2.1.1. Nguyên liệu
Một số dung môi, hóa chất sử dụng để thực hiện khóa luận được trình bày trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Danh mục dung môi, hóa chất
STT Hóa chất Tiêu chuẩn Xuất xứ
1 2,3-Dimethoxybenzaldehyd AR Bỉ
2 Aceton AR Trung Quốc
3 Acid acetic AR Trung Quốc
4 Acid formic 85% AR Nga
5 Acid hydrocloric đặc DĐVN V Trung Quốc
6 Amoni acetat AR Trung Quốc
7 Amoniac AR Trung Quốc
8 n-BuOH ( Butanol) AR Trung Quốc
9 Cloroform BP 2005 Trung Quốc
10 Dicloromethan AR Trung Quốc
11 Diethyl ether AR Trung Quốc
12 Dimethylformamid AR Trung Quốc
13 Đồng clorid AR Trung Quốc
14 Đồng sulfat AR Trung Quốc
15 Ethanol 96% AR Việt Nam
16 Ethanol tuyệt đối AR Trung Quốc
17 Ethylacetat AR Trung Quốc
18 Glyoxal 40% For synthesis Bỉ
19 Kali carbonat AR Trung Quốc
25
20 Khí nitơ AR Việt Nam
21 Methanol AR Trung Quốc
22 Natri borohydrid AR Trung Quốc
23 Natri hydroxyd AR Trung Quốc
24 Natri sulfat khan AR Trung Quốc
25 Toluen AR Trung Quốc
26 Niken(II) clorid hexahydrat AR Trung Quốc
27 Ninhydrin AR Trung Quốc
28 Nitromethan AR Trung Quốc
29 Nhôm clorid khan AR Trung Quốc
30 Pyridin AR Trung Quốc
31 THF (Tetra hydro furan) AR Hàn Quốc
32 Piperonal AR Merck
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng trong khóa luận được trình bày ở bảng 2.2.
Bảng 2.2. Danh mục thiết bị, dụng cụ
STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Bản mỏng silica gel 60 F254 Đức
2 Bình sắc ký Trung Quốc
3 Bộ lọc hút chân không Trung Quốc
4 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S, độ chính xác
0,01 g Thụy Sỹ
5 Dụng cụ thủy tinh thông thường Đức
6 Đèn cồn Trung Quốc
7 Đèn soi UV sắc ký CN6 Đức
8 Tủ hotte Unilab Model TH 1300 Trung quốc
26
9 Giấy lọc Việt Nam
10 Máy cất quay chân không Buchi R210 Thụy Sỹ
11 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt Mỹ
12 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA Đức
13 Nhiệt kế thủy ngân Trung Quốc
14 Phễu lọc Đức
15 Tủ lạnh Hàn Quốc
16 Tủ sấy Memmert Đức
17 Máy đo phổ LC-MS/MS-Xevo Mỹ
18 Máy đo phổ Bruker AV 500 Thụy Sỹ
2.2. Nội dung nghiên cứu
2.2.1. Tổng hợp và tinh chế berberin clorid ở quy mô phòng thí nghiệm.
Khảo sát các thông số tối ưu theo sơ đồ tổng hợp sau đây:
Hình 2.1. Sơ đồ tổng hợp berberin clorid từ piperonal
2.2.2. Kiểm tra độ tinh khiết, xác định cấu trúc hóa học của berberin clorid tổng hợp được.
2.2.3. Xây dựng qui trình tổng hợp berberin clorid quy mô 50 g/mẻ
27
Mục tiêu là giải quyết các vấn đề khi nâng cấp quy trình và tối ưu hóa các điều kiện tiến hành. Tập trung nghiên cứu giải quyết các vấn đề sau:
+ Dung môi: Nghiên cứu thay thế các dung môi dễ cháy nổ, độc hại, đắt tiền bằng các dung môi an toàn và rẻ tiền hơn.
+ Phương thức nạp liệu: Tối ưu hóa cách thức nạp liệu cho phù hợp với từng thiết bị và điều kiện tiến hành.
+ Phân lập và tinh chế sản phẩm: Nghiên cứu phương pháp phân lập và tinh chế cho phù hợp qui mô sản xuất lớn.
+ Theo dõi điểm kết thúc phản ứng: Nghiên cứu các dấu hiệu tìm ra điểm kết thúc phản ứng.
+ Phương pháp thao tác, gia nhiệt: Biết cách thao tác và kiểm soát nhiệt độ phù hợp.
+ Thiết bị: Yêu cầu về vật liệu làm thiết bị và các loại thiết bị cần sử dụng.
+ Thu hồi, xử lý dung môi: Nghiên cứu quy trình xử lý phù hợp.
2.2.4. Kiểm nghiệm chất lượng berberin clorid tổng hợp được
Sản phẩm berberin clorid được tiến hành kiểm nghiệm theo chuyên luận của dược điển Việt Nam V [4].
Phương pháp định lượng berberin clorid theo dược điển V là sắc ký lỏng:
Pha động: Hòa tan 3,4 g kali dihydrophosphat (TT) và 1,7 g natri laurylsulfat (TT) trong hỗn hợp nước – acetonitril (1:1) và pha loãng thành 1000 ml với cùng dung môi.
Dung dịch thử: Cân chính xác khoảng 0,010 g chế phẩm, hòa tan trong pha động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,010 g berberin clorid chuẩn, hòa tan trong pha động và pha loãng thành 100,0 ml với cùng dung môi.
28
Dung dịch phân giải: Hòa tan 1 mg berberin clorid chuẩn và 1 mg palmatin clorid chuẩn trong 10 ml pha động.
Điều kiện sắc ký:
Cột kớch thước (25 cm X 4 nm) được nhồi pha tĩnh c (5 àm).
Detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước sóng 345 nm.
Nhiệt độ cột: 40 °C.
Tốc độ dòng: Điều chinh tốc độ dòng sao cho thời gian lưu của berberin khoảng 10 min.
Thể tớch tiờm: 10 àl.
Cách tiến hành:
Kiểm tra tính phù hợp của hệ thống: Tiến hành sắc ký dung dịch phân giải, thứ tự rửa giải lần lượt là pic palmatin và pic berberin, độ phân giải giữa hai pic không nhỏ hơn 1,5.
Tiêm riêng biệt 5 lần dung dịch chuẩn, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic berberin không lớn hơn 1,5 %.
Tiến hành sắc ký các dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
Tính hàm lượng berberin clorid, C20H18NO4Cl, trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn, dung dịch thử và hàm lượng C20H18NO4Cl trong berberin clorid chuẩn.
Yêu cầu: Hàm lượng berberin trong chế phẩm từ 95,0 % đến 102,0 %.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Tổng hợp hóa học và tinh chế sản phẩm, khảo sát các thông số tối ưu Sử dụng các phản ứng hóa học với các tác nhân phù hợp để thu được sản phẩm mong muốn.
Sử dụng các phương pháp kết tinh, phân đoạn, lọc, sắc ký …. để tinh chế sản phẩm đạt yêu cầu.
29 2.3.2. Phương pháp kiểm tra độ tinh khiết
Sản phẩm được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy.
a. Sắc ký lớp mỏng
- Pha tĩnh: Bản mỏng silica gel 60 F254 (Merck).
- Pha động: Hệ dung môi khai triển sử dụng
▪ n-hexan : EtOAc = 3,0 : 7,0.
▪ CH2Cl2 : CH3OH = 90,0 :1,0.
▪ n– buOH : AcOH : H2O = 9,0 : 2,0 : 2,5.
Quan sát sắc ký đồ dưới ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm, 366 nm hoặc hiện màu bằng dung dịch ninhydrin 0,1% trong ethanol hoặc dùng hơi iod.
b. Đo nhiệt độ nóng chảy
Nhiệt độ nóng chảy đo bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ-Melt (Mỹ).
2.3.3. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học
Các sản phẩm tổng hợp được xác định cấu trúc thông qua các số liệu phổ khối lượng (MS), phổ hồng ngoại (IR) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR).
Phổ khối lượng: Đo trên máy LC-MS/MS-Xevo, tại phòng Phân tích khối phổ, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, tại khoa Hóa học, trường đại học Khoa học tự nhiên, đại học Quốc gia Hà Nội, chế độ đo ESI.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: Đo trên máy Bruker AV 500, tần số 500 MHz (đối với 1H-NMR), 125 MHz (đối với 13C-NMR) tại khoa Hóa học, trường đại học Khoa học tự nhiên, đại học Quốc gia Hà Nội, dung môi DMSO.
30
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ