BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ HỒNG NGỌC ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG LIỀN VẾT THƯƠNG IN VITRO VÀ ĐIỀU TRỊ LOÉT DA MẠN TÍNH TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM CỦA CHẾ
TỔNG QUAN
Tổng quan da và bệnh loét da mạn tính
1.1.1 Cấu tạo mô học và chức năng sinh lý da
Da là một trong những cơ quan lớn nhất cơ thể, có diện tích khoảng 1,7 m 2 và nặng khoảng 15% trọng lượng cơ thể Da bao bọc toàn bộ diện tích mặt ngoài cơ thể, là hàng rào vật lý bảo vệ giữa cơ thể và môi trường, ngăn ngừa mất nước và chất điện giải, giảm sự xâm nhập của hóa chất và bảo vệ cơ thể chống lại các vi sinh vật gây bệnh Da gồm 3 lớp chính: Biểu bì, trung bì và hạ bì [14] [15]
Hình 1 1 Cấu tạo các lớp của da[14]
Biểu bì (hay thượng bì): đây là lớp ngoài cùng của da, tiếp xúc với môi trường Biểu bì là loại biểu mô sừng hóa bao gồm nhiều lớp tế bào và không có bất kì mạch máu nào Các tế bào ở lớp này được nuôi dưỡng từ các mạch máu của lớp trung bì và hạ bì Độ dày trung bình của lớp biểu bì là 0,5 - 1mm, tuy nhiên
5 có thể dày hoặc mỏng hơn do phụ thuộc vào từng da của từng vị trí trên cơ thể [14]
Biểu bì thuộc loại biểu mô lát tầng sừng hóa, gồm các dòng tế bào khác nhau tạo thành: các tế bào sừng (keratinocytes) nằm ở phía ngoài, chiếm phần lớn (khoảng 95%) và các tế bào không sừng hóa nằm ở phía trong Từ trong ra ngoài, biểu bì được chia thành 5 lớp: Lớp đáy (lớp sinh sản), lớp gai (lớp Manpighi), lớp hạt, lớp bóng và lớp sừng Biểu bì có độ dày thay đổi tùy từng vùng cơ thể, phụ thuộc vào tính chất và sức tỳ đè của môi trường xung quanh tác động vào da [14]
Trung bì: là lớp ở giữa trong cấu tạo da Đây là lớp da dày nhất, có chứa nhiều collagen và eslatin giúp cho da đàn hồi và dẻo dai Trung bì gồm nhiều tế bào xơ và mô liên kết vững chắc Tổ chức tế bào hình thoi hoặc hình sao, có thể biến thành đại thực bào đóng vai trò quan trọng bảo vệ cơ thể Trung bì được chia thành 2 lớp nhưng ranh giới không rõ ràng:
- Lớp nhú: sát với lớp biểu bì, được tạo thành bởi mô liên kết thưa gồm những sợi collagen nhỏ, những sợi chun, ít tế bào
- Lớp lưới: là mô liên kết đặc, gồm những bó sợi collagen xếp song song với mặt da, sợi chun tạo thành lưới sợi phong phú và dày đặc giữa những bó sợi collagen
Trung bì còn chứa dây thần kinh, tuyến mồ hôi, tuyến bã nhờn, nang lông, mạch máu [14]
Hạ bì: nằm dưới lớp trung bì, chứa mô liên kết và phân tử chất béo tạo nên lớp mỡ dưới da Lớp hạ bì như một lớp đệm tạo thành bởi mô liên kết thưa, nối chân bì với các cơ quan bên dưới, giúp cho da trượt lên các cơ quan này và cách nhiệt các mô bên dưới da khỏi các chấn thương cơ học và nhiệt độ Tùy từng vùng cơ thể, tùy tình trạng dinh dưỡng, lớp hạ bì có thể có những thùy mỡ tạo thành một lớp mỡ dày hay mỏng [14]
1.1.1.2 Chức năng sinh lý da
Từ các đặc điểm cấu tạo da đã trình bày trên đây, da đảm nhiệm những chức năng tương ứng như sau [15]:
- Chống lại sự cọ sát từ môi trường bên ngoài
- Chống lại sự mất nước, sự bốc hơi nước và chất điện giải, chống thấm nước
- Bảo vệ cơ thể chống tia cực tím
- Ngăn cản các loại vi khuẩn, ký sinh trùng xâm nhập vào cơ thể
- Da có sự đàn hồi và khả năng hấp thụ nước mang lại sự đầy đặn cho làn da, bảo vệ cơ thể chống lại lực nén
- Tham gia đào thải một số chất ra khỏi cơ thể (qua tuyến mồ hôi)
- Có khả năng tự liền lại khi tổn thương (các loại vết thương, bệnh lý như tiểu đường, bệnh lý tĩnh mạch )
- Giúp duy trì thân nhiệt nhờ các mạch máu và tuyến mồ hôi
- Cung cấp cảm giác nhờ dây thần kinh
Loét da mạn tính (chronic skin ulcer - CSU) là một vết thương trên da về giải phẫu và chức năng không phục hồi trong vòng 4 tuần hoặc tái phát nhiều lần [1] [2]
Sự hình thành vết loét mạn tính xảy ra do mất cân bằng giữa các yếu tố sửa chữa và tổn thương mô trong quá trình liền vết thương, dẫn đến rối loạn, gián đoạn hoặc kéo dài quá trình liền vết thương thông thường [14] [16]
1.1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng
Có nhiều yếu tố cản trở quá trình liền vết thương và được chia thành 2 nhóm: yếu tố toàn thân và yếu tố tại chỗ Trong khi yếu tố tại chỗ (giảm phân áp oxy, nhiễm khuẩn, dị vật, viêm tắc tĩnh mạch) trực tiếp ảnh hưởng đến các đặc điểm của vết loét thì yếu tố toàn thân (tuổi, giới, stress, nội tiết,…) lại mang tính cá thể, khác nhau ở từng bệnh nhân [14] [16]
Việc sử dụng corticoid toàn thân hay tại chỗ đều làm trì hoãn quá trình biểu mô hóa tại vết thương Điều này được ứng dụng để gây vết thương lâu liền hay loét da mạn tính trên động vật [16] [17]
1.1.2.3 Phân độ, đánh giá và điều trị loét da
Cho đến nay, việc phân độ của loét da mạn tính vẫn chủ yếu dựa vào phân độ của NPUAP và EPUAP về loét da mạn tính do tỳ đè Theo đó, có 2 nhóm chính (Hình 1.2) [18]:
• Nhóm có thể phân loại (4 độ): Độ I - Ban đỏ không mất màu trên da còn nguyên vẹn; Độ II - Loét nông; Độ III - Tổn thương sâu nhưng chưa vượt qua lớp cân; Độ IV - Tổn thương sâu, xâm nhập cân, cơ, xương
• Nhóm không thể phân loại: không thể phân giai đoạn (a) và nghi ngờ tổn thương mô sâu (b) Độ I Độ II Độ III Độ IV a b
Hình 1 2 Phân độ loét da mạn tính do tỳ đè [18] Đánh giá vết loét
Có nhiều công cụ được sử dụng để đánh giá tình trạng vết loét da và theo dõi quá trình liền vết thương: Thang điểm đánh giá liền vết loét do tỳ đè (Pressure Ulcer Scale for Healing – PUSH); Công cụ đánh giá vết thương Bates-Jensen
(Bates-Jensen Wound Assessment Tool – BWAT); DESIGN/DESIGN-R [19] Năm 2002, Hiệp hội loét do tỳ đè Nhật Bản (the Japanese Society of Pressure Ulcers - JPSU) giới thiệu thang điểm DESIGN được sử dụng trong phân loại và theo dõi quá trình liền vết thương mạn tính trên lâm sàng (Bảng 1.1), gồm 7 chỉ tiêu: Độ sâu (Depth); Tiết dịch (Exudate); Kích thước ( Size); Nhiễm trùng (Infection); Mô hạt (Granulation); Mô hoại tử (Necrotic tissue); Hốc (Pocket)
[29] Với ưu thế tương đối đơn giản, dễ dàng sử dụng trong quá trình đánh giá và theo dõi vết thương, thang điểm DESIGN đã đươc sử dụng trong rất nhiều nghiên cứu [7] [20]
Bảng 1.1 Hệ thống tính điểm DESIGN [20]
Chỉ tiêu DESIGN Giá trị Điểm
Depth – Độ sâu (được đo ở điểm sâu nhất của vết loét)
- Không có tổn thương khác biệt trên da và không đỏ
- Tổn thương đến chân bì
- Tổn thương đến mô dưới da
- Tổn thương đến cơ, cân, xương
(chiều dài* x chiều rộng*) mm 2
Không Triệu chứng không rõ ràng hoặc nhiễm trùng tại chỗ
Mô hạt không thể xác định vì vết thương bị liền hoặc quá nông
Mô hạt khỏe mạnh chiếm ≥ 50% diện tích vết loét
Mô hạt khỏe mạnh chiếm < 50% diện tích vết loét 6
Necrotic – Mô hoại tử Không có
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Mẫu nghiên cứu: Dầu dừa nguyên chất Xuất xứ: Việt Nam Lọ 120 ml Số lô sản xuất: 02/01/23 Ngày sản xuất: 02/01/23 Hạn sử dụng: 02/01/24 Tiêu chuẩn ISO 22000:2018 (Phụ lục 1)
Thành phần: Dầu dừa nguyên chất Bảo quản thuốc nơi khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp, nhiệt độ ≤ 300C
2.1.2 Máy móc và hoá chất nghiên cứu
- Môi trường nuôi cấy Dulbecco's Modified Eagle Medium - Highglucose (DMEM HG) - xuất xứ: PAN-Biotech- Đức
- Dung dịch đệm phệm phosphate PBS - xuất xứ: PAN-Biotech
- Đĩa 24 giếng, 96 giếng - xuất xứ: SPL - Hàn Quốc
- Dụng cụ tạo vết rạch SPL Scar – Hàn Quốc
- Máy đo độ hấp thụ - Hidex
- Dimethyl sulfate (DMSO) 99% (Kanto Chemical Co., Inc., Nhật Bản);
- Doxorubicin (Doxorubicin “Ebewe” 50 mg/25 ml, Áo);
- Thuốc gây mê cloralhydrat (Trung Quốc);
- Dung dịch truyền tĩnh mạch natri clorid 0,9% của công ty TNHH B Braun, Việt Nam;
- Kit định lượng các enzym và chất chuyển hoá trong máu: ALT (alanin aminotransferase); AST (aspartat aminotransferase); bilirubin toàn phần; albumin; cholesterol toàn phần; và creatinin của hãng Erba, định lượng trên máy sinh hóa bán tự động Erba của Ấn Độ
- Các dung dịch xét nghiệm máu của hãng Horiba Medical, định lượng trên máy phân tích huyết học ABX Micros 60 ES của hãng Horiba Medical (Pháp)
- Kính hiển vi soi ngược - Carl Zeiss – Đức
- Kính hiển vi quang học – Carl Zeiss – Đức
- Tủ nuôi cấy – Eppendorf – Đức
- Tủ an toàn sinh học cấp 2 – ESCO
- Máy lắc, Máy ly tâm tế bào – Labnet
- Máy scan HP G2410 do công ty Hewlett-Packard sản xuất
- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến Specord210 (AnalytikJena, Đức)
- Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học
Nguyên bào sợi chuột STO (American Type Culture Collection (ATCC)) được bảo quản tại phòng Công nghệ tế bào động vật - Khoa sinh học- Đại học khoa học Tự nhiên- Đại học quốc gia Hà Nội Tế bào được nuôi cấy trong điều kiện môi trường: DMEM HG có bổ sung 10% FBS (v/v) +1% kháng sinh (50 U/ml penicillin – 50 ug/ml streptomycin) + 0,1% β (v/v) và duy trì trong điều kiện
Chuột nhắt trắng chủng Swiss Albino, cả hai giống, khoẻ mạnh, trọng lượng 35g ± 2g được cung cấp bởi Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương Động vật thí nghiệm được nuôi 7 ngày trước khi nghiên cứu và trong suốt thời gian nghiên cứu trong điều kiện nhiệt độ duy trì 25 ± 1˚C, độ ẩm không khí và ánh sáng thích hợp Động vật thí nghiệm được nuôi bằng thức ăn tiêu chuẩn do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung Ương cung cấp và được uống nước tự do theo nhu cầu, tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội.
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1.Đánh giá tác động của Dầu dừa lên tế bào trên mô hình liền vết thương in vitro
Thí nghiệm đánh giá tác động liền vết thương của Dầu dừa trên mô hình in vitro gồm ba bước:
1) Tìm nồng độ và cách thức pha trộn phù hợp để thu được hỗn hợp phân tán đều của Dầu dừa trong môi trường;
2) Xác định độc tính và nồng độ thích hợp của Dầu dừa đảm bảo duy trì sức sống của tế bào (limit test);
3) Thử nghiệm tác động liền vết thương của Dầu dừa trên mô hình in vitro với nồng độ không gây độc với tế bào
Toàn bộ thí nghiệm được khái quát ở Hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ quy trình thử nghiệm đánh giá tác động của Dầu dừa trên mô hình liền vết thương in vitro
2.2.1.1 Xác định nồng độ và cách thức pha trộn Dầu dừa phù hợp
Các bước thực hiện được mô tả trong hình 2.2
Bước 1: Dùng pipet hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ trong đĩa nuôi cấy Bước 2: Rửa 2 lần bằng dung dịch PBS (1ml) để loại bỏ tế bào chết
Bước 3: Thêm 1ml enzym trysin để bong tế bào
Xác định nồng độ và cách thức pha trộn Dầu dừa phù hợp
Xác định độc tính và nồng độ thích hợp của Dầu dừa đảm bảo duy trì sức sống của tế bào (limit test)
Thử nghiệm tác động liền vết thương của Dầu dừa trên mô hình in vitro
Chuẩn bị tế bào: Hoạt hóa tế bào và cấy chuyển vào đĩa 96 giếng
Chờ 1 thời gian (2-3 phút) đến khi 80-90% tế bào co tròn và tách ra khỏi bề mặt nuôi cấy, dùng pipet đánh tan làm đơn tế bào
Bước 4: Bất hoạt trysin với 2 lần thể tích môi trường có bổ sung 10% FBS Bước 5: Chuyển vào ống ly tâm, ly tâm để thu pellet, ly tâm 1200xg, 5 phút tại nhiệt độ phòng
Bước 6: Loại bỏ dịch nổi, tái huyền phù bằng 1mL môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh
Hút 20 μL dịch huyền phù vào ống và đếm tế bào, tính lượng tế bào thu được
Hình 2 2 Chuẩn bị tế bào
Sau đó, cấy tế bào vào đĩa 96 giếng trong với mật độ 100.000 tế bào/100àL/giếng Nuụi tế bào ở 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ
* Xác định chất thử và cách pha dải nồng độ thử nghiệm
Nồng độ Dầu dừa gốc là 100%
Tạo hỗn hợp nhũ tương: Dầu dừa -Tween 80-DMEM HG
Dầu dừa được nhũ tương hóa trong chất hoạt động bề mặt là Tween 80, trộn và khuấy bằng máy khuấy từ với tốc độ 400 vòng/phút, 45°C trong 30 phút Sau đó, môi trường DMEM HG được thêm vào để tăng tổng thể tích nhũ tương Nhũ
33 tương đạt yêu cầu để được tiếp tục dùng cho tiến hành thử nghiệm cần đồng nhất trong hỗn hợp, không phân tách pha
Từ nhũ tương được chọn, tiến hành pha loãng dầu dừa thành dải nồng độ trong môi trường nuôi cấy tế bào DMEM HG + 10% FBS + agarose ở các nồng độ khác nhau, để lựa chọn tỉ lệ dầu dừa: Tween 80: DMEM HG và nồng độ agarose tối ưu cho suốt quá trình thử nghiệm khả năng sống tế bào và thử nghiệm liền vết thương của dầu dừa
Các tỉ lệ dầu dừa: Tween 80: DMEM HG tiến hành pha bao gồm 1:1:3, 2:1:7, 3:1:6, 3:2:5, 4:1:5, 5:1:4, 9:1:10 và các nồng độ khác nhau của agarose
Quan sát độ tách lớp, độ mịn nhũ tương 48h sau khi pha, lựa chọn tỉ lệ dầu dừa:Tween 80:DMEM HG và nồng độ agarose trong dung môi DMEM HG tối ưu để tiến hành thử nghiệm
2.2.1.2 Xác định độc tính và nồng độ thích hợp của Dầu dừa đảm bảo duy trì sức sống của tế bào (limit test)
Nguyên tắc: Phương pháp đánh giá tác động của Dầu dừa dựa trên mô hình thử nghiệm xác định khả năng sống tế bào bằng thuốc thử MTT theo Ahmad Zunairah và cộng sự [12] và tiêu chuẩn ISO 10993 Tế bào STO được cấy lên các giếng với mật độ tương đương nhau và nuôi trong môi trường chứa Dầu dừa với nồng độ khác nhau, có mẫu đối chứng Nếu Dầu dừa gây độc cho da thì sẽ làm lượng tế bào giảm dần theo thời gian
Quy trình: Để xác định khoảng nồng độ gây tác động tới tế bào, trước tiên, chúng tôi tiến hành thí nghiệm limit test, xác định nồng độ cao nhất không gây ảnh hưởng và nồng độ thấp nhất gây ức chế hoàn toàn Các bước thí nghiệm được khái quát ở Hình 2.3
Các tế bào STO được cấy chuyển vào đĩa 96 giếng với mật độ 1 × 10 5 tế bào/giếng và được ủ ở 37°C, 5% CO2 trong 24 giờ
Sau khi tế bào bám dính và bao phủ toàn bộ bề mặt giếng
Hút bỏ môi trường cũ, rửa lại bằng PBS
Các tế bào được nuôi cấy tiếp 24h, chia thành các nhóm (mỗi nhóm 8 giếng):
+ Nhóm đối chứng 1 (ĐC1– đối chứng sinh học): tế bào STO được nuôi trong mụi trường DMEM HG cú 10% FBS (200 àL/giếng)
+ Nhóm đối chứng 2 (ĐC2– đối chứng môi trường): tế bào STO được nuôi trong mụi trường 0,125% agarose/DMEM HG cú 10% FBS (200 àL/giếng)
+ Nhóm đối chứng 3 (ĐC3– đối chứng dung môi): tế bào STO bổ sung hỗn hợp Tween 80 + agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS (200 àL/giếng) với nồng độ Tween 80 tương ứng với dải nồng độ Tween 80 trong MT
+ Nhóm thử (MT): tế bào STO được bổ sung thêm nhũ tương dầu dừa 200 àL/giếng (dải nồng độ dựa trờn kết quả thử nghiệm limit test đó trỡnh bày ở trờn) Đĩa tế bào được nuôi ở 37°C, 5% CO2 trong 48 giờ
Sau đú, loại bỏ dịch chiết trong cỏc giếng, thờm 100 àL mụi trường nuụi cấy DMEM HG cú 10% FBS và 10 àL dung dịch MTT vào mỗi giếng, đem ủ ở 37°C trong 3 - 4 giờ
Các tinh thể formazan màu xanh tím được tạo ra Hút bỏ toàn bộ dung dịch trong cỏc giếng và và thay thế bằng 100 àL DMSO trong mỗi giếng
Mang đĩa đi lắc 250 vòng/phút trong 10 phút Đo OD độ hấp thụ ở bước sóng 570nm
Khả năng tồn tại của tế bào theo phương trình:
Khả năng tồn tại của tế bào (%) = (Mẫu thử⁄Mẫu đối chứng) × 100 %
Tính giá trị IC0, IC10, IC50 để lựa chọn nồng độ cho thử nghiệm liền vết thương tiếp theo
Hình 2.3 Sơ đồ các bước thử nghiệm limit test
2.2.1.3 Đánh giá tác động của Dầu dừa trên mô hình liền vết thương in vitro Nguyên tắc: Nghiên cứu áp dụng trên phương pháp xét nghiệm liền vết thương
(wound healing assay) Khi tạo vết rách trên vùng tế bào mật độ dày, tế bào có xu hướng di chuyển vào vết rách [80]
Cho vào mỗi giếng tế bào 200 àL hóa chất đã chuẩn bị Đem ủ 48 giờ ở 37°C, 5% CO2
Loại bỏ dịch trong cỏc giếng Thờm 100 àL mụi trường nuụi cấy cú huyết thanh và 10 àL dung dịch MTT vào mỗi giếng Đem ủ 3-4 giờ ở 37°C, 5% CO2
Các tinh thể formazan màu xanh tím được tạo ra Hút bỏ toàn bộ dung dịch trong các giếng và thay thế bằng dung dịch DMSO 100 àL/giếng
Cho đĩa lên máy lắc với tốc độ 250 vòng/phút trong 10 phút Đo mật độ quang (OD) ở bước sóng 570 nm
Tính giá trị IC0, IC10, IC50 để tiến hành thử nghiệm tiếp theo
Các tế bào STO được nuôi cấy và cấy chuyển vào đĩa 24 giếng với mật độ
3 × 10 5 tế bào/giếng Quá trình thực hiện được khái quát trong Hình 2.4
Sau khi tế bào bám dính và bao phủ toàn bộ bề mặt giếng, tiến hành tạo vết thương in vitro bằng dụng cụ tạo vết rạch chuyên dụng SPL Scar với kích thước vết rạch khoảng 0,7mm Đầu của SPL Scar có dạng lược nhọn đi cùng là nắp chuyên dụng có khoảng trống vừa cho lược đi qua Đặt đầu lược vào sát cạnh của giếng, kéo xuống sao cho chạm đến cạnh còn lại của giếng Rửa lại bằng PBS Bộ dụng cụ SPL Scar có 2 loại dành cho đĩa 24 giếng và đĩa 6 giếng, gồm 1 nắp với khe hở định hình cho vết rạch được tạo bằng chiếc cào đi cùng Lựa chọn sử bộ dụng cụ cho đĩa 24 giếng giúp tăng số lượng vết rạch đạt yêu cầu cũng chính là tăng số lượng hóa chất có thể đánh giá trong 1 lần
Sau khi tạo vết thương, tế bào STO được nuôi cấy tiếp trong 6 nhóm: + Nhóm đối chứng 1 (ĐC1): Tế bào STO được nuôi trong môi trường DMEM
+Nhóm đối chứng 2 (ĐC2): Tế bào STO trong môi trường DMEM có 10% FBS và agarose 0,125%
+ Các nhóm đối chứng 3 (ĐC3): Tế bào STO trong môi trường DMEM có 10% FBS, agarose 0,125% và Tween 80 có nồng độ tương ứng với nồng độ của Tween
80 trong các nhóm mẫu thử (MT)
+ Các nhóm mẫu thử (MT): mỗi nhóm chứa Tế bào STO trong dầu dừa ở nồng độ IC0 và IC10
Hình ảnh vết rạch được tạo được thu lại ở các thời điểm sau khi rạch 0h, 12h, 14h, 16h, 18h và 22h sau khi rạch Chụp ảnh vết rạch thông qua kính hiển vi soi ngược với vật kính 5x sẽ quan sát khu vực vết thương rộng hơn so với việc sử dụng các vật kính lớn
Xử lý kết quả hình ảnh sau khi thu được bằng phần mềm MRI_Wound Healing Tool của ImageJ Macro nhằm xác định diện tích các vết thương tại vị trí đánh dấu qua các khung giờ để từ đó đánh giá được sự ảnh hưởng của dịch chiết lên khả năng làm lành vết thương của tế bào Kết quả thu được là ảnh hiển thị khu vực không chứa tế bào và bảng kết quả diện tích vết thương
Xử lý số liệu thu được và xây dựng đồ thị bằng phần mềm Microsoft Excel
Tỷ lệ đóng vết thương được tính bằng phương trình:
%Đóng vết thương = (W0h – Wxh)/ Wxh × 100 %
W0h = Diện tích vết thương lúc 0 giờ
Wxh = Diện tích vết thương ở ‘x’ h (‘x’ = 0h, 12h, 14h, 16h, 18h, 22h)
Hình 2.4 Sơ đồ các bước thử nghiệm liền vết thương in vitro
B5: Thu kết quả B4: Thu và xử lý hình ảnh
B1: Nuôi cấy tế bào trong đĩa 24 giếng
B2: Tạo vết rạch bằng bộ dụng cụ SPL Scar B3: Nuôi tế bào trong đĩa đã tạo vết rạch với mẫu thử
2.2.2 Đánh giá tác dụng điều trị tại chỗ và ảnh hưởng toàn thân của Dầu dừa trên mô hình gây loét da mạn tính ở động vật thực nghiệm
2.2.2.1 Xác định tác dụng điều trị tại chỗ
Nguyên tắc: Mô hình được tiến hành dựa trên các nghiên cứu trước đó gây loét da bằng doxorubicin trên chuột nhắt trắng [81] [55]
Cách tiến hành: Chuột nhắt trắng cả hai giống được chia ngẫu nhiên thành 5 lô, mỗi lô 10 con Vùng lưng của chuột được cạo bằng máy cạo râu điện và khử trùng bằng cồn 70%
- Lô 1 (chứng sinh học) (n): Tiêm trong da nước muối sinh lý, không bôi thuốc thử
- Lô 2 (mô hình) (n): Tiêm trong da một lần 0,2ml doxorubicin liều 2mg/ml, để liền vết loét tự nhiên
- Lô 3 (chứng dương) (n): Tiêm trong da một lần 0,2ml doxorubicin liều 2mg/ml, để vết loét tiến triển trong 7 ngày Sau đó, nhỏ 0,1 ml DMSO lên vùng bị loét, ngày nhỏ 2 lần, dùng trong vòng 21 ngày Nhỏ DMSO đảm bảo bao phủ vết loét, không băng bó sau khi nhỏ DMSO
Phân tích xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng Microsoft Excel, GraphPad Prism 8 và sử dụng SigmaPlot 12.0 (SYSTAT Software Inc, Richmond, CA, USA) để phân tích Kết quả được biểu thị dưới dạng giá trị trung bình ± SD hoặc trung vị (các tứ phân vị)
Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (ONE WAY ANOVA) sau đó sử dụng test hậu kiểm Student-
Newman-Keuls để so sánh từng cặp hoặc dùng Kruskall-Wallis và sử dụng Mann- Whitney U-test để so sánh từng cặp
Kết quả sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p < 0,05
Địa điểm – thời gian nghiên cứu nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Dược lý - Trường Đại học Y Hà Nội và Khoa Sinh học – trường Đại học Khoa học tự nhiên – Đại học Quốc Gia Hà Nội
Các xét nghiệm vi thể được thực hiện tại Khoa Giải phẫu bệnh - Bệnh viện
103 (do ThS BS Nguyễn Thành Chung đọc kết quả vi thể)
Thời gian nghiên cứu: Tháng 4-9/2023
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành hoàn toàn vì mục đích y học, thử nghiệm sản phẩm trên động vật trước khi tiến hành trên người Động vật nghiên cứu được chăm sóc đúng quy định và không tiến hành trên động vật cái mang thai
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Tác động của Dầu dừa lên tế bào trên mô hình liền vết thương in
Qua thí nghiệm limit test, chúng tôi đã xác định được khoảng nồng độ Dầu dừa gây ảnh hưởng đến sự tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi chuột (nồng độ cao nhất không gây ảnh hưởng và nồng độ thấp nhất gây ảnh hưởng 100%) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần, kết quả được xử lý bằng phần mềm GraphPad Prism 8, chúng tôi tính toán được giá trị IC50, IC10 và IC0 của chất thử để sử dụng cho thí nghiệm kiểm tra sự tác động của chất thử đến khả năng làm lành vết thương
Hình 3.1 Biểu đồ thể hiện đáp ứng liều của các nhóm mẫu thử
Chú thích: ĐC1: DMEM HG + 10% FBS; ĐC2: Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS; ĐC3: Tween 80 + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS;
MT: Dầu dừa + Tween 80 + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS Nhận xét: Từ kết quả đường cong đáp ứng liều, chúng tôi nhận thấy agarose
0,125% (ĐC2) hầu như không ảnh hưởng tế bào, được so sánh với đối chứng là môi trường nuôi cấy tế bào ĐC1 Tuy nhiên, nhóm mẫu thử MT và nhóm ĐC3 có gây ảnh hưởng độc hơn so với nhóm ĐC1 và ĐC2 Nhóm MT ít độc hơn so
45 với ĐC3 Từ kết quả tính toán bằng Grapad Prism 8 và biểu đồ vẽ được, ta có các nồng độ Dầu dừa tại IC0 là 0,018% (v/v), IC10 là 0,053% và IC50 là 0,122%
Chúng tôi đánh giá sự tác động của các nồng độ khác nhau của Dầu dừa lên tế bào thể hiện qua hình ảnh tế bào sau 48h phơi nhiễm với hóa chất, được quan sát bằng kính hiển vi Chúng tôi quan sát hình thái và mật độ tế bào trên đĩa 96 giếng và nhận thấy có sự thay đổi rõ rệt về mật độ và hình thái tế bào đối với các nồng độ khác nhau của mẫu thử, so sánh với các đối chứng (Hình 3.3) ĐC1 ĐC2
Hình 3.2 Một số hình ảnh tế bào nhóm ĐC1 và ĐC2 sau 48h ĐC3 nồng độ 0,0042 % ĐC3 nồng độ 0,0167% ĐC3 nồng độ 0,0417% ĐC3 nồng độ 0,0667%
Hình 3.3 Một số hình ảnh tế bào nhóm ĐC3 sau 48h
Hình 3.4 Một số hình ảnh tế bào sau khi phơi nhiễm 48h với các nồng độ
Chú thích: ĐC1 chứa DMEM HG + 10% FBS ĐC2 chứa Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS ĐC3 chứa Tween 80 + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
MT chứa Dầu dừa + Tween 80 + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS với tỉ lệ Dầu dừa:Tween 80 là 3:1
Hình ảnh mật độ tế bào STO ở MT 0,0125% dày hơn so với STO ở ĐC3 nồng độ 0,0042%
Tương tự, ở MT 0,05% và MT 0,125% cho hình ảnh mật độ tế bào STO dày hơn so với STO tại ĐC3 nồng độ 0,0167% và ĐC3 nồng độ 0,0417%
Tại MT 0,2% và ĐC3 nồng độ 0,0667%, trên hình ảnh thu được không còn thấy sự xuất hiện của tế bào STO So sánh với kết quả đo mật độ quang OD ở bước sóng 570 nm ở cùng nồng độ phơi nhiễm với tế bào cho kết quả có sự liên
47 quan giữa khả năng sống của tế bào đo được (%) với hình ảnh tế bào quan sát bằng kính hiển vi
Từ kết quả đánh giá độc tính tế bào, chúng tôi sử dụng hai nồng độ IC0 và
IC10 là khoảng nồng độ không gây biến đổi hình dạng tế bào để kiểm tra tác động của Dầu dừa lên khả năng di chuyển vào vị trí vết thương in vitro của tế bào nguyên bào sợi chuột (IC0 của Dầu dừa là 0,018% (v/v) và IC10 là 0,053%, tương ứng với nồng độ Tween 80 trong đó là 0,006% và 0,018%) Kết quả hình ảnh tế bào thu nhận được sau khi tạo vết thương và phơi nhiễm với mẫu thử tại các thời điểm sau 12 giờ đến 22 giờ có sự khác biệt so với đối chứng (Hình 3.4)
Hình ảnh chụp vết rạch tại 4 thời điểm 0 giờ; 12 giờ; 18 giờ và 22 giờ sau khi phơi nhiễm với Dầu dừa (MT)
Hình 3.5 Hình ảnh chụp vết rạch tại 4 thời điểm 0, 12, 18 và 22 giờ của nhóm ĐC1 và ĐC2
Hình 3.6 Hình ảnh chụp vết rạch tại 4 thời điểm 0, 12, 18 và 22 giờ của nhóm ĐC3.1 và ĐC3.2
Hình 3.7 Hình ảnh chụp vết rạch tại 4 thời điểm 0, 12, 18 và 22 giờ của nhóm MT1 và MT2
Chú thích: ĐC1 chứa DMEM HG + 10% FBS ĐC2 chứa Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS ĐC3.1 chứa Tween 80 nồng độ 0,006% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS ĐC3.2 chứa Tween 80 nồng độ 0,018% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
MT1 chứa Dầu dừa 0,018% + Tween 80 nồng độ 0,006% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
MT2 chứa Dầu dừa 0,053% + Tween 80 nồng độ 0,018% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
Nhận xét: Vết thương ở các giếng tại lúc ngay sau khi rạch (tại thời điểm 0 giờ) có độ rộng và kích thước tương đương nhau Giếng ĐC1 và ĐC2 có khả năng phục hồi tương tự nhau, chứng tỏ hàm lượng agarose trong mẫu thử không gây ảnh hưởng tới khả năng phục hồi vết thương của tế bào Vết rạch trong giếng MT1 phục hồi nhanh hơn giếng ĐC1 và ĐC2 Tuy nhiên giếng MT2, ĐC3.1 và ĐC3.2 chậm liền vết rạch hơn Để phân tích chi tiết và xác định diện tích vết thương còn lại sau các giờ theo dõi, chúng tôi đã tiến hành xử lý các hình ảnh trên bằng công cụ MRI_Wound Healing Tool của ImageJ Số liệu thu được xử lý tiếp bằng phần mềm Micosoft Excel 2016 và đồ thị được xây dựng bằng phần mềm GraphPad Prism 8 (hình 3)
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn phần trăm diện tích vết rạch còn lại sau khi phơi nhiễm với hóa chất tại các khung giờ
Chú thích: ĐC1 chứa DMEM HG + 10% FBS ĐC2 chứa Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS ĐC3.1 chứa Tween 80 nồng độ 0,006% + Agarose 0,125% + DMEM HG +
10% FBS ĐC3.2 chứa Tween 80 nồng độ 0,018% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
MT1 chứa Dầu dừa 0,018% + Tween 80 nồng độ 0,006% + Agarose 0,125%
MT2 chứa Dầu dừa 0,053% + Tween 80 nồng độ 0,018% + Agarose 0,125% + DMEM HG + 10% FBS
Vết thương ở các giếng tại lúc ngay sau khi rạch (tại thời điểm 0 giờ) có độ rộng và kích thước tương đương nhau Tỉ lệ phục hồi vết thương được thể hiện ở
51 đồ thị biểu diễn phần trăm diện tích vết rạch sau khi phơi nhiễm với hóa chất tại các khung giờ 0h, 12h, 14h, 16h, 18h, 20h, 22h (Hình 3 ) Tế bào trong giếng ĐC1 và ĐC2 có khả năng phục hồi tương tự nhau, chứng tỏ hàm lượng agarose 0,125% trong mẫu thử không gây ảnh hưởng tới khả năng phục hồi vết thương của tế bào
Khả năng phục hồi vết thương ở giếng chứa MT1 nhanh hơn so với giếng ĐC1, ĐC2, cụ thể: tỉ lệ phục hồi vết thương sau 22 giờ ở giếng phơi nhiễm MT1 nồng độ 0,018% là 96.5%±5%, giếng ĐC1 và ĐC2 lần lượt là 93.5%±5% và 89.5%±5% Tuy nhiên, khả năng phục hồi vết thương ở giếng MT2, ĐC3.1 và ĐC3.2 chậm hơn, cụ thể: tỉ lệ phục hồi vết thương sau 22 giờ ở giếng MT2 nồng độ 0,053%, ĐC3.1 nồng độ 0,006% và ĐC3.2 nồng độ 0,018% lần lượt là 80,5%±5%; 72,59%±5% và 68,5%±5% Ngoài ra, chúng tôi sử dụng kiểm định Anova: Two-Factor With Replication để kiểm tra sự khác biệt về tỉ lệ phục hồi vết thương ở các giếng có tế bào phơi nhiễm với mẫu thử và các giếng đối chứng, kết quả cho thấy, sự khác biệt này là mang ý nghĩa thống kê và sai số giữa các giếng đối chứng với các giếng tế bào có phơi nhiễm agarose 0,125% là ngẫu nhiên, không mang ý nghĩa thống kê.
Tác dụng điều trị tại chỗ và ảnh hưởng toàn thân của Dầu dừa trên mô hình gây loét da bằng doxorubicin ở động vật thực nghiệm
3.2.1 Tác dụng điều trị tại chỗ của Dầu dừa trên mô hình gây loét da bằng doxorubicin ở động vật thực nghiệm
3.2.1.1 Tác dụng điều trị tại chỗ của Dầu dừa thể hiện qua sự thay đổi tổng điểm DESIGN và hình ảnh đại thể của vết loét tại các thời điểm nghiên cứu
Bảng 3.1 So sánh tổng điểm DESIGN giữa các nhóm sau 14 và 21 ngày
Lô chuột DESIGN (± SD) điểm
Lô 3: Lô chứng dương bôi DMSO 22,30 ± 2,18 10,05 ± 3,25 1,75 ± 2,54 p so với lô 2 > 0,05 0,05
Lô 5: Bôi Dầu dừa liều
21,95 ± 1,90 9,95 ± 2,32 1,95 ± 1,85 p so với lô 2 > 0,05 0,05 >0,05 p so với lô 4 > 0,05 >0,05 >0,05
Nhận xét: Kết quả bảng 3.1 cho thấy:
Tại thời điểm trước khi bôi thuốc thử, tổng điểm DESIGN không có sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu (p>0,05)
Sau 14 ngày điều trị, tổng điểm DESIGN ở lô bôi DMSO liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và lô bôi thuốc thử Dầu dừa liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và liều 0,2 ml/lần,
2 lần/ngày giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 p so với lô 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Lô 5: Bôi Dầu dừa liều 0,2 ml/lần,
7,09 ± 4,20 p so với lô 2 > 0,05 > 0,05 < 0,05 < 0,01 p so với lô 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p so với lô 4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Nhận xét: Kết quả bảng 3.2 cho thấy
- Tại thời điểm trước khi bôi thuốc thử và thời điểm sau 7 ngày bôi thuốc thử, diện tích vết loét da không có sự khác biệt giữa các lô nghiên cứu (p>0,05)
- Tại thời điểm sau 14 ngày bôi thuốc thử, diện tích vết loét ở lô bôi DMSO liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và lô bôi thuốc thử Dầu dừa liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày
56 và liều 0,2 ml/lần, 2 lần/ngày giảm có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p0,05)
- Tại thời điểm sau 21 ngày bôi thuốc thử, DMSO và Dầu dừa cả 2 mức liều đều có tác dụng làm giảm diện tích tổn thương da rõ rệt so với lô mô hình tại cùng thời điểm, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p0,05)
3.2.1.3 Tác dụng của Dầu dừa đến nồng độ hydroxyprolin tại mô tổn thương
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của Dầu dừa đến nồng độ hydroxyprolin trong da chuột
Lô chuột n Nồng độ hydroxyprolin trong da chuột (mg/g da) (x̅ ± SD)
Lô 2: Mô hình 10 14,26 ± 2,32 p so với lô 1 < 0,001
Lô 3: Bôi DMSO liều 0,1 ml/lần,
17,33 ± 1,90 p so với lô 1 < 0,01 p so với lô 2 < 0,05
Lô 4: Bôi Dầu dừa liều 0,1 ml/lần,
16,47 ± 2,20 p so với lô 1 < 0,001 p so với lô 2 < 0,05 p so với lô 3 > 0,05
Lô 5: Bôi Dầu dừa liều 0,2 ml/lần,
17,60 ± 2,85 p so với lô 1 < 0,01 p so với lô 2 < 0,05 p so với lô 3 > 0,05 p so với lô 4 > 0,05
Kết quả bảng 3.3 cho thấy:
- Tại thời điểm kết thúc nghiên cứu, nồng độ hydroxyprolin trong da chuột của lô mô hình giảm rõ rệt so với lô chứng sinh học, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p 0,05 > 0,05 > 0,05 < 0,01 < 0,01 < 0,01 p so với lô 3 < 0,05 > 0,05 < 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Lô 5: Bôi Dầu dừa liều 0,2 ml/lần,
0,5 (0; 1) 0 (0; 0) 1 (0; 1) 1 (1; 1) 1 (1; 1) 1 (1; 1) p so với lô 2 < 0,01 > 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 < 0,05 p so với lô 3 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 p so với lô 4 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05 > 0,05
Kết quả bảng 3.4 cho thấy:
- Đánh giá trên vi thể da cho thấy DMSO liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và Dầu dừa liều 0,2 ml/lần, 2 lần/ngày có tác dụng làm giảm rõ rệt phản ứng viêm tại vết loét so với lô mô hình, sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p0,05)
- Không có sự khác biệt về mức độ phù trên giải phẫu bệnh vi thể da chuột giữa lô bôi DMSO liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và Dầu dừa cả hai mức liều so với lô mô hình (p>0,05)
BÀN LUẬN
Đánh giá tác động của Dầu dừa lên tế bào trên mô hình liền vết thương in vitro
Nguyên bào sợi là tế bào tham gia tích cực trong quá trình chữa lành vết thương Để kiểm tra hoạt động di chuyển và tăng sinh tế bào của các tế bào nguyên bào sợi in vitro giúp mô tả phần nào quá trình chữa lành vết thương ở da người, nhiều nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm với đối tượng nghiên cứu là tế bào nguyên bào sợi, trong số đó có tế bào nguyên bào sợi phôi chuột STO [84]
Vai trò của nguyên bào sợi có trong suốt cả quá trình liền vết thương như giai đoạn tăng sinh được đặc trưng bởi sự di cư và tăng sinh mạnh mẽ của các tế bào và tổng hợp mô hạt, bao gồm chất nền ngoại bào tạm thời, đại thực bào, tế bào nội mô và nguyên bào sợi [84] Nguyên bào sợi tổng hợp các hợp chất của ma trận ngoại bào tạm thời, bao gồm collagen loại III, proteoglycan và fibronectin, để hỗ trợ di chuyển tế bào vào khu vực Ở giai đoạn tái tạo của quá trình chữa lành vết thương ngoài da, các nguyên bào sợi được kích thích bởi TGF-β1 để biệt hóa thành nguyên bào sợi cơ, thu được kiểu hình có thể co lại và giảm diện tích bị tổn thương do có nhiều điểm kết nối protein nguyên bào sợi cơ với các sợi collagen Tình trạng kéo dài quá trình viêm làm cản trở sự tăng sinh tế bào nguyên bào sợi ở vùng bị thương [85]
Khả năng tồn tại của tế bào nguyên bào sợi phôi chuột STO sau khi tiếp xúc với Dầu dừa trong dung môi pha thích hợp được đánh giá với thử nghiệm MTT bằng cách đánh giá tổn thương tế bào, đo hoạt động trao đổi chất của tế bào, từ đó xác định độc tính của chất thử [12] Độc tính của các hợp chất được sàng lọc sớm là rất cần thiết, vì việc sàng lọc giúp xác định liệu chất thử có thể được sử dụng tiếp để đánh giá hoạt động sinh học hay không [86] Nguyên tắc phương pháp này dựa trên cơ chế là muối MTT bị khử để chuyển thành formazan màu tím không hòa tan, bằng cách phân cắt vòng tetrazolium bằng enzym succinate dehydrogenase trong ty thể tế bào ở 37 ◦ C Sản phẩm formazan không thấm vào
72 màng tế bào và do đó nó tích tụ trong các tế bào khỏe mạnh, được hòa tan bằng cách thêm các chất hòa tan như dimethylsulfoxide (DMSO) Do các tế bào chết không có khả năng khử muối tetrazolium tạo các sản phẩm formazan có màu, nên cường độ màu của sản phẩm tỷ lệ thuận với số lượng tế bào có thể tồn tại trong giếng Sản phẩm màu này có độ hấp thụ tối đa gần 570 nm nên được đo định lượng ở mức 570 nm bằng máy đọc quang phổ đa đĩa [31] [32]
Trong nghiên cứu của chúng tôi về thử nghiệm in vitro đánh giá khả năng sống của tế bào với Dầu dừa, kết quả là nồng độ Dầu dừa thấp (dưới 0,018% v/v Dầu dừa) không làm ảnh hưởng sức sống của tế bào nguyên bào sợi STO, thêm nữa có ghi nhận sự tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi STO Khả năng sống của tế bào đạt được trên 50% trong khoảng nồng độ Dầu dừa dưới 0,122 % (v/v) Ở nồng độ cao hơn 0,2% (v/v) của Dầu dừa gây độc tế bào và làm mất khả năng sống của tế bào
Ngoài ra, từ kết quả thí nghiệm limit test chúng tôi có được kết quả là nồng độ lớn hơn 0,0042% Tween 80 (chất hoạt động bề mặt dùng để nhũ tương hóa Dầu dừa) đã gây ảnh hưởng sức sống đối với các tế bào STO Tuy nhiên, khi 0,0042% Tween dùng để nhũ tương hóa Dầu dừa, khả năng tồn tại của tế bào STO tăng lên, hay chính là độc tính của Tween 80 với tế bào STO giảm đi Điều này chứng tỏ rằng tác động gây độc tế bào của Tween 80 được vô hiệu hóa một phần (bị ức chế) bởi Dầu dừa, cho thấy rằng sự tương tác giữa các chất hoạt động bề mặt và chất thử nghiệm là Dầu dừa có thể ảnh hưởng đến tác động sinh học Do vậy, quan sát trong luận văn này là có ý nghĩa vì chúng tôi đã chứng minh được sự tương tác giữa chất thử là Dầu dừa và chất hoạt động bề mặt Tween 80 Tuy nhiên, điều này là phức tạp khi chúng ta cố gắng ngoại suy (so sánh) với cơ thể sống bình thường Do trong cơ thể sống, tất cả các chất thử không nhất thiết phải dễ dàng tiếp xúc với protein huyết thanh Liều lượng truyền tĩnh mạch (IV) có thể sẽ dẫn đến tương tác với protein huyết thanh, nhưng đối với đường dùng ngoài
(bôi da), protein huyết thanh liên quan rất ít Trong trường hợp này, Tween 80 rất ít ảnh hưởng đến protein
So sánh với các nghiên cứu trước đó, theo Ahmad Zunairah và cộng sự (2017), khả năng gây độc tế bào của VCO được xác định bởi nồng độ của chúng Người ta quan sát thấy rằng tỷ lệ phần trăm khả năng sống của tế bào đã đạt được trên 50 % trong khoảng 0,1 - 10,0 mg/mL nồng độ VCO Thử nghiệm khả thi sử dụng chiết xuất VCO rất hiệu quả ở liều lượng thấp; một hiệu ứng mạnh mẽ hơn đã được ghi nhận đối với sự tăng sinh nguyên bào sợi Nồng độ cao hơn của VCO (100 mg/mL) gây độc tế bào và làm giảm đáng kể khả năng sống của tế bào xuống 28,9 % Dựa trên kết quả, chiết xuất VCO có thể tăng cường sự tăng sinh và khả năng tồn tại của các tế bào nguyên bào sợi ở da người [12]
Một nghiên cứu khác của Varma Sandeep R và cộng sự (2019), thử nghiệm MTT cho kết quả độc tính tế bào của VCO với giá trị IC50 là 706,53±2.1 và 787.15±1.1 àg/mL trong cỏc tế bào THP-1 (Bạch cầu đơn nhõn ở người) và HaCaT (Tế bào sừng ở người) tương ứng VCO được xác định là rất ít độc đối với tế bào RHE và tế bào NIH3T3 với IC50 giỏ trị trờn 1000àg/mL [63]
Tóm lại, nghiên cứu của chúng tôi có sự tương đồng về kết quả với các nghiên cứu vừa nêu trên ở điểm chiết xuất dầu dừa nguyên chất có thể tăng cường sự tăng sinh và khả năng tồn tại của các tế bào nguyên bào sợi Khả năng gây độc tế bào của Dầu dừa nguyên chất được xác định bởi nồng độ của chúng Thử nghiệm khả thi sử dụng chiết xuất Dầu dừa rất hiệu quả ở liều lượng thấp; cùng ghi nhận đối với sự tăng sinh nguyên bào sợi Nồng độ cao hơn của Dầu dừa gây độc tế bào và làm giảm đáng kể khả năng sống của tế bào Sự khác biệt về kết quả nồng độ Dầu dừa giữa các báo cáo do nhiều nguyên nhân: do các tế bào bản chất và nguồn gốc khác nhau, có sự thay đổi tính chất của các tế bào này trong quá trình nuôi cấy hoặc do sự thay đổi trong cách xử lý chúng ở các phòng thí nghiệm khác nhau, nguồn gốc hóa chất sử dụng khác nhau…
Phương pháp xét nghiệm liền vết thương (wound healing assay) được dùng trong nghiên cứu của chúng tôi để đánh giá tác động của Dầu dừa dựa trên mô hình thử nghiệm in vitro Hiệu quả chữa lành vết thương được đánh giá dựa vào mức độ các tế bào di chuyển đến rìa của vết đứt và tăng sinh tế bào Đây là công cụ phổ biến và tiên tiến nhằm cung cấp sự hiểu biết và bằng chứng về cơ chế hoạt động và tác dụng có lợi của các hoạt chất trong việc chữa lành vết thương [44] [43] [80]
Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi thu được, nhận thấy Dầu dừa có khả năng kích thích tăng sinh nguyên bào sợi và di chuyển tế bào trong việc tăng cường hoạt động chữa lành vết thương đã được chứng minh bằng thử nghiệm vết xước in vitro Dầu dừa nồng độ 0,018% thể hiện tỷ lệ đóng vết thương cao nhất
96.5%±5% sau 22 giờ Đối với các tế bào không chứa Dầu dừa hoặc Dầu dừa ở nồng độ cao hơn (0,053% v/v), quá trình di chuyển của tế bào chậm hơn và tỷ lệ đóng vết thương thấp hơn sau 22 giờ điều trị Điều này có thể được giải thích bởi thành phần Dầu dừa có chứa các hợp chất hoạt tính sinh học như hợp chất phenolic và chất chống oxy hóa giúp kích thích sự phát triển và tăng sinh tế bào nguyên bào sợi để tăng cường hoạt động đóng vết thương
Tuy nhiên, thử nghiệm vết xước in vitro chỉ mô tả đúng phần nào mà không thể hoàn toàn thể hiện quá trình hoạt động đóng vết thương hoàn toàn giống như các vết thương thực tế như vết thương ngoài da và vết loét [80] [44] [43]
So sánh với nghiên cứu của Ahmad H Ibrahim cộng sự (2017) [87], tỷ lệ đúng vết thương của cỏc tế bào hạch vừng mạc RGC-5 trong nhúm 3 và 6 àg/mL dầu dừa sau 12h, 18h và 24h cao hơn đáng kể so với nhóm đối chứng chứng (Tween 80 nồng độ 0,5%) Tương tự, tỷ lệ đóng vết thương của các tế bào nguyên bào sợi đại tràng CCD-18 trong nhúm 25, 50 và 100 àg/ mL dầu dừa cao hơn đáng kể so với nhóm đối sau 12, 18 và 24 giờ ủ (tất cả đều có p0,05), như vậy đảm bảo tính tương đồng giữa các nhóm cho thời điểm bắt đầu nghiên cứu
Sau 14 ngày và 21 ngày điều trị, diện tích vết loét ở các lô bôi DMSO liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và lô bôi thuốc thử Dầu dừa liều 0,1 ml/lần, 2 lần/ngày và
82 liều 0,2 ml/lần, 2 lần/ngày giảm rõ rệt và có ý nghĩa thống kê so với lô mô hình (p0,05)
Từ kết quả hình ảnh giải đại thể vết loét da chuột tại các thời điểm nghiên cứu nhận thấy có sự khác biệt rõ rệt về đặc điểm giữa lô mô hình, lô chứng và bôi thuốc thử dầu dừa Tại thời điểm kết thúc nghiên cứu, diện tích da bị loét của chuột lô bôi DMSO và thuốc thử Dầu dừa cả hai mức liều đã thu hẹp đáng kể so