điều kiện đã chọn ở trên nhưng ở 1 ngày khác và trên máy HPLC Shimadzu LC-
20 Kết quả thẩm định được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.8 dưới đây:
Bảng 3.4: Kết quả thẩm định độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Kiểm nghiệm viên 1 Kiểm nghiệm viên 2
Kết quả định lượng ngày 15/4/2024
- Thiết bị: máy HPLC Agilent 1260
- Spic (TB) của chuẩn: 796811 mAU.s
- Khối lượng cân chuẩn: 49,99 mg
Kết quả định lượng ngày 17/4/2024
- Thiết bị: máy HPLC Shimadzu LC-20
- Spic (TB) của chuẩn: 925777 mAU.s
- Khối lượng cân chuẩn: 50,57 mg
Kết quả định lượng trung bình của 2 kiểm nghiệm viên là 100,0 % (n = 12),
Hình 3.8: Kết quả test F so sánh hàm lượng hoạt chất trong 2 ngày
Với điều kiện sắc ký đã chọn, giá trị RSD với 6 mẫu thử của kiểm nghiệm viên 1 là 0,2 % và của kiểm nghiệm viên 2 là 0,2 %, đều thỏa mãn yêu cầu không vượt quá 2,0 % Ngoài ra, giá trị RSD với 12 mẫu thử của 2 kiểm nghiệm viên là 0,2 %, thỏa mãn yêu cầu không vượt quá 1,0 %
Kết quả so sánh hàm lượng hoạt chất trong 2 ngày khác nhau có Ftn < Flt (1,4 < 5,1) tức là sự khác nhau về hàm lượng giữa 2 ngày không có ý nghĩa thống kê hay phương pháp định lượng có độ chính xác trung gian đạt yêu cầu khi thẩm định ở 2 ngày và trên 2 thiết bị khác nhau
Kết luận: Phương pháp đạt về độ lặp lại và độ chính xác trung gian.
Bàn luận
3.3.1 Về điều kiện xử lý mẫu
Tất cả các mẫu dùng để chạy sắc ký đều được hòa tan trong pha động do muối diclofenac epolamin hòa tan tốt trong nước và dung môi hữu cơ Ngoài ra, việc hòa tan trong pha động giúp tiến hành sắc ký thuận tiện hơn và dễ dàng so sánh kết quả sắc ký đồ 3.3.2 Về điều kiện sắc ký
Nhiều nghiên cứu định lượng diclofenac epolamin đã được công bố trên thế giới để so sánh, đánh giá mức độ hấp thu qua da và nồng độ trong huyết tương với các muối diclofenac khác đang có trên thị trường (các tài liệu đã nêu ở bảng 1.1) Ngoài ra, gốc epolamin trong muối bị rửa giải rất nhanh và không hấp thụ quang nên không ảnh hưởng đến độ hấp thụ quang của gốc diclofenac Do đó, dựa vào những tài liệu đã tham khảo được, với mục tiêu xây dựng được phương pháp định lượng nguyên liệu diclofenac epolamin, khóa luận tốt nghiệp đã được thực hiện trên các hệ thống máy HPLC Agilent 1260 và HPLC Shimadzu LC-20 với các điều kiện cố định được chọn là: cột sắc ký Apollo C8 (250 × 4,6 mm; 5 àm), thể tớch tiờm mẫu: 20 àl, nhiệt độ cột: 25°C, tốc độ dũng: 1,0 ml/phỳt
Pha động là Dung dịch đệm phosphat pH 2,5 - Methanol (34:66, tt/tt) cũng được lựa chọn dựa theo các tài liệu tham khảo trên cùng các dược điển (Dược điển Việt Nam V và Dược điển Châu Âu 11.0) Các pic trên sắc ký đồ thu được khi sử dụng pha động trên có hình dáng cân đối và thời gian lưu của diclofenac cũng tương đối ngắn (khoảng từ 17,2 - 18,0 phút trên cả 2 máy HPLC)
3.3.3 Về quy trình thẩm định phương pháp định lượng
Quy trình thẩm định phương pháp định lượng diclofenac epolamin được thực hiện dựa trên hướng dẫn của ICH và AOAC International 2016 với các chỉ tiêu: tính thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, độ tuyến tính, độ đúng, độ lặp lại và độ chính xác trung gian
Kết quả thu được cho thấy phương pháp đạt về tính thích hợp hệ thống (RSD < 2 %) và có độ đặc hiệu tốt với diclofenac epolamin Thêm vào đó, có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của các mẫu chuẩn trong khoảng nồng độ từ 60 % - 140 % với hệ số tương quan R > 0,998 Độ đúng của phương pháp ở các nồng độ 80 %, 100 % và
120 % cũng đạt về tỷ lệ thu hồi trong khoảng giới hạn cho phép từ 98,0 % - 102,0 % với RSD < 2,0 % Ngoài ra, với điều kiện sắc ký đã chọn thì độ chính lặp lại và độ chính xác trung gian đều thỏa mãn yêu cầu của các hướng dẫn của ICH và AOAC International 2016 ở 2 thời điểm và trên 2 thiết bị khác nhau với RSD của hàm lượng không vượt quá 2,0 %
Vì vậy, phương pháp được xây dựng là phù hợp và đủ tính tin cậy để định lượng diclofenac epolamin
Tuy nhiên, do gốc epolamin bị rửa giải nhanh và không hấp thụ quang nên phương pháp mới chỉ có độ đặc hiệu vừa phải và chưa thể phân biệt được hai muối diclofenac epolamin và diclofenac natri Do đó, theo hướng dẫn của AOAC International 2016, để phân biệt được hai muối này cần kết hợp thêm các phương pháp khác có tính đặc hiệu tốt hơn
3.3.4 Ứng dụng của phương pháp
Hiện nay, trên các dược điển và tài liệu công bố chưa có nghiên cứu nào với nội dung về định lượng diclofenac epolamin dạng nguyên liệu Thêm vào đó, nhu cầu sử dụng dược chất diclofenac epolamin ngày càng tăng và để tự chủ được nguồn nguyên liệu trong nước bằng con đường tổng hợp thì việc tiêu chuẩn hóa dược chất này là hết sức cần thiết Do đó mà qua đề tài này, một đề tài cấp thành phố, phương pháp định lượng đã được xây dựng có tính ứng dụng thực tế rất cao và rộng rãi, là bước đầu để xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu diclofenac epolamin tự tổng hợp trong nước và các chế phẩm chứa dạng muối này
Ngoài ra, sau khi thẩm định phương pháp, nhận thấy rằng hàm lượng của mẫu thử nguyên liệu diclofenac epolamin tự tổng hợp được nằm trong khoảng từ 99,5 % - 100,3 % Với mức hàm lượng này, khi so sánh với tiêu chuẩn về hàm lượng của nguyên liệu diclofenac natri trong Dược điển Việt Nam V là từ 99,0 % - 101,0 %, chúng ta có thể kỳ vọng vào mức tiêu chuẩn hàm lượng của nguyên liệu diclofenac epolamin tự tổng hợp trong nước có thể đạt từ 99,0 % - 101,0 %
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Qua quá trình thực nghiệm, khóa luận này đã đạt được các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả sau:
1 Đã xây dựng được quy trình định lượng diclofenac epolamin dạng nguyên liệu bằng máy HPLC với các điều kiện sắc ký như sau:
- Hệ thống máy HPLC Agilent 1260 kết nối với detector DAD
- Cột sắc ký: Apollo C8 (250 ì 4,6 mm; 5 àm)
- Hệ pha động: Dung dịch đệm phosphat pH 2,5 - Methanol (34:66, tt/tt)
- Bước sóng phát hiện: 254 nm
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Kết quả sắc ký đồ thu được từ chương trình sắc ký trên cho ra thời gian lưu tương đối ngắn và ổn định, hệ số đối xứng cao
2 Đã thẩm định phương pháp định lượng được theo hướng dẫn của ICH và AOAC International 2016 cho kết quả như sau:
- Tính thích hợp hệ thống: độ phân giải giữa pic tạp F và và pic của diclofenac là 6,75; RSD của thời gian lưu và diện tích pic là 0,1 %
- Độ tuyến tính phù hợp trong khoảng nồng độ 60 % - 140 %
- Độ đúng: tỷ lệ thu hồi nằm trong giới hạn với RSD của 3 nồng độ đều không vượt quá 2 %
- Độ lặp lại: RSD (n=6) của hàm lượng là 0,2 %
- Độ chính xác trung gian: RSD (n) của hàm lượng là 0,2 %
Phương pháp định lượng đã đạt về các chỉ tiêu thẩm định và có thể được ứng dụng dễ dàng tại các cơ sở có sẵn hệ thống HPLC do các hóa chất sử dụng dễ dàng được tìm kiếm và mua bán trên thị trường ĐỀ XUẤT
1 Tiếp tục nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho nguyên liệu diclofenac epolamin có nguồn gốc tổng hợp trong nước
2 Tiến hành mở rộng nghiên cứu sang các dạng bào chế hiện có trên thị trường của diclofenac epolamin, đồng thời xem xét ảnh hưởng của các tá dược và dạng bào chế
34 đến phương pháp và kết quả định lượng diclofenac epolamin Từ đó xây dựng tiêu chuẩn để đánh giá chất lượng của các chế phẩm trên thị trường hiện nay
3 Ứng dụng phương pháp vào việc định lượng và đánh giá chất lượng của các mẫu nguyên liệu diclofenac epolamin đang có trên thị trường.
