đặng thành vinh nghiên cứu xây dựng mô hình dược động học sinh lý và ứng dụng bào chế thuốc giải phóng kéo dài chứa l tetrahydropalmatin

L-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2024

L-TETRAHYDROPALMATIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

Người hướng dẫn:

1 TS Nguyễn Trần Linh 2 NCS Phạm Thị Phương Dung

Nơi thực hiện:

1 Bộ môn Bào chế 2 Viện KN ATVSTPQG

HÀ NỘI - 2024

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên, em xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Trần Linh và NCS Phạm

Thị Phương Dung đã tận tình hướng dẫn, luôn đồng hành và chỉ bảo em từ những điều

nhỏ nhặt nhất, giúp em trang bị và bổ sung kiến thức, quan tâm và giúp đỡ em trong suốt quá trình nghiên cứu tại bộ môn và làm khóa luận tốt nghiệp

Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Thạch Tùng, thầy đã

luôn động viên, trao cho em niềm đam mê nghiên cứu, giúp em tích lũy kĩ năng cần thiết cho quá trình thực nghiệm khoa học Định hướng tư duy khoa học của thầy là hành trang quý báu cho em trong những chặng đường tiếp theo

Em xin được gửi lời cảm ơn tới DS Trần Trung Thành và toàn thể các anh chị

đang công tác tại Viện Kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm Quốc gia đã hết mình tạo điều kiện về cơ sở vật chất, máy móc và nguyên vật liệu để em thực hiện đề tài này

Em xin được cảm ơn đến tất cả các thầy cô, các anh chị kỹ thuật viên trong Bộ môn Bào chế đã luôn tạo điều kiện để em được thực hiện và hoàn thành khóa luận tại bộ môn

Em xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu và các thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội đã truyền đạt cho em nhiều kiến thức quý báu trong suốt thời gian em học tập tại trường

Xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn K74 và các em K75 trong nhóm nghiên cứu của thầy Thạch Tùng đã giúp đỡ em trong quá trình làm khóa luận

Cuối cùng, em xin bày tỏ lòng biết ơn tới gia đình, bạn bè đã luôn sát cánh, quan tâm, động viên và giúp đỡ em trong suốt thời gian qua

Hà Nội, tháng 06 năm 2024

Sinh viên

Đặng Thành Vinh

MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮTDANH MỤC CÁC BẢNG

1.1.4 Chỉ định và tác dụng không mong muốn 3

1.1.5 Một số chế phẩm chứa l-tetrahydropalmatin trên thị trường 3

1.1.6 Một số nghiên cứu bào chế viên giải phóng kéo dài chứa l-THP 4

1.2 Tổng quan về mô hình dược động học sinh lý 4

1.2.1 Khái niệm 4

1.2.2 Mô hình dược động học sinh lý toàn thân (Whole-body) 5

1.2.3 Mô hình hấp thu sinh lý 7

1.3 Các phương pháp - phần mềm xây dựng mô hình dược động học sinh lý 9

1.3.1 Phương pháp xây dựng mô hình 9

1.3.2 Các phần mềm dùng để xây dựng mô hình dược động học sinh lý 10

1.3.3 Một số nghiên cứu về mô hình dược động học sinh lý 10

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12

2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị 12

2.1.1 Nguyên vật liệu 12

2.1.2 Thiết bị 12

2.2 Nội dung nghiên cứu 13

2.2.1 Nghiên cứu xây dựng mô hình dược động học sinh lý của thuốc chứa l-THP 13

2.2.2 Ứng dụng mô hình đã xây dựng được để xây dựng công thức bào chế thuốc giải phóng kéo dài chứa l-THP 13

2.3 Phương pháp nghiên cứu 13

2.3.1 Phương pháp bào chế 13

2.3.2 Phương pháp đánh giá 14

2.3.3 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng thuốc đường uống 15

2.3.4 Phương pháp xây dựng mô hình dược động học sinh lý của thuốc chứa l-THP 17

2.3.5 Tối ưu hóa công thức viên giải phóng kéo dài chứa l-THP 22

3.2 Đánh giá sinh khả dụng in vivo trên chó 25

3.3 Đánh giá độ hòa tan in vitro của các viên kiểm soát giải phóng và viên kết dính sinh học bằng phương pháp thử hòa tan tối ưu 26

3.4 Xây dựng mô hình dược động học sinh lý trên chó 26

3.4.1 Xây dựng mô hình toàn cơ thể 26

3.4.2 Xây dựng mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa (ACAT) 29

3.5 Tối ưu hóa công thức chế phẩm giải phóng kéo dài chứa l-THP 39

3.5.1 Đánh giá độ hòa tan in vitro của các công thức khảo sát 39

3.5.2 Thiết kế thí nghiệm 39

3.5.3 Đánh giá kết quả phân tích thí nghiệm và tối ưu hóa 40

3.5.4 Bào chế công thức viên tối ưu và đánh giá lại về kết quả 41

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACAT Mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa

(Advanced Compartmental Absorption and Transit model)

ADME Quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ của thuốc

(Absorption, Distribution, Metabolism, and Excretion) AUC Diện tích dưới đường cong nồng độ theo thời gian

(Area under curve) AUC0-inf

Diện tích dưới đường cong nồng độ từ thời điểm 0 đến thời điểm vô cùng

AUC0-t Diện tích dưới đường cong nồng độ từ thời điểm 0 đến thời điểm t CAT Mô hình ngăn mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa

(Compartmental Absorption and Transit model)

GPKD Giải phóng kéo dài

HPMC Hydroxypropyl methyl cellulose IR Giải phóng ngay (Immediate Release) IV Tiêm tĩnh mạch (Intravenous)

IVIVC Tương quan in vitro – in vivo

(In Vitro – In Vivo Correlation)

Kp Hệ số phân bố thuốc vào mô KSGP Kiểm soát giải phóng

(Polyacrylat trung tính hóa một phần) PopPK Phân tích dược động học của quần thể

(Population Pharmacokinetic Analysis) PSA Phân tích độ nhạy của các thông số

(Parameter sensitivity analysis) PStc Tính thấm của thuốc trên 1 đơn vị diện tích

(Permeability: Surface area for current drug and tissue)

SolFactor Hệ số hòa tan

(Solubility factor) St Trans time Thời gian di chuyển thuốc tại dạ dày

(Stomach Transition time) T1/2

Thời gian cần thiết để nồng độ thuốc trong huyết tương giảm xuống còn một nửa (50%)

TCNSX Tiêu chuẩn nhà sản xuất Tmax

Thời điểm dược chất đạt nồng độ tối đa trong huyết tương (Time to peak drug concentration)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu 12

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 12

Bảng 2.3 Thành phần của viên nén giải phóng ngay - IR 10 mg 13

Bảng 2.4 Chương trình dung môi của phương pháp LC-MS/MS 17

Bảng 2.5 Độ tan của l-THP trong các điều kiện pH khác nhau 17

Bảng 2.6 Thông số đầu vào phần mềm GastroPlus 19

Bảng 3.1 Thông số dược động học trung bình của viên IR và viên PNP 25

Bảng 3.2 Thông số của mô hình cơ thể chó sinh lý mặc định 27

Bảng 3.3 Các thông số phân bố và thải trừ của gan, thận sau khi được tối ưu bằng dữ liệu SKD của chế phẩm tiêm tĩnh mạch IV 28

Bảng 3.4 Giá trị AUC và Cmax tính toán được sau khi mô phỏng dữ liệu SKD của viên IR với mô hình toàn cơ thể 30

Bảng 3.5 Các thông số FPE Gut và Peff sau khi được tối ưu 31

Bảng 3.6 Giá trị AUC, Cmax của viên IR tính toán được sau khi mô phỏng với 32

Bảng 3.7 Giá trị AUC, Cmax của viên FR tính toán được sau khi mô phỏng với mô hình ACAT ban đầu 33

Bảng 3.8 Các thông số FPE Gut và Peff sau khi được tối ưu 34

Bảng 3.9 Giá trị AUC, Cmax của viên FR sau khi mô phỏng với mô hình tối ưu 35

Bảng 3.10 Giá trị AUC, Cmax của viên MR tính toán được sau khi mô phỏng 35

Bảng 3.11 Giá trị AUC, Cmax của viên SR tính toán được sau khi mô phỏng 36

Bảng 3.12 Giá trị AUC, Cmax của viên PNP tính toán sau khi mô phỏng 36

Bảng 3.13 Các thông số FPE Gut và St Trans time sau khi được tối ưu 38

Bảng 3.14 Giá trị AUC, Cmax của viên PNP 38

Bảng 3.15 Bảng thiết kế thí nghiệm 40

Bảng 3.16 Trọng số của hàm hy vọng riêng 41

DANH MỤC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của l-tetrahydropalmatin [33] 2

Hình 1.2 Mô hình dược động học sinh lý (mũi tên xanh thể hiện đường đi của huyết tương, mũi tên đỏ là đường đi của hệ bạch huyết) [40] 5

Hình 1.3 Mô hình Mô hạn chế tưới máu (perfusion limited tissue) [40] 6

Hình 1.4 Mô hình Mô hạn chế tính thấm (permeability limited) [40] 7

Hình 1.5 Quá trình hấp thu dược chất ở đường tiêu hóa [16] 7

Hình 1.6 Mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa ACAT [40] 8

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xây dựng mô hình PBPK 21

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ l-THP trong môi trường methanol 23

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ l-THP trong môi trường acid hydrocloric pH 1,2 24

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích píc chất chuẩn trên diện tích píc nội chuẩn của l-THP bằng phương pháp LC-MS/MS 24

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn nồng độ l-THP trong huyết tương chó theo thời gian của chế phẩm IV, viên IR, viên PNP, viên FR, viên MR, viên SR (n = 6, TB ± SE) 25

Hình 3.5 Đồ thị giải phóng dược chất theo thời gian của viên FR, MR, SR, PNP (n=3, TB, %) 26

Hình 3.6 Đồ thị mô phỏng dữ liệu SKD của chế phẩm IV bằng mô hình chó sinh lý mặc định (dạng log và semi-log) (đường: mô phỏng, điểm: thực tế) 27

Hình 3.7 Mức độ ảnh hưởng của các thông số phân bố và thải trừ của gan, thận đến AUC0-t và AUC0-inf của chế phẩm tiêm tĩnh mạch 28

Hình 3.8 Đồ thị mô phỏng dữ liệu SKD của chế phẩm IV với thông số ở gan, thận đã được tối ưu (dạng log và semi-log) 29

Hình 3.9 Đồ thị mô phỏng dữ liệu SKD của viên IR với mô hình toàn cơ thể ban đầu (dạng thường và dạng semi-log) 30

Hình 3.10 Mức độ ảnh hưởng của thông số Phần trăm chuyển hóa thuốc lần đầu tại ruột và Tính thấm hiệu dụng đến AUC0-t, AUC0-inf và Cmax của viên IR 31

Hình 3.11 Đồ thị mô phỏng dữ liệu SKD của viên FR với mô hình ACAT ban đầu (dạng log và semi-log) 33

Hình 3.12 Mức độ ảnh hưởng của thông số Phần trăm chuyển hóa thuốc lần đầu tại ruột và Tính thấm hiệu dụng của thuốc đến AUC0-t, AUC0-inf và Cmax của viên FR 34

Hình 3.13 Đồ thị mô phỏng dữ liệu SKD của viên PNP với mô hình PBPK của viên FR (dạng log và semi-log) 37

Hình 3.14 Mức độ ảnh hưởng của thông số Phần trăm chuyển hóa thuốc tại ruột và Thời

gian di chuyển thuốc tại dạ dày ảnh hưởng đến AUC, Tmax của viên PNP 37

Hình 3.15 Kết quả lựa chọn công thức viên giải phóng kéo dài tối ưu 41

Hình 3.16 Đồ thị giải phóng dược chất theo thời gian của viên tối ưu (n=3, TB) 42

Hình 3.17 Đồ thị mô phỏng dự đoán dữ liệu SKD của viên tối ưu 42

ĐẶT VẤN ĐỀ

l-Tetrahydropalmatin (l-THP) hay còn gọi là rotundin - một loại alkaloid tự nhiên,

được chiết xuất từ các loài thuộc chi Stephania và Corydalis và thường được sử dụng làm thuốc giảm đau, giải lo âu và an thần [46] l-THP là chất đối kháng thụ thể dopamin và đã được chứng minh tiềm năng trong điều trị cai nghiện [17], [64] Tuy nhiên tác dụng ngắn, chuyển hóa nhanh, sinh khả dụng thấp [58] nên phải sử dụng nhiều lần để mang lại hiệu quả điều trị Kèm theo tác dụng gây ra phụ thuộc vào liều nên điều quan trọng trong quá trình phát triển các chế phẩm chứa l-THP là cần phải xác định được nồng độ thuốc trong huyết tương để đảm bảo tác dụng dược lý mong muốn, đồng thời thiết kế các dạng chế phẩm giải phóng kéo dài để dễ kiểm soát hơn, tránh nồng độ l-THP vượt quá ngưỡng nồng độ tối đa an toàn

Để thực hiện mục tiêu đó, trong những năm gần đây, mô hình dược động học sinh lý - PBPK (Physiologically based pharmacokinetics) được sử dụng như là một phương pháp hữu ích giúp mô tả tương đối chính xác quá trình dược động học hấp thu của thuốc theo từng cơ quan trong cơ thể Mô hình dược động học sinh lý PBPK đã được nghiên cứu và phát triển để dự đoán quá trình hấp thu thuốc [28], hỗ trợ phát triển công thức [65] và được ứng dụng trong lâm sàng [56], [60],… Mô hình PBPK dự đoán quá trình động học của thuốc dựa trên các đặc tính, dạng bào chế, các yếu tố sinh lý trên đường hấp thu thuốc Do đó, mô hình PBPK có thể được sử dụng như một công cụ đánh giá rủi ro trong quá trình phát triển công thức bào chế

Xuất phát từ thực tiễn trên, tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng mô

hình dược động học sinh lý và ứng dụng bào chế thuốc giải phóng kéo dài chứa l-tetrahydropalmatin” được thực hiện với các mục tiêu:

1) Xây dựng được mô hình dược động học sinh lý mô phỏng quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hóa, thải trừ l-THP từ viên giải phóng kiểm soát

2) Ứng dụng mô hình đã xây dựng để tối ưu hóa công thức bào chế thuốc giải phóng kéo dài chứa l-THP

2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về l-tetrahydropalmatin

1.1.1 Công thức cấu tạo, tính chất lý hóa

1.1.1.1 Công thức cấu tạo

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của l-tetrahydropalmatin [33]

- Cảm quan: Tinh thể màu trắng hay hơi vàng, không mùi, không vị, bị chuyển thành màu vàng khi tiếp xúc với ánh sáng hoặc nhiệt [1]

- Độ tan: Tan tốt trong cloroform, hơi tan trong ethanol và ether, không tan trong nước, dễ tan trong acid sulfuric loãng [1]

- Nhiệt độ nóng chảy: 141 – 144˚C [1] - LogP = 3,09

Nam Châu Á (Ấn Độ, Việt Nam, Lào, Campuchia) [63]

3 Trong tự nhiên, tetrahydropalmatin tồn tại ở cả hai dạng đồng phân đối quang d và l Đồng phân l đã được chứng minh rằng có hiệu quả mạnh hơn đồng phân d trong việc đối kháng receptor dopamin, dẫn đến các tác dụng dược lý như an thần, giảm đau và làm giãn cơ trơn với mức độ mạnh hơn so với đồng phân d [27]

1.1.3 Tác dụng dược lý

l-Tetrahydropalmatin có tác dụng an thần, gây ngủ được chứng minh là có liên

quan đến tính đối kháng của thuốc trên hệ dopaminergic, cụ thể trên các receptor D1, D2

và D3 của dopamin với tác dụng đối kháng giảm dần theo thứ tự tương ứng [62] Yan Du và cộng sự (2017) đã chỉ ra ở chuột liều 20mg/kg l-THP dùng đồng thời với ketamin trong quá trình điều hòa đã ức chế sự thu nhận CPP do ketamin gây ra Hơn nữa, ở mức liều này l-THP đã ngăn chặn quá trình phosphoryl hóa tăng cường ERK và CREB trong CPu và Hip Kết quả này cho thấy l-THP có tác dụng điều trị tiềm năng đối với CPP do ketamine gây ra, ứng dụng l-THP để điều trị chứng nghiện ketamin [18]

Trong nghiên cứu của Lian Liu [29] đã chỉ ra việc tiếp xúc với methamphetamin (METH) dẫn đến hành vi tìm kiếm và sử dụng ma túy bắt buộc, cuối cùng là nghiện METH và nhiễm độc thần kinh l-THP có tác dụng ức chế tỷ lệ mắc, duy trì và tái nghiện METH thông qua việc tăng cường độ dẻo dai và chức năng của các tế bào thần kinh Do đó, l-THP có tiềm năng trở thành một thuốc điều trị quan trọng cho nghiện METH và nhiễm độc thần kinh

Ngoài ra, l-THP còn được chỉ ra tác dụng ức chế chứng nghiện nicotin bằng cách ngăn chặn các chức năng của tế bào thần kinh α4β2-nAChR và tăng nồng độ dopamin ngoại bào trong vỏ nhân não, giảm nicotin hấp thu và ngăn ngừa tái phát [20], [25]

1.1.4 Chỉ định và tác dụng không mong muốn

- Điều trị chứng lo âu, mất ngủ với mức liều 30 – 90 mg [2] - Điều trị giảm đau như: đau nhức đầu, đau dây thần kinh, đau do loét hành tá tràng với mức liều 60 – 120 mg [2]

- Hỗ trợ điều trị cai nghiện nhóm opioid [64] - Tác dụng không mong muốn: Bệnh nhân sử dụng liều 300 mg/24 giờ có những biến đổi về điện tim, mức liều cao hơn có thể gây ra những triệu chứng như giảm ý thức dẫn đến hôn mê, thở yếu, viêm phổi do sặc, hạ huyết áp, buồn nôn, nôn [2]

1.1.5 Một số chế phẩm chứa l-tetrahydropalmatin trên thị trường

- Rotunda (Dược phẩm TW 2 - Dopharma), Rudexen (Mediplantex), Rotundin 30 (Donaipharm): viên nén 30 mg, hộp 10 vỉ x 10 viên

- Stilux - 60 (Traphaco): viên nén 60 mg, hộp 10 vỉ x 10 viên - Rotundin sulfat (Pharbaco): ống tiêm 60 mg/2 ml, hộp 10 – 50 ống tiêm

4

1.1.6 Một số nghiên cứu bào chế viên giải phóng kéo dài chứa l-THP

Thuốc giải phóng kéo dài có nhiều ưu điểm như duy trì nồng độ dược chất trong khoảng điều trị, đảm bảo tuân thủ và nâng cao hiệu quả điều trị, đặc biệt đối với bệnh nhân mạn tính phải điều trị dài ngày Tuy nhiên, thuốc cũng có nhược điểm như không thải trừ ngay khỏi cơ thể khi bị ngộ độc, bào chế phức tạp, giải phóng dược chất trong đường tiêu hóa phụ thuộc nhiều yếu tố khác nhau nên nếu sai sót trong kĩ thuật bào chế hay những thay đổi sinh học cá thể đều có thể dẫn đến thất bại điều trị Do đó, không phải dược chất nào cũng có thể bào chế dạng giải phóng kéo dài [5]

Như đã đề cập, l-THP là dược chất tiềm năng có nhiều tác dụng dược lý khác nhau [17] với tốc độ hấp thu nhanh nhưng mức độ hấp thu lại rất thấp [3], [6], đồng thời tác dụng của thuốc còn phụ thuộc vào mức liều sử dụng nên đây là bất lợi trong sử dụng thuốc của các bệnh mạn tính Hiện nay, trên thế giới chưa có nhiều nghiên cứu về thuốc giải phóng kéo dài chứa l-THP, có thể do có nguồn gốc thiên nhiên nên chỉ phổ biến ở một số quốc gia, cũng có thể do đặc điểm sinh dược học của l-THP đòi hỏi kĩ thuật bào chế phức tạp hơn trong thiết kế dạng thuốc giải phóng kéo dài (ER)

Tại Việt Nam, Đỗ Thị Hà và cộng sự (2019) đã bào chế viên nén dạng cốt thân nước chứa rotundin sulfat giải phóng kéo dài bằng phương pháp tạo hạt ướt Sử dụng phần mềm MODDE 8.0 để thiết kế thí nghiệm, đánh giá yếu tố ảnh hưởng và tối ưu hóa công thức bằng FormRules v2.0 và INForm v3.1 để chọn công thức tối ưu bào chế viên nén rotundin sulfat giải phóng kéo dài 8 giờ [4] Nguyễn Như Nam (2021) và cộng sự đã bào chế pellet giải phóng kéo dài chứa hệ phân tán rắn chứa l-THP bằng phương pháp đùn tạo cầu và lựa chọn được công thức tối ưu bằng phần mềm MODDE 12.0 [7]

1.2 Tổng quan về mô hình dược động học sinh lý 1.2.1 Khái niệm

Theo FDA, phân tích dược động học sinh lý (PBPK) là sử dụng các mô hình và mô phỏng kết hợp với đặc tính sinh lý học, quần thể và tính chất thuốc để mô tả dược động học (PK) và/hoặc dược lực học (PD) của thuốc Các mô hình PBPK dự đoán được sử dụng để hỗ trợ đưa ra quyết định thực hiện một nghiên cứu lâm sàng, cách tiến hành và thời gian thực hiện cũng như đưa ra liều khuyến cáo trên nhãn của sản phẩm [21]

Theo EMA, mô hình dược động học sinh lý (PBPK) là mô hình toán học mô phỏng nồng độ thuốc trong máu và tại các mô theo thời gian, thông qua tính tốc độ hấp thu, phân bố, chuyển hóa và thải trừ thuốc khỏi cơ thể (ADME) trên cơ sở sự ảnh hưởng giữa các yếu tố sinh lý, hóa lý và sinh hóa [19]

Hiện nay trong đăng ký thuốc, mô hình PBPK được ứng dụng chủ yếu để dự đoán một cách định tính và định lượng tương tác thuốc (DDI) [32], xác định liều khởi đầu của thử nghiệm lâm sàng trên người Tuy nhiên, người ta hy vọng rằng việc sử dụng mô hình PBPK sẽ tăng lên và sớm được coi như bằng chứng bổ sung cho thực nghiệm [19]

5

1.2.2 Mô hình dược động học sinh lý toàn thân (Whole-body)

Mô hình PBPK toàn thân giúp mô phỏng nồng độ thuốc trong cơ thể theo thời gian bằng cách mô tả quá trình hấp thu, phân phối và thải trừ trong điều kiện sinh lý của các cơ quan Các mô tả này được xây dựng dựa trên đặc tính của thuốc như tính chất hóa lý: logP, pKa, độ tan, tính thấm, mức độ liên kết với protein huyết tương, độ thanh thải… và được tích hợp trong một mô hình sinh lý chung Cấu trúc chung của mô hình PBPK

toàn thân mô tả sự kết nối giữa các cơ quan được thể hiện ở Hình 1.2 [40]

Hình 1.2 Mô hình dược động học sinh lý (mũi tên xanh thể hiện đường đi của huyết tương, mũi tên đỏ là đường đi của hệ bạch huyết) [40]

Mô hình PBPK toàn thân thường gồm nhiều ngăn trong đó cơ quan như não (brain), phổi (lung), tim (heart), dạ dày (stomach), lá lách (spleen), tuyến tụy (pancreas), ruột (gut), gan (liver), thận (kidney) và tuyến giáp (thymus), da (skin), cơ (muscle), xương (bone), mô mỡ (adipose) được biểu diễn dưới dạng các ngăn và liên kết với nhau bởi ngăn động mạch (arterial blood), ngăn tĩnh mạch (venous blood) và hệ bạch huyết Mỗi cơ quan này lại được chia thành ba ngăn chính đại diện cho không gian mạch máu, nội sinh và vùng kẽ Không gian nội sinh lại tiếp tục được chia thành ba ngăn nhỏ hơn Mỗi ngăn được đặc trưng bởi tốc độ tưới máu (blood flow), thể tích (volume) và hệ số

phân bố thuốc vào mô Kp,… [40]

6 Tùy thuộc vào đặc tính của dược chất mà các ngăn kể trên sẽ được thiết lập ở chế độ khác nhau là hạn chế tưới máu (perfusion-limited) hay hạn chế thấm (permeability limited) sao cho mô phỏng một cách chính xác nhất quá trình hấp thu [40]

Chế độ hạn chế tưới máu (perfusion-limited): Với các dược chất có tính thấm cao, lượng thuốc phân bố vào mô bị hạn chế bởi tốc độ tưới máu đến mô và lượng thuốc tại mô ở mỗi thời điểm được biểu thị bằng hệ số phân bố Kp và có thể ước tính từ các đặc tính lý hóa như logP, pKa, tỷ lệ nồng độ máu/ huyết tương,

Hình 1.3 Mô hình Mô hạn chế tưới máu (perfusion limited tissue) [40]

Trong đó Cbi, Cbo là nồng độ thuốc vào (động mạch) và ra (tĩnh mạch) mô; Rbp là tỷ lệ nồng độ thuốc máu/huyết tương; Kp là hệ số phân bố thuốc mô/ huyết tương; Vv, Vt là thể tích huyết tương và mô; Cv, Ct là nồng độ thuốc ở huyết tương và mô; fut và fup là tỷ lệ thuốc ở dạng tự do ở mô và huyết tương; CLint là độ thanh thải của mô

Với các mô hạn chế tưới máu và không thải trừ thuốc, lượng thuốc thay đổi ở mô bằng tích của lưu lượng máu mô với chênh lệch nồng độ dược chất ở ngăn động

mạch và ngăn tĩnh mạch (Phương trình (1)) Nồng độ thuốc trong máu tĩnh mạch được

biểu thị bằng tỷ lệ giữa nồng độ dược chất ở mô sau khi hiệu chỉnh với tỷ lệ liên kết hồng cầu chia cho hệ số phân bố mô/ huyết tương Qua đó khi Kp tăng, nồng độ thuốc rời khỏi mô (Cbo) trong máu giảm khiến thuốc tích tụ nhiều hơn trong mô

𝑉𝑡𝑑𝐶𝑡

𝑑𝑡 = 𝑄 (𝐶𝑏𝑖 − 𝐶𝑡 𝑥 𝑅𝑏𝑝

𝐾𝑝 ) (1)

Với các mô hạn chế tưới máu có thải trừ thuốc, phương trình cần được bổ sung

thêm CLint (L/h) - độ thanh thải nội tại của dược chất dạng tự do ở mô (Phương trình (2)) Độ thanh thải nội tại này góp vào độ thanh thải toàn thân và giá trị tối đa là bằng

với lưu lượng máu tới mô [33] 𝑉𝑡𝑑𝐶𝑡

7 vào khoang nội bào Ngoài thấm thụ động, với các dược chất vận chuyển bằng chất mang, quá trình này còn bị ảnh hưởng bởi sự bão hòa chất vận chuyển [40]

Hình 1.4 Mô hình Mô hạn chế tính thấm (permeability limited) [40]

Trong đó Ve, Ce là thể tích và nồng độ dược chất ở khoang ngoại bào; Vv và Cv là thể tích và nồng độ dược chất ở khoang huyết tương trong mô; Vt và Ct là thể tích và nồng độ dược chất ở khoang nội bào; PSct là tích của tính thấm và diện tích bề mặt của mô; Vm và Km là hằng số tốc độ tối đa và bằng ½ tốc độ tối đa Michaelis – Menten

1.2.3 Mô hình hấp thu sinh lý

Trong mô hình hấp thu sinh lý, các con đường đưa thuốc (như tĩnh mạch, tiêu hóa, hô hấp, mắt, da, …) sẽ được chia nhỏ thành các ngăn để mô phỏng lại quá trình ADME của thuốc, trong đó phổ biến nhất là đưa thuốc qua đường tiêu hóa Quá trình hấp thu thuốc từ đường tiêu hóa chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau như sinh lý, đặc điểm của thuốc Quá trình hấp thu thuốc ở đường tiêu hóa được minh họa dưới đây:

Hình 1.5 Quá trình hấp thu dược chất ở đường tiêu hóa [16]

Trong đó: CM: vận chuyển qua trung gian chất mang; F: sinh khả dụng, fa: phần thuốc

qua mô mỡ (passive lipoidal diffusion); PPD: hệ số khuếch tán thụ động qua biểu mô tế bào (passive paracellular diffusion)

Đầu tiên, dạng bào chế của thuốc cần phải rã để giải phóng các phân tử dược chất và hòa tan trong dịch tiêu hóa Chỉ có phần dược chất ở dạng hòa tan thì mới được hấp thu, độ hòa tan của dược chất ở ruột phải đủ cao để có tốc độ hòa tan đủ nhanh Phần thuốc tự do tạo ra một gradient nồng độ giữa lòng ruột và máu, gradient này là động lực

8 cho thuốc thấm qua Tính thấm là đại diện cho sự vận chuyển thuốc qua màng, hàng rào màng sẽ giới hạn tốc độ vận chuyển

Nồng độ thuốc tự do trong lòng ruột giảm có thể do thuốc bị kết tủa/ phân hủy bởi enzym (CYP 3A4, CYP 2D6, CYP 2C9…) hoặc tạo thành phức hợp với các chất trong lòng ruột Ngoài ra, trên màng tế bào ruột có P-gp là bơm vận chuyển ngược thuốc trở lại lòng ruột nên làm giảm hấp thu

Các phân tử thuốc được coi là hấp thu sau khi được vận chuyển qua màng phospholipid (ngăn các phân tử lớn và phân tử ưa nước đi qua) Cuối cùng, trước khi được hấp thu, thuốc được đưa vào tuần hoàn chung rồi đổ vào tĩnh mạch cửa gan Ở gan, thuốc có thể bị chuyển hóa mất tác dụng hoặc bài tiết về ruột theo đường mật [16] Mô hình PBPK đầu tiên là mô hình ngăn mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa – CAT (Compartmental Absorption and Transit model) [48] gồm thông tin dược chất, công thức bào chế, yếu tố sinh lý để dự đoán hấp thu thuốc qua đường uống Tuy nhiên, mô hình không xét đến sự hấp thu ở dạ dày và đại tràng, không có quá trình hòa tan/ giải phóng có kiểm soát, chưa có độ tan phụ thuộc vào pH, … nên mô hình chỉ có giá trị với thuốc mà quá trình hấp thu không bị giới hạn bởi hòa tan [40] Do đó, mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa - ACAT (Advanced Compartmental Absorption and Transit model) ra đời [47], [34] tính đến cả sự thay đổi độ tan theo pH, hấp thu thuốc ở dạ dày và đại tràng,… nên thường được sử dụng Mô hình ACAT được mô tả dưới đây:

Hình 1.6 Mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa ACAT [40]

Mỗi mũi tên đại diện cho một quá trình và được mô tả bằng một phương trình vi phân

Trong mô hình ACAT, đường tiêu hóa được chia thành 9 ngăn, mỗi ngăn lại được chia nhỏ thành bốn ngăn phụ: chưa giải phóng (unreleased), chưa hòa tan (undissolved), hòa tan (dissolved) và tế bào ruột (enterocyte) ứng với lượng dược chất chưa giải phóng, đã giải phóng nhưng chưa hòa tan và dược chất đã hòa tan Chỉ có dược chất dạng hòa tan mới bị phân hủy trong lòng ruột, hấp thu, chuyển hóa, bơm ngược trở lại ruột Dược chất ở dạng chưa giải phóng và chưa hòa tan có thể di chuyển xuống các ngăn phía dưới

9 tùy thuộc vào dạng bào chế (như với dạng thuốc giải phóng tại dạ dày, toàn bộ lượng dược chất chưa giải phóng sẽ nằm tại dạ dày cho tới khi giải phóng hết) [40]

Mô hình ACAT tích hợp nhiều thông tin: - Yếu tố thuộc về sinh lý đường tiêu hóa: pH, thời gian vận chuyển qua các ngăn, chiều dài – bán kính, nồng độ muối mật, … đặc biệt còn được chia theo đặc điểm: loài (người, khỉ, chó beagle, chuột, …), giới tính (nam, nữ), tuổi và trọng lượng cơ thể…

- Yếu tố thuộc về dược chất: độ tan, tính thấm, pKa, logP, bị chuyển hóa bởi enzym, … có thể dự đoán bằng phần mềm từ công thức cấu tạo hoặc tham khảo từ các nghiên cứu, thực nghiệm

- Yếu tố thuộc về dạng bào chế: dạng thuốc (dung dịch, hỗn dịch, viên nén giải

phóng có kiểm soát…), độ hòa tan, tốc độ hòa tan, kích thước tiểu phân của dược chất…

- Yếu tố thuộc về dược động học: con đường hấp thu, tỷ lệ dược chất dạng tự do, hệ số phân bố, phần trăm thuốc bị phân hủy ở ruột, hoạt động của P-gp, chuyển hóa thuốc bởi enzym, …

Các thông tin trên ảnh hưởng đến mức độ chính xác của kết quả dự đoán từ mô hình Ngoài ra khi xây dựng mô hình, các thông số này có thể điều chỉnh dựa trên kết quả Phân tích độ nhạy của các thông số - PSA (Parameter Sensitivity Analysis) cho phù hợp với quần thể nghiên cứu và mô phỏng dữ liệu thực nghiệm một cách chính xác nhất

1.3 Các phương pháp - phần mềm xây dựng mô hình dược động học sinh lý 1.3.1 Phương pháp xây dựng mô hình

Phương pháp “bottom – up”: Mô hình được xây dựng từ dữ liệu in vitro và dữ

liệu tiền lâm sàng, sau đó được xác minh lại trong giai đoạn lâm sàng Chất lượng của dữ liệu đầu vào ảnh hưởng trực tiếp đến mô hình Trong giai đoạn đầu, kết quả ngoại

suy từ in vitro sang in vivo thường không chắc chắn nên cần bổ sung các yếu tố để xác minh lại (thường là dữ liệu lâm sàng in vivo) Trong một số trường hợp việc hiệu chuẩn

các thông số của mô hình bằng phương pháp “middle - out” cũng sẽ được xem xét [55]

Phương pháp “top - down”: Mô hình bắt đầu bằng việc điều chỉnh các thông số để

khớp dữ liệu in vivo trên người hoặc dữ liệu in vivo khi sử dụng các công thức bào chế

khác nhau Cách này thường dùng để phân tích thống kê các thông số dược động học của 1 quần thể (PopPK) Mục tiêu chính là xây dựng được mô hình mô tả dữ liệu quan sát được, ước tính giá trị trung bình các tham số và dao động cá thể để xác định phương sai của các thông số dược động học Mô hình tối ưu thường chỉ dùng để nội suy trong không gian dữ liệu ban đầu, chưa thể ngoại suy ngoài không gian dữ liệu này [55]

Phương pháp “middle - out”: Là sự kết hợp của 2 phương pháp trên Mô hình được

xây dựng từ các dữ liệu như tính chất hóa lý của dược chất, in vitro, tiền lâm sàng, kết hợp với dự đoán in silico về thông số phân bố thuốc Các thông số của mô hình cần được

điều chỉnh cho phù hợp và mô hình cần phải thẩm định ngoại để chứng minh khả năng

10 dự đoán Sau khi xác minh, mô hình có thể dùng để ứng dụng trên lâm sàng như yêu cầu miễn thử nghiệm lâm sàng hoặc ngoại suy dữ liệu dược động học từ người lớn, trẻ nhỏ sang trẻ sơ sinh để kiểm tra về mức liều [51], [55]

1.3.2 Các phần mềm dùng để xây dựng mô hình dược động học sinh lý

Sự phát triển các phương pháp hóa học được áp dụng trong dự đoán các đặc tính hóa lý và dược động học (PK) của dược chất đã hỗ trợ việc xây dựng mô hình PBPK

Với khả năng xử lý ngày càng tăng, các công cụ dự đoán in silico được cải tiến và các

phần mềm mới liên quan đến xây dựng mô hình PBPK đã ra đời [49] Các phần mềm này được chia thành 2 loại [49]

- Nền tảng mở (open platform): các phương trình của mô hình được hiển thị cho người dùng thấy rõ ví dụ: Phoenix [23], PK-Sim [44], WinSAAM [43]… với cấu trúc mô hình linh hoạt và cơ sở dữ liệu nhiều loài, nhiều đường dùng thuốc

- Nền tảng đóng (closed platform): các phương trình vi phân được ẩn với người sử dụng và biên dịch thành các tùy chọn trên giao diện ví dụ: GastroPlus [31], Simcyp [24], … bao gồm giao diện với rất nhiều lựa chọn khác nhau

Trong đó, các nền tảng mở phù hợp để hiểu rõ về mô hình PBPK, người dùng tự do khám phá ảnh hưởng của các thông số (thêm bớt, thay đổi phương trình vi phân) và dễ dàng thay đổi cấu trúc của mô hình Tuy nhiên, do dễ thay đổi nên kết quả dự đoán không chắc chắn, dễ sai sót và yêu cầu người dùng có kỹ năng lập trình nhất định [49]

1.3.3 Một số nghiên cứu về mô hình dược động học sinh lý

Năm 2022, Nguyễn Thị Hòa và cộng sự [8] đã ứng dụng mô hình PBPK để xây

dựng tương quan IVIVC giữa mức độ thấm in vitro và mức độ hấp thu in vivo cho miếng dán trên da chứa l-THP Đánh giá mức độ thấm in vitro của miếng dán với da chuột

trong điều kiện: Thiết bị khuếch tán Franz (thể tích 7 ml, diện tích khuếch tán 1,767 cm2) với tốc độ 600 v/p trong dung dịch đệm phosphat 7,4 chứa ethanol 50%,

nhiệt độ 32 ± 0,5˚C Sai số dự đoán khi thẩm định tương quan IVIVC xây dựng đạt yêu cầu của FDA (9,5% với AUC và 9,2% với Cmax) Thêm nữa, bằng việc ứng dụng mô

hình PBPK đã cho thấy mức độ hấp thu in vivo của dược chất gần giống mức độ thấm in vitro nhưng SKD lại thấp hơn và bằng khoảng 1/3 so với mức độ thấm in vitro, điều

này đã không thể hiện được ở mô hình ngăn và không ngăn Dalia Safaa Hamdi và cộng sự [38] đã nghiên cứu bào chế màng lưu tại dạ dày

chứa metoclopramid HCl (MTC) và dự đoán SKD in silico bằng phần mềm GastroPlus

Nghiên cứu đã xây dựng được mô hình PBPK của MTC với khả năng dự đoán tốt (PE < 15%) Dữ liệu đầu vào là SKD trên người của chế phẩm IV và dung dịch uống (10 mg và 30 mg MTC), bổ sung thông số Km, Vmax của enzyme chuyển hóa chính P2D6 Kết

quả in silico cho thấy lượng MTC cao nhất trong màng (Sod Alginate-8 và Sod

11 Alginate-10) và được giữ trong thời gian bằng với thời gian trôi nổi của màng ở dạ dày Ngoài ra, mô hình PBPK còn cho thấy hỗng tràng 1 có vị trí hấp thụ MTC cao

Năm 2021, Macwan và các cộng sự [54] ứng dụng mô hình PBPK để nghiên cứu ảnh hưởng của độ hòa tan đến SKD của bisoprolol Nghiên cứu đã xây dựng mô hình

PBPK và tương quan IVIVC từ dữ liệu in vitro, in silico và lâm sàng, kết hợp với các

thử nghiệm tương đương sinh học ảo để đánh giá ảnh hưởng của sự thay đổi độ hòa tan

tới hiệu quả lâm sàng của thuốc Kết quả cho thấy, với độ hòa tan in vitro đạt 70% trong

15 phút và 79,5% trong 30 phút thì các công thức này vẫn tương đương sinh học với chế phẩm đã phê duyệt (độ hòa tan > 85% trong 15 phút), khoảng tin cậy 90% của Cmax và AUC nằm trong giới hạn tương đương sinh học (0,8 – 1,25)

Năm 2019, Rebeka Jereb và cộng sự [26] xây dựng mô hình PBPK để xây dựng

tương quan IVIVC cho dược chất nhóm I BCS Chế phẩm dùng để xây dựng tương quan

là viên nang GPKD chứa 0,4 mg dược chất dạng muối, đối chiếu là chế phẩm truyền IV 0,125 mg/ 4 giờ và viên nén IR với các liều: 0,05 mg; 0,1 mg và 0,2 mg Thử hòa tan viên GPKD và chế phẩm đối chiếu ở điều kiện: Thiết bị cánh khuấy (100 v/ph); 500 ml dung dịch polysorbat 80 nồng độ 0,003% trong 2 giờ, sau đó là 500 ml dung dịch đệm phosphat pH 7,2 trong 10 giờ ở 37C Sử dụng GastroPlus để thiết lập mô hình PBPK

và xây dựng tương quan IVIVC Tính thấm in vivo xác định từ mô hình lớn hơn kết quả đo được từ in vitro, cho thấy dược chất có khả năng thấm cao Mô hình PBPK của các

chế phẩm đối chiếu đều có sai số PE < 10% với Cmax và AUC nên đều đạt yêu cầu Shriram và cộng sự [39] đã xây dựng mô hình PBPK của Topiramat Mô hình mô phỏng dữ liệu nồng độ thuốc theo thời gian của các công thức có tốc độ giải phóng khác

nhau (nhanh, chậm, trung bình, thẩm định ngoại) từ độ hòa tan in vitro và thiết lập tương

quan IVIVC Tương quan xây dựng được là tuyến tính với hệ số tương quan R2 = 0,966 lớn hơn so với R2 = 0,946 khi thiết lập tương quan bằng phương pháp giải chập đại số Sai số dự đoán khi thẩm định nội và thẩm định ngoại của mô hình PBPK đều đạt yêu cầu của FDA (7,7% với Cmax và 9,2% với AUC) nhỏ hơn so với phương pháp giải chập đại số (13,5% với Cmax và 12,6% với AUC)

Có thể thấy, mô hình dược động học sinh lý với những đặc tính ưu việt có ý nghĩa

rất lớn trong nghiên cứu phát triển thuốc Đây là một công cụ hữu dụng giúp hiểu rõ hơn về dược chất, các yếu tố sinh lý trong cơ thể và tác động của chúng đến sinh khả dụng của thuốc, từ đó đưa ra được những phương án để thay đổi cách thức bào chế nhằm đạt được mục tiêu nghiên cứu Vì vậy với bản chất là nguyên liệu thiên nhiên có nhiều ứng dụng trong điều trị bệnh nhất là tác dụng chống gây nghiện, việc xây dựng mô hình dược động học sinh lý của l-tetrahydropalmatin là phù hợp, tạo cơ sở tối ưu hóa quá trình

nghiên cứu, từ đó xây dựng được công thức bào chế tối ưu đạt hiệu quả điều trị cao

12

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị

2.1.1 Nguyên vật liệu

Bảng 2.1 Các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu

chuẩn 1 l-tetrahydropalmatin Sichuan Yuxin Pharmaceutical

9 Polyvinyl pyrolidon K30 Huangshan bonsun –

2.1.2 Thiết bị

Bảng 2.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

9 Máy dập viên tâm sai Shanghai VFD007S21A Trung Quốc

11 Hệ thống sắc kí lỏng khối phổ LC-MS/MS Agilent 6460 QQQ Mỹ

- Sử dụng dữ liệu SKD đường uống trên chó của viên giải phóng ngay IR để xây dựng mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa (ACAT) ban đầu

- Sử dụng dữ liệu SKD và độ hòa tan in vitro của viên FR để xây dựng mô hình ACAT

Thẩm định mô hình đã xây dựng với dữ liệu của viên MR, viên SR và ứng dụng mô hình để phân tích SKD của viên kết dính sinh học PNP

2.2.2 Ứng dụng mô hình đã xây dựng được để xây dựng công thức bào chế thuốc giải phóng kéo dài chứa l-THP

- Xây dựng bộ công thức viên giải phóng kéo dài với các polyme và đánh giá độ hòa

tan in vitro của các công thức Sau đó sử dụng mô hình PBPK đã xây dựng để dự đoán

SKD của các công thức khảo sát - Tối ưu hóa và dự đoán công thức tối ưu, sau đó tiến hành thẩm định lại bằng mô hình PBPK của polyme tương ứng

2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp bào chế

2.3.1.1 Phương pháp bào chế viên nén giải phóng ngay:

- Phương pháp bào chế: Dập thẳng - Thành phần:

Bảng 2.3 Thành phần của viên nén giải phóng ngay - IR 10 mg

+ Tiến hành trộn bột kép gồm dược chất và tá dược độn bằng chày cối Sau đó trộn hỗn hợp bột kép với các tá dược trơn trong khoảng 2 phút trong túi nilon

+ Cân lượng bột chứa khoảng 10mg dược chất (khoảng 0,2 g), dập viên trên máy dập viên tâm sai với bộ chày tròn đường kính 7 mm, độ cứng viên dao động từ 7 – 9 kP

2.3.1.2 Phương pháp bào chế viên nén giải phóng kéo dài gồm:

Viên tạo hạt ướt: Các viên giải phóng kéo dài sử dụng các polyme kiểm soát giải

phóng khác nhau (Khóa luận tốt nghiệp của Dược sĩ Vũ Quang Linh [14] và Dược sĩ

14 Phạm Nguyễn Mỹ Linh [10]): Viên FR chứa 30% HPMC E15LV, viên MR chứa 15% HPMC K4M, viên SR chứa 45% HPMC K100M

Viên dập thẳng:

Viên kết dính sinh học tại dạ dày chứa 15% PNP (Khóa luận tốt nghiệp của Dược

sĩ Vũ Mai Linh [13]) và các viên khảo sát dùng trong nghiên cứu tối ưu hóa

Viên dùng trong nghiên cứu tối ưu hóa:

- Thành phần: Khảo sát với 4 loại polyme KSGP và kết dính sinh học lần lượt là HPMC E15LV, HPMC K4M, HPMC K100M và PNP với các tỷ lệ là: 7,5%, 15%, 30%, 45% - Mô tả quy trình bào chế:

+ l-THP và Erapac được nghiền và rây qua rây 250, tá dược trơn aerosil, magnesi stearat được rây qua rây 125 Cân các thành phần theo công thức

+ Tiến hành trộn bột kép gồm dược chất, polyme và tá dược bằng chày cối Sau đó trộn hỗn hợp bột kép với các tá dược trơn trong khoảng 2 phút trong túi nilon

+ Cân lượng bột chứa khoảng 30 mg dược chất (khoảng 0,2 g), dập viên trên máy dập viên tâm sai với bộ chày tròn đường kính 7mm, độ cứng các mẫu viên dao động từ

9 – 13 kP

2.3.2 Phương pháp đánh giá

2.3.2.1 Phương pháp đánh giá độ cứng và đường kính viên

- Đánh giá độ cứng viên thông qua lực gây vỡ viên Tiến hành trên máy đo lực vỡ viên Pharmatest PTB 311E Thử trên 10 viên, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn - Đường kính viên cũng được đo đồng thời bằng máy đo lực vỡ viên Pharmatest PTB 311E Thử trên 10 viên, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn

2.3.2.2 Phương pháp định lượng a Định lượng hàm lượng dược chất trong viên

Phương pháp định lượng được tham khảo từ nghiên cứu của Nguyễn Như Nam và cộng sự [7] như sau:

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,030 g l-THP hòa tan trong 25 ml methanol thu được dung dịch chuẩn gốc Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng methanol thành dãy các dung dịch có nồng độ từ 10 – 50 µg/ml

Chuẩn bị mẫu thử: Nghiền bột 20 viên sau đó lấy một lượng bột tương đương với 0,030 g l-THP Hòa tan trong 25 ml methanol thu được dung dịch thử Pha loãng dung dịch thử bằng methanol để thu được các dung dịch có nồng độ từ 10 – 50 µg/ml

Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 281 nm với mẫu trắng là methanol Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ giữa độ hấp thụ quang và nồng độ l-THP để tính toán kết quả

15

b Định lượng dược chất giải phóng trong môi trường hòa tan

Chuẩn bị mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,030 g l-THP hòa tan trong 25 ml môi trường hòa tan thu được dung dịch chuẩn gốc Pha loãng dung dịch chuẩn gốc bằng môi trường hòa tan thành dãy các dung dịch có nồng độ từ 10 – 50 µg/ml

Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử hòa tan tại các thời điểm (đã xử lý qua giấy lọc thô) Đo độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn tại bước sóng 281 nm với mẫu trắng là môi trường hòa tan Xây dựng đường chuẩn và phương trình biểu diễn mối quan hệ độ hấp thụ quang và nồng độ l-THP để tính toán kết quả

2.3.2.3 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng dược chất in vitro

Phương pháp thử hòa tan được lựa chọn thông qua nghiên cứu khảo sát các phương

pháp đạt được mối tương quan tuyến tính giữa hòa tan in vitro và hấp thu in vivo của ba

công thức FR, MR, SR Phương pháp được tiến hành như sau: - Thiết bị: giỏ quay

- Tốc độ: 100 vòng/phút - Nhiệt độ: 37 ± 0,5oC - Môi trường: 450 ml dung dịch acid hydrocloric pH 1,2 - Thời gian thí nghiệm: 8 giờ

- Thời điểm lấy mẫu: 0,5; 1; 2; 4; 6; 8 giờ - Tiến hành: cho mẫu viên vào giỏ quay và đưa vào bình thử hòa tan, chạy thiết bị theo các thông số đã cài đặt, tại mỗi thời điểm nêu trên, hút 10 ml dịch thử hòa tan và bổ sung ngay 10 ml môi trường sau khi hút mẫu

- Mẫu thử được lọc qua giấy lọc và định lượng l-THP giải phóng như phương

pháp đã nêu ở phần 2.3.2.2

- Cách tính kết quả: % giải phóng =𝑚𝑡𝑛

2.3.3 Phương pháp đánh giá sinh khả dụng thuốc đường uống

2.3.3.1 Mô hình đánh giá sinh khả dụng thuốc trên chó a Chuẩn bị động vật thí nghiệm:

Chó trưởng thành có trọng lượng 9 - 11 kg được nuôi trong phòng nuôi động vật tại Khoa Dược, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên Chó được nhịn ăn và uống qua đêm trước khi tiến hành thí nghiệm và sau khi dùng thuốc không được ăn trong 4 giờ

b Chế phẩm thử:

- Viên nén giải phóng ngay chứa l-THP (IR) hàm lượng l-THP 10 mg - Viên kết dính sinh học tại dạ dày chứa l-THP (PNP) hàm lượng l-THP 30 mg

16

c Cho uống thuốc:

- Động vật trong thí nghiệm được sử dụng: đơn liều, đơn thuốc, và trải qua 2 giai đoạn Tất cả 6 đối tượng đều sử dụng cùng 1 chế phẩm thử

- Các giai đoạn được trình bày cụ thể như sau: + Giai đoạn 1: mỗi đối tượng thử được cho uống 1 viên IR + Giai đoạn 2: mỗi đối tượng thử được cho uống 1 viên PNP - Thời gian nghỉ giữa các giai đoạn là 5 ngày

d Lấy mẫu và xử lý huyết tương:

Sau khi cho chó uống mẫu thuốc tại các thời điểm 0, 15, 30, 45 phút và 1, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 36, 48 giờ tiến hành lấy 3 ml máu ở tĩnh mạch chi của chó, cho vào ống chống đông chứa ETDA Ly tâm 10.000 vòng/phút trong 10 phút, thu huyết tương và bảo quản ở nhiệt độ -19ºC (ngăn đông) trước khi đưa đi phân tích LC-MS/MS

2.3.3.2 Phương pháp chiết QuEChERS

Tiến hành chiết theo quy trình QuEChERS như sau: hút chính xác 0,5 ml huyết tương cho vào ống ly tâm 2 ml Thêm 25 µl dung dịch berberin clorid 1 µg/ml và 0,5 ml acetonitril Tiến hành lắc xoáy trong vòng 1 phút để tạo hỗn hợp đồng nhất Tiếp tục thêm 0,2 g magnesi sulfat và 0,05 g natri clorid Lắc xoáy trong vòng 1 phút, sau đó ly tâm với tốc độ 16.000 vòng/phút trong vòng 10 phút Hút lớp dịch lỏng trên cùng để định lượng bằng phương pháp LC-MS/MS [41]

2.3.3.3 Phương pháp định lượng trong huyết tương bằng kỹ thuật LC-MS/MS

Định lượng nồng độ l-THP trong huyết tương chó bằng kỹ thuật LC-MS/MS như nghiên cứu của Phạm Thị Phương Dung và các cộng sự [11] với các điều kiện như sau:

- Phương pháp sử dụng chất chuẩn nội (IS): berberin clorid - Thiết bị: AB Sciex 5500 QQQ mass spectrometer (AB Sciex, USA) - Cột sắc ký: C18 (150 mm x 3 mm × 3,5 μm) và tiền cột C18 của Waters - Thể tích tiêm mẫu: 1 µl

- Thời gian phân tích: 10 phút/ mẫu Các thông số bộ phận phân tích MS như sau: chế độ ion dương, cường độ dòng mao quản 2678 nA; nhiệt độ nguồn MS1100°C; nhiệt độ nguồn MS2 100°C; nhiệt độ của dòng khí Gas 300°C; áp suất tạo khí làm khô 20 psi; khí va chạm ở Q2 là khí N2

tinh khiết cao (99,9995%)

(%)

ACN (%)

- Dịch chiết huyết tương trắng được chuẩn bị bằng 0,5 ml acetonitril chiết với 0,5 ml huyết tương tại thời điểm 0 phút Sau khi hỗn hợp đồng nhất được lắc xoáy 1 phút, dung dịch được chiết tách bằng 0,2 g magnesi sulfat và 0,05 g natri clorid và lắc

xoáy 1 phút Hút lớp dịch trên pha loãng để thu được dãy dung dịch chuẩn Tiến hành

định lượng dãy dung dịch chuẩn bằng phương pháp LC-MS/MS

2.3.4 Phương pháp xây dựng mô hình dược động học sinh lý của thuốc chứa l-THP

2.3.4.1 Dữ liệu đầu vào

Đối với mỗi dược chất, dữ liệu về các đặc tính lý hóa của riêng hợp chất: độ hòa tan, tính thấm, logP, pKa, kích thước hạt, …; liều lượng, thông số về hòa tan và hấp thu của chế phẩm đang nghiên cứu được sử dụng, đưa vào để xây dựng mô hình [34]

Cấu trúc của l-THP được tải xuống từ cơ sở dữ liệu PubChem [33] Tất cả các đặc tính của l-THP được ước tính bằng chức năng ADMET Predictor tích hợp sẵn trong phần mềm GastroPlus và được nghiên cứu thêm trong tài liệu

Mô hình sinh lý (Physiology): Beagle - Physiological – Fasted Physiology và mô hình tính thấm ASF: Opt logD Model SA / V 6.1 được sử dụng cho tất cả các mô phỏng Độ tan của l-THP trong các điều kiện pH khác nhau được tham khảo từ nghiên cứu của Phạm Nguyễn Mỹ Linh và các cộng sự [10] như sau:

Bảng 2.5 Độ tan của l-THP trong các điều kiện pH khác nhau

Dung dịch đệm phosphat pH 4,5 4,615 ± 2,75 Dung dịch đệm phosphat pH 6,8 0,04 ± 0,00

18 Dữ liệu độ tan ở pH 1,2 và pH 6,8 khá tương đồng với kết quả trong nghiên cứu của Nguyễn Thạch Tùng (72,14 mg/ml ở pH 1,2 và 0,0238 mg/ml ở pH 6,8) [58] Dữ liệu này sẽ được nhập vào phần mềm GastroPlus để tính toán pKa và SolFactor Giá trị pKa được xác định là 6,771, khá tương đồng với giá trị pKa dự đoán từ công cụ ADMET Predictor là 6,29 Qua đó, pKa = 6,771 vừa được xác định này sẽ được sử dụng cho các mô phỏng tiếp theo

Giá trị của Peff có thể được xác định bằng phép đo độc lập trong ống nghiệm với tế bào Caco-2 đơn lớp hoặc các thí nghiệm tưới máu ruột chuột [57] Tuy nhiên do thiếu dữ liệu về tính thấm hiệu dụng Peff trực tiếp ở chó và để phù hợp với điều kiện cho phép nên nhóm nghiên cứu đã tìm các tài liệu hỗ trợ xác định tính thấm của l-THP

- Chỉ có một nghiên cứu của Yang - Zi Liu và các cộng sự được công bố [52] về tính thấm của l-THP trên tế bào Caco-2 đơn lớp, tính thấm xác định được trên tế bào Caco-2 đơn lớp được nhóm nghiên cứu công bố là 10-5 cm/s Giá trị này sẽ được sử dụng để xây dựng mô hình PBPK và tiếp tục điều chỉnh cho phù hợp

- Tuy nhiên theo Pettarin và cộng sự, Peff được thực hiện từ các nghiên cứu

Caco-2 có thể không đồng nhất và không tương quan với tính thấm in vivo [35] hay là

theo Briske-Anderson và cộng sự [15] cũng phát hiện ra rằng tính thấm trên tế bào 2 của cùng một loại thuốc từ các phòng thí nghiệm khác nhau là khác nhau đáng kể

Caco-Dữ liệu in vitro: Độ hòa tan in vitro theo thời gian của 4 viên: Viên FR, viên MR,

viên SR và viên kết dính sinh học PNP

➔ Các thông số đầu xây dựng mô hình PBPK được trình bày trong bảng dưới đây:

19

Bảng 2.6 Thông số đầu vào phần mềm GastroPlus

Khối lượng phân tử (g/mol) 355,44 ADMET Predictor

tan trong các pH khác nhau

2.3.4.2 Xây dựng mô hình dược động học sinh lý của chó

Xây dựng mô hình PBPK của chó bằng phần mềm GastroPlusTM (phiên bản 9.8.3, Simulator Plus Inc) bằng phương pháp sau:

Bước 1: Xây dựng mô hình toàn cơ thể

- Sử dụng mô hình chó sinh lý mặc định của phần mềm cùng với các dữ liệu đầu vào để mô phỏng nồng độ dược chất trong huyết tương sau khi tiêm tĩnh mạch liều 30 mg l-THP So sánh kết quả dự đoán từ mô hình với kết quả thu được từ thực nghiệm

- Phân tích các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả dự đoán của mô hình:

20 Có nhiều thông số sinh lý trong mô hình ảnh hưởng đến quá trình phân bố và thải trừ nên cần tiến hành đánh giá mức độ ảnh hưởng của chúng đến dữ liệu

in vivo Sử dụng chức năng Phân tích độ nhạy của các thông số - PSA (Parameter Sensitivity Analysis) để sàng lọc các thông số từng cơ quan ảnh hưởng dữ liệu in vivo

- Tối ưu hóa các thông số phân bố và thải trừ của mô hình Dựa trên kết quả phân tích PSA, chọn các thông số cần tối ưu Sử dụng chức năng Tối ưu hóa (Optimization) kết hợp điều chỉnh thủ công để tối ưu các thông số này sao

cho nồng độ thuốc trong huyết tương dự đoán khớp nhất với dữ liệu in vivo thực nghiệm,

thu được mô hình toàn cơ thể

Bước 2: Xây dựng mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý đường tiêu hóa (ACAT)

dựa trên dữ liệu in vivo của viên nén IR và dữ liệu in vivo, in vitro của viên FR

Sử dụng mô hình toàn cơ thể để mô phỏng nồng độ dược chất trong huyết tương sau khi uống viên IR So sánh kết quả dự đoán từ mô hình với kết quả từ thực nghiệm

- Phân tích các yếu tố ảnh hưởng kết quả dự đoán bằng công cụ PSA Với thuốc uống, các yếu tố về công thức bào chế hay yếu tố sinh lý đường tiêu hóa như tính thấm và thời gian lưu ở từng ngăn, các quá trình động học, tương tác của dược chất với mô ở từng ngăn, … ảnh hưởng nhiều đến dược động học của dược chất

- Tối ưu hóa các thông số đã phân tích được trên nhờ chức năng Optimization kết hợp điều chỉnh thủ công sao cho nồng độ thuốc trong huyết tương dự đoán khớp

nhất với dữ liệu in vivo thực nghiệm, thu được mô hình ngăn cải tiến mô phỏng sinh lý

đường tiêu hóa (ACAT) ban đầu

Sau khi thu được mô hình ACAT ban đầu, sử dụng dữ liệu in vivo và in vitro của

viên FR để mô phỏng nồng độ dược chất trong huyết tương khi uống viên FR Tiến hành tương tự trên, điều chỉnh các thông số của mô hình sao cho nồng độ thuốc trong huyết

tương dự đoán khớp nhất với dữ liệu in vivo thực nghiệm của viên FR, thu được mô hình

ACAT Thẩm định lại mô hình đã xây dựng được với dữ liệu của viên MR, SR Ứng dụng mô hình đã thẩm định để giải thích SKD của viên kết dính PNP và đưa ra các đặc điểm của từng loại tá dược trong khảo sát Qua đó, dựa vào mô hình PBPK đã xây dựng để phân tích và dự đoán SKD của các công thức bào chế tương ứng với từng loại tá dược theo thí nghiệm đã thiết kế

21 Quy trình xây dựng mô hình PBPK được tóm lược lại như dưới đây:

Hình 2.1 Sơ đồ quy trình xây dựng mô hình PBPK

+ Với Cmax: %𝑃𝐸𝐶𝑚𝑎𝑥 = |(𝐶𝑚𝑎𝑥.𝑜𝑏𝑠−𝐶𝑚𝑎𝑥.𝑝𝑟𝑒𝑑)

𝐶𝑚𝑎𝑥.𝑜𝑏𝑠 | × 100% + Với AUC: %𝑃𝐸𝐴𝑈𝐶 = |(𝐴𝑈𝐶𝑜𝑏𝑠−𝐴𝑈𝐶𝑝𝑟𝑒𝑑)

𝐴𝑈𝐶𝑜𝑏𝑠 | × 100%

Sử dụng tiêu chuẩn chấp nhận của FDA đối với tương quan in vitro - in vivo [22]

để đánh giá PE của mô hình Độ chính xác của mô hình PBPK được chấp nhận nếu giá trị tuyệt đối của sai số dự đoán trung bình (% PE)  10% đối với Cmax và AUC; và giá trị tuyệt đối của sai số dự đoán (% PE) cho mỗi công thức  15%

22

2.3.5 Tối ưu hóa công thức viên giải phóng kéo dài chứa l-THP

Với mục tiêu tối ưu hóa công thức bào chế viên giải phóng kéo dài, cần xác định được cửa sổ điều trị của l-THP Cửa sổ điều trị được xác định dựa trên khoảng nồng độ Css min - Css max ở trạng thái ổn định của liều an toàn mang lại tác dụng dược lý mong muốn Viên giải phóng kéo dài cần duy trì được nồng độ l-THP trong huyết tương lớn hơn nồng độ có tác dụng (Css min) và nhỏ hơn nồng độ tối đa không gây độc (Css max)

để tăng tác dụng và giảm tác dụng bất lợi [37]

+ Y2 (ng/ml): Nồng độ thuốc trong máu tối đa Cmax nằm trong khoảng Css min – Css max là lớn nhất

+ Y3 (h): Thời gian thuốc bắt đầu có tác dụng (Cp = Css min) nhỏ nhất - Thiết kế được sử dụng là Full Factorial Design 4x4, tối ưu hóa công thức theo phương

pháp hàm hy vọng với công cụ Maximize Desirability

2.3.5.2 Đánh giá lại kết quả của công thức tối ưu

Sau khi thu được công thức tối ưu, tiến hành đánh giá độ hòa tan in vitro trong môi

trường acid HCl pH 1,2 của công thức Sử dụng dữ liệu này là dữ liệu đầu vào, mô

phỏng quá trình hấp thu in vivo của viên tối ưu bằng mô hình PBPK của polyme tương

ứng để kiểm tra kết quả dự đoán

- Dự đoán các thông số sinh dược học của l-THP bằng phần mềm ADMET Predictor - Xây dựng mô hình PBPK các chế phẩm l-THP ở chó bằng phần mềm Gastro PlusTM - Tối ưu hóa công thức và các phép so sánh thống kê được thực hiện bằng phần mềm JMP Pro 17

Tiến hành đo mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn l-THP có nồng độ từ 10 μg/ml đến 50 μg/ml trong dung môi methanol tại bước sóng 281 nm Kết quả được thể hiện ở

Hình 3.1

Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ l-THP

trong môi trường methanol Nhận xét: Kết quả cho thấy trong môi trường methanol có mối tương quan tuyến

tính giữa mật độ quang và nồng độ của l-THP trong khoảng từ 10 μg/ml đến 50 μg/ml, với phương trình hồi quy là y = 0,0144x + 0,0191; hệ số tương quan R2 = 0,9996 > 0,99 Do đó, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến để định lượng nồng độ l-THP trong các mẫu thử

3.1.2 Xây dựng đường chuẩn định lượng l-THP bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến trong môi trường acid hydrocloric pH 1,2

Tiến hành tương tự mục 3.1.1, quét phổ dung dịch l-tetrahydropalmatin chuẩn có nồng độ 24 μg/ml trong dung dịch acid hydrocloric pH 1,2 trong khoảng bước sóng từ 200 nm đến 400 nm và xác định được đỉnh hấp thụ cực đại tại 281 nm, do đó lựa chọn bước sóng 281 nm để định lượng l-THP bằng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến

Tiến hành đo mật độ quang của dãy dung dịch chuẩn l-THP có nồng độ từ 10 μg/ml đến 50 μg/ml trong dung môi acid hydrocloric pH 1,2 tại bước sóng 281 nm Kết quả

được thể hiện ở Hình 3.2

y = 0.0144x + 0.0191R² = 0.9996

00.20.40.60.8

24

Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ l-THP

trong môi trường acid hydrocloric pH 1,2 Nhận xét: Kết quả cho thấy trong môi trường acid hydrocloric pH 1,2 có mối

tương quan tuyến tính giữa mật độ quang và nồng độ của l-THP trong khoảng nồng độ từ 10 μg/ml đến 50 μg/ml, với phương trình hồi quy là y = 0,0146x + 0,0327; hệ số tương quan R2 = 0,9995 > 0,99 Do đó, có thể sử dụng phương pháp quang phổ hấp thụ tử ngoại khả kiến để định lượng nồng độ l-THP trong các mẫu thử hòa tan

3.1.3 Định lượng l-THP trong huyết tương bằng kỹ thuật LC-MS/MS

Phương pháp định lượng l-THP trong huyết tương chó bằng LC-MS/MS đã được phát triển trong các nghiên cứu trước Do đó, đề tài chỉ tiến hành thẩm tra lại khoảng tuyến tính của phương pháp Tiến hành định lượng dãy dung dịch chuẩn đã được chuẩn

bị theo quy trình đã mô tả ở mục 2.3.3.3, kết quả được thể hiện trong hình dưới đây:

Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ và tỉ lệ diện tích píc chất chuẩn trên diện tích píc nội chuẩn của l-THP bằng phương pháp LC-MS/MS

Nhận xét: Phương trình hồi quy thu được: y = 0,0049x + 0,008, R2 = 0,9993 Hệ số tương quan R2 > 0,99 chứng tỏ ở khoảng nồng độ khảo sát có sự phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ l-THP trong huyết tương với tỉ lệ diện tích píc chất chuẩn trên diện tích píc chất nội chuẩn Từ đó có thể sử dụng phương pháp LC-MS/MS đã xây dựng để định lượng nồng độ l-THP trong huyết tương chó

y = 0.0146x + 0.0327R² = 0.9995

00.20.40.60.81

0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.200

25

3.2 Đánh giá sinh khả dụng in vivo trên chó

Viên nén giải phóng ngay được bào chế theo quy trình đã nêu ở mục 2.3.1.1, viên kết dính sinh học PNP được bào chế theo quy trình đã nêu ở mục 2.3.1.2

Đánh giá SKD đường uống trên chó của viên IR và viên PNP theo phương pháp

mô tả trong mục 2.3.3 Kết hợp tham khảo số liệu thử SKD trên chó của chế phẩm IV,

viên nhanh - FR, viên trung bình - MR, viên chậm - SR trong Khóa luận tốt nghiệp của Dược sĩ Vũ Quang Linh [14] Kết quả định lượng nồng độ l-THP trong huyết tương chó của các chế phẩm được thể hiện như hình dưới đây:

Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn nồng độ l-THP trong huyết tương chó theo thời gian của chế phẩm IV, viên IR, viên PNP, viên FR, viên MR, viên SR (n = 6, TB ± SE)

Sử dụng phần mềm Phoenix Winnolin 8 để tính toán các thông số dược động học của viên IR và viên PNP Kết quả được trình bày ở bảng sau:

Bảng 3.1 Thông số dược động học trung bình của viên IR và viên PNP