DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Analytical Collaborations Hiệp hội cộng đồng phân tích CXP Collision cell Exit Potential Thế thoát khỏi ô va chạm ESI Electrospray Ionization Ion h
TỔNG QUAN
Tổng quan về Dehydroepiandrosteron (DHEA)
1.1.1 Nguồn gốc và cấu trúc hoá học
Dehydroepiandrosteron (5-androsten-3β-ol-17-on) hay còn được gọi là Prasteron
[28], [29] là một tiền hormon steroid nội sinh có nguồn gốc từ cholesterol được hình thành thông qua một loạt các phản ứng dưới sự xúc tác monooxygenase thuộc cytochrom P450 và hydroxysteroid dehydrogenase Dehydroepiandrosteron (DHEA) được tiết ra chủ yếu bởi vùng lưới của vỏ thượng thận và các bộ phận tinh hoàn, buồng trứng, da và não ở người và các loài linh trưởng khác [15], [18], [26], [35] Sự tiết DHEA được kiểm soát bởi adrenocorticotrophin (ACTH) và các yếu tố tuyến yên khác [23], [26], [31] Chức năng chủ yếu của nó như một chất trung gian trao đổi chất trong quá trình sinh tổng hợp steroid sinh dục androgen và estrogen [26], [28], [29] Nồng độ Dehydroepiandrosteron giảm theo tuổi ở nam và nữ, đôi khi đạt giá trị thấp tới 10-20% so với nồng độ gặp ở người trẻ [15], [26]
Hình 1.1.Cấu trúc hoá học của DHEA
Khối lượng phân tử: 288.4 g/mol
DHEA tương đối bền dưới khi bảo quản ở nhiệt độ thường và tác động của nhiệt độ [25] Độ tan: Độ tan của DHEA trong ethanol, DMSO, dimethyl formamid lần lượt là 10 mg/ml, 15 mg/ml, 25 mg/ml, ít tan trong nước độ tan 0,0635 mg/ml (ở 25°C) [37], [38] Nhiệt độ nóng chảy: 140 -141°C Log P = 3,23 [36]
Dehydroepiandrosteron hòa tan trong H2SO4 tạo thành dung dịch màu vàng, khi thêm nước cẩn thận sẽ tạo thành vòng màu xanh tím và khi lắc sẽ tạo ra dung dịch màu xanh tím (hấp thụ tối đa ở bước sóng khoảng 560 nm), màu biến mất khi thêm nước Đối với phản ứng màu với riêng H2SO4 và với sự có mặt của benzaldehyd hoặc furfural thì DHEA tạo ra phản ứng màu Pettenkofer-Schmidt rất mạnh (với axit furfural và sulfuric trong axit acetic) có thể được sử dụng để ước tính so màu
4 Tạo ra màu xanh hơi vàng nhạt với độ đồng đều cao với dung dịch SbCl2, trong anhydrit axit acetic-acetic băng (9:1, v/v)
Trong phản ứng của Zimmermann với m-dinitrobenzen và 15% KOH trong rượu hoặc rượu-dioxan, DHEA nhanh chóng tạo ra màu đỏ đậm [13]
1.1.3.1.Chức năng sinh học DHEA trong cơ thể
DHEA hoạt động như một tiền thân của hormon testosteron và estrogen [14] Ở phụ nữ, sau thời kỳ mãn kinh, tất cả estrogen và gần như tất cả androgen được sản xuất cục bộ ở các mô ngoại vi từ DHEA gián tiếp tác động lên hình thành xương, mỡ, cơ, insulin và glucose sự trao đổi chất, làn da, ham muốn tình dục Ở nam giới sự đóng góp của DHEA cho androgen nhiều nhất ở tuyến tiền liệt, nơi có khoảng 50% androgen được sản xuất từ DHEA [22]
1.1.3.2.Một số dạng dùng của DHEA và chỉ định
DHEA thường được dùng dưới dạng thực phẩm chắc năng nhằm mục đích tăng cường các nội tiết tố giúp cải thiện các biểu hiện suy giảm nội tiết tố [26] Nó còn có một số tác dụng khác như làm chậm quá trình lão hoá, tăng cơ bắp, cải thiện khả năng sinh sản hoặc điều trị các tình trạng bệnh lý như loãng xương và trầm cảm [18]
DHEA ngoài được sử dụng dưới dạng thực phẩm chức năng để bổ sung hormon, nó còn được gọi dưới tên Prasteron dùng để điều trị đau khi quan hệ tình dục do teo âm đạo và chuẩn bị cổ tử cung để sinh con Nó được sử dụng đường uống, bôi lên da, đặt âm đạo hoặc tiêm bắp [39] Ngoài ra còn dùng phối hợp với ibuprofen để điều trị giảm bùng phát tự miễn dịch ở bệnh nhân nữ mắc bệnh lupus ban đỏ hệ thống hoạt động (SLE) [40]
1.1.3.3.Một số tác dụng khác của DHEA
Tác dụng lên bệnh béo phì:
- DHEA có thể kiểm soát cân nặng [14] tác động lên quá trình chuyển hóa glucose ở mô hình động vật và làm giảm quá trình tạo glucose ở gan Bằng cách sử dụng cơ chất thụ thể insulin 1 và 2 (IRS1 và IRS2) được kích thích bằng insulin chuột chúng ta đã thấy được tác dụng của DHEA đối với gan DHEA làm tăng quá trình phosphoryl hóa Akt ở gan của C57BL6 IRS1 - và IRS2 - những con chuột bị thiếu hụt được nuôi bằng chế độ ăn nhiều chất béo (HFD), điều này cho thấy sự gia tăng Tín hiệu Akt do DHEA tạo ra là đủ khi có IRS1 hoặc IRS2 [6].
Tác dụng lên hệ miễn dịch:
- DHEA có nhiều mối liên hệ với nhiều khía cạnh của chức năng miễn dịch và thường được coi là có lợi và hỗ trợ khả năng miễn dịch [14], [22], mặc dù không phải là nguồn gốc duy nhất, tỷ lệ cortisol:DHEA tăng lên dường như là một yếu tố góp phần vào sự suy giảm chức năng miễn dịch liên quan đến tuổi tác được
5 gọi là lão hóa miễn dịch [10] Vai trò của DHEA như một chất kháng glucocorticoid và tác dụng của nó đối với cả thụ thể androgen và estrogen Với nghiên cứu bổ sung, DHEA có thể hữu ích như một liệu pháp điều trị, đặc biệt trong các bệnh có mức độ viêm cao hoặc khi việc sản xuất tuyến thượng thận bị thay đổi [10], [22].
Tác dụng lên hệ tim mạch
- DHEA có tác dụng giảm cholesterol trong đại thực bào giảm xơ vữa động mạch ở thỏ [14]
- DHEA chống lại xơ vữa động mạch [14], [27], [34] bằng cách chống lại các cơ chế này, bao gồm điều chỉnh tình trạng lipid máu, bảo vệ tế bào nội mô (bao gồm đối phó với stress oxy hóa và phản ứng viêm của mạch máu nội mô, ức chế quá trình apoptosis của tế bào nội mô và tạo ra NO) và ức chế sự tăng sinh và di cư của các tế bào cơ trơn mạch máu Kết quả là, DHEA có giá trị lớn trong việc ngăn ngừa xơ vữa động mạch và ức chế nó [27], [34]
- Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng DHEA có tác động đa dạng do đó mức độ giảm của DHEA có thể liên quan đến nhiều loại bệnh lý khác nhau, bao gồm bệnh tim mạch Tại mức tế bào trong hệ thống tim mạch, DHEA dường như ảnh hưởng đến một loạt các con đường tín hiệu (các kênh ion, canxi tế bào nội) dẫn đến tác động chống tái cấu trúc và giãn mạch [27] DHEA đã xuất hiện như một liệu pháp đầy hứa hẹn ở một số bệnh các dạng tăng huyết áp động mạch phổi như tăng huyết áp do thiếu oxy liên quan đến mãn tính bệnh phổi tắc nghẽn [27]
1.1.4 Quy định trên thế giới và Việt Nam về việc sử dụng DHEA Ở Việt Nam và trên thế giới hiện nay vẫn chưa có một quy định nào liên quan đến việc yêu cầu ngưỡng hàm lượng được phép có trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ của DHEA Tuy nhiên, theo quy định của uỷ ban Olympic, DHEA và một số các loại hormon sinh dục khác đã bị cấm cho các vận động viên thể thao khi chúng được coi là doping [8], [16], [17].
Các phương pháp nghiên cứu xác định DHEA
1.2.1 Các nghiên cứu xác định DHEA đã được thực hiện trên thế giới
Các phương pháp như HPLC-UV, LC-MS/MS, GC-MS thường được sử dụng để xác định DHEA trong các nền mẫu khác nhau như TPBVSK, dịch sinh học hay thực phẩm,…
Bảng 1.1 Các nghiên cứu xác định DHEA trên thế giới
STT Nền mẫu Xử lý mẫu Điều kiện sắc kí LOD,
- Nghiền 5 viên, mỗi viên chứa 50 mg DHEA, trọng lượng trung bình viên 300,69 mg
- 28,7 mg mẫu + 20 ml pha động (dung môi) → siêu âm 10 phút → pha loãng thành 50 ml → Lọc dịch qua màng 0,45 àm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút
- Lấy khối lượng mẫu tương đương 1 viên → bình định mức 100 ml + 60 ml ACN (hoặc MeOH) → lắc cơ học trong 20 phút
- Dịch chiết được pha loãng bằng thể tích thích hợp tuỳ từng chế phẩm 5,
10, 25, 50 mg đến nồng độ cuối cùng là 0,05 mg/ml
- Pha tĩnh: A Zorbax Rx C18 (250 × 4,6 mm, 5 àm)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 50 àl
+LOQ3,28 ng/àl +LOD0,89 ng/àl
+ LOQ4,39 ng/àl + LOD1,28 ng/àl
Viên nang Tương tự viên nén [29]
- Trộn 5 liều xịt (25 mg DHEA) → cốc có mỏ 150 mL → cân chính xác 1 liều, pha loãng bằng 60 mL (pha động A) → siêu âm trong 5 phút → bình định mức 100 mL pha bằng pha động A
- 10,0 ml dung dịch trên → pha loãng thành 50 mL bằng pha động A
- Lấy một lượng chứa 25 mg DHEA → bình định mức 100 ml chứa 60 ml pha động A → siêu âm trong 5–10 giây + định mức bằng pha động A
- Pha loãng 10,0 ml dung dịch trên thành 50 ml với pha động A
18 mg DHEA + 20 ml ACN → siêu âm 5 phút → cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng ACN
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/ phút
- Thể tích tiêm mẫu: 10 àL
- 10 viên (25 mg) cân và nghiền thành bột → cân khối lượng tương đương 1 viên → bình định mức 25 ml và hòa tan trong pha động + siêu âm trong 30 phút → ly tâm
- Loại chất nổi → bay hơi/N2 → cắn → hoàn nguyên trong 25 ml pha động
- Pha động: MeOH : Đệm Natri acetat (5 g/l) : Axit acetic (500 ml/l)
- Pha tĩnh: Cột Supelcosil C18 (250 × 4,6 mm, 5 àm)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 25 àl
- 1 g mẫu + chuẩn nội (testosteron - d3 100 ng/g) + 5 ml MeOH → lắc xoáy
- Bay hơi MeOH đến khô + 2 ml NaOH (1M) + 5 ml pentan:diethylether (9:1, v/v) trong 1 giờ → lắc
- Ly tâm → lớp hữu cơ → bay hơi bằng N2/40 o C + 50 ml pha động (MeOH :
+ Chế độ ion hoá APCI
Discovery HS C18 column (150 × 4,6 mm, 5 àm) Supelco, Bellefonte
- Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 20 àl
- 500 mg mẫu + 4 ml etyl acetat/axit acetic (99,9 : 0,1, v/v) → lắc → ly tâm lấy lớp trên
- Qua cột d-SPE NH2 2 lần 3 ml ethyl acetat
→ hoà tan bằng 200 àl pha động H2O:MeOH (50 : 50, v/v)
- Pha tĩnh: Waters Acquity BEH C18 (50 × 2,1 mm, 1,7 àm)
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 10 àl
Thực phẩm bổ sung protein
- 5 ml dịch nổi trên qua d-SPE (MgSO4 và PSA)
+ Kênh (A): Axit formic 0,1% trong nước khử ion
+ Kênh (B): Axit formic 0,1% trong ACN
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
- 1 g mẫu + 5 ml MeOH và 20 𝜇l dung dịch chuẩn nội (hỗn hợp d3- nortestosteron, d3- testosteron, d3- noretiocholanolon, 2,5 μg/ml mỗi loại)
- Lắc trong 5 phút và ly tâm trong 5 phút ở 1500 g
→ chiết bằng 5 ml n- pentan → loại bỏ lớp nước và lớp n-pentan được chiết lại bằng 2ml MeOH/H2O (95:5, v/v)
- 2 μl dung dịch DIPA (mỗi loại 0,5 μg/ml 1- N,N-diiso- propylamino- n-tetradecane đến 1-N,N- diisopropyl- amino-n- tricosane – DIPA 14-23) đã được thêm vào lớp MeOH Sau khi làm bay
Helium, áp suất đầu 13 psi
- Thể tích: 2 μl không chia dòng
10 hơi đến khô trong chân không, 100 μl thuốc thử tạo dẫn xuất
(MSTFA/NH4I/ethanethi ol, 1000:2:3, v/v/v) thêm vào và quá trình tạo dẫn xuất được thực hiện trong
- 1 gam mẫu + 5 ml MeOH → lắc → ly tâm
500 𝜇l lớp MeOH + 1 giọt HCl 1% EtOH → bay hơi đến khô
- 25 𝜇l diphenylamin (1 mg/ml, chuẩn nội), 0,5 ml KOH 5N, 1 thìa NaCl và
2 ml tert- Butylmethylether (TBME) được thêm → lắc
→ ly tâm → pha hữu cơ 1 thìa Na2SO4 khan → khuấy + 1 giọt H2SO4
Zebron, Phenomenex, Torrance, CA, USA)
- 100 μl Huyết thanh + 10 μl chuẩn nội + 200 μl ACN → lắc xoáy (1 phút) + 100 μl nước
- Kết tủa protein bằng cách ly tâm (10,000 g) trong 2 phút ở 4°C
- Tách pha lạnh: bảo quản mẫu ở −30°C trong 10 phút, dung dịch được bảo quản tách thành 2 pha
- Lấy 100 μl pha trên +100 μl natri bicarbonat 0,1M + 10 μl dung dịch
Dansyl Clorua 10 mg/ml trong ACN → ủ (10 phút) ở 65°C → Tách pha lạnh được thực hiện lại ở
- Phương pháp LC- MS/MS
+ Kênh (A): axit formic trong nước (0,2% v/v) + amoni acetat 10 mmol/l
+ Kênh B: axit formic trong metanol (0,2% v/v) + amoni acetat 10 mmol/l
- Pha tĩnh: Cột Kinetex C18 100 Å (100 × 3 mm, 2,6 μm)
- Lấy 50 μl pha trên + 50 μl nước → phân tích
ZnSO4 trong MeOH → kết tủa → ly tâm lấy phần dung dịch bên trên (200 đến 300 àL) → qua cột HybridSPE (loại phospholilip) → lọc lấy dịch
- Phương pháp LC- MS/MS
- Pha tĩnh: Cột Restek Raptor Biphenyl, (100 × 2,1 mm, 2,7 àm)
- 200 𝜇l huyết thanh cho ống ly ly tâm + 20 𝜇l chuẩn nội và chuẩn làm việc → chiết với 1 ml methyl t-butyl ether → lấy pha hữu cơ bay hơi/N2 ở 50 °C → cắn
- Cắn + 75 𝜇l hydroxylamin (0,7 mol/l) trong MeOH:H2O (3:7, v/v) → ủ 70°C trong 15 phút → sau ủ thêm 75 𝜇l
+ m/z: mảnh mẹ (304) – đã dẫn xuất, mảnh con (253)
- 5 gam mẫu → vào ống ly tâm + 100 μl chuẩn nội testosteron 100 μg/l + 10 ml dung dịch đệm acetat 0,2 mol/l (pH 5,2) → siêu âm khoảng 1 phút
- 100 μl glucuronidase/arylsulfatas e được thêm vào và ủ qua đêm ở 37°C
→ trộn bằng máy khuấy vortex trong 2 phút → ly tâm
- Phần dịch nổi phía trên được gạn vào cốc thủy tinh 250 ml và được pha loãng với 125 ml bằng nước siêu tinh khiết
- Qua cột chiết pha rắn (SPE) làm sạch
- Bay hơi/N2 → cắn + 1,0 ml H2O/MeOH (1:1, v/v)
ESI (+) + m/z: mảnh mẹ (289,5), mảnh con (271,0; 253,1)
- Pha tĩnh: Cột Acquity UPLCTM BEH C18 (100 × 2,1 mm, 1,7 𝜇m)
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
- Bảo quản mẫu nước tiểu ở - 20°C, sau đó thêm 50
𝜇l 6M HCl → lọc qua màng cellulose acetat 0,45
- Pha tĩnh: cột Nucleodur CN-RP (125 × 4 mm, 3 𝜇m)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
50 ml + 100 àl chuẩn nội 0,5 mg/l
- Lấy lớp trên sau khi xoáy trong 1 phút và sau đó ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 10 phút ở 4°C + ACN chiết thêm 1 lần
- Bay hơi lớp hữu cơ trên
- Phương pháp UHPLC-MS/MS:
- Pha tĩnh: cột Endeavorsil C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 àm)
- Tốc độ dòng: 0,3 ml/phút
- Thể tích tiêm mẫu: 5 àl
1.2.2 Các nghiên cứu xác định DHEA đã được thực hiện tại Việt Nam
Hiện tại, vẫn chưa có một nghiên cứu chính thức nào được công bố xác định DHEA tại Việt Nam
Nhận xét: Các phương pháp trên thường sử dụng dung môi là ACN và MeOH kết hợp với siêu âm để chiết mẫu [4], [28], [12] Đa số các phương pháp sử dụng phương pháp LC-MS/MS và GC-MS/MS cũng như HPLC-UV Tuy nhiên phương pháp GC- MS/MS yêu cầu thường phải dẫn xuất bằng cách thay đổi cấu trúc hoá học của chất phân tích dẫn đến chất đó có khả năng ion hoá cao hơn giúp cải thiện độ nhạy của phương pháp [7], [19] và một số nghiên cứu sử dụng HPLC-UV [4], [12], [28], [29] ứng dụng định lượng những viên nén với thành phần không phức tạp, tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là có thể bị ảnh hưởng bởi một số nền mẫu chứa nhiều thành phần dược liệu, khoáng chất, vitamin,… dẫn đến trong một số trường hợp phải thay đổi điều kiện phân tích hoặc không định lượng được [29] LC-MS/MS được sử dụng phổ biến với độ chọn lọc cao và quá trình xử lý mẫu không phải dẫn xuất nên phù hợp với việc định lượng DHEA trong thực phẩm bảo vệ sức khoẻ
1.2.3 Tổng quan về sắc ký lỏng khối phổ
Sắc ký lỏng khối phổ là kỹ thuật phân tích dựa trên khả năng phân tách các thành phần khác nhau trong hỗn hợp của bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao (High performance
14 liquid chromatography - HPLC) kết hợp với khả năng phân tich số khối (m/z) của bộ phận khối phổ (Mass spectrometry – MS) [1]
Hình 1.2 Sơ đồ hệ thống sắc kí lỏng khối phổ 1.2.3.1 Bộ phận sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là kỹ thuật phân tích dựa vào việc các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh dưới tác động của pha động lỏng Do đó, dựa vào sự khác nhau về ái lực của các chất phân tích với pha tĩnh dưới tác động của pha lỏng mà các chất phân tích có thể tách khỏi nhau Pha tĩnh là các hạt nhỏ có hình dạng khác nhau với rất nhiều chất mang biến đổi hoá học thường được chế tạo từ silica hoặc polyme Pha động là dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, có thể có thành phần và di chuyển với tốc độ không đổi theo chế độ đẳng dòng hoặc có thành phần, tỷ lệ, tốc độ dòng dung môi thay đổi gọi là chế độ rửa giải gradient
Hình 1.3 Sơ đồ hệ thống HPLC 1.2.3.2 Bộ phận khối phổ (MS)
15 Khối phổ - MS là thiết bị phát hiện chất phân tích bằng kỹ thuật đo trực tiếp tỷ số khối lượng và điện tích (m/z) của ion được tạo thành trong pha khí từ phân tử hoặc nguyên tử của mẫu
Trong quá trình phân tích, mẫu ở thể lỏng được loại dung môi, sau đó được ion hoá để tạo thành các ion hoặc các tiểu phân mang điện ở pha khí và được gia tốc đến bộ phận phổ khối để chia tách thành từng loại tuỳ thuộc vào tỉ lệ (m/z) của chúng Cuối cùng các ion đi đến bộ phận phát hiện detector ghi lại tín hiệu dưới dạng các vạch phổ của từng ion Cường độ tín hiệu của vạch phổ trên phổ đổ phụ thuộc vào số lượng ion ghi nhận ở bộ phận phát hiện
Các bộ phận chính của hệ thống MS:
- Buồng ion hoá: Có nhiều phương pháp ion hoá được áp dụng trong bộ phận phân tích khối phổ nhưng có hai phương pháp được áp dụng phổ biến là ion hoá phun sương điện tử (ESI – Electron Spray Ionization) và ion hoá học ở áp suất khí quyển (APCI – Atmospheric Pressure Chemical Ionization)
- Kỹ thuật ion hoá phun sương điện tử ESI: Bao gồm quá trình cơ bản sau tạo thành các giọt mang điện tích, làm giảm kích thước của các hạt, và phân nhỏ các hạt, quá trình hình thành pha hơi các ion Khi dung dịch mẫu ra khỏi cột sắc ký, được đưa vào ống mao quản bằng kim loại Đầu mao quản này được áp điện thế cao (4-6 kV) và sự hỗ trợ của khí mang, mẫu được phun thành hạt nhỏ tích điện tại bề mặt Khi điện tích dư trên đầu mao quản vượt qua sức căng bề mặt của dịch mẫu thì sẽ tạo thành các giọt mang điện tích Tiếp đó các giọt mang điện này được làm giảm kích thước nhờ hai quá trình liên tục xảy ra, đó là sự hóa hơi dung môi nhờ dòng khí
N2 được liên tục thổi vào và sự bắn phá của các giọt tích điện cùng dấu Cuối cùng dẫn đến sự hình thành pha hơi của các ion Nhờ lực hút tĩnh điện mà các ion này được dẫn vào bộ phân tích khối phổ qua một cửa sổ rất nhỏ Dung môi và khí trơ
N2 được hút ra ngoài do một dòng khí (Curtain Gas)
- Bộ phân phân tích khối: Bộ phân phân tích khổi có nhiệm vụ tách các ion có tỷ lệ m/z khác nhau thành từng loại riêng biệt nhờ tác dụng của từ trường, điện trường
Bộ phận phân tích phổ khối gồm 4 loại chính có cấu tạo và nguyên lý hoạt động khác khau: bộ phân phân tích từ, bộ phân tích tứ cực, bộ phân tích thời gian bay, bộ phân tích cộng hưởng ion cyclontron
- Bộ phận phân tích khối phổ hai lần LC-MS/MS còn gọi là bộ phận tứ cực kiểu chập ba được sử dụng trong nghiên cứu, gồm 3 bộ tứ cực nối tiếp :
+ Q1: Tách ion và lựa chọn một hoặc một số ion mẹ đưa vào tứ cứ Q2
+ Q2: Ion mẹ bị phân mảnh do va chạm với các khí trơ trong buồng tạo thành các ion nhỏ hơn (ion con)
+ Q3: tách các ion riêng các ion con thu được từ Q2 để đi đến bộ phận phát hiện
Hình 1.4 Sơ đồ quá trình ion hoá và phân mảnh tại các tứ cực khác nhau
- Bộ phận phát hiện ion (detector): tiếp nhận các ion đã được phân tách và chọn lựa, ghi lại tín hiệu của chúng
- Kỹ thuật ghi phổ: Đối với khối phổ tứ cực chập ba có 2 kỹ thuật ghi phổ MS/MS thường được sử dụng là:
+ Kỹ thuật SRM (Selected Reaction Monitoring): Bằng cách cô lập ion cần chọn, sau đó phân mảnh ion cô lập đó, trong cách mảnh ion tạo thành, cô lập 1 mảnh ion con cần quan tâm và đưa vào đầu dò để phát hiện
+ Kỹ thuật MRM (Multiple Reaction monitoring): Cô lập ion cần chọn (ion mẹ) ở tứ cực thứ nhất, phân mảnh ion cô lập đó ở tứ cực thứ 2 thu được các ion con, cô lập 2 (hoặc nhiều) ion con cần quan tâm ở tứ cực thứ 3 và đưa vào đầu dò để phát hiện
+ Trong thực tế kĩ thuật MRM hay được sử dụng hơn SRM do trong phân tích các ion con cần quan tâm thường từ 2 trở lên
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu các mẫu thực phẩm chức năng chứa Dehydroepiandrosteron (DHEA) trên thị trường Đối tượng phân tích Dehydroepiandrosteron (DHEA).
Nguyên vật liệu, thiết bị
Nguyên liệu DHEA 99,3% FocusHerb Corp, số lô FH20230112
Dung môi dùng cho LC-MS: ACN, MeOH (Merk)
Muối Amoniformat (Merk); Dung dịch acid formic bão hoà (Merk)
PSA (Agilent Technologies); Bondesil C18 bulk sorbent, 40 μm, 100 g (Agilent Technologies); GCB (Agilent Technologies)
Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ ba tứ cực LC-MS/MS SCIEX Triple TM Quad 5500; vial 1,5 ml có nắp dùng tiêm mẫu LC-MS/MS; cột sắc ký pha đảo: XSelect HSS C18
SB (2,1 mm ì 100 mm, 3,5 àm); mỏy ly tõm (HERMLE), (Hettich); mỏy siờu õm (Elma); máy lắc xoáy vortex (IKA); cân phân tích (Sartorius – Đức); micropipet điều chỉnh được thể tích (Eppendorf – Đức) loại 10-100 𝜇𝑙, 20-200 𝜇𝑙, 100-1000 𝜇𝑙, 1000-5000 𝜇𝑙; bình định mức 50 ml, 100ml; Ống ly tâm 50 ml; màng lọc 0,2 𝜇𝑚.
Nội dung nghiên cứu
Khảo sát điều kiện sắc ký và điều kiện khối phổ
Khảo quy trình xử lý mẫu Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu
Thẩm định phương pháp phân tích Ứng dụng định lượng các mẫu chứa DHEA trên thị trường.
Phương pháp nghiên cứu
2.4.1 Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn gốc DHEA 400 𝜇g/ml: Cân chính xác một lượng 0,0400 g DHEA chuẩn cho vào bình định mức 100 ml, thêm ACN vào lắc đến tan, định mức vừa đủ đến vạch bằng ACN
Dung dịch chuẩn trung gian DHEA 100 𝜇g/ml: Hút chính xác 5,00 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 20 ml định mức vừa đủ đến vạch bằng ACN
Dung dịch chuẩn DHEA 10 𝜇g/ml : Hút chính xác 2,00 ml dung dịch chuẩn trung gian 100 𝜇g/ml vào bình định mức 20 ml định mức vừa đủ đến vạch bằng ACN
18 Dãy dung dịch chuẩn làm việc 2,5 𝜇g/ml; 3,0 𝜇g/ml; 4,0 𝜇g/ml; 5,0 𝜇g/ml; 6,0 𝜇g/ml; 7,5 𝜇g/ml được pha loãng từ dung dịch chuẩn 10 𝜇g/ml
2.4.2 Khảo sát điều kiện LC-MS
2.4.2.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Lựa chọn nguồn ion hoá, các thông số thiết bị Điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con: thế đầu ra (CXP) và năng lượng bắn phá (CE)
Lựa chọn mảnh ion mẹ, ion con để định lượng, định tính
2.4.2.2 Khảo sát điều kiện sắc ký
Khảo sát và lựa chọn pha động và chương trình gradient và các thông số khác: thể tích tiêm mẫu, tốc độ dòng, thời gian phân tích
2.4.3 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Quy trình xử lý mẫu dự kiến được thể hiện ở hình 2.1 tham khảo quy trình xử lý mẫu các tài liệu [12], [16], [28], [29]
Hình 2.1 Quy trình xử lý mẫu dự kiến
Tiến hành khảo sát các yếu tố có thể ảnh hưởng đến quá trình chiết mẫu:
- Khảo sát loại dung môi chiết mẫu
- Khảo sát số lần chiết mẫu
- Khối lượng chất làm sạch sử dụng
2.4.4 Đánh giá ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích Ảnh hưởng nền là ảnh hưởng của một hay nhiều thành phần trong nền mẫu đến việc xác định hàm lượng đến việc xác định hàm lượng chất phân tích Ảnh hưởng của nền có thể nhận biết qua việc tăng hoặc giảm tín hiệu của dung dịch chất phân tích nền mẫu so với dung dịch cùng nồng độ trong dung môi [3]
Khảo sát các đường chuẩn trên nền dung môi và đường chuẩn trên 2 nền mẫu trắng
- Nền viên cứng: các TPBVSK trên thị trường bào chế dạng viên nén và nhân nang cứng (lấy phần nhân nang) không chứa chất phân tích
- Nền lỏng : các TPBVSK trên thị trường bào chế dạng dầu, nhân viên nang mềm (dạng dầu) không chứa chất phân tích
Xác định ảnh hưởng nền mẫu lên tín hiệu của chất phân tích bằng cách so sánh hai hệ số góc của hai đường chuẩn
Yêu cầu: Ảnh hưởng của nền không được vượt quá ±15% [3]
2.4.5 Thẩm định phương pháp phân tích
Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn của AOAC 2016 [5], và theo tài liệu hướng dẫn chuyên khảo [1], [3] trên nền mẫu trắng với các chỉ tiêu:
2.4.5.1 Độ phù hợp hệ thống Độ phù hợp hệ thống là các phép thử để đánh giá độ ổn định, hiệu quả của hệ thống, hệ thống hoạt động đúng theo mục đích sử dụng
Tiến hành tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn ghi lại thời gian lưu và diện tích mảnh định lượng của mỗi lần tiêm sắc ký Độ phù hợp hệ thống được biểu thị qua độ lệch chuẩn tương đối RSD(%) của các đáp ứng phân tích
Yêu cầu: RSDThời gian lưu ≤ 2% và RSDDiện tích peak ≤ 2%
Tiến hành so sánh sắc ký đồ của chất phân tích trên 3 mẫu:
- Mẫu trắng: Mẫu TPBVSK không chứa chất phân tích tiến hành xử lý mẫu như quy trình
- Mẫu thêm chuẩn trên nền dạng rắn và lỏng đã lựa chọn: Mẫu trắng được thêm chuẩn và tiến hành xử lý mẫu như quy trình
- Mẫu chuẩn: Dung dịch chuẩn DHEA 5,0 𝜇g/ml
- Sắc kí đồ của mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu dung dịch chuẩn
- Sắc kí đồ của mẫu thêm chuẩn phải có thời gian lưu chất phân tích tương ứng với thời gian lưu chất phân tích ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,1 phút
- Số điểm IP của các ion mẹ và ion con trong mẫu phải có điểm IP≥ 4 (theo tiêu chuẩn của hội đồng châu Âu EU 2021/808 cách tính điểm IP đối với phương pháp LC-MS/MS: mỗi ion mẹ được tính 1 điểm; mỗi ion con được tính 1,5 điểm)
- Tỉ số ion của hai ion con thu được ở mẫu thêm chuẩn phải tương đồng với tỉ số ion ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá theo quy định bảng 2.1
- Độ lệch giữa tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn và mẫu chuẩn được tính bằng công thức:
- Rdiff : độ lệch tương đối
- IRspk : tỉ số ion trong mẫu thêm chuẩn
- IRstd : tỉ số ion trong mẫu chuẩn dung môi
Bảng 2.1 Yêu cầu về độ lệch tương đối (Rdiff%)
Cường độ tương ứng (so với ion chính) (IR) LC-MS/MS
Khoảng tuyến tính của một phương pháp là khoảng nồng độ mà tại đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích Đường chuẩn là đường biểu diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa giá trị đại lượng đo được và nồng độ chất phân tích
Tiến hành xây dựng đường chuẩn bằng cách thêm chuẩn vào dịch chiết mẫu trắng, và dung môi Vẽ đường phụ thuộc giữa tín hiệu chất phân tích (y) vào nồng độ (x): y = ax + b Trong đó:
- b là hệ số chặn (intercept) Độ lệch các điểm nồng độ dùng xây dựng đường chuẩn Sau khi lập đường chuẩn xong cần kiểm tra bằng phương pháp tính ngược lại nồng độ của các điểm chuẩn sử dụng để xây dựng đường chuẩn từ đó tính các giá trị độ chệch theo công thức sau:
- ∆𝑖: Độ chệch của từng điểm chuẩn dùng xây dựng đường chuẩn
- Ct: Nồng độ tính ngược theo đường chuẩn của các điểm
- Cc: Nồng độ của các điểm chuẩn
- ∆ không được vượt quá ±15 % cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20 %
- Đường chuẩn đạt yêu cầu: 0,995 ≤R≤ 1 hay 0,99 ≤R 2 ≤ 1.
2.4.5.4 Độ lặp lại và độ đúng Độ lặp lại là mức độ gần nhau của các giá trị riêng lẻ của phép đo lặp lại Độ lặp lại được biểu thị thông qua độ lệch chuẩn tương đối RSD (%), được tính theo công thức:
- 𝑥𝑖: là nồng độ của lần thử nghiệm thứ i
- 𝑥̅: là nồng độ trung bình tính được của N lần thí nghiệm
Yêu cầu: RSD (%) nằm trong khoảng theo quy định của AOAC trong bảng 2.2 Độ đúng là mức độ gần nhau của giá trị trung bình của kết quả phân tích với giá trị đúng hoặc giá trị được chấp nhận là đúng Độ đúng có thể thực hiện thông qua tính toán độ thu hồi Để xác định độ lặp lại và độ thu hồi của phương pháp, thực hiện thêm chuẩn vào mẫu trắng ở 3 mức nồng độ khác nhau và tính toán kết quả theo công thức: Độ thu hồi (%) = 𝐶𝑡ℎự𝑐
Cthực: là nồng độ chất phân tích có trong mẫu, được tính thông qua đường chuẩn
Cspk: là nồng độ chất phân tích được thêm lý thuyết vào mẫu trắng
Yêu cầu: độ thu hồi (%) nằm trong khoảng theo quy định của AOAC trong bảng 2.3
Bảng 2.2 Độ lặp lại tối đa chấp nhận tại các nồng độ khác nhau (theo AOAC)
TT Hàm lượng (%) Tỷ lệ chất Đơn vị RSD (%)
Bảng 2.3 Quy định về độ thu hồi (theo AOAC)
(%) Tỷ lệ chất Đơn vị Độ thu hồi
2.4.5.5 Độ chính xác trung gian
Tiến hành phân tích 6 lần ở một mức nồng độ thêm chuẩn tương tự độ lặp lại nhưng ở thời gian khác
Yêu cầu: Giá trị RSD (%) kết quả nồng độ xác định theo yêu cầu của AOAC tại bảng
2.4.6 Ứng dụng phương pháp và xử lý kết quả Ứng dụng phương pháp phân tích các mẫu TPBVSK chứa DHEA trên thị trường
Xử lý kết quả trên phần mềm Microsoft Excel và phần mềm Analyst 1.6.2 (AB SCIEX, Mỹ)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Xây dựng phương pháp LC-MS/MS
3.1.1 Khảo sát điều kiện phân tích
3.1.1.1 Khảo sát điều kiện khối phổ
Tiến hành khảo sát tối ưu các mảnh phổ của DHEA bằng kỹ thuật (ESI) với chế độ ion hoá dương Thực hiện tiêm trực tiếp dung dịch chuẩn DHEA 10 𝜇g/ml vào thẳng hệ thống MS chạy ở chế độ Q1 MS (Q1) để xác định ion mẹ, thường cho số khối lớn hơn khối lượng phân tử 1 đơn vị (m/z = M+1) khi ion ở dạng [M-H] +
Sau khi lựa chọn được ion mẹ, chuyển sang chế đọ chạy Product ion (MS2) để khảo sát các điều kiện bắn phá ion mẹ để tạo ion con 6 ion con với cường độ tín hiệu cao nhất được chọn ra để tối ưu các thông năng lượng bắn phá (CE) và thế đầu ra (CXP) Kết quả ion mẹ, mảnh ion con và các thông số CE và CXP tối ưu cho từng mảnh được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1
Hình 3.1 Tín hiệu 6 mảnh ion con có tín hiệu cao nhất
Bảng 3.1 Kết quả và điều kiện tối ưu cho các mảnh của chất phân tích
Ion con (m/z) CE (eV) CXP (V) Ứng dụng
Hình 3.2 Sự hình thành ion mẹ ở dạng [M-H] +
DHEA tạo thành ion mẹ ở dạng [M-H] + có số khối m/z = 289 lớn hơn khối lượng phân tử 1 đơn vị Từ hình 3.1 có 6 mảnh ion con có 3 mảnh có tín hiệu cao nhất là 271,
253, 213 còn lại các mảnh 77, 91, 115 có tín hiệu thấp hơn Nên lựa chọn mảnh 271 định lượng với tín hiệu cao nhất, mảnh 253 và mảnh 213 với tín hiệu thấp hơn định tính Trong đó mảnh 271 ở dạng [M+H–H2O] + , mảnh 253 ở dạng [M+H–2H2O] + [21] Tối ưu các thông số thiết bị: áp suất khí mang (CUR), áp suất khí va chạm (CAD), điện thế ion hoá (IS), nhiệt độ nguồn ion (TEM), áp suất của nguồn khí thứ nhất (GS1), áp suất nguồn khí thứ 2 (GS2), thế cổng vào (EP) Kết quả được trình bày ở bảng 3.2:
Bảng 3.2 Các thông số tối ưu cho thiết bị MS/MS
Ion source gas 1 (GS1) 60 psi
Ion source gas 2 (GS2) 70 psi
3.1.1.2 Khảo sát điều kiện sắc ký lỏng
Lựa chọn cột sắc ký: Dựa vào cấu trúc hoá học của chất phân tích, các tài liệu tham khảo [8], [16], [17], [33] và điều kiện có sẵn của phòng thí nghiệm, cột sắc ký pha đảo XSelect HSS C18 SB (3,5 àm, 2,1 mm ì 100 mm) được sử dụng
Lựa chọn hệ pha động: Pha động trong LC-MS/MS không chỉ đóng vai trò quan trọng việc tách các chất mà nó còn ảnh hưởng đến quá trình ion liên quan đến tín hiệu các chất phân tích Việc sử dụng pha động chứa 10 mM ammonium format hoặc 10 mM ammonium acetat kết hợp với 0,1% axit formic hoặc axit acetic mang lại hiệu quả cao trong việc tăng cường tín hiệu ion hóa, đặc biệt là trong chế độ ion hóa ESI [11] Đặc biệt điều này còn rất quan trọng với DHEA, do cấu trúc của các steroid nói chung không có bất kỳ gốc axit hoặc bazơ cao nào trong cấu trúc của chúng và thường chỉ chứa nhóm ceton (vị trí số 3 hoặc 17 trong vòng steroid) là vị trí có thể tạo ion, do đó việc ion hoá trở nên khó khăn [21], còn đối với DHEA nói riêng (gốc ceton ở vị trí -17-on vòng D)
25 khó ion hoá hơn một số steroid khác (-4-en-3-on vòng A)có nhóm ceton ở vị trí thuận lợi hơn để tạo dạng [M-H] + [9]
Tiến hành tiêm cùng một nồng độ 5,0 𝜇g/ml vào hệ thống sắc ký và khảo sát pha động với thành phần như bảng 3.3 – tham khảo tài liệu [11], [16], [24] và với điều kiện phân tích của phòng thí nghiệm với chương trình gradient theo bảng 3.4
Bảng 3.3 Chương trình khảo sát pha động
2 Đệm HCOONH4 10mM – HCOOH 0,1%/H2O ACN
4 Đệm HCOONH4 10mM – HCOOH 0,1%/H2O MeOH
Thời gian (phút) Pha động A (%tt/tt) Pha động B(%tt/tt)
Sau khi khảo sát 4 pha động thì pha động số 3 Kênh (A) HCOOH 0,1%/H2O – Kênh (B) MeOH cho hình dáng pic cân xứng và tín hiệu cao nhất, có thể nói pha động này giúp quá trình ion hoá DHEA diễn ra thuận lợi hơn Chương trình gradient lựa chọn đảm bảo thời gian lưu của các chất ổn định, hợp lý và đủ dài Kết quả khảo sát pha động được trình bày ở hình 3.3 Điều kiện sắc ký được lựa chọn
- Cột sắc ký pha đảo XSelect HSS C18 SB (3,5 àm, 2,1 mm ì 100 mm)
- Hệ pha động gồm: Kênh (A) HCOOH 0,1%/H2O và Kênh (B) MeOH theo chương trình gradient bảng 3.4
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Thời gian phân tích: 8 phút
Hình 3.3 Sắc ký đồ khảo sát pha động
3.1.2 Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Lấy một sản phẩm trên thị trường có công bố chứa DHEA, ngoài ra còn chứa các thành phần khác như cao dược liệu, vitamin,…
Khảo sát dung môi chiết, số lần chiết, thời gian siêu âm, khảo sát chất làm sạch, lượng chất làm sạch bằng cách lấy một khối lượng mẫu như nhau có đã đồng nhất rồi thực hiện khảo sát các điều kiện nêu trên theo qui trình xử lý mẫu dự kiến sơ đồ hình 2.1
3.1.2.1 Khảo sát dung môi chiết
Qua tham khảo tài liệu [12], [16], [28], [29] khảo sát dung môi chiết trên 3 dung môi
ACN, MeOH:ACN (1:1, v/v), MeOH và thực hiện quy trình xử lý mẫu dự kiến Sau đó phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký lựa chọn ở mục 3.1.1
Kết quả khảo sát được trình bày ở hình 3.4
Hình 3.4 Kết quả khảo sát dung môi chiết
Từ kết quả khảo sát, đáp ứng của chất phân tích với các dung môi chiết là xấp xỉ nhau Tuy nhiên, với các công thức DHEA có chứa các nguyên liệu từ dược liệu, … ACN sẽ hoà tan ít chất ngoại lai hơn so với MeOH [29] Nên lựa chọn dung môi chiết cho quy trình xử lý mẫu là ACN
3.1.2.2 Khảo sát số lần chiết
Sau khi lựa chọn dung môi chiết là ACN và qua tham khảo tài liệu [12], [16], [28], [29] khảo sát lần lượt 1, 2, 3, 4 lần chiết và thực hiện quy trình xử lý mẫu dự kiến Sau đó phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký lựa chọn ở mục 3.1.1
Kết quả khảo sát được trình bày hình 3.5
Từ kết quả khảo sát, ta thấy sau 2 lần chiết lượng chất chiết được cao hơn so với lần
1 và không chênh lệch đáng kể so với chiết 3 lần và chiết 4 lần nên lựa chọn chiết 2 lần để tiết kiệm thời gian và dung môi
Hình 3.5 Kết quả khảo sát số lần chiết 3.1.2.3 Khảo sát thời gian siêu âm
Qua tham khảo tài liệu [12], [28] khảo sát lần lượt thời gian siêu âm tại 5, 10, 20 phút và thực hiện quy trình xử lý mẫu dự kiến Sau đó phân tích các mẫu theo điều kiện sắc ký lựa chọn ở mục 3.1.1
Kết quả khảo sát được trình bày hình 3.6
Hình 3.6 Kết quả khảo sát thời gian siêu âm Đáp ứng của chất phân tích với thời gian chiết là 10 phút cho tín hiệu cao nhất Do đó 10 phút là khoảng thời gian siêu âm được lựa chọn
3.1.2.4 Khảo sát chất làm sạch Ảnh hưởng của nền là một vấn đề thường gặp của các phương pháp khối phổ (như LC-MS) Kỹ thuật LC-MS sử dụng nguồn ESI thường có sự ảnh hưởng của nền do sự tăng hoặc giảm tín hiệu từ việc ức chế hoặc tăng cường ion [3], [16] Đồng thời các công
29 thức hiện có của DHEA có thể bao gồm nó như một thành phần hoạt chất duy nhất hoặc có thể kết hợp với các chất bổ sung steroid hoặc vitamin khác, cao dược liệu, các thành phần chiết xuất từ dược liệu [29] Một trong những cách giảm ảnh hưởng của nền là: sử dụng ít mẫu hơn, sử dụng các kỹ thuật làm sạch mẫu (LLE, SPE,…) [3], [16], [33] Hơn nữa DHEA cũng là một chất khó ion hoá như đã nêu bên trên [9], [21] Việc sử d-SPE còn giúp làm sạch mẫu bảo vệ cột sắc ký và nguồn ion MS, làm giàu mẫu
Thẩm định phương pháp phân tích
3.2.1 Độ phù hợp hệ thống
Tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn DHEA 5,0 𝜇g/ml vào hệ thống phân tích theo điều kiện đã chọn ở mục 3.1.1
Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic Kết quả được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả độ phù hợp hệ thống
STT Diện tích peak (×10 7 ) Thời gian lưu t R (phút)
RSD của thời gian lưu của DHEA là 0,12% (< 2%), RSD của diện tích pic của DHEA là 1,23% (< 2%) Đạt yêu cầu về độ phù hợp hệ thống
Tiến hành chuẩn bị các dung dịch và phân tích theo điều kiện đã chọn ở mục 3.1.1
- Mẫu dung dịch chuẩn nồng độ 5,0 𝜇g/ml
- Mẫu trắng nền rắn, lỏng : Cân 0,5 g nền mẫu rắn, lỏng sau đó tiến hành xử lý mẫu như hình 3.9
- Mẫu thêm chuẩn 5 𝜇g/ml vào nền rắn, lỏng: Thêm 5ml dung dịch chuẩn gốc 400 𝜇g/ml vào 0,5 g nền mẫu rắn, lỏng tiến hành xử lý mẫu và phân tích như hình 3.9 Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic mẫu trắng trên nền mẫu rắn, lỏng, mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn trên nền rắn, lỏng
Kết quả được trình bày ở hình 3.10
Hình 3.10 Sắc ký đồ của mẫu trắng trên nền rắn, lỏng; mẫu chuẩn; mẫu thêm chuẩn trên nền rắn, lỏng
Tỉ số ion (IR) và độ lệch (% Rdiif) giữa tỉ lệ ion mẫu thêm chuẩn trên nền mẫu và mẫu chuẩn trong dung môi được trình bày ở bảng 3.8
Bảng 3.8 Bảng so sánh tỉ số ion
Dung môi Nền rắn Nền lỏng Yêu cầu
- Sắc kí đồ của mẫu trắng không xuất hiện tín hiệu chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu dung dịch chuẩn
Mẫu thêm chuẩn nền rắn
Mẫu thêm chuẩn nền lỏng
- Thời gian lưu chất phân tích ở mẫu thêm chuẩn tương ứng với thời gian lưu chất phân tích ở mẫu chuẩn hoặc chênh lệch không quá 0,1 phút
- Chất phân tích có 1 ion mẹ và 2 ion con đạt số điểm IP = 5 ≥ 4, tỉ số ion của hai ion con thu được ở mẫu thêm chuẩn ở nền rắn và lỏng tương đồng với mẫu chuẩn, chêch lệch (-5,66%) nền rắn và (-6,72%) đạt yêu cầu phân tích theo hội đồng Châu Âu
- Phương pháp có độ đặc hiệu cao
Tiến hành phân tích dãy đường chuẩn 2,5 𝜇g/ml; 3,0 𝜇g/ml; 4,0 𝜇g/ml; 5,0 𝜇g/ml; 6,0 𝜇g/ml; 7,5 𝜇g/ml, mỗi nồng độ tiến hành chạy lặp 3 lần theo điều kiện đã chọn ở mục 3.1.1
Ghi lại sắc ký đồ, thời gian lưu và diện tích pic của các dung dịch chuẩn trên
Kết quả được thể hiện ở hình 3.11, bảng 3.9
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của DHEA Bảng 3.9 Độ chệch các điểm chuẩn
Nồng độ tìm lại (𝝁g/ml) Độ chệch
35 Đường chuẩn cho thấy mối tương quan chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích pic của DHEA với hệ số tương quan R = 0,9985 (0,995 ≤R≤ 1) và độ chệch các điểm nồng độ trên đường chuẩn đều