Nghiên cứu xây dựng quy trình tổng hợp và tinh chế berberin clorid đạt tiêu chuẩn dược dụng ở quy mô 50 gmẻ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TRUNG KIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ BERBERIN CLORID ĐẠT TIÊU CHUẨN DƯỢC DỤNG Ở QUY MÔ 50 G/MẺ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC HÀ NỘI 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM TRUNG KIÊN NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG QUY TRÌNH TỔNG HỢP VÀ TINH CHẾ BERBERIN CLORID ĐẠT TIÊU CHUẨN DƯỢC DỤNG Ở QUY MÔ 50 G/MẺ LUẬN VĂN THẠC SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM VÀ BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 8720202 Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Nguyễn Đình Luyện Ths NCS Nguyễn Minh Ngọc HÀ NỘI 2019 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, tơi xin gửi lời cảm ơn tới thầy giáo PGS.TS Nguyễn Đình Luyện, Ths.NCS Nguyễn Minh Ngọc người trực tiếp hướng dẫn, bảo tận tình tạo điều kiện giúp đỡ tơi hồn thành khóa luận Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy giáo TS Nguyễn Văn Giang, TS Nguyễn Văn Hải hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi suốt thời gian thực khóa luận vừa qua Tôi xin gửi lời cảm ơn đến thầy cô giáo thuộc môn Công nghiệp Dược, thầy cô trường Đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho tơi hồn thành luận văn tốt nghiệp dạy bảo tơi tận tình suốt q trình học Cuối cùng, xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến gia đình tơi, đồng nghiệp quan nơi công tác lời cảm ơn chân thành đến bạn bè tôi, nguồn động lực thiếu, bên giúp đỡ suốt thời gian học suốt trình thực luận văn tốt nghiệp Hà Nội, tháng 03 năm 2019 Học viên Phạm Trung Kiên MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Khái quát chung berberin clorid 1.1.1 Đặc điểm cấu trúc hóa học 1.1.2 Tính chất hóa lý 1.1.3 Ứng dụng lâm sàng 1.1.4 Tác dụng dược lý khác 1.2 Phương pháp sản xuất berberin 1.2.1 Phương pháp chiết xuất 1.2.2 Phương pháp sử dụng cơng nghệ khí canh 1.2.3 Phương pháp tổng hợp hóa học 10 1.3 Phân tích lựa chọn phương pháp 21 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1.Nguyên liệu, thiết bị 24 2.1.1 Nguyên liệu 24 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ 25 2.2 Nội dung nghiên cứu 26 2.2.1 Tổng hợp tinh chế berberin clorid quy mơ phòng thí nghiệm 26 2.2.2 Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học berberin clorid tổng hợp 26 2.2.3 Xây dựng qui trình tổng hợp berberin clorid quy mô 50 g/mẻ 26 2.2.4 Kiểm nghiệm chất lượng berberin clorid tổng hợp 27 2.3 Phương pháp nghiên cứu 28 2.3.1 Tổng hợp hóa học tinh chế sản phẩm, khảo sát thông số tối ưu 28 2.3.2 Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết 29 2.3.3 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học 29 CHƯƠNG THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ 30 3.1 Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mơ phòng thí nghiệm 30 3.1.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 30 3.1.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4 methylendioxy-β-nitrostyren (61) 34 3.1.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 38 3.1.4 Tổng hợp berberin clorid (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N(2,3-dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 42 3.2 Xây dựng quy trình tinh chế berberin clorid quy mơ phòng thí nghiệm 45 3.2.1 Quy trình tiến hành: 45 3.2.2 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng 46 3.3 Xây dựng quy trình tổng hợp berberin clorid quy mô 50 g/mẻ 47 3.3.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 47 3.3.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 3,4methylendioxy-β-nitrostyren (61) 48 3.3.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 50 3.3.4 Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 52 3.4 Tinh chế sản phẩm đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 53 3.4.1 Tiến hành tinh chế sản phẩm, thử độ tinh khiết 53 3.4.2 Kiểm tra độ tinh khiết 54 3.5 Xác định cấu trúc hóa học 56 3.5.1 Xác định cấu trúc sản phẩm 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) 56 3.5.2 Xác định cấu trúc sản phẩm homopiperonylamin hydroclorid (6a) 57 3.5.3 Xác định cấu trúc sản phẩm 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 58 3.5.4 Xác định cấu trúc sản phẩm berberin (1) 59 3.6 Kiểm nghiệm đạt tiêu chuẩn theo Dược điển Việt Nam V 60 3.7 Tóm tắt quy trình tổng hợp tinh chế berberin clorid từ nguyên liệu ban đầu piperonal 62 CHƯƠNG BÀN LUẬN 63 4.1 Tổng hợp hóa học 63 4.1.1 Tổng hợp 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) từ piperonal 63 4.1.2 Tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) từ 61 64 4.1.3 Tổng hợp 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3-dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) từ homopiperonylamin hydroclorid (6a) 66 4.1.4 Tổng hợp berberin (1) từ 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3dimethoxybenzyl)ethan-1-amin hydrochlorid (31) 68 4.2 Độ tinh khiết hợp chất tổng hợp 70 4.3 Cấu trúc hóa học hợp chất tổng hợp 70 4.3.1 Hợp chất 3,4-methylendioxy-β-nitrostyren (61) 70 4.3.2 Hợp chất homopiperonylamin hydroclorid (6a) 71 4.3.3 Hợp chất 2-(benzo[d][1,3]dioxol-5-yl)-N-(2,3 dimethoxybenzyl) ethan-1-amin hydrochlorid (31) 72 4.3.4 Hợp chất berberin clorid (1) 72 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 75 TÀI LIỆU THAM KHẢO 76 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ac Acetyl ACC Acetyl coenzym-A carboxylase AChE Acetylcholinesterase ADN Acid Deoxyribonucleic AR Tiêu chuẩn phân tích (Analytical Reagent) AMPK Protein kinase hoạt hóa adenosin monophosphat (Adenosine Monophosphate-Activated Protein Kinase) BChE Butyrylcholinesterase BP 2005 Dược điển Anh 2005 (British Pharmacopoeia 2005) Bu n – Butyl COX Cyclooxygenase DCM Dicloromethan DĐVN Dược điển Việt Nam DMSO Dimethyl sulfoxid đvC đơn vị Cacbon Et Ethyl FBG Đường huyết lúc đói (Fasting blood glucose) g gam h HbA1c Hemoglobin A1c kg kilogam LDL Lipoprotein tỉ trọng thấp (Low Density Lipoprotein) LPS Phân tử gồm lipid polysaccharid (Lipopoly Saccharide) m/z Tỉ số khối lượng điện tích MAO Monoamin oxidase mARN Acid Ribonucleic thơng tin (Messenger Ribonucleic Acid) MD Kháng nguyên biệt hóa myeloid (Myeloid differentiation) Me Methyl MHz megahertz MMP Proteinase kim loại chất ngoại bào (Matrix Metalloproteinkinase) MS Khối phổ (Mass Spectrometry) NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy) PBG Đường huyết sau bữa ăn (Postprandial blood glucose) Ph Phenyl Rf Hệ số lưu giữ (Retention factor) STT Số thứ tự TC Tổng nồng độ cholesterol toàn phần (Total Cholesterol) TFA Acid trifluoroacetic TG Triglycerid TLR Thụ thể giống Toll (Toll – like receptor) Ts p-Toluensulfonyl THF Tetrahydrofuran USD đô la Mỹ SKLM Sắc ký lớp mỏng DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh mục dung môi, hóa chất 24 Bảng 2.2 Danh mục thiết bị, dụng cụ 25 Bảng 3.1 Kết tổng hợp 61 theo phương pháp 31 Bảng 3.2 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol nitromethan/piperonal tới hiệu suất phản ứng 32 Bảng 3.3 Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian tới hiệu suất phản ứng 33 Bảng 3.4 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất phản ứng 33 Bảng 3.5 Kết tổng hợp homopiperonylamin hydroclorid (6a) theo phương pháp 36 Bảng 3.6 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol NaBH4 3,4methylendioxy-β-nitrostyren (61) đến hiệu suất phản ứng 37 Bảng 3.7 Kết khảo sát ảnh hưởng xúc tác cho phản ứng khử hóa nhóm nitro 37 Bảng 3.8 Kết tổng hợp 31 theo phương pháp 40 Bảng 3.9 Kết khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol aldehyd (6a) 40 Bảng 3.10 Kết khảo sát ảnh hưởng bazơ khác đến hiệu suất phản ứng 41 Bảng 3.11 Kết khảo sát ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất phản ứng 41 Bảng 3.12 Kết tổng hợp berberin clorid (1) theo phương pháp 44 Bảng 3.13 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ mol đến hiệu suất phản ứng 44 Bảng 3.14 Khảo sát ảnh hưởng thời gian đến hiệu suất phản ứng 45 Bảng 3.15 Ảnh hưởng dung môi tới hiệu suất kết tinh 46 Bảng 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ tới quy trình tinh chế 47 Bảng 3.17 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 61 với tác nhân NaOH 48 Bảng 3.18 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 6a 50 Bảng 3.19 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 31 51 Bảng 3.20 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tổng hợp chất 53 Bảng 3.21 Kết đánh giá độ lặp lại quy trình tinh chế chất 54 Bảng 3.22 Đặc điểm sắc ký hợp chất tổng hợp 55 Bảng 3.23 Nhiệt độ nóng chảy hợp chất tổng hợp 55 Bảng 3.24 Kết phân tích cấu trúc 61 56 Bảng 3.25 Kết phân tích cấu trúc 6a 57 Bảng 3.26 Kết phân tích cấu trúc 31 58 Bảng 3.27 Kết phân tích cấu trúc 59 Bảng 3.28 Sơ định lượng hàm lượng berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V 60 Bảng 3.29 Kết kiểm nghiệm berberin clorid theo tiêu chuẩn Dược điển61 Bảng 4.1 Kết so sánh phổ 1H-NMR berberin tổng hợp phổ chuẩn berberin clorid 73 Bảng 4.2 Kết so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp phổ chuẩn berberin clorid 73 Bảng 4.3 Kết so sánh phổ 13C-NMR berberin tổng hợp phổ chuẩn berberin clorid (tiếp) 74 Phụ lục 10 Phổ 1H-NMR hợp chất 31 98 Phụ lục 11 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 2.0 – 4,5 ppm) 99 Phụ lục 12 Phổ 1H-NMR giãn rộng hợp chất 31 (vùng 5,0 – 7,5 ppm) 100 Phụ lục 13 Phổ 13C-NMR hợp chất 31 101 Phụ lục 14 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất 31 (Vùng 100 – 160 ppm) 102 Phụ lục 15 Phổ IR hợp chất 31 103 Phụ lục 16 Phổ MS hợp chất 104 Phụ lục 17 Phổ 1H-NMR hợp chất 105 106 Phụ lục 18 Phổ 13C-NMR hợp chất Phụ lục 19 Phổ 13C-NMR giãn rộng hợp chất (vùng 95 – 155 ppm) 107 Phụ lục 20 Phổ IR hợp chất 108 Phụ lục 21 Phổ chuẩn berberin theo K Hasada 109 Phụ lục 22 Kết phân tích mẫu berberin clorid chuẩn 110 Phụ lục 23 Kết phân tích mẫu berberin clorid thử 111 Phụ lục 24 Phiếu kiểm nghiệm berberin clorid Viện kiểm nghiệm thuốc Trung Ương 112 ... (giảm 25% LDL, 35% chất béo trung tính giảm 29% cholesterol toàn phần) Trong nghiên cứu khác kéo dài tháng với 63 bệnh nhân, sử dụng berberin 500 mg hai lần ngày giảm LDL trung bình 23,8% kết hợp... nhiều hóa chất đắt tiền (POCl3, NaBH4) c Phương pháp Viện Y học cổ truyền Trung Quốc (1980) Năm 1980, Viện Y học cổ truyền Trung Quốc đưa quy trình tổng hợp berberin từ phenol qua 17 bước theo sơ... đồ tổng hợp berberin T Kametani cộng 11 Hình 1.5 Sơ đồ tổng hợp berberin Viện Y học cổ truyền Trung Quốc 13 Hình 1.6 Sơ đồ tổng hợp berberin W Liu 14 Hình 1.7 Sơ đồ tổng hợp berberin Z