PHẠM TRUNG KIÊN NGHIÊN cứu xây DỰNG QUY TRÌNH tổ NG hơp và TINH CHẾ BERBERIN CLORID đạt TIÊU CHUẨN dược DỤNG ở QUY mô 50 GMẺ

Trên thế giới, berberin được sản xuất bằng con đường chiết xuất từ dược liệu, nuôi cấy mô, kết hợp công nghệ khí canh và tổng hợp hóa học.. Ở trong nước đã có những nghiên cứu ban đầu về

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM TRUNG KIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ BERBERIN CLORID ĐẠT TIÊU CHUẨN DƯỢC

DỤNG Ở QUY MÔ 50 G/MẺ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

HÀ NỘI 2019

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM TRUNG KIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ BERBERIN CLORID ĐẠT TIÊU CHUẨN DƯỢC

DỤNG Ở QUY MÔ 50 G/MẺ

LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ

Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn đến các thầy cô giáo thuộc bộ môn Công nghiệp Dược, cũng như các thầy cô trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này và đã dạy bảo tôi tận tình trong suốt quá trình học

Cuối cùng, tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tôi, đồng nghiệp cơ quan nơi tôi công tác và lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, là nguồn động lực không thể thiếu, luôn bên tôi giúp đỡ tôi suốt thời gian đi học và trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp

Hà Nội, tháng 03 năm 2019

Học viên

Phạm Trung Kiên

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH MỤC CÁC BẢNG

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Khái quát chung về berberin clorid 3

1.1.1 Đặc điểm cấu trúc hóa học 3

1.1.2 Tính chất hóa lý 3

1.1.3 Ứng dụng trong lâm sàng 4

1.1.4 Tác dụng dược lý khác 5

1.2 Phương pháp sản xuất berberin 9

1.2.1 Phương pháp chiết xuất 9

1.2.2 Phương pháp sử dụng công nghệ khí canh 9

1.2.3 Phương pháp tổng hợp hóa học 10

1.3 Phân tích và lựa chọn phương pháp 21

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24

2.1.Nguyên liệu, thiết bị 24

2.1.1 Nguyên liệu 24

2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 25

2.2 Nội dung nghiên cứu 26

2.2.1 Tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm 26

2.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học của berberin clorid tổng hợp được 26

2.2.3 Xây dựng qui trình tổng hợp berberin clorid quy mô 50 g/mẻ 26

2.2.4 Kiểm nghiệm chất lượng berberin clorid tổng hợp được 27

2.3 Phương pháp nghiên cứu 28

2.3.1 Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu 28

2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 29

2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 29

CHƯƠNG 3 THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 30

3.1 Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm 30

3.1.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 30

3.1.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4 methylendioxy-β-nitrostyren (61) 34

3.1.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 38

3.1.4 Tổng hợp berberin clorid (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 42

3.2 Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mô phòng thí nghiệm 45

3.2.1 Quy trình tiến hành: 45

3.2.2 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng 46

3.3 Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid ở quy mô 50 g/mẻ 47

3.3.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 47

3.3.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) 48

3.3.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 50

3.3.4 Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 52

3.4 Tinh chế sản phẩm đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 53

3.4.1 Tiến hành tinh chế sản phẩm, thử độ tinh khiết 53

3.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 54

3.5 Xác định cấu trúc hóa học 56 3.5.1 Xác định cấu trúc sản phẩm 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) 56

3.5.2 Xác định cấu trúc sản phẩm homopiperonylamin hydroclorid (6a) 57

3.5.3 Xác định cấu trúc sản phẩm

2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 58

3.5.4 Xác định cấu trúc sản phẩm berberin (1) 59

3.6 Kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 60

3.7 Tóm tắt quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid từ nguyên liệu ban đầu là piperonal 62

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 63

4.1 Tổng hợp hóa học 63

4.1.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 63

4.1.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 61 64

4.1.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 66

4.1.4 Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 68

4.2 Độ tinh khiết của các hợp chất tổng hợp được 70

4.3 Cấu trúc hóa học của các hợp chất tổng hợp được 70

4.3.1 Hợp chất 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) 70

4.3.2 Hợp chất homopiperonylamin hydroclorid (6a) 71

4.3.3 Hợp chất 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3 dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) 72

4.3.4 Hợp chất berberin clorid (1) 72

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75

TÀI LIỆU THAM KHẢO 76

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT

ACC Acetyl coenzym-A carboxylase

AChE Acetylcholinesterase

ADN Acid Deoxyribonucleic

AR Tiêu chuẩn phân tích (Analytical Reagent)

AMPK Protein kinase được hoạt hóa bởi adenosin monophosphat

(Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase)

DĐVN Dược điển Việt Nam

DMSO Dimethyl sulfoxid

LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein)

LPS Phân tử gồm lipid và polysaccharid (Lipopoly Saccharide) m/z Tỉ số khối lượng và điện tích

mARN Acid Ribonucleic thông tin (Messenger Ribonucleic Acid)

MD Kháng nguyên biệt hóa myeloid (Myeloid differentiation)

(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy)

PBG Đường huyết sau bữa ăn (Postprandial blood glucose)

Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor)

TC Tổng nồng độ cholesterol toàn phần (Total Cholesterol)

TFA Acid trifluoroacetic

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất 24

Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ 25

Bảng 3.1 Kết quả tổng hợp 61 theo 2 phương pháp 31

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu suất phản ứng 32

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian tới hiệu suất phản ứng 33 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng 33 Bảng 3.5 Kết quả tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo 2 phương pháp 36

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa NaBH4 và 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng 37

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của xúc tác cho phản ứng khử hóa nhóm nitro 37

Bảng 3.8 Kết quả tổng hợp 31 theo 2 phương pháp 40

Bảng 3.9 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol giữa aldehyd và (6a) 40

Bảng 3.10 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các bazơ khác nhau đến hiệu suất phản ứng 41

Bảng 3.11 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất phản ứng 41

Bảng 3.12 Kết quả tổng hợp berberin clorid (1) theo 2 phương pháp 44

Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng 44

Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến hiệu suất phản ứng 45

Bảng 3.15 Ảnh hưởng của dung môi tới hiệu suất kết tinh 46

Bảng 3.16 Ảnh hưởng của nhiệt độ tới quy trình tinh chế 47

Bảng 3.17 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH 48

Bảng 3.18 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 6a 50

Bảng 3.19 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 31 51

Bảng 3.20 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tổng hợp chất 1 53

Bảng 3.21 Kết quả đánh giá độ lặp lại của quy trình tinh chế chất 1 54

Bảng 3.22 Đặc điểm sắc ký của các hợp chất tổng hợp được 55

Bảng 3.23 Nhiệt độ nóng chảy của các hợp chất tổng hợp được 55

Bảng 3.24 Kết quả phân tích cấu trúc 61 56

Bảng 3.25 Kết quả phân tích cấu trúc 6a 57

Bảng 3.26 Kết quả phân tích cấu trúc 31 58

Bảng 3.27 Kết quả phân tích cấu trúc 1 59

Bảng 3.28 Sơ bộ định lượng hàm lượng berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 60

Bảng 3.29 Kết quả kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển61 Bảng 4.1 Kết quả so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid 73

Bảng 4.2 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid 73

Bảng 4.3 Kết quả so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp được và phổ chuẩn của berberin clorid (tiếp) 74

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ

Hình 1.1 Phản ứng khử berberin 4

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm 4

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams 10

Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp berberin của T Kametani và cộng sự 11

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc 13

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp berberin của W Liu 14

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin của Z X Chen 15

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008) 16

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland 17

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy 18

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng 19

Hình 1.12 Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng 21

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối hydroclorid của amin 6) 22

Hình 1.14 Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal 23

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ piperonal 26

Hình 3.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren từ piperonal với tác nhân amoni acetat 30

Hình 3.2 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren từ piperonal với tác nhân NaOH 31

Hình 3.3 Sơ đồ tổng hợp homopiperonylamin (6a) từ 61 dùng hệ NiCl2/NaBH4 34

Hình 3.4 Sơ đồ tổng hợp homopiperonylamin (6) từ 61 dùng hệ CuCl2/NaBH4 35

Hình 3.5 Sơ đồ tổng hợp 31 từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) sử dụng NaOH 38

Hình 3.6 Sơ đồ tổng hợp 31 từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) sử dụng

triethylamin 39

Hình 3.7 Sơ đồ tổng hợp berberin từ 31 42

Hình 3.8 Sơ đồ tổng hợp berberin từ 31 43

Hình 3.9 Sắc ký đồ berberin tổng hợp và berberin chuẩn 55

Hình 3.10 Quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid từ nguyên liệu ban đầu là piperonal 62

Hình 4.1 Cơ chế phản ứng ngưng tụ piperonal và nitromethan 63

Hình 4.2 Quá trình khử hóa nitrostyren 61 thành muối amin 6a 64

Hình 4.3 Cơ chế phản ứng khử nối đôi trong phân tử 61 bằng NaBH4 65

Hình 4.4 Cơ chế phản ứng hình thành 31 từ (6a) 67

Hình 4.5 Cơ chế phản ứng hình thành berberin (1) từ 31 68

1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Berberin là alcaloid nhân isoquinolin, có trong nhiều loài thực vật bậc cao và là hoạt chất được sử dụng lâu đời trong nền y học truyền thống Tác dụng lâm sàng phổ biến nhất của berberin là chống tiêu chảy do vi khuẩn, ký sinh trùng đường ruột Berberin còn được bào chế thành thuốc nhỏ mắt điều trị viêm kết mạc, đau mắt đỏ do kích thích bên ngoài (như gió, nắng, lạnh, bụi, khói ) và điều trị bệnh mắt hột Ngoài ra, berberin cũng có thể giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm và chống lại tác hại của vi khuẩn tả Những nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng: berberin có khả năng hạ đường huyết hiệu quả như metformin, làm giảm mạnh lượng cholesterol, triglycerid và xơ vữa, nhưng không gây ra tác dụng phụ điển hình như statin Berberin ngăn chặn sự phát triển của nhiều loại tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến sự phát triển của các tế bào bình thường [73] Ngoài ra, berberin còn có tác dụng bảo vệ tim mạch, đồng thời có tác dụng chống trầm cảm [67] Với tiềm năng to lớn trong điều trị và nghiên cứu, nhu cầu về hoạt chất berberin ngày càng tăng Người ta ước tính nhu cầu berberin hàng năm khoảng 500 tấn (năm 2010) Tuy nhiên từ năm 2012, con số này tăng đột biến, ước tính 700 tấn một năm tại Trung Quốc Trên thế giới, berberin được sản xuất bằng con đường chiết xuất từ dược liệu, nuôi cấy mô, kết hợp công nghệ khí canh và tổng hợp hóa học Tại Việt Nam, berberin được sản xuất chủ yếu bằng con đường chiết xuất

từ dược liệu (vàng đắng, hoàng liên chân gà, hoàng liên gai ) [5], [7] Tuy nhiên, do khai thác tràn lan quá mức mà chưa có chiến lược bảo tồn hợp lý, nguồn nguyên liệu chiết xuất berberin đang đứng trước nguy cơ cạn kiệt [1], [2] Do vậy, sản xuất berberin bằng con đường tổng hợp hóa học nhằm đảm bảo sự ổn định, bền vững nguồn nguyên liệu là vô cùng triển vọng và thiết thực

2

Trên thế giới, các quốc gia như Nhật Bản, Trung Quốc đã tổng hợp, thương mại hóa chế phẩm berberin từ rất lâu Ở trong nước đã có những nghiên cứu ban đầu về tổng hợp berberin qui mô phòng thí nghiệm, từ các nguồn nguyên liệu có sẵn vanilin, piperonal Tuy nhiên, hiệu suất tổng hợp toàn phần còn thấp, nên cần có thêm các nghiên cứu nhằm tối ưu hóa quy trình, nâng cao hiệu suất để có thể ứng dụng đưa vào sản xuất trong công nghiệp [9]

Để góp phần tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc và phát triển nền công

nghiệp hóa ngành dược nước nhà, chúng tôi thực hiện đề tài: ‘‘Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid đạt tiêu chuẩn dược dụng ở quy mô 50 g/mẻ” với mục tiêu sau:

Nghiên cứu xây dựng được qui trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid quy mô 50 g/mẻ đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V

3

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung về berberin clorid

1.1.1 Đặc điểm cấu trúc hóa học

- Công thức phân tử: [C20H18NO4]+Cl- (M = 373,86 đvC)

- Công thức cấu tạo [75]:

- Tên khoa học: g]isoquino[3,2-a] isoquinolin-7-ium clorid

9,10-dimethoxy-5,6-dihydro[1,3]dioxolo[4,5 Dạng dược dụng được quy định trong Dược điển Việt Nam V [4] là muối berberin clorid dihydrat, trong Dược điển Nhật bản XVII [75] và Dược điển Hàn Quốc X [76] là muối berberin clorid hydrat và muối berberin tannat

1.1.2 Tính chất hóa lý

* Tính chất vật lý

- Tinh thể hay bột kết tinh màu vàng, không mùi, vị rất đắng [4]

- Berberin clorid tan trong nước theo tỷ lệ 1/400, tan tốt trong nước nóng, ethanol, không tan trong cloroform và ether Berberin không có

C bất đối nên không có đồng phân quang học [10], [58]

- Dạng base [C20H18O4N]+OH- có nhiệt độ nóng chảy là 145°C [58]

- Berberin clorid có nhiệt độ nóng chảy là 191-192°C [60]

* Tính chất hóa học

- Hóa tính của N: Dạng base có khả năng tạo muối với các acid khác nhau, việc tạo muối berberin không giống như các alcaloid khác mà

- Hóa tính của liên kết đôi [3], [61]:

* Phản ứng cộng nucleophil vào liên kết đôi C=N+

[C20H18O4N]+Cl- + NaCN → [C20H18O4N]+CN- + NaCl

* Nhân thơm có chứa N của berberin clorid có thể bị khử bởi các

tác nhân khác nhau tạo thành hydro alcaloid không màu theo hình 1.1

Hình 1.1 Phản ứng khử berberin

- Hóa tính của oxy: Berberin kém ổn định trong môi trường kiềm mạnh,

N không vững bền, trong môi trường kiềm mạnh dễ hỗ biến mở vòng,

cho chức aldehyd gọi là berberinal theo hình 1.2

Hình 1.2 Phản ứng thủy phân berberin trong môi trường kiềm

1.1.3 Ứng dụng trong lâm sàng

5

Berberin là thuốc có hoạt tính kháng khuẩn chống viêm được chỉ định trong lâm sàng để điều trị nhiễm trùng đường ruột, tiêu chảy, lỵ, viêm ống mật [25], [19], [89], giúp ngăn ngừa nhiễm nấm, bội nhiễm nấm [28], [33]

Berberin có phổ kháng khuẩn rộng, tác dụng ức chế sự phát triển của

các chủng vi khuẩn gram (-) và gram (+) bao gồm Staphylococcus aureus, Shigella antidysenteria, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Escherichia coli [95], [46], [84], [79]

Tác dụng điều trị nhiễm khuẩn của berberin do khả năng liên kết với các protein amyloid trong màng sinh học, làm gián đoạn sự ổn định của nó và tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của kháng sinh, đồng thời cạnh tranh với LPS để gắn với TLR4 / MD-2, điều này ức chế sự viêm nhiễm trong nhiễm trùng [18]

1.1.4 Tác dụng dược lý khác

a Tác dụng hạ đường huyết

Nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng trên 36 người mắc bệnh đái tháo đường loại 2 được phân ngẫu nhiên điều trị bằng berberin hoặc metformin trong một thử nghiệm 3 tháng Tác dụng hạ đường huyết của berberin tương tự như của metformin Nhóm điều trị bằng berberin giúp giảm đáng kể hemoglobin A1c (HbA1c từ 9,5% xuống 7,5%), đường huyết lúc đói (FBG từ 10,6 ± 0,9 mmol/L xuống 6,9 ± 0,5 mmol/L), đường huyết sau bữa ăn (PBG từ 19,8 ± 1,7 mmol/L xuống 11,1 ± 0,9 mmol/L) [93]

Tác dụng hạ đường huyết của berberin dựa trên nhiều cơ chế khác nhau như bảo vệ và phục hồi chức năng tế bào 𝛽 đảo tụy, tăng cường biểu hiện

mARN insulin receptor, giảm tình trạng kháng insulin [29], [50], [74], [91],

[98] Trong tế bào gan, tế bào mỡ, berberin làm tăng tiêu thụ hoặc hấp thu glucose khi không có insulin có thể là do sự kích thích glycolysis, có liên quan đến sự ức chế quá trình oxy hóa trong ty thể [44], [90], [92] Berberin

6

cũng có thể hoạt động như một chất ức chế α-glucosidase Nó ức chế các hoạt

động disacaridase và giảm vận chuyển glucose qua biểu mô ruột [64], [65]

b Tác dụng trên hệ thần kinh

Alzheimer là chứng mất trí nhớ phổ biến nhất, đặc biệt ở người cao tuổi, hiện đang trở thành vấn đề sức khỏe được quan tâm trên toàn cầu Đây là bệnh gây tử vong ở người cao tuổi đứng hàng thứ 6 hiện nay và là một trong những bệnh tốn kém nhất cho xã hội ở các nước phát triển Berberin có thể được xem là một tác nhân đầy hứa hẹn để ứng dụng trong điều trị bệnh Alzheimer do hợp chất này sở hữu các tác dụng sinh học như chống oxy hóa,

ức chế AChE và BChE, ức chế monoamin oxidase (MAO), giảm sự kết tập

mảng β-amyloid và hạ cholesterol Thử nghiệm cho thấy sử dụng berberin

đường uống với liều 50 mg/kg thể trọng, một lần mỗi ngày, trong 14 ngày, cải thiện đáng kể tình trạng suy giảm trí nhớ trong mô hình gây bệnh Alzheimer trên chuột [40], [37], [38], [41]

Trong một mô hình chuột bị suy giảm trí nhớ gây ra bởi việc bơm acid ibotenic, sự tồn tại của các tế bào hình chóp và hạt được tăng lên rất nhiều trong vùng hippocampus (vùng liên quan tới khả năng lưu trữ, xử lý thông tin trong não) khi dùng berberin Trong một mô hình chấn thương của dây thần kinh chuột, bốn tuần sau khi sử dụng berberin (20 mg/kg, một lần mỗi ngày trong 1 tuần), độ dày của các sợi trục được cải thiện khoảng 1,4 lần ở gốc xa của vết thương [32]

c Tác dụng hạ lipid máu

Trong một nghiên cứu của 32 bệnh nhân điều trị hạ lipid máu bằng cách sử dụng berberin 500 mg, hai lần mỗi ngày trong 3 tháng Ở những bệnh nhân này, giảm đáng kể LDL, triglycerid, và tổng số cholesterol (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính và giảm 29% cholesterol toàn phần) Trong một nghiên cứu khác kéo dài 2 tháng với 63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500

7

mg hai lần mỗi ngày giảm LDL trung bình 23,8% và kết hợp của simvastatin

20 mg mỗi ngày và berberin hạ xuống LDL trung bình 31,8% [47], [66] Nghiên cứu phân tích meta thực hiện bởi Hui Dong và cộng sự đối với 14 thử nghiệm lâm sàng trên 1068 người tình nguyện, cũng chỉ ra rằng nồng độ lipoprotein cholesterol giảm rõ rệt khi được điều trị bằng berberin [27] So sánh với simvastatin, berberin cũng cho hiệu quả điều trị tương tự: TC, LDL,

TG giảm lần lượt 21,8%; 23,8%; 22,1% đối với berberin và 9,1%; 14,3%; 11,4% đối với simvastatin Mặt khác, berberin còn cho tác dụng hiệp đồng khi kết hợp với simvastatin [45]

Sử dụng đơn độc berberin hoặc kết hợp với các chế độ ăn kiêng khác giúp giảm tỷ lệ LDL trung bình từ 20% đến 30%, đồng thời có hiệu quả cho những bệnh nhân không dung nạp statin, bệnh nhân đề kháng với liệu pháp statin giúp mở ra các phương pháp điều trị thay thế cho những bệnh nhân không được chỉ định liệu pháp statin [47]

Cơ chế hạ lipid máu của berberin có thể thông qua quá trình hoạt hóa AMPK Protein kinase hoạt hóa adenosine monophosphate (AMPK), điều chỉnh chuyển hóa năng lượng bằng cách kích hoạt các con đường tạo ATP như glycolysis và oxy hóa acid béo, ức chế các con đường tiêu thụ ATP như tạo acid béo và tổng hợp cholesterol AMPK thúc đẩy chuyển vị acid béo bằng cách phosphoryl hóa hoặc bất hoạt acetyl - CoA carboxylase (ACC), làm giảm ảnh hưởng của malonyl - CoA, một chất ức chế quá trình chuyển vị, berberin giúp hoạt hóa AMPK nên giúp hạ lipid máu [83] Ngoài ra, thông qua quá trình hoạt hóa AMPK, berberin còn ức chế tổng hợp và bài tiết TG, cholesterol [17], [72], [82], [83], [88]

d Tác dụng chống ung thư

Đã có rất nhiều báo cáo về tác dụng chống ung thư của berberin Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng berberin có thể ức chế sự tăng sinh của các tế bào

8

khối u, thông qua tương tác với các mục tiêu và cơ chế khác nhau Berberin

có thể làm thay đổi biểu hiện của gen gây ung thư và các gen liên quan đến gây ung thư, bằng cách điều chỉnh lại hoạt động của adenosine protein kinase hoạt hóa monophosphate (AMPK) Berberin kích hoạt phosphoryl hóa gen ức chế khối u p53 trong các tế bào cơ trơn mạch máu Berberin cũng ức chế các

enzym liên quan đến gây ung thư

Năm 2004, berberin được chứng minh là một chất nhạy cảm của các tế bào u thần kinh đệm, làm tăng sự thành công của xạ trị trong các khối u não [80] Berberin tăng cường hoạt động của carmustin, một loại thuốc hóa trị thường được sử dụng trên các khối u não Berberin khi dùng đơn độc, tỷ lệ tiêu diệt trong tế bào nuôi cấy là 91% so với 43% cho carmustin Khi cả hai được kết hợp, tỷ lệ hiệu quả lên đến 97% [96]

Berberin làm nhạy cảm các tế bào ung thư phổi [54], gây độc tế bào đối với các tế bào ung thư cổ tử cung [55], ức chế sự tăng trưởng tế bào trong các

tế bào ung thư tuyến tụy bằng cách gây tổn thương DNA [59]

Berberin ngăn chặn sự phát triển của tế bào và gây ra quá trình

apoptosis (chết tế bào ung thư) trong các tế bào ung thư vú một cách đơn độc, hoặc tác dụng hiệp đồng với curcumin [81] Năm 2016, một nghiên cứu của Trường Y khoa Đại học Lan Châu ở Trung Quốc cho thấy rằng berberin có thể tác động tới enzym AMPK nên có thể tiêu diệt các tế bào ung thư vú Một nghiên cứu năm 2017 cho thấy, berberin có thể ức chế sự di căn và

xâm lấn của các tế bào ung thư đại trực tràng trong cơ thể và in vitro theo ba

cách: ức chế (COX-2), giảm phosphoryl hóa và ức chế biểu hiện MMP [53] Trong năm 2011, một đánh giá về tác dụng chống ung thư của berberin kết luận: đây là một tác nhân chống ung thư có triển vọng, an toàn với một số công dụng trị liệu tiềm năng [26]

e Tác dụng khác

1.2 Phương pháp sản xuất berberin

1.2.1 Phương pháp chiết xuất

Trong tự nhiên, berberin có trong thân rễ một số loài thực vật như

hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr.) hàm lượng 2,5%, hoàng liên chân

gà (Coptis chinensisFranch.) hàm lượng 4%, hoàng liên gai (Berberis wallichiaDC.) hàm lượng 3-4%, vàng đắng (Coscinium fenestratum (Gaertn.) Colebr.) hàm lượng 3,5%, lá táo ta (Ziziphus mauritiana lam.) Hiện nay,

berberin được sản xuất chủ yếu bằng con đường chiết xuất từ thân và rễ cây vàng đắng do hàm lượng berberin trong cây khá cao, phương pháp tiến hành đơn giản, nguồn nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm Phương pháp chiết xuất thường được sử dụng là chiết bằng dung dịch H2SO4 0,4% hoặc dung dịch nước vôi trong [3], [6]

1.2.2 Phương pháp sử dụng công nghệ khí canh

Nghiên cứu tại Việt Nam được tiến hành trên đối tượng cây Hoàng liên gai nhằm đánh giá khả năng sản xuất sinh khối rễ của công nghệ khí canh so với trồng bằng địa canh truyền thống Kết quả thu được cho thấy sinh khối rễ cây hoàng liên gai thu được sau trồng 1 năm trong hệ thống khí canh cao gấp 3,43 lần so với trồng bằng phương pháp địa canh truyền thống Trong hệ thống khí canh, cây Hoàng liên gai sinh trưởng tốt nhất khi nồng độ dinh dưỡng đặt ở mức 1.300 - 1.600 µs/cm với chế độ phun thích hợp nhất là phun

10

10 giây, nghỉ 15 phút [8] Phương pháp cho kết quả khá khả quan, tuy nhiên nghiên cứu mới dừng lại ở quy mô phòng thí nghiệm

1.2.3 Phương pháp tổng hợp hóa học

a Phương pháp của AméPictet và AlfonsGams (1911)

Năm 1911, hai tác giả Amé Pictet và Alfons Gams đã đưa ra quy trình

tổng hợp berberin theo sơ đồ hình 1.3 như sau [100]:

Điều kiện phản ứng: (a) PCl5; (b) KOH; (c) P2O5, 68 - 70oC; (d) Sn, HCl; (e) HCHO, HCl, Br2, CS2

Hình 1.3 Sơ đồ tổng hợp berberin của Amé Pictet và Alfons Gams

Quy trình tổng hợp: Hợp chất acyl clorid 5 thu được bằng cách clo hóa

acid 2-(3,4-dimethoxyphenyl) acetic (4) bằng PCl5 Sau đó ngưng tụ 5 với homopiperonylamin (6) trong môi trường kiềm thu được amid 7 Đun nóng 7

với với P2O5 ở 68 - 70oC thu được 8 Khử hóa 8 bằng thiếc trong HCl thu được 9 Đem 9 ngưng tụ với HCHO, chất sinh ra cho tác dụng với brom và cacbon disulfid tạo thành berberin (1) [100]

Nhược điểm: Sử dụng tác nhân nhạy cảm với nước như PCl5, P2O5; quy trình nhiều giai đoạn khó nâng cấp tổng hợp ở quy mô lớn

b Phương pháp của T Kametani và cộng sự (1969)

11

Năm 1969, T Kametani và cộng sự đưa ra quy trình tổng hợp berberin

theo sơ đồ hình 1.4 như sau [42]:

Điều kiện phản ứng: (a) 170oC, 4h; (b) POCl3, 2h; (c) NaBH4, 1h; (d) HCl/EtOH, 3h; (e) HCHO, HCl, 3h; (f) Zn, NaOH, 2h; (g) CH2N2, 48h; (h) I2, 1h

Hình 1.4 Sơ đồ tổng hợp berberin của T Kametani và cộng sự

Quy trình tổng hợp: Ngưng tụ ester 10 với homopiperonylamin (6) thu

được amid 11 Đem 11 phản ứng tiếp với POCl3 trong 2h thu được sản phẩm

đóng vòng 12 Khử hóa 12 bằng NaBH4 thu được 13 Loại bỏ nhóm bảo vệ benzyl của 13 bằng HCl đặc trong EtOH thu được 14 Chất 14 tham gia phản ứng Mannich đóng vòng tạo hợp chất 15 Xử lý 15 với Zn trong NaOH giúp

loại bỏ nhóm thế (Br-) thu được 16 Sản phẩm 16 được methyl hóa trong

12

nitromethan, chất thu được phản ứng với I2 thu được berberin iodid Hiệu suất

cả quy trình là 3% [42]

Nhược điểm: Quy trình nhiều giai đoạn, hiệu suất thấp, sử dụng nhiều

hóa chất đắt tiền (POCl3, NaBH4)

c Phương pháp của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc (1980)

Năm 1980, Viện Y học cổ truyền Trung Quốc đưa ra quy trình tổng

hợp berberin từ phenol qua 17 bước theo sơ đồ hình 1.5 [103]:

Điều kiện phản ứng: (a) Cl2/C6H6, 24 - 28oC; (b) NaOH/CuSO4; (c) HCl; (d) DCM/NaOH, 110 - 115oC; (e) 1,3,5-Trioxan HCl; (f) AcOH, hexamethylentetramin;(g) AcOH/H2O; (h) ClCH2CO2CH3, CH3ONa/CH3OH; (i) NaOH/CH3OH; (j) AcOH; (k) NH3/CH3OH; (l) H2/Ni; (m) 2,3-

13

dimethoxybenzaldehyd, H2/Ni; (n) HCl/EtOH; (o) Glyoxal, CuSO4, NaCl,

Ac2O, AcOH; (p) CaO/H2O; (q) HCl/H2O

Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp berberin của Viện Y học cổ truyền Trung Quốc

Quy trình tổng hợp: Xuất phát từ phenol (18) trải qua các quá trình clo

hóa và thủy phân tạo hợp chất catechol (21) Từ 21 phản ứng với diclomethan trong NaOH được 22, đem 22 tương tác với 1,3,5-trioxan thu 23, chất này kết hợp với hexamethylentetramin, sản phẩm 24 thu được xử lý với acid acetic thu được piperonal (25) Đem 25 ngưng tụ với ClCH2CO2CH3, sau đó thủy

phân trong môi trường kiềm và xử lý với acid acetic thu được aldehyd 28 Ngưng tụ 28 với NH3 tạo thành imin 29, khử hóa 29 bằng H2 xúc tác Ni thu

được homopiperonylamin (6) Tiếp theo, 6 được ngưng tụ với 2,3 –

dimethoxybenzaldehyd tạo imin rồi khử bằng H2, xúc tác Ni cho 30 Muối hydroclorid của 30 tham gia phản ứng đóng vòng với glyoxal được 32 Xử lí trong điều kiện thích hợp sẽ thu được berberin clorid (1) Hiệu suất toàn bộ

quy trình là 15%

Ưu điểm: Độ tinh khiết cao (trên 99%) so với phương pháp chiết xuất

(97%) Năm 1981, xí nghiệp dược phẩm Đông Bắc (Trung Quốc) đã sản xuất berberin theo quy trình này với sản lượng 30 tấn/năm

Nhược điểm: Quy trình phức tạp, hiệu suất thấp, chi phí lớn, sử dụng

nhiều tác nhân gây ô nhiễm môi trường như benzen, dimethyl sulfoxid nên

năm 1994, phương pháp này đã bị ngừng lại [52], [103]

d Phương pháp của W Liu (1981)

Nghiên cứu của W Liu và cộng sự tập trung vào rút ngắn giai đoạn chuyển

hợp chất 23 thành homopiperonylamin (6), đồng thời xuất phát từ nguyên liệu

ban đầu là catechol nên rút ngắn giai đoạn điều chế, giảm lượng hóa chất dung môi, nâng cao hiệu suất (tăng 20% so với viện y học cổ truyền Trung Quốc) [52], [103]

14

Quy trình tổng hợp được thể hiện trên sơ đồ hình 1.6 [52]:

Điều kiện phản ứng: (a) DCM, NaOH, H2O, Bu4NBr, 90 - 100oC; (b) 1,3,5- trioxan, HCl, PCl3, 70 - 90oC; (c) NaCN, NaOH, Bu4NBr, H2O; (d)

NH3, H2/Ni, CH3OH; (e) 2,3-dimethoxybenzaldehyd, H2/Ni, CH3OH; (f) Glyoxal, CuCl2, NaCl, Ac2O, AcOH; (g) NH3, H2O

Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp berberin của W Liu

Quy trình tổng hợp: Catechol (21) được đem phản ứng với DCM trong

môi trường kiềm thu được chất 22 Alkyl hóa 22 với 1,3,5-trioxan, HCl, PCl3

ở nhiệt độ 70 - 90oC thu được 23 Thực hiện phản ứng thế Cl) của 23 bởi

(-CN) sau đó khử hóa bằng H2 xúc tác Ni thu được chất 6 Ngưng tụ 6 với

2,3-dimethoxybenzaldehyd, sau đó khử hóa tiếp bằng H2 xúc tác Ni thu được 30 Đem 30 tạo phản ứng đóng vòng với glyoxal sau đó xử lý với NH3 thu được berberin

Nhược điểm: Quy trình sử dụng hợp chất cyanid độc hại (NaCN)

e Phương pháp của Z X Chen (2007)

Năm 2007, Z X Chen và các cộng sự đã nghiên cứu quy trình sản xuất berberin gồm 6 giai đoạn đi từ nguyên liệu 2,3-dimethoxylphenylmethanol

(34) hình 1.7 Quy trình này đã được đưa vào sản xuất trong công nghiệp bởi

công ty dược phẩm Changzhou Yabang, Trung Quốc [52], [101] Hiệu suất toàn bộ quy trình là 67% trong đó mỗi giai đoạn đều đạt hiệu suất trên 90%

15

Điều kiện phản ứng: (a) NaOH 30%, (CH3)2SO4, 80°C; (b) (CH2O)n/HCl, toluen, 30°C; (c) NaCN, (Bu)4NBr, toluen, 100°C; (d) CH3OH,

H2SO4, hồi lưu; (e) homopiperonylamin (6), 170°C; (f) PCl5, DCM, 40oC

Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin của Z X Chen

Quy trình tổng hợp: 2,3-dimethoxylphenylmethanol (34) được methyl

hóa bằng dimethyl sulfat trong dung dịch NaOH 30% ở 80°C trong môi

trường kiềm thu được 35 Tiếp theo 35 cho phản ứng với paraformaldehyd và HCl trong toluen ở 30°C thu được 36 Thực hiện phản ứng thế (-Cl) bằng (- CN) thu được 37, thêm tiếp CH3OH, H2SO4 thu được ester 38 Ngưng tụ 38 với homopiperonylamin (6) thu được amid 39 rồi thực hiện phản ứng đóng vòng 39 với PCl5 và DCM thu được berberin (1)

Ưu điểm: Hiệu suất cao, đã được đưa vào sản xuất trong công nghiệp Nhược điểm: Sử dụng hợp chất cyanid độc hại (NaCN), tác nhân nhạy

cảm với nước (PCl5)

g Phương pháp của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang (2008)

Sử dụng chất ban đầu là homopiperonylamin (6), hai tác giả X Bian

(2006) [13] và P Yang (2008) [88] đã độc lập đưa ra quy trình tổng hợp

berberin theo sơ đồ hình 1.8 như sau:

16

Điều kiện phản ứng: (a) 2,3-dimethoxyl benzaldehyd, 100oC, 8h; (b) NaBH4, MeOH, 5h, 60 - 80%; (c) (CHO)2, HCOOH, CuSO4, 5h; (d) CaO, MeOH, H2O, 2h; (e) HCl, EtOH, 0,5h

Hình 1.8 Sơ đồ tổng hợp berberin của Xiaolin Bian (2006) và Peng Yang

(2008) Quy trình tổng hợp: Tạo imin 40 bằng cách ngưng tụ 6 với 2,3-

dimethoxyl benzaldehyd ở 100oC trong 8h Sau đó 40 được khử hóa với

NaBH4 trong methanol trong 5h được 30 Lấy 30 cho phản ứng với glyoxal,

CuSO4 trong axit formic tạo thành berberin dưới dạng muối format Hòa tan sản phẩm trong methanol và nước, cho phản ứng với CaO rồi chuyển về dạng berberin clorid bằng HCl trong ethanol [13], [88]

Ưu điểm: Ít giai đoạn, hiệu suất cao, có thể nghiên cứu nâng cấp quy

mô tổng hợp

h Phương pháp của Alice Gatland (2014)

Năm 2014, Alice Gatland và cộng sự thuộc Phòng thí nghiệm Hóa học

- Trường đại học Oxford đã đề xuất quy trình tổng hợp berberin từ aldehyd 41

và acid 42 sử dụng xúc tác chứa Pd với hiệu suất 50% [30] Quy trình được trình bày ở sơ đồ hình 1.9 như sau:

17

Hình 1.9 Sơ đồ tổng hợp berberin của Alice Gatland

Quy trình tổng hợp: Aryl bromid 43 thu được bằng cách methyl hóa

41 rồi bảo vệ nhóm aldehyd bằng ethylenglycol, xúc tác TsOH Khử hóa acid

42 bằng BH3, tạo ester pivaloat rồi thực hiện phản ứng acyl hóa Friedel-Craft với Ac2O và ZnCl2 thu được 44

Hợp chất 43 và 44 kết hợp tạo hợp chất 45 bằng phản ứng aryl hóa với

xúc tác Cs2CO3 và (Amphos)2PdCl2 Xử lý 45 với NH4Cl ở 90oC thu được

isoquinolin 46 Tiếp tục tăng nhiệt độ lên 110oC để loại nhóm pivaloat thu được berberin Kiềm hóa bằng NaOH rồi chiết với DCM, xử lí dịch chiết với HCl thu được berberin clorid tinh khiết Bên cạnh đó, có thể tiến hành phản ứng one-pot sử dụng dung môi THF, EtOH và H2O để thu được berberin

18

clorid từ hợp chất 43 và 44 với hiệu suất 40% Hiệu suất toàn bộ quy trình là 68% tính theo 41 hoặc 50% tính theo 42 [30]

Nhược điểm: Hóa chất không sẵn có, phản ứng tiến hành phức tạp, khó

triển khai nâng cấp ở quy mô lớn

i.Phương pháp của Virshinha Reddy (2015)

Năm 2015, V Reddy và cộng sự đưa ra phương pháp tổng hợp berberin

gồm 4 giai đoạn, hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 32% như sơ đồ hình 1.10

[68]:

Điều kiện phản ứng: (a) Bu4NF, THF, 1h; (b) PdCl2(PPh3)2, CuI,

Et3N, 70oC, 3h; (c) NH4OAc, AgNO3, t-BuOH, 15h; (d) PPh3, DCM:CCl4(1:2), 12h

Hình 1.10 Sơ đồ tổng hợp berberin của Virshinha Reddy

Quy trình tổng hợp: Dẫn xuất của 2-alkynylarylethanol (49) thu được

bằng cách thủy phân loại nhóm bảo vệ của 48 với tetrabutylamoni florid, hiệu suất 88% Tiến hành phản ứng Sonogashira giữa 49 với 2,3-dimethoxy-5- bromo benzaldehyd 50 thu được hợp chất 51, hiệu suất 65% Isoquinolin 52

19

tạo thành bởi phản ứng đóng vòng 51 sử dụng xúc tác AgNO3 và NH4OAc trong alcol tert-butylic, hiệu suất 78% Cuối cùng, thực hiện phản ứng Apel

52 chuyển thành berberin, hiệu suất 72% [68]

Nhược điểm: Nguyên liệu 48 không sẵn có, sử dụng xúc tác đắt tiền, dung

môi độc hại (CCl4), hiệu suất còn thấp, khó triển khai nâng cấp ở quy mô lớn

k Phương pháp của Chen Cheng (2016)

Năm 2016, Chen Cheng và cộng sự đưa ra phương pháp tổng hợp berberin xuất phát từ nguyên liệu ban đầu là pyrocatechol, hiệu suất toàn bộ quá trình

đạt 13,6% như sơ đồ hình 1.11 [105]:

Điều kiện phản ứng: (a) CH2Cl2, DMSO, NaOH, 80oC, 4h; (b) (CH2O)n, HCl, PhCH3, 0 - 5oC, 9h; (c) C2H5ONa, CH2(COOC2H5)2, 60oC, 9h; (d) NaOH, HCl, reflux, 6h; (e) C6H5Cl, 130oC, 5h; (f) HCONH2, 180oC, 8h; (g) NaClO, C2H5OH, NaOH, 0 - 80oC, 24h; (h) 2,3-dimethoxybenzaldehyd,

CH3OH, NaBH4, 70 - 105oC, 10,5h; (i) HCOOH, CHOCHO, CuSO4, 60oC, 4,5h

Hình 1.11 Sơ đồ tổng hợp berberin của Chen Cheng

20

Quy trình tổng hợp: Đầu tiên catechol (21) phản ứng với CH2Cl2trong dung môi DMSO, môi trường kiềm ở nhiệt độ 80oC trong 4h thu được

22 Alkyl hóa 22 với paraformaldehyd, toluen, acid clohydric đậm đặc ở 0 -

5oC trong 9h được 23 Cho 23 phản ứng với C2H5ONa, CH2(COOC2H5)2 ở 60

oC trong 9h thu được ester 53 Thủy phân ester 53 với NaOH, HCl hồi lưu trong 6h thu được dẫn xuất của acid malonic 54 Cho 54 phản ứng với C6H5Cl

ở 130oC trong 5h thu được dẫn xuất của acid propionic 55 Amid 56 được tạo thành bằng phản ứng giữa 55 và formamid ở 180oC trong 8h Loại bỏ nhóm

CO của amid 56 bằng NaClO, C2H5OH, NaOH giữ ở 0 - 80oC trong 24h thu được homopiperonylamin (6) Đem 6 ngưng tụ với 2,3-dimethoxybenzaldehyd, khử hóa bằng NaBH4 thu 30, sau đó đóng vòng 30 với glyoxal thu berberin clorid (1)

Nhược điểm: Quy trình gồm nhiều giai đoạn, hiệu suất thấp, khó triển khai nâng cấp ở quy mô lớn

l Phương pháp của Chen Cheng (2017)

Năm 2017, Chen Cheng và cộng sự tiếp tục đưa ra phương pháp tổng hợp berberin gồm 5 giai đoạn, hiệu suất toàn bộ quá trình đạt 33% xuất phát

từ 1,2-methylenedioxybenzen như sơ đồ hình 1.12 [104]:

22 phản ứng với acetonitril, LiBr, CH3CN ở 32oC, trong 8h, hiệu suất đạt

77% Ziridin (57) ngưng tụ với di-tert-butyl dicarbonat trong môi trường diclometan và triethylamin khuấy trộn ở nhiệt độ phòng trong 4h thu được 58, hiệu suất đạt 93% Tiếp theo tạo thuốc thử Grignard và cho 58 tác dụng 59 thu được 60, hiệu suất đạt 78% 60 đem cho phản ứng với axit trifluoroacetic,

CH2Cl2 ở nhiệt độ phòng trong 17h thu được 6 với hiệu suất đạt 94% Ngưng

tụ 6 với 2,3-dimethoxybenzaldehyd tạo imin sau đó khử bằng NaBH4 thu

được 30, hiệu suất đạt 96% 30 đóng vòng với glyoxal trong môi trường acid

formic và CuSO4 ở 60oC trong 4,5h thu được 1, hiệu suất đạt 60%

Nhược điểm: Sử dụng hóa chất đắt tiền, dẫn chất cyanid độc hại

(CH3CN), khó triển khai nâng cấp ở quy mô lớn

1.3 Phân tích và lựa chọn phương pháp

Nhật bản và Ấn độ là quốc gia đang dẫn đầu sản xuất nguồn nguyên liệu tổng hợp berberin clorid đạt tiêu chuẩn chất lượng Hàng năm, hai quốc gia này xuất khẩu berberin clorid 1,7 tỷ USD (40 nghìn tỷ VNĐ), tương đương với lượng 21007 tấn/năm Giá trung bình của berberin clorid theo tiêu chuẩn Nhật Bản cho mỗi kg dao động từ 5.200 – 5.600 USD, theo tiêu chuẩn Anh là 100.000.000 VNĐ/1 kg Trong khi đó nguyên liệu thô mua từ Trung Quốc với giá 100USD/1kg berberin clorid tương đương 2.300.000 VNĐ/1kg

Rẻ hơn so với nguyên liệu Nhật bản 56 lần, với nguyên liệu Anh là 43 lần Qua đó, nhận thấy rằng giá nguyên liệu của berberin clorid rất khác nhau về

22

chất lượng và nhu cầu về berberin clorid đạt tiêu chuẩn chất lượng là rất lớn

Hiện nay, tại Việt Nam berberin được sản xuất chủ yếu bằng con đường chiết xuất từ dược liệu (vàng đắng, hoàng liên ) Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là nguồn nguyên liệu đang ngày càng cạn kiệt Một

số phương pháp sản xuất berberin khác như nuôi cấy mô hoặc kết hợp công nghệ khí canh đều mới chỉ thu được những kết quả ban đầu Vì vậy, thực tế đòi hỏi cần phải có một giải pháp thay thế cho phương pháp chiết xuất berberin truyền thống Một trong những hướng đi hứa hẹn nhiều triển vọng hiện nay là phương pháp tổng hợp hóa học, đặc biệt là từ những nguồn

nguyên liệu rẻ tiền, dễ kiếm

Phần lớn các quy trình tổng hợp berberin trên đều đi qua chất trung

gian homopiperonylamin (6) Đây là một mắt xích quan trọng trong tổng hợp

alcaloid nói chung, tổng hợp berberin nói riêng [12], [104]

Hình 1.13 Sơ đồ tổng hợp berberin qua hợp chất trung gian 6a (dạng muối hydroclorid của amin 6)

Hợp chất 6a có thể được tổng hợp từ các dẫn chất nitro, amid, nitril

tương ứng [48], [69], [97], [99], [106] Trong luận văn này, chúng tôi lựa

23

chọn phương pháp tổng hợp 6a đi từ nguyên liệu ban đầu là piperonal Sở dĩ

lựa chọn piperonal là do những ưu điểm về trữ lượng, giá thành, phương pháp sản xuất cũng như cách tiến hành đơn giản Năm 2017, nhóm nghiên cứu đã thực hiện thành công quy trình sản xuất berberin từ piperonal ở quy mô phòng

thí nghiệm như hình 1.14 [9]:

Điều kiện phản ứng: (a) CH3NO2, AcOH, NH4OAc, 120oC, 1,5h; (b) NaBH4, MeOH, THF, Ni2B, 25 - 30oC, 3,5h; (c) 2,3-dimethoxybenzaldehyd, NaOH, MeOH, Na2SO4, 70oC, 8h ; (d) NaBH4, MeOH, 70oC, 6h; (e) glyoxal, CuSO4, HCOOH, 100oC, 26h

Hình 1.14 Sơ đồ tổng hợp berberin từ piperonal

Sơ bộ đánh giá, chúng tôi nhận thấy qui trình tổng hợp berberin từ piperonal khá đơn giản, hiệu quả, sản phẩm đạt yêu cầu về độ tinh khiết và giới hạn tạp chất Tuy nhiên, quy trình này chỉ phù hợp với qui mô nhỏ do có một số nhược điểm là: hiệu suất ở một vài giai đoạn còn thấp, thời gian tiến hành phản ứng dài, quá trình tinh chế loại tạp còn khó khăn Chúng tôi nhận thấy cần phải khảo sát các thông số để nâng cao hiệu suất từng giai đoạn, đồng thời nghiên cứu cải tiến quy trình tổng hợp berberin clorid từ piperonal

để có thể triển khai ở qui mô lớn hơn (50 g/mẻ) và có khả năng ứng dụng trong sản xuất

Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất

25

26 Niken(II) clorid hexahydrat AR Trung Quốc

4 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ chính xác

26

10 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ

11 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ

2.2 Nội dung nghiên cứu

2.2.1 Tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm

Khảo sát các thông số tối ưu theo sơ đồ tổng hợp sau đây:

Hình 2.1 Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ piperonal

2.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học của berberin clorid tổng hợp được

2.2.3 Xây dựng qui trình tổng hợp berberin clorid quy mô 50 g/mẻ

2.2.4 Kiểm nghiệm chất lượng berberin clorid tổng hợp được

Sản phẩm berberin clorid được tiến hành kiểm nghiệm theo chuyên luận của dược điển Việt Nam V [4]

Phương pháp định lượng berberin clorid theo dược điển V là sắc ký lỏng:

Pha động: Hòa tan 3,4 g kali dihydrophosphat (TT) và 1,7 g natri

laurylsulfat (TT) trong hỗn hợp nước – acetonitril (1:1) và pha loãng thành

1000 ml với cùng dung môi

Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,010 g chế phẩm, hòa tan trong

pha động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi

Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,010 g berberin clorid chuẩn,

hòa tan trong pha động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi

28

Dung dịch phân giải: Hòa tan 1 mg berberin clorid chuẩn và 1 mg palmatin clorid chuẩn trong 10 ml pha động

Điều kiện sắc ký:

Cột kích thước (25 cm X 4 nm) được nhồi pha tĩnh c (5 µm)

Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 345 nm

Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin không lớn hơn 1,5 %

Tiến hành sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn

Tính hàm lượng berberin clorid, C20H18NO4Cl, trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng

C20H18NO4Cl trong berberin clorid chuẩn

Yêu cầu: Hàm lượng berberin trong chế phẩm từ 95,0 % đến 102,0 %

2.3 Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu

Sử dụng các phản ứng hóa học với các tác nhân phù hợp để thu được sản phẩm mong muốn

Sử dụng các phương pháp kết tinh, phân đoạn, lọc, sắc ký … để tinh chế sản phẩm đạt yêu cầu