nguyễn thị bích liên xây dựng và thẩm định phương pháp xác định histamin trong cá và sản phẩm từ cá bằng lc msms

BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

NGUYỄN THỊ BÍCH LIÊN

XÂY DỰNG VÀ THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HISTAMIN TRONG

CÁ VÀ SẢN PHẨM TỪ CÁ BẰNG

LC-MS/MS

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Trần Nguyên Hà và ThS Bùi Cao Tiến là những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị trong Khoa Độc học và dị nguyên và Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã quan tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình nghiên cứu

Em xin cảm ơn các thầy cô giáo tại Khoa Hóa phân tích – Kiểm nghiệm thuốc, các thầy cô giáo và cán bộ nhân viên trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy bảo và giúp đỡ em trong suốt 5 năm học tập tại trường

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè, anh chị em luôn bên cạnh giúp đỡ, động viên em hoàn thành khóa luận tốt nghiệp của mình một cách tốt nhất Em xin chân thành cảm ơn!

Hà Nội, ngày 26 tháng 05 năm 2024

Sinh viên Nguyễn Thị Bích Liên

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

1.1.1 Tính chất lý hóa của histamin 2

1.1.2 Sinh tổng hợp và sự chuyển hóa của histamin 2

1.1.2.1 Sinh tổng hợp histamin 2

1.1.3 Tác dụng sinh lý và độc tính của histamin 5

1.1.3.1 Tác dụng sinh lý của histamin 5

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17

2.1 Đối tượng nghiên cứu 17

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 17

2.2.1 Nguyên vật liệu 17

2.2.2 Trang thiết bị 18

2.3 Nội dung nghiên cứu 18

2.3.1 Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích histamin bằng LC-MS/MS 18

2.3.2 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản 18

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu 19

2.3.4 Thẩm định phương pháp 19

2.3.5 Đánh giá hàm lượng histamin trên một số mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản 19

2.4 Phương pháp nghiên cứu 19

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ 19

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến 20

2.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nền 20

2.4.4 Phương pháp thẩm định phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS 21

2.5 Phương pháp xử lý số liệu 25

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 26

3.1 Tối ưu hóa điều kiện tách và xác định histamin bằng LC-MS/MS 26

3.1.1 Tối ưu hóa điều kiện MS 26

3.1.2 Tối ưu hóa các điều kiện sắc ký lỏng 26

3.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu 28

3.2.1 Khảo sát điều kiện chiết histamin 28

3.2.2 Khảo sát điều kiện tạo dẫn xuất 30

3.3 Khảo sát ảnh hưởng nền mẫu 33

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

Ionization

Ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển

Spectrometry

Detector khối phổ hai lần

SRM Selected Reaction Monitoring Kỹ thuật ghi phổ phản ứng chọn lọc

UHPLC/ UPLC

Ultra High Performance Liquid Chromatography

Sắc ký lỏng siêu hiệu năng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Một số quy định về liều lượng cho phép của histamin 6

Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích 9

Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần 21

Bảng 2.2 Tỷ lệ ion đối với LC-MS/MS 22

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau 24

Bảng 2.4 Độ lặp lại chấp nhận ở các mức nồng độ 25

Bảng 3.1 Kết quả các mảnh của chất phân tích 26

Bảng 3.2 Các thông số MS/MS tối ưu 26

Bảng 3.3 Chương trình gradient pha động 28

Bảng 3.4 Điều kiện sắc ký tối ưu 28

Bảng 3.5 Kết quả đường chuẩn khảo sát ảnh hưởng nền trên các nền mẫu 34

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá ảnh hưởng nền 34

Bảng 3.7 Kết quả độ phù hợp hệ thống 35

Bảng 3.8 Bảng so sánh tỉ số ion 36

Bảng 3.9 Kết quả LOQ trên các nền mẫu 37

Bảng 3.10 Đường chuẩn histamin trên các nền mẫu 38

Bảng 3.11 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền cá 39

Bảng 3.12 Kết quả độ thu hồi và độ lặp lại trong nền mắm 40

Bảng 3.13 Kết quả phân tích mẫu thực 41

DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ, HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Công thức cấu tạo histamin 2

Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp histamin 2

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa chính của histamin 4

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng tạo dẫn xuất của histamin và dansyl clorid 14

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ 15

Hình 3.1 Sắc ký đồ khảo sát pha tĩnh 27

Hình 3.2 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết trên nền mẫu cá 29

Hình 3.3 Biểu đồ khảo sát dung môi chiết trên nền mẫu mắm 29

Hình 3.4 Biểu đồ khảo sát số lần chiết trên nền mẫu cá 30

Hình 3.5 Biểu đồ khảo sát thời gian dẫn xuất trên nền mẫu cá 31

Hình 3.6 Biểu đồ khảo sát thời gian dẫn xuất trên nền mẫu mắm 31

Hình 3.7 Biểu đồ khảo sát nhiệt độ tạo dẫn xuất trên nền mẫu cá 32

Hình 3.8 Biểu đồ khảo sát nhiệt độ dẫn xuất trên nền mẫu mắm 32

Hình 3.9 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu thủy sản và nước mắm 33

Hình 3.10 Đường chuẩn khảo sát ảnh hưởng nền trên các nền mẫu 34

Hình 3.11 Sắc ký đồ của histamin ở mẫu trắng, mẫu chuẩn và mẫu thêm chuẩn 36

Hình 3.12 Sắc ký đồ LOQ của histamin trên các nền mẫu 37

Hình 3.13 Đường chuẩn histamin trên các nền mẫu 38

ĐẶT VẤN ĐỀ

Trong các nguồn thực phẩm, thủy sản là nguồn dinh dưỡng phong phú và hấp dẫn, nhưng cũng chứa hàm lượng cao acid amin histidine - nguyên liệu cho phản ứng chuyển hóa tạo histamin, một amin sinh học gây độc Sau đánh bắt, nếu thủy sản không được bảo quản đúng cách, sự chuyển hóa histidine thành histamin sẽ tăng lên, tăng hàm lượng histamin trong mô cơ của chúng ngay cả khi chưa có sự hư hỏng về cảm quan Histamin bền với nhiệt nên độc tính của nó vẫn còn nguyên vẹn trong thực phẩm đã qua chế biến Tiêu thụ lượng lớn những thực phẩm này có thể gây ngộ độc histamin với các triệu chứng cấp tính như đau đầu, buồn nôn, tiêu chảy, và trong trường hợp nghiêm trọng, có thể gây tử vong

Các tiêu chuẩn về giới hạn an toàn của histamin đã được thiết lập nhằm quản lý và kiểm soát độc tố này Theo Cơ quan Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA), mức histamin trong thủy sản 50 – 200 mg/kg là an toàn cho sức khỏe con người Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) khuyến cáo hàm lượng histamin trong thủy sản không nên vượt quá 200 mg/kg để đảm bảo an toàn cho người tiêu dùng 10,15

Hiện nay, trên toàn thế giới đã có các phương pháp phân tích histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản như phương pháp sắc ký lỏng (LC) và phương pháp sắc ký khí (GC) với các detector khác nhau Tại Việt Nam cũng đã phát triển một số phương pháp phân tích histamin như HPLC – PDA, HPLC – FLR, nhưng chưa có công bố chính thức nào về phương pháp phân tích histamin bằng LC – MS/MS Vì vậy, nghiên cứu và phát triển phương pháp phân tích histamin mới nhằm tăng độ nhạy, độ chọn lọc dựa trên LC – MS/MS là một phần quan trọng trong việc quản lý và bảo vệ sức khỏe người tiêu dùng tại Việt Nam

Qua đó nhóm nghiên cứu đã tiến hành đề tài:“Xây dựng và thẩm định phương

pháp xác định histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng LC – MS/MS”

với 2 mục tiêu sau: 1 Xây dựng và thẩm định phương pháp xác định histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng LC – MS/MS

2 Áp dụng phương pháp trên để xác định histamin trong một số mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản trên thị trường

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về histamin

1.1.1 Tính chất lý hóa của histamin

Histamin là một amin sinh học có công thức hóa học là C5H9N3, khối lượng mol là 111,15 g/mol Danh pháp IUPAC là 2-(1H-Imidazol-4-yl)ethanamine 40, 31

Hình 1.1 Công thức cấu tạo histamin

Histamin dạng rắn là các tinh thể không màu, không mùi, hút ẩm, khá bền với nhiệt LogP = − 0,7 nên độ phân cực cao, dễ hòa tan trong nước, ethanol, chloroform nóng và ít tan trong ether hoặc benzen Histamin có điểm nóng chảy ở 84oC, điểm sôi ở 18 mmHg là 209 − 210oC Histamin không có cực đại hấp thụ trong vùng UV-Vis ở bước sóng từ 210 − 700 nm Histamin ổn định trong không khí nhưng bị ảnh hưởng bởi ánh sáng 14, 40, 31

Histamin có hai trung tâm base, nhóm −NH2 có pKa = 9,68 và được ưu tiên cho proton, trong khi vòng imidazol có pKa = 5,8 chỉ nhận một proton trong môi trường acid hơn Histamin có tính chất của amin bậc 1 và nhóm imidazol 14, 34:

- Tạo phức với một số kim loại: kẽm, đồng, coban, niken - Phản ứng tạo phẩm màu azo: trong môi trường bazơ yếu nhóm imidazol phản ứng với muối diazoni tạo phẩm màu azo

- Phản ứng với một số tác nhân kết tủa alkaloid tạo muối phức hòa tan kém

1.1.2 Sinh tổng hợp và sự chuyển hóa của histamin

1.1.2.1 Sinh tổng hợp histamin Khả năng tổng hợp histamin rất phổ biến ở các vi sinh vật như vi khuẩn hoặc nấm men, ở người, động vật và thực vật Histamin có nguồn gốc từ quá trình khử carboxyl của acid amin histidine thông qua sự xúc tác của enzyme L-histidine decarboxylase

Hình 1.2 Cơ chế sinh tổng hợp histamin

Ở người, Histidine decarboxylase (HDC) là một loại enzyme được biểu hiện trong các tế bào khác nhau trong cơ thể, bao gồm hệ thần kinh trung ương (tế bào thần kinh), dạ dày - niêm mạc (tế bào thành), tế bào mast, tế bào bạch cầu ái kiềm Vì vậy histamin trong cơ thể được tìm thấy ở các vị trí này, gọi là histamin nội sinh Tế bào mast là kho lưu trữ chính của histamin, được tìm thấy trong hầu hết các mô, đặc biệt là trong các tế bào biểu bì của da, trong các tế bào lưu trữ histamine của màng nhầy, trong ống phế quản, niêm mạc dạ dày Histamin trong các tế bào thần kinh như tế bào nội mô mạch máu não và nồng độ histamin cao nhất có thể đo được ở vùng dưới đồi 35

Ở một số động thực vật, histamin được sản xuất và lưu trữ như một chất bảo vệ Trong động vật, histamin được tiết ra bởi các tuyến da của một số loài ếch

Leptodactylidae, từ tế bào mast trong nọc ong vò vẽ Trong thực vật, histamin được

dự trữ trong các sợi lông trên lá và thân cây Tầm ma thông thường 35 Histamin có thể được tìm thấy trong hầu hết các loại thực phẩm với nồng độ khác nhau Histamin xuất hiện khi thực phẩm bị hỏng, đặc biệt là các sản phẩm được lên men, chín hoặc đã được lưu trữ trong một thời gian dài Thủy sản và các sản phẩm của thủy sản là một điển hình Thủy sản sau đánh bắt trong quá trình bảo quản, sản xuất tạo các sản phẩm ở điều kiện không đảm bảo có thể bị nhiễm vi sinh vật Các vi khuẩn

Proteus Vulgaris,Vibrio alginolyticus, Enterobacteriaceae, Morganella morganii

phát triển sản sinh ra enzym histidine decarboxylase xúc tác cho phản ứng chuyển acid amin histidine thành histamin Quá trình này xảy ra nhanh chóng ở các loài cá có hàm lượng histidine tự do tương đối cao trong mô cơ cả khi còn sống, làm nồng độ histamin tăng cao ngay cả khi chưa có sự hư hỏng cảm quan Nồng độ histamin cao thường được phát hiện ở các loài cá thuộc họ Scombroidae, các loài cá có thịt sẫm màu như cá ngừ, cá nục xanh, cá thu, cá trích và cá thu đao do hàm lượng histidine tự do cao trong thịt chúng 38, 19, 35

Ở cá được bảo quản đúng cách, lượng histamin thường nhỏ hơn 0,1 mg/100 g cá Cá bị ô nhiễm thì mức histamin là từ 20 - 50 mg/100 g cá Sự tích tụ histamin thường xảy ra khi các sản phẩm đông lạnh được rã đông và để ở nhiệt độ phòng trong một khoảng thời gian nhất định Histamin bền với nhiệt nên độc tính của nó vẫn còn nguyên vẹn trong các sản phẩm cá đã nấu chín hoặc đóng hộp 26

Một trong những sản phẩm phổ biến của thủy sản là nước mắm Nước mắm là một chất lỏng màu nâu trong suốt được sản xuất bằng cách lên men tự nhiên của nhiều loại cá khác nhau như cá cơm, cá trích với muối Những loài cá này thường chứa hàm lượng cao acid amin tự do đặc biệt là histidine Sau khi được đánh bắt trên tàu, các nhà sản xuất có thực hành sản xuất tốt sẽ trộn cá với muối ngay trên tàu, làm chậm quá trình hình thành histamin Tuy nhiên, một số tàu giữ cá không có muối tối đa 8 giờ trong thùng chứa mở mà không có hệ thống làm mát thích hợp trước khi đến nhà máy sản

xuất sẽ tăng hình thành histamin trong nguyên liệu Trong quá trình lên men, sự thủy phân protein được gây ra bởi các proteinase nội sinh trong mô cơ cá và đường tiêu hóa cũng như các proteinase được tạo ra bởi vi khuẩn ưa mặn Do tính chất của nguyên liệu và phương pháp sản xuất nước mắm truyền thống, nhiều mẫu nước mắm được phát hiện có hàm lượng histamin cao 25

1.1.2.2 Chuyển hóa của Histamin

Trong cơ thể người histamin có thể được chuyển hóa thông qua hai cơ chế chính theo Hình 1.3

Hình 1.3 Sơ đồ chuyển hóa chính của histamin 22

- Cơ chế 1: Chuyển hóa histamin nội sinh: Methyl hóa histamin thông qua enzym histamine N-methyltransferase (HNMT) tạo sản phẩm N-metylhistamine, chất này được chuyển hóa tiếp thành chất chuyển hóa chính trong nước tiểu M-methylimidazole acetic acid bởi monoamine oxidase (MAO B) HNMT xúc tác quá trình methyl hóa histamin với sự có mặt của các chất cho methyl như S-adenosyl-L-methionine (SAMe) HNMT hiện diện trong bào tương của các tế bào ở nhiều mô bao gồm thận, gan, lá lách, tuyến tiền liệt, buồng trứng, tủy sống, phế quản và khí quản 22, 33, 35

- Cơ chế 2: Chuyển hóa histamin ngoại sinh: Oxi hóa nhóm amin bậc 1 thông qua enzym diamine oxidase (DAO) tạo sản phẩm Imidazol-4-yl-acetaldehyd Diamine oxidase (DAO), còn được gọi là histaminase, là enzyme chính chịu trách nhiệm chuyển hóa histamin ăn vào Nó được tìm thấy ở mức cao trong tế bào chất của niêm mạc đường tiêu hóa, giúp phân hủy histamin trong ruột ngăn chặn sự hấp thu histamin chưa được chuyển hóa vào tuần hoàn, bảo vệ cơ thể khỏi độc tính Ngoài ra histamin cũng được sản xuất ở mức cao trong nhau thai và thận 9, 33, 35

Bên cạnh đó có 2 con đường chuyển hóa histamin khác 35:

- Acetyl hóa histamin thành acetylhistamin Con đường chuyển hóa này chủ yếu quan trọng trong quá trình phân hủy do vi sinh vật

- Hydroxylase histamin thành axit propionic hydantoin Vitamin C có thể là đồng yếu tố trong các phản ứng hydroxylase

1.1.3 Tác dụng sinh lý và độc tính của histamin

1.1.3.1 Tác dụng sinh lý của histamin

Histamin là chất trung gian điều hòa hoạt động sinh lý bệnh của cơ thể và biểu hiện khác nhau qua bốn thụ thể nằm trên màng tế bào:

- Thụ thể H1 được biểu hiện ở cơ trơn, tế bào nội mô mạch máu, tim và hệ thần kinh trung ương Các thụ thể H1 được kích hoạt bởi histamin nội sinh giải phóng bởi các tế bào thần kinh 32, 35

- Thụ thể H2 được biểu hiện trong các mô ngoại vi như tế bào thành dạ dày, cơ trơn mạch máu, tế bào mast, ở các mô hệ thống thần kinh trung ương như vỏ não 32, 35

- Thụ thể H3 chủ yếu được tìm thấy trước synap trên các tế bào của hệ thống thần kinh trung ương và ngoại biên 32, 35

- Thụ thể H4 được biểu hiện cao trong tủy xương và tế bào bạch cầu, liên quan đến hóa ứng động của tế bào mast và bạch cầu ái toan 32, 35

1.1.3.2 Độc tính của histamin - Nguyên nhân: Ngộ độc histamin là một tình trạng nhiễm độc hóa chất, chủ yếu do tiêu thụ thực phẩm có hàm lượng histamin cao như thịt lên men, pho mát lâu năm đặc biệt là thủy sản và các sản phẩm thủy hải sản Ước tính lượng histamin trong thực phẩm có thể gây độc nằm trong khoảng 50 - 200 mg/100 mg thực phẩm 12, 23, 12 Mặc dù ở điều kiện sinh lý bình thường trong cơ thể histamin nhanh chóng bị bất hoạt bởi enzym DAO và HNMT nhưng khi các enzym chuyển hóa histamin này bị ức chế hoặc bị quá tải bởi histamin từ chế độ ăn uống trong cơ thể con người có thể dẫn đến tăng nồng độ histamin trong máu Nồng độ histamin trong huyết tương bình thường ở mức 0,3 - 1 ng/ml, khi nồng độ này tăng cao có thể gây ra những rối loạn về thần kinh và thể chất, có thể gây độc 22

- Triệu chứng: Mức độ nghiêm trọng của các triệu chứng thay đổi đáng kể tùy thuộc vào lượng histamin tiêu thụ và độ nhạy cảm cá nhân của bệnh nhân ăn phải histamin Histamin có nhiều thụ thể nằm ở nhiều cơ quan trong cơ thể nên ngộ độc histamin có triệu chứng lâm sàng khá phức tạp:

+ Ban đỏ đột ngột trên mặt (đỏ bừng), ngứa và ban đỏ trên cơ thể là triệu chứng cổ điển

+ Các triệu chứng trên đường tiêu hóa: cảm giác nóng ran trong miệng, tăng tiết nước bọt, kích thích tiết dịch vị của dạ dày, gây buồn nôn, nôn, tiêu chảy và đau bụng

+ Các triệu chứng ảnh hưởng đến đường hô hấp và các triệu chứng tim mạch: hạ huyết áp, chóng mặt, đau đầu hoặc nhịp tim nhanh hiếm gặp hơn

Các triệu chứng thường diễn ra trong thời gian ngắn, xảy ra nhanh từ một đến vài giờ sau khi tiêu thụ thực phẩm Vì tất cả các triệu chứng được mô tả cũng có thể được kích hoạt bởi histamin được giải phóng nội sinh, nên có thể cần phải chẩn đoán phân biệt để xác định các cơ chế bệnh lý khác như dị ứng, nổi mề đay, bệnh tế bào mast 38, 21, 24

1.1.4 Một số khuyến cáo về liều lượng cho phép của histamin

Sự xuất hiện của histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản phản ánh mức độ chất lượng của những thực phẩm này, đặc biệt là độc tính của histamin tới người tiêu thụ thực phẩm Do đó một số cơ quan tổ chức đã đưa ra quy định mức giới hạn của histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản ở các mức khác nhau như sau:

Bảng 1.1 Một số quy định về hàm lượng cho phép của histamin

Cục quản lý thực phẩm và thuốc Hoa Kỳ (FDA)

Các mẫu có 35 - 50 ppm histamin có thể coi là cá bị tạp nhiễm vì chúng bị phân hủy và/hoặc sản xuất trong điều kiện không hợp vệ sinh Ở mức 200 - 500 ppm có thể gây hại cho sức khỏe con người

10

Ủy ban chuyên gia của Tổ chức Lương thực và Nông nghiệp/Tổ chức Y tế Thế giới

(FAO/WHO)

Mức an toàn tối đa của histamine là 200 mg/kg thủy sản và sản phẩm thủy sản, tương đương 200 ppm

15

Ủy bạn Châu Âu ( EC ) Giới hạn an toàn thực phẩm của histamin là:

+ 100 - 200 mg/kg với sản phẩm thủy sản từ các loài cá có hàm lượng histidine cao

+ 200 - 400 mg/kg với các sản phẩm thủy sản được sản xuất từ các loại thủy sản có hàm lượng histidine cao được xử lý lên men enzym trong nước muối

30

Tiêu chuẩn thực phẩm quốc tế (Codex

36, 37

Cơ quan Thanh tra Thực phẩm Canada (CFIA)

Sản phẩm từ cá do enzym lên men (mắm): 20mg/100 g

Tất cả các sản phẩm cá khác: 10 mg/100 g

39

Bộ luật Tiêu chuẩn Thực phẩm của Úc và New Zealand

đa 40 mg/100 g Cá muối (không bao gồm cá có hàm lượng histamin cao) chứa tối đa 20 mg/100 g

- Kết tủa protein là một kỹ thuật thường dùng, sử dụng các thuốc thử hữu cơ để tủa protein, gồm tủa bằng acid hoặc dung môi hữu cơ Thuốc thử thường dùng là acid tricloracetic, acid perchloric, methanol, ethanol, acetonitril, Hỗn hợp được ly tâm lọc lấy dịch lọc, lặp lại quá trình đến khi protein được loại bỏ hoàn toàn 1, 28

- Chiết rắn - lỏng (SLE) là phương pháp chiết xuất được sử dụng phổ biến nhất Để cải thiện khả năng hòa tan của histamin, sử dụng các acid làm dung môi trong quá trình chiết xuất (acid hydrochloric, acid trichloroacetic, acid perchloric) Hỗn hợp sau đó được ly tâm và lọc lấy dịch lọc Dịch chiết histamin sau đó có thể được tạo dẫn xuất hoặc đưa vào phân tích trực tiếp Độ thu hồi tốt và độ chính xác cho thấy phương pháp chiết hiệu quả, chính xác phù hợp để xử lý các nền mẫu phức tạp Tuy nhiên SLE có hiệu suất chiết xuất thấp và cần sử dụng lượng dung môi hữu cơ cao làm cho nó kém tối ưu Bên cạnh đó, chiết pha rắn (SPE) thường được sử dụng để làm sạch sau khi chiết thông qua quá trình hấp phụ và giải hấp phụ chất phân tích trên pha tĩnh Các yếu tố hấp phụ và giải hấp phụ như loại pha rắn, nồng độ dung môi rửa giải, pH, tốc độ dòng chảy… sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu suất chiết Histamin là một chất phân cực nên sẽ được chiết hoặc tinh chế bằng SPE pha đảo với cột Waters Oasis HLB được tạo thành từ n-vinyl pyrrolidine thân nước và lipid divinyl benzen theo một tỷ lệ nhất định,

acetonitril được chọn làm dung môi rửa giải SPE có thể tách chiết đồng thời làm sạch mẫu tốt, từ đó cải thiện tính chọn lọc và độ nhạy 1, 28

- Chiết lỏng - lỏng (LLE) ít gây ảnh hưởng cho các chất, nồng độ chất tan và mức độ tinh chế cao hơn khi sử dụng chiết xuất nhiều tầng Mẫu dạng lỏng như mắm, được chiết với các dung môi là acid như acid hydrochloric, acid perchloric Dịch chiết histamin sau đó có thể được tạo dẫn xuất hoặc đưa vào phân tích trực tiếp Mặc dù LLE đơn giản và dễ vận hành, nhưng tốn nhiều dung môi hữu cơ 1, 28

- Phương pháp QuEChERS dựa trên nguyên tắc chiết lỏng - lỏng một lần bằng dung môi hữu cơ (Acetonitril, methanol, acid perchloric và acid trichloroacetic) đã được ổn định pH bằng đệm và tách khỏi nước có trong mẫu nhờ muối magnesi sulfat (MgSO4) Quá trình làm sạch bằng chiết phân tán pha rắn (d-SPE) được dùng để loại bỏ các acid hữu cơ, nước còn dư và các thành phần khác nhờ phối hợp các chất hấp phụ và muối MgSO4 Các chất hấp phụ thường dùng bao gồm propyl ethylenediamine (PSA), octadecylsilane (C18) và muội than graphit hóa (GCB), quả cầu carbon dựa trên nhựa phenolic (PFC/CS) Chất hấp phụ PSA có thể loại bỏ nhiều thành phần cản trở phân cực như acid béo, đường Chất hấp phụ GCB có tác dụng tốt trong việc loại bỏ cholesterol, sterol và sắc tố Chất hấp phụ C18 có thể hấp phụ các tạp chất như chất béo, sắc tố và hương liệu, thường được trộn lẫn với PSA Đặc biệt kết hợp PSA và PFC/CS có thể loại bỏ đáng kể các tạp chất gây nhiễu trong dung dịch chiết histamin, với tỷ lệ thu hồi cao, hiệu quả tinh chế tốt 16 QuEChERS có nhiều ưu điểm như: nhanh, dễ thực hiện, ít tốn kém, hiệu quả tốt, ổn định trên nhiều loại nền mẫu và an toàn cho người phân tích Tuy nhiên phương pháp QuEChERS vẫn bị ảnh hưởng nền đối với một số nền mẫu phức tạp, cần phối hợp với các kỹ thuật sắc ký đủ nhạy như GC-MS, LC-MS 5

Ngoài ra có thể dùng siêu âm là phương pháp phụ trợ vào trong các quá trình chiết tách để tăng phân tán chất phân tích vào dung môi chiết, giúp tăng hiệu suất và tiết kiệm thời gian chiết 28

1.2.2 Một số phương pháp xác định Histamin

Một số phương pháp phân tích histamin bằng sắc ký với các quy trình xử lý mẫu, các kỹ thuật khác nhau được trình bày trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Một số phương pháp phân tích

pháp

Nền mẫu

+ Thủy sản: Chiết rắn - lỏng bằng methanol

+ Mẫu nước mắm chiết lỏng - lỏng bằng methanol

→ Làm sạch bằng chiết pha rắn trên cột trao đổi anion, rửa giải bằng nước, tạo dẫn xuất huỳnh quang với o-phthal aldehyd (OPT)

- Cột C18 (50 mm x 4,6 mm x 5mm), Licrocart

- Pha động: hỗn hợp gồm: KH2PO4 , axetonitril và TEA , pH 7,3

- Bước sóng kích thích: 350 nm, bước sóng phát xạ 444 nm

5 mg/kg

90 – 110% Quy tình xử lý mẫu đơn

giản, dẫn xuất OPT trong thời gian ngắn, nhưng sản phẩm kém bền

HPLC-DAD

Cá và sản phẩm của cá

diaminoheptan, chiết xuất rắn - lỏng với dung môi là acid perchloric 0.4 M Lọc qua màng 0,45 μm

- Dẫn xuất 0,5 mL dịch chiết: thêm 100 μL NaOH 2N + 150 μL NaHCO3 + 1 mL dansyl clorid 10 mg/mL, phản ứng ở 40oC trong 45 phút Để nguội 10

- Cột Zorbax Eclipse XDB C18 (150mm x 4,6 mm x 5 µm) - Pha động: Ammonium acetat 0,1M pH 7,9 (A): acetonitril (B), chế độ gradient

- Bước sóng 254 nm

10 mg/kg

97 – 103% Phương pháp có sử dụng

chuẩn nội giúp giảm sai số do mất mẫu khi xử lý mẫu và giảm ảnh hưởng nền mẫu lên kết quả phân tích Phương pháp với độ thu hồi tốt, nhưng còn kém nhạy

phút, thêm 50 μL NH4OH 25% phản ứng với dansyl clorid dư trong 30 phút Hoàn nguyên

acetonitril (1:1), lọc qua màng 0,45 μm

-DAD

Cá và sản phẩm của cá

Chiết rắn – lỏng 2 lần: lần 1 với acid perchloric 6%, lần 2 với nước Lọc qua màng 0,45 μm

- Cột Supelcosil LC-ABZ (150 mm, 4,6 mm, 5 μm)

- Pha động: đệm phosphat pH 6,9 : acetonitril (85:15)

- Bước sóng 210 nm

7,2 mg/kg

100 – 104%

Quy trình xử lý mẫu đơn giản, phân tích trực tiếp histamin mà không cần tạo dẫn xuất Phương pháp chính xác, nhạy, đặc hiệu cao và thân thiện với môi trường vì lượng dung môi dùng ít

HPLC-DAD

Cá - Chiết rắn - lỏng với dung môi

là acid trichloroacetic 5% - Dẫn xuất 1 mL dịch chiết: thêm 200 μl NaOH 2M + 300 μl NaHCO3 bão hòa + 2 mL dansyl clorid 10mg/mL, dẫn xuất ở 40oC trong 45 phút Thêm 100 μl NH4OH 28-30% phản ứng

- Cột C18 (250 mm, 4,6 mm, 5 μm), Merck

- Pha động: H2O (A): acetonitril (B), chế độ gradient

- Bước sóng 254 nm

2,0 mg/kg

Độ nhạy, độ chính xác, độ phân giải, tính linh hoạt cao Xử lý mẫu đơn giản, phản ứng tạo dẫn xuất ổn định Dễ tự động hóa, đơn giản để sử dụng phổ biến

với dansyl clorid dư trong 30 phút Hoàn nguyên bằng ACN, lọc qua màng 0,22 μm

Error! Reference source not found

PDA

HPLC-Rượu vang

- Lọc qua màng 0,45 μm - Dẫn xuất 0,5 mL dịch + 150 μl NaHCO3 bão hòa pH 11,5 + 2mL dansyl clorid 0,5% ở 40oC trong 45 phút Thêm 200 μl NH4OH phản ứng với dansyl clorid dư trong 30 phút Hoàn nguyên bằng ACN, lọc qua màng 0,45 μm

- Cột Supelcosil LC-18 (250mm, 4,6 mm, 5 μm), Sigma

- Pha động: H2O (A): acetonitril (B), chế độ gradient

- Bước sóng 254 nm

0,2 mg/L

91 – 92%

RP-UV

HPLC-Cá Chiết bằng HCl 0,3M, lọc qua

màng 0,22 µm

- Cột C18 (250mm, 4,6mm, 5 μm)

- Pha động: acetonitrile (A): 2-5 dihy-droxybenzoic acid 6 mM pH 2,65 (B) (50:50)

- Bước sóng: 205 nm

3 mg/kg

86 – 96,62%

Quy trình xử lý mẫu đơn giản tránh nhiễm mẫu Phương pháp đơn giản, hiệu quả, tiết kiệm thời gian, chi phí Tuy nhiên sự thay đổi pH của pha động ảnh hưởng đến phản ứng dẫn xuất của histamin, ảnh hưởng đến độ chính xác, độ nhạy

18

LC-MS/MS

Cá và sản phẩm của cá

- Chiết rắn – lỏng bằng acid trichloroacetic 20%

- Dẫn xuất 1mL dịch chiết: thêm 0,2 g Na2CO3 khan + 1 mL dansyl clorid 1%, phản ứng ở 45oC trong 1 giờ Thêm 0,5 mL proline 10% phản ứng với dansyl clorid dư trong 30 phút - Chiết lỏng – lỏng với toluen, 1 mL dịch toluen được thổi khô Hòa tan cắn trong acetonitril: nước (1:1)

- Cột Acquity - BEH C18 (150 mm, 2,1 mm, 1,7 μm)

(A) và HCOOH 0,05% /Acetonitril, chế độ gradient - Chế độ ESI(+), ghi phổ SRM - m/z: ion mẹ (345), ion con ( 170 – định lượng, 154 – định tính)

5 mg/kg

82 – 118% Quy tình xử lý mẫu phức

tạp Phân tích MS/MS cho độ nhạy, tính chọn lọc vượt trội

HPLC-FLD

Cá và sản phẩm của cá

- Chiết rắn - lỏng bằng dung dịch đệm methanol - phosphat (1:1) Làm sạch bằng chiết pha rắn với cột Waters Oasis MCX, rửa giải bằng NH3.H2O-CH3OH 0,6 M

- Dẫn xuất OPT trực tuyến trước cột

- Cột C18 (150mm, 4,6mm, 5μm)

- Pha động: triethylamine 1,2% + acid phosphoric 2,5%/H2O : MeOH (60:40)

- Bước sóng kích thích: 345 nm, bước sóng phát xạ 445 nm

0,2 mg/kg

97 – 100% Dẫn xuất OPT trong thời

gian ngắn, tăng độ nhạy Dẫn xuất OPT trước cột trực tuyến còn tăng độ chính xác Phương pháp với khoảng tuyến tính rộng, độ thu hồi, độ lặp lại tốt, độ nhạy, độ chọn lọc cao Là quy trình phân tích nhanh, hiệu quả, dễ tự động hóa

25

UPLC-MS/MS

Cá và sản phẩm của cá

Chiết bằng methanol, pha loãng dịch bằng nước, lọc qua màng 0,22 µm

- Cột HILIC Silica (50 mm, 2.1mm, 3 µm), Atlantis

+ HCOOH 0,1%/MeOH) và B

0,1%/H2O), chế độ gradient - Ion hóa ESI(+), ghi phổ SRM - m/z: ion mẹ (112,2), ion con định lượng (95,11)

Cá: 14,12 ng/mL Mắm: 11,50 ng/mL

98,5 – 102,5%

Độ nhạy, độ chọn lọc, độ chính xác cao Quy trình xử lý mẫu đơn giản, cho phép phân tích trực tiếp histamin, rút ngắn thời gian phân tích, tuy nhiên giá thành thiết bị cao

HPLC-MS/MS

Cá và sản phẩm của cá

Chiết rắn – lỏng bằng acid trichloroacetic 20% Lọc qua màng 0,45 µm

- Cột ZIC-pHILIC (4.6 mm, 150 mm, 5 μm), Merck

- Pha động: nước : acetonitrl : amoni acetat 500mM (45:50:5) - Ion hóa ESI(+), ghi phổ MRM - m/z: ion mẹ (117,78), ion con định lượng (94,61)

0,052mg/kg

101,5 – 103,9%

Quá trình xử lý mẫu đơn giản, không yêu cầu tinh chế mẫu do MS/MS có độ nhạy độ chọn lọc cao, cho phép phân tích các chất phân cực trực tiếp và nhanh chóng Nhược điểm thiết bị đắt tiền

Có thể thấy phương pháp phân tích histamin chủ yếu là các phương pháp sắc ký sử dụng các detector khác nhau Histamin là một chất phân cực, không có cực đại hấp thụ trong vùng UV-Vis, không phát huỳnh quang, có thể định lượng histamin trực tiếp hoặc gián tiếp Định lượng histamin trực tiếp bằng các thiết bị với detector khối phổ MS/MS Định lượng histamin gián tiếp bằng HPLC với các detector như PDA, FLD, UV-Vis bằng cách tạo dẫn xuất với các thuốc thử tạo huỳnh quang (dansyl clorid, o-phthalaldehyd, fluorescamin, ), tạo dẫn chất hấp thụ UV-Vis (o-phthalaldehyd, ninhydrin, dansyl clorid, 9-Fluorenylmethyl chloroformat, ) Trong đó phương pháp tạo dẫn xuất dasyl clorid được áp dụng nhiều do tạo sản phẩm khá ổn định (trong vài ngày) 2:

Hình 1.4 Cơ chế phản ứng tạo dẫn xuất của histamin và dansyl clorid 18

LOQ tương đối dao động giữa các phương pháp mà không phụ thuộc hoàn toàn vào thuốc thử dẫn xuất Mỗi phương pháp có ưu điểm và hạn chế riêng, tùy thuộc vào kĩ thuật phân tích sẽ áp dụng các quy trình xử lý mẫu phù hợp để tối ưu hóa hiệu suất phân tích Trong thực tế LC – MS/MS là phương pháp phổ biến với độ nhạy, khoảng tuyến tính rộng LC – MS/MS được ứng dụng trong phân tích histamin với ưu điểm nổi bật so với các quá trình tách thông thường đó là quá trình tách và phát hiện diễn ra đồng thời Vì vậy, trong nghiên cứu này chúng tôi nghiên cứu và phát triển phương pháp phân tích histamin gián tiếp sau khi dẫn xuất với dansyl clorid bằng LC – MS/MS

1.3 Giới thiệu về LC – MS/MS

1.3.1 Sắc ký lỏng

Sắc ký lỏng là một kỹ thuật sắc ký dùng để tách các hợp chất trong hỗn hợp, dựa vào ái lực khác nhau của chất phân tích với pha tĩnh và pha động lỏng Pha tĩnh dùng trong LC là các hạt nhỏ có hình dạng và vật liệu khác nhau Bản chất pha tĩnh sẽ quyết định khả năng lưu giữ chất phân tích Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp dung môi khác nhau trong mỗi quy trình phân tích Pha động có thể có thành phần không đổi và di chuyển theo tốc độ hằng định trong phép phân tích (chế độ đẳng dòng) hoặc theo chế độ rửa giải gradient hay chương tình dung môi tức là thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng dung môi thay đổi trong quá trình phân tích Việc lựa chọn các thành phần pha động,

chất phụ gia (muối, acid) và điều kiện gradient phụ thuộc vào bản chất của cột và thành phần mẫu Pha động ảnh hưởng đến qua trình rửa giải chất phân tích (thời gian lưu), hiệu lực cột tách, độ rộng pic LC thường sử dụng các loại pha tĩnh khác nhau chứa trong các cột, bơm cao áp đẩy pha động và các thành phần mẫu qua cột tới bộ phận phát hiện là detector Có nhiều loại detector khác nhau, bao gồm detector hấp phụ tử ngoại - khả kiến, detector mảng diod, detector huỳnh quang, detector điện hóa, detector khối phổ hoặc các loại detector đặc biệt khác Trong xây dựng phương pháp phân tích sẽ căn cứ vào bản chất chất phân tích, mức nồng độ và nền mẫu mà lựa chọn detector phù hợp 2

1.3.2 Detector MS/MS

Detector MS/MS phát hiện chất phân tích bằng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích (m/z) của ion được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu

Cấu tạo của một thiết bị khối phổ bao gồm các phần: bộ nạp mẫu, nguồn ion hóa, bộ phân tích khối và bộ phận phát hiện, bộ phận ghi và xử lý số liệu

Hình 1.5 Sơ đồ cấu tạo thiết bị khối phổ [41]

• Bộ phận nạp mẫu: mẫu phân tích ở thể lỏng từ bộ phận sắc ký lỏng đi tới giao diện kết nối của MS sẽ được loại dung môi thành các phân tử trung hòa điện tích ở thể khí bay hơi

• Nguồn ion hóa: Giai đoạn ion hóa rất quan trọng trong, có nhiều phương pháp ion hóa khác nhau như ion hóa bằng va chạm điện tử, ion hóa hóa học, ion hóa áp suất khí quyển (API), Trong đó API là kỹ thuật ion hóa quan trọng và phổ biến nhất Có 2 Kiểu API là ion hóa phun sương điện tử (ESI), ion hóa hóa học ở áp suất khí quyển (APCI) Nghiên cứu này sử dụng kĩ thuật ESI, gồm ba quá trình cơ bản là tạo thành các giọt mang điện tích; làm giảm kích thước các hạt, phân nhỏ các hạt; quá trình hình thành pha hơi các ion Các quá trình này diễn ra dưới ảnh hưởng của điện thế cao và sự hỗ trợ của khí mang Có hai chế độ bắn phá là chế độ ion dương ESI(+) thường tạo ion [M+H]+ và chế độ ion âm ESI(-) thường tạo ion [M-H]-

• Bộ phận phân tích khối: Các ion hình thành ở nguồn ion hóa đi vào bộ phận phân tích khối để tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng

của từ trường, điện trường Trong nghiên cứu này sử dụng bộ phân tích khối tứ cực kiểu chập ba gồm ba bộ tứ cực nối tiếp nhau Q1, Q2, Q3 Tứ cực có cấu tạo gồm 4 cực bằng kim loại đặt song song tạo khoảng không ở giữa để các ion bay qua Chỉ các ion có tỷ số m/z phù hợp mới đi qua bộ lọc này Q1 sẽ tách các ion, lựa chọn một hoặc một số ion ban đầu (ion mẹ) đưa vào tứ cực Q2 Trong buồng Q2 với áp suất cao, ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ có mặt trong buồng như nitơ, argon, heli tạo các ion nhỏ hơn (ion con) Các ion con mới hình thành được dẫn đến Q3 phân tích khối tách riêng

• Kỹ thuật ghi phổ: - SCAN: MS sẽ nhận được tất cả các mảnh ion để cho phổ đồ toàn ion đối với tất cả các chất trong suốt quá trình phân tích

- SIM: MS chỉ cho tín hiệu của các ion đã được lựa chọn trước đó, chế độ SIM thường được lựa chọn để khảo sát năng lượng phân mảnh khi đã biết ion mẹ

- SRM: cô lập ion cần chọn và phân mảnh chúng, trong các mảnh ion tạo thành, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện

- MRM: cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở Q1, phân mảnh ion cô lập đó tại Q2 thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở Q3 và đưa vào đầu dò để phát hiện

• Bộ phận phát hiện: Có nhiệm vụ chuyển các ion đã đến, khuếch đại thành các tín hiệu điện đo bằng hệ điện tử của máy khối phổ Các tín hiệu thu được sẽ chuyển vào máy tính để xử lí và lưu trữ

Do các hợp chất có cấu tạo khác nhau sẽ có cơ chế phân mảnh khác nhau và hình thành các ion con có số khối khác nhau nên MS/MS có độ đặc hiệu, độ nhạy rất cao Ngoài ra nó còn cung cấp thêm các thông tin về cấu tạo của hợp chất Tuy nhiên độ nhạy sẽ phụ thuộc chủ yếu vào lượng ion con tạo thành 2

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu

Đối tượng phân tích: Histamin (C5H9N3) Đối tượng nghiên cứu:

- Mẫu trắng: sử dụng mẫu cá, xay nghiền nhỏ, phân tích lặp lại 3 lần, xác định không cho tín hiệu tại thời gian lưu của chất phân tích

- Mẫu thêm chuẩn: là mẫu trắng được thêm chuẩn ở các mức nồng độ - Mẫu chuẩn: là chuẩn trong nền dung môi

- Mẫu thực: là các mẫu cá và nước mắm được tiêu thụ trong chế độ ăn hàng ngày

2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị

2.2.1 Nguyên vật liệu

2.2.1.1 Chất chuẩn • Chuẩn Histamine Dihydrochloride có độ tinh khiết 99,4%, LGC, Lot (141581) • Pha dung dịch chuẩn:

- Dung dịch chuẩn gốc histamin: Cân 0,04166g chuẩn histamine dihydrochloride vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng nước nước cất hai lần, thu được chuẩn gốc 5000 ppm

- Dung dịch chuẩn làm việc: + Chuẩn 2000 ppm: Dùng micropipet hút chính xác 2 mL dung dịch chuẩn gốc 5000 ppm vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng nước cất hai lần

+ Chuẩn 100 ppm: Dùng micropipet hút chính xác 100 µL dung dịch chuẩn gốc 5000 ppm vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng nước cất hai lần

+ Chuẩn 10 ppm: Dùng micropipet hút chính xác 10 µL dung dung dịch chuẩn gốc 5000 ppm vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng nước cất hai lần + Chuẩn 1 ppm: Dùng micropipet hút chính xác 50 µL dung dịch chuẩn 100 ppm vào bình định mức 5 mL, định mức tới vạch bằng nước cất hai lần

2.2.1.2 Hóa chất và dung môi - Acid trichloroacetic, Merck - Acid hydrochloric 37%, Trung Quốc - Acid pechloric 70 – 72% , Merck - Natri hydroxid, Trung Quốc - Natri bicarbonat, Trung Quốc - Amoniac (25%), Merck - Dansyl chlorid, LGC - Acid formic 89 – 91%, Merck - Acetonitril (loại tinh khiết dùng cho sắc ký)

- Nước cất hai lần (phòng thí nghiệm) - Amoni acetat, Merck

- Dung dịch acid perchloric 0,4M: Hút 40 mL acid perchoric đặc (70-72%) vào cốc có mỏ 1000 mL, định mức tới vạch bằng nước

- Dung dịch natri hdroxyd 2M: cân 8,0 g NaOH, hòa tan hoàn toàn bằng 20 mL nước và chuyển vào cốc có mỏ 100 mL, định mức tới vạch bằng nước

- Dung dịch natri bicarbonate bão hòa: cân khoảng 1 g natri bicarbonat vào 10 mL nước, đun trên bể cách thủy 30 phút và gạn lấy phần dịch

- Dung dịch dansyl chlorid 0,1mg/mL: cân 10 mg dansyl chlorid, hòa tan trong 100 mL aceton, bảo quản dung dịch tránh ánh sáng

2.2.2 Trang thiết bị

2.2.2.1 Thiết bị - Máy sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS SCIEX Triple TM Quad 5500 - Cân phân tích (có độ chính xác đến 0,1 mg), Metler Toledo

- Cân kỹ thuật (có độ chính xác đến 0,01g), Precisa - Máy ly tâm, Hermle

- Máy lắc Vortex IKA vortex Genius 3 - Máy lắc ngang IKA KS501

- Máy ủ lắc ổn nhiệt có lạnh, Amerex 2.2.2.2 Dụng cụ

- Bình định mức có nút mài, dung tích 5, 10, 50, 100 mL - Micropipet 2-20 µL, 10-100 µL, 10-200 µL, 100-1000 µL và đầu côn tương ứng - Pipet Pasteur

- Ống đong chia vạch dung tích 25 mL - Phễu

- Ống nhựa ly tâm 15, 50 mL - Màng lọc 0,2 µm

- Giấy lọc - Vial 2,0 mL

2.3 Nội dung nghiên cứu

2.3.1 Khảo sát xây dựng điều kiện phân tích histamin bằng LC-MS/MS

• Tối ưu hóa điều kiện sắc ký: Khảo sát lựa chọn pha tĩnh, pha động • Khảo sát điều kiện khối phổ: tìm các điều kiện tối ưu của MS để xác định ion mẹ,

lựa chọn các ion con phù hợp

2.3.2 Khảo sát xây dựng quy trình xử lý mẫu để tách histamin trong thủy sản và sản phẩm thủy sản

• Khảo sát và lựa chọn điều kiện chiết histamin trên các nền mẫu:

- Dung môi chiết: thực hiện xử lý mẫu theo quy trình dự kiến, khảo sát các dung môi lần lượt là acid perchloric (HClO4), acid hydrochloric (HCl), acid trichloracetic (TCA)

- Số lần chiết: thực hiên xử lý mẫu theo quy trình dự kiến, thay đổi số lần chiết là 1 lần, 2 lần, 3 lần, 4 lần

• Khảo sát và lựa chọn điều kiện tạo dẫn xuất của histamin với dansyl clorid: - Nhiệt độ dẫn xuất: thực hiện xử lý mẫu theo quy trình dự kiến, khảo sát giữa các nhiệt độ là 30oC, 40oC, 50oC, 60oC

- Thời gian dẫn xuất: thực hiện xử lý mẫu theo quy trình dự kiến, thay đổi thời gian dẫn xuất lần lượt là 20 phút, 30 phút, 45 phút, 60 phút

2.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nền mẫu

Đánh giá tương quan giữa đường chuẩn dựng trên dung môi và đường chuẩn dựng trên nền mẫu

2.3.4 Thẩm định phương pháp

Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 và theo tài liệu hướng dẫn chuyên khảo 7, 4

• Độ phù hợp hệ thống • Tính chọn lọc

• Giới hạn phát hiện LOD, giới hạn định lượng LOQ • Đường chuẩn và khoảng tuyến tính

• Độ lặp lại (Độ chụm) • Độ đúng (Độ thu hồi)

2.3.5 Đánh giá hàm lượng histamin trên một số mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản

• Lấy mẫu thủy sản và sản phẩm thủy sản từ các chợ và các cửa hàng trên địa bàn Hà Nội

• Ứng dụng phương pháp để phân tích và đánh giá kết quả

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp lấy mẫu và xử lý mẫu sơ bộ

• Phương pháp lấy mẫu: - Lấy mẫu theo phương pháp lấy mẫu ngẫu nhiên - Địa điểm lấy mẫu: tại các chợ và các cửa hàng trên địa bàn Hà Nội • Xử lý mẫu sơ bộ: Sau khi lấy mẫu, thủy sản được loại bỏ xương, cho toàn bộ phần thịt nghiền bằng máy đồng nhất đến khi nhỏ, mịn và đồng đều sau đó cho vào túi polyethylen, điền đầy đủ thông tin, bảo quản đông lạnh Mẫu mắm sau khi lấy mẫu được điền đầy đủ thông tin, bảo quản ở nhiệt độ phòng

2.4.2 Phương pháp xử lý mẫu dự kiến

Quy trình xử lý mẫu ban đầu được tổng hợp từ các tài liệu tham khảo 6, 13,18 • Quy trình chiết:

- Nền mẫu thủy sản: Cân chính xác khoảng 5,0 g mẫu đã đồng nhất vào ống ly tâm 50 mL Thêm khoảng 20 mL HClO4 0,4 M, lắc vortex trong 1 phút rồi lắc ngang 20 phút Sau đó mẫu được ly tâm 6000 prm trong 5 phút, gạn dịch, tiếp tục thêm khoảng 20 mL HClO4 0,4M, chiết lặp lần hai tương tự như lần thứ nhất Gộp dịch chiết 2 lần vào bình định mức 50 mL và định mức tới vạch bằng HClO4 0,4M (Dịch chiết 1)

- Mẫu nước mắm: Hút 100 µL nước mắm vào bình định mức 10 mL, định mức tới vạch bằng HClO4 0,4M (Dịch chiết 2)

• Quy trình tạo dẫn xuất: Hút 0,5 mL dịch chiết 1 hoặc 2 vào ống nghiệm, thêm 100

và ủ trong bể điều nhiệt 45 phút ở 40oC Sau đó lấy mẫu ra để nguội trong 10 phút và

định mức dung dịch về 5 mL bằng hỗn hợp Amoniacetat 0,1M: Acetonitril tỉ lệ 1:1 (v/v) Lọc dịch qua màng 0,2 µm vào vial Bảo vệ dung dịch khỏi ánh sáng

• Tính kết quả histamin có trong mẫu theo công thức:

Cthủy sản =C

mCnước mắm = C′× 1000 × F Trong đó:

Cthủy sản: hàm lượng histamin có trong mẫu thủy sản (µg/g) Cnước mắm: hàm lượng histamin có trong mẫu nước mắm (µg/mL) C′: nồng độ histamin tính từ đường chuẩn (ng/mL)

F: hệ số pha loãng (nếu có) m: khối lượng cân (g)

2.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng nền

Xây dựng đồng thời đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên nền mẫu trắng, mẫu thực

Xác định ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng so sánh 2 hệ số góc của 2 đường chuẩn

ME (%) =anền mẫu− anền dung môi

anền dung môi × 100% Nếu:

ME% >0: ảnh hưởng nền dương, nền mẫu gây tăng tín hiệu chất phân tích ME% <0: ảnh hưởng nền âm, nền mẫu gây giảm tín hiệu chất phân tích

2.4.4 Phương pháp thẩm định phương pháp phân tích bằng LC-MS/MS

2.4.4.1 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là phép thử để chứng minh hệ thống hoạt động theo mục đích sử dụng

Cách xác định: Tiến hành tiêm lặp 6 lần dung dịch chuẩn làm việc vào hệ thống sắc ký và xác định độ lệch chuẩn tương đối RSD (%) của các đáp ứng phân tích

Yêu cầu: RSDThời gian lưu ≤ 2% RSDDiện tích pic ≤ 2% 2.4.4.2 Tính chọn lọc

Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện được chính xác chất phân tích khi có mặt các tạp chất khác

Cách xác định: so sánh phổ của chất phân tích trên mẫu trắng, mẫu trắng thêm chuẩn và mẫu chuẩn ở cùng nồng độ

Yêu cầu: - Mẫu trắng không được cho tín hiệu tại thời gian lưu gần với thời gian lưu của chất phân tích

- Thời gian lưu của chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn tương ứng với thời gian lưu chất phân tích ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,1 phút

Ngoài ra tính chọn lọc còn được khẳng định bằng số điểm nhận dạng và tỷ lệ các ion Hội đồng Châu Âu (EU 2021/808) quy định cách tính điểm IP đối với phương pháp LC-MS/MS: kỹ thuật tách LC được tính 1 điểm, mỗi ion mẹ được tính 1 điểm, mỗi ion con được tính 1,5 điểm Tổng số điểm nhận dạng được tính theo Bảng 2.1

Bảng 2.1 Số điểm IP cho kỹ thuật phân tích sắc ký lỏng khối phổ hai lần

Bảng 2.2 Tỷ lệ ion đối với LC-MS/MS

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ hoặc hàm lượng chất có thể phát hiện được với một mức đảm bảo đo hợp lý

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được với kết quả có độ chính xác mong muốn bằng phương pháp đó

Cách xác định: Phân tích mẫu (mẫu thực, mẫu thêm chuẩn, mẫu chuẩn) ở các nồng độ thấp dần cho đến khi còn có thể phát hiện tín hiệu của chất phân tích (n ≥ 2) Xác định tỉ lệ tín hiệu chia nhiễu (S/N) LOQ chấp nhận tại nồng độ mà tại đó S/N = 10-20

Giới hạn phát hiện (LOD) được tính từ giá trị nồng độ LOQ:

3,3Trong đó:

S là chiều cao tín hiệu của chất phân tích N là nhiễu đường nền

2.4.4.4 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích

Tiến hành xây dựng đường chuẩn theo hai cách:

- Đường chuẩn trên mẫu trắng: Mẫu trắng được thêm các chất chuẩn tại các mức nồng độ khác nhau, sau đó tiến hành chuẩn bị mẫu và phân tích tương tự như mẫu thực

- Đường chuẩn trên mẫu thực: Mẫu thực được thêm các nồng độ chuẩn khác nhau, sau đó tiến hành chuẩn bị mẫu và phân tích tương tự như mẫu thực

Xây dựng đường phụ thuộc giữa tính hiệu chất phân tích (y) và nồng độ (x): y = ax+b (a là độ dốc, b là hệ số chắn)

Xác định hệ số tương quan R và độ chệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn:

Trong đó: ∆i: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn Ct : Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm chuẩn Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn

Yêu cầu: - Hệ số tương quan : 0,995 ≤ R ≤ 1 hoặc 0,99 ≤ R2 ≤ 1 - Độ chệch ∆i không được vượt quá ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%

2.4.4.5 Độ đúng và độ chụm Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng có thể được biểu diễn dưới dạng độ thu hồi

Độ chụm chỉ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình Độ chụm được phân loại thành 3 trường hợp: độ lặp lại, độ chụm trung gian (độ tái lập nội bộ), độ tái lập

Cách xác định độ thu hồi và độ lặp lại: Tiến hành thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu trắng và mẫu thử thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ khác nhau, làm lặp 6 lần, tính toán kết quả theo các công thức:

- Độ thu hồi: Độ thu hồi chung là trung bình của độ thu hồi các lần làm lặp lại Đối với mẫu thử: R% =Cm+c− Cm

Đối với mẫu trắng: R% = Ctt

Cc × 100 Trong đó:

R%: Độ thu hồi % Cm+c : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn C : Nồng độ chất phân tích trong mẫu thử

Cc : Nồng độ chuẩn thêm (lý thuyết) Ctt : Nồng độ chất phân tích trong mẫu trắng thêm chuẩn - Độ lặp lại:

RSD (%) =SD

x̅ × 100% SD = √∑ (xi−x̅ )2

ni=1

n−1

Trong đó: SD: Độ lệch chuẩn n: số lần thử nghiệm xi: Giá trị tính được của lần thử nghiệm thứ “i” x̅: Giá trị trung bình của các lần thử nghiệm RSD (%): Độ lệch chuẩn tương đối

➢ Yêu cầu về độ thu hồi và độ lặp lại: Các kết quả độ thu hồi và độ lặp lại ở các mức nồng độ nằm trong giới hạn cho phép quy định trong Bảng 2.3 và Bảng 2.4

Bảng 2.3 Độ thu hồi chấp nhận ở các nồng độ khác nhau