Tóm tắt: Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

HỌC VIỆN QUÂN Y

NGUYỄN DUY HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG HỆ VI KHUẨNĐƯỜNG RUỘT VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ MIỄN DỊCHTRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHI SỬ DỤNG

CHẾ PHẨM PROBIOTIC LABMIX VÀ BACIMIX

Ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

Người hướng dẫn khoa học: 1 TS CHU ĐÌNH TỚI

2 PGS TS NGUYỄN THÁI SƠN

Phản biện 1: PGS TS Nguyễn Thị Mai Phương

Phản biện 2: PGS TS Vũ Xuân Nghĩa

Phản biện 3: PGS.TS Lê Thu Hồng

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường

Vào hồi: giờ ngày tháng năm 2024

2 Thư viện Học viện Quân y

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic là các vi sinh vật có lợi, được bổ sung vào đường tiêu hóa của con người với một lượng vừa đủ nhằm cải thiện và cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại, từ đó cải thiện sức khỏe của con người Sự có mặt của probiotic trong đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế và loại trừ các vi sinh vật có hại trong đường ruột, duy trì hệ vi sinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng Vì vậy bổ sung probiotic mang lại nhiều tác dụng trong phòng và điều trị các bệnh có liên quan đến sự suy giảm chức năng của hàng rào bảo vệ tại ruột như tiêu chảy cấp, tiêu chảy do sử dụng kháng sinh và các bệnh lý viêm đường ruột

Chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix có chứa các lợi khuẩn được phân lập trực tiếp từ thức ăn lên men và đường tiêu hóa của người Việt Nam Các chủng sử dụng làm probiotic đã được đánh giá về đặc tính làm probiotic trong phòng thí nghiệm Mặc dù các chủng chứa trong hai chế phẩm trên đều thuộc nhóm an toàn khi sử dụng, nhưng để sử dụng trên người vẫn cần đánh giá tính an toàn và tác dụng trên động vật thực nghiệm.

Từ thực tế đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu với mục tiêu sau:

1 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trườngdiễn của chế phẩm LabMix và BaciMix trên động vậtthực nghiệm.

2 Đánh giá sự thay đổi nồng độ IL-6, TNF-αα,IgA huyết thanh, IgA niêm mạc ruột trên động vật thựcnghiệm khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix.

3 Phân tích sự biến động hệ vi khuẩn đườngruột trên động vật thực nghiệm bằng phương phápmetagenomics khi sử dụng chế phẩm LabMix vàBaciMix.

Những đóng góp mới của luận án:

- Đây là nghiên cứu đầu tiên về đánh giá độc tính cấp và độc tính bán trường diễn, sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và thay đổi một số chỉ số miễn dịch IL-6, TNF-αα, IgA huyết thanh, IgA niêm mạc ruột khi sử

dụng chế phẩm LabMix và BaciMix trên động vật thực nghiệm Kết quả nghiên cứu chỉ rằng chế phẩm LabMix và BaciMix không ảnh hưởng đến sự phát triển bình thường của chuột, và các chỉ số huyết học, sinh hóa máu, cấu trúc đại thể, vi thể của các tạng gan, thận, lách của chuột cống trắng trong 28 ngày sử dụng chế phẩm Ngoài ra, chế phẩm LabMix và BaciMix có tác dụng làm giảm các cytokine IL-6, TNF-α trong máu,

đồng thời làm tăng IgA huyết thanh, IgA niêm mạc ruột của chuột cống trắng khi sử dụng chế phẩm trong 28 ngày và mô hình chuột tiêu chảy do sử dụng kháng sinh.

- Kết quả nghiên cứu cho thấy Chế phẩm LabMix và BaciMix (liều tương ứng 2,52 × 109 CFU/kg và 1,68 × 109 CFU/kg) đã làm tăng đa dạng alpha và thay đổi

cấu trúc của hệ vi khuẩn đường ruột bị rối loạn do sử dụng kháng sinh Tăng mức độ phong phú của ngành Fimicutes và giảm của ngành Bacteroidota, Proteobacteria Ngoài ra, chế phẩm tăng khả năng hồi phục các chi vi khuẩn có lợi và giảm sự hồi phục các vi khuẩn có hại của hệ vi khuẩn đường ruột.

Cấu trúc luận án

- Tổng cộng 132 trang gồm: Phần đặt vấn đề; 4 chương (Chương 1: Tổng quan tài liệu; Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu; Chương 3: Kết quả nghiên cứu; Chương 4: Bàn luận); Phần kết luận và

FAO/WHO (2001) định nghĩa probiotic gồm các vi sinh vật có lợi, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ Từ định nghĩa có thể thấy hai yếu tố quan trọng của chế phẩm probiotic cần đạt được là chủng vi khuẩn và liều lượng của chế phẩm probiotic khi sử dụng.

1.1.2 Vai trò, cơ chế tác động của probiotic

Theo hướng dẫn của WGO (World Gastroenterology Organisation) (2017), probiotic có vai

trò chủ yếu là ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và kích thích tăng cường miễn dịch cho cơ thể.

1.1.3 Chế phẩm LabMix và BaciMix

Thành phần của chế phẩm LabMix bao gồm hỗn

hợp 3 chủng L acidophilus LA 304.17; L casei LC304.08; B bifidum BF 304.98 và tá dược Chế phẩmBaciMix bao gồm hỗn hợp 2 chủng B subtilisBS304.04; B coagulans BC 304.06 và tá dược bao gồm

kẽm, manitol, aerosil.

1.1.4 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam

1.2 Tổng quan về ảnh hưởng của chế phẩmprobiotic đến đáp ứng miễn dịch

1.2.1 Khái niệm

Đáp ứng miễn dịch là một quá trình bảo vệ quan trọng và phức tạp của cơ thể sinh vật Các yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch bao gồm: các cơ quan lympho trung ương (tủy xương, tuyến ức) và ngoại vi (hạch lympho, lách, các mô lympho không có vỏ bọc); các tế bào lympho T, B; các tế bào thực bào đơn nhân và một số tế bào máu khác như bạch cầu (BC) trung tính, BC ái toan, BC ái kiềm và tiểu cầu.

1.2.2 Một số yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch1.2.3 Vai trò của probiotic trong đáp ứng miễndịch

Những lợi khuẩn làm probiotic có khả năng kích thích các đáp ứng miễn dịch của cơ thể thông qua các cơ chế khác nhau Một số lợi khuẩn có khả năng điều chỉnh các chức năng của tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn

nhân, đại thực bào và tế bào lympho, giúp tăng cường quá trình thực bào mầm bệnh xâm nhập vào đường ruột.

Hiện nay có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch của chế phẩm probiotic trên động vật thực nghiệm Các đánh giá được thực hiện trên chuột bình thường và mô hình bệnh lý Một số nghiên cứu đã chứng minh vai trò tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic thông qua kích thích các thông số miễn dịch.

1.3 Hệ vi khuẩn đường ruột

1.3.1 Khái niệm

Các ngành vi khuẩn được tìm thấy trong đường ruột của con người bao gồm các ngành như Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria và Verrucomicrobia trong đó 2 ngành Firmicutes và Bacteroidetes chiếm đến 90% hệ vi khuẩn đường ruột Ngành Firmicutes bao

gồm hơn 200 chi khác nhau như Lactobacillus, Bacillus,Clostridium, Enterococcus và Ruminicoccus; trong đóchi Clostridium chiếm 95% trong ngành Firmicutes.Ngành Bacteroidetes bao gồm chi Bacteroides vàPrevotella là các chi chiếm đa số trong ngành này.

1.3.2 Sự phân bố các vi khuẩn đường ruột

Vi khuẩn đường ruột cư trú theo chiều dài đường tiêu hóa nhưng khác nhau về chủng loại và mức độ phong phú tùy theo từng khu vực Số lượng vi khuẩn có trong dịch ở dạ dày và tá tràng là 10 – 103 CFU/g, ở ruột non là 104 – 107 CFU/g, ở đại tràng là 1011 –

1012 CFU/g Đại tràng là nơi có số lượng lớn và nhiều loài vi khuẩn nhất Hoạt động của các loài vi khuẩn ở đây làm cho đại tràng trở thành cơ quan chuyển hóa tích cực của cơ thể Vi khuẩn trong đại tràng chiếm hơn 70% tổng số vi khuẩn trong cơ thể và chủ yếu thuộc ngành Firmicutes và Bacteroidetes

1.3.5 Các nghiên cứu về sự biến động hệ vikhuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm

Vai trò của hệ vi khuẩn đường ruột với một số bệnh đã được chứng minh qua một số mô hình nghiên cứu trên động vật thực nghiệm Các nghiên cứu này đã đánh giá vai trò của lợi khuẩn trong một số bệnh ở đường tiêu hóa như tiêu chảy do sử dụng kháng sinh, viêm ruột và táo bón

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊNCỨU

2.1 Đối tượng nghiên cứu

2.1.1 Chế phẩm LabMix và BaciMix

Chế phẩm LabMix và BaciMix là sản phẩm của đề tài “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic”, mã số ĐTĐL.CN 61/19 được sản xuất tại Nhà máy đạt tiêu chuẩn GMP – Công ty cổ phần Công nghệ Sinh phẩm Nam Việt Chế phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở và được cung cấp bởi Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội Chế phẩm LabMix là chế phẩm đa chủng dạng bột chứa

Lactobacillus acidophilus LA 304.17, Lactobacilluscasei LC 304.08 và Bifidobacterium bifidum BF 304.98

với mật độ 3×109 CFU/g cho mỗi chủng Chế phẩm

BaciMix là chế phẩm đa chủng dạng bột chứa Bacillussubtilis BS 304.04 và Bacillus coagulans BC 304.06 với

mật độ 3x109 CFU/g cho mỗi chủng.

2.1.2 Động vật nghiên cứu

Động vật nghiên cứu là chuột nhắt trắng chủng Swiss (70 con) và chuột cống trắng chủng Wistar (98 con) do Trung tâm Nghiên cứu động vật Thực nghiệm -Học viện Quân y cung cấp, được nuôi dưỡng trong điều kiện phòng thí nghiệm 05 ngày trước khi được thử nghiệm Chuột được ăn thức ăn theo tiêu chuẩn thức ăn cho động vật nghiên cứu và được uống nước tự do.

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

* Thời gian nghiên cứu: Thời gian nghiên cứu từ

8/2021 đến tháng 8/2023.

* Địa điểm nghiên cứu: Nghiên cứu được tiến hành

tại Bộ môn Dược lý, Học viện Quân y và Viện Vi sinh vật và công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội.

2.4 Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm

Cân một lượng chính xác chế phẩm và hòa tan chế phẩm bằng một lượng dung môi vừa đủ (nước cất) Nồng độ của hỗn dịch chế phẩm được chuẩn bị theo mục đích của từng thí nghiệm và được quy đổi tương đương theo liều giữa các loài khác nhau (tỷ lệ giữa chuột nhắt trắng - người là 1: 11,76, chuột cống - người là 1: 6,47)

2.4.2 Xác định độc tính cấp và độc tính bántrường diễn của chế phẩm probiotic LabMix vàBaciMix

Độc tính cấp và xác định liều LD50: Chuột nhắt trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô, mỗi lô 10 con Cho chuột nhắt trắng uống với các mức liều khác nhau Trong số các mức liều đem thử, khoảng cách giữa mức liều cao nhất không gây chết chuột và mức liều thấp nhất gây chết 100% số chuột trong nhóm được sử dụng để tính toán Thời gian theo dõi liên tục trong 3 ngày đầu và các ngày sau cho đến 14 ngày sau khi uống thuốc Theo dõi tình trạng nhiễm độc cấp của chuột, cân nặng, tình trạng ăn uống, khả năng vận động, bài tiết, hô hấp, phản xạ của chuột và tình trạng sống, chết của chuột trong từng nhóm được theo dõi để tính toán LD50.

Độc tính bán trường diễn: Thực hiện theo hướng dẫn của Bộ Y tế Việt Nam về nghiên cứu tính an toàn và hiệu lực của thuốc y học cổ truyền và các chất có nguồn gốc thiên nhiên (2015) Chuột được chia vào các lô, mỗi lô 10 con, sau đó cho chuột uống với 2 liều cho mỗi chế phẩm LabMix với liều 2,52 × 109 CFU/kg cân nặng và liều 12,6 × 109 CFU/kg cân nặng BaciMix với liều 1,68 × 109 CFU/kg cân nặng và liều 8,4 × 109 CFU/ kg cân nặng Các lô chuột được cho uống liên tục trong 28 ngày, mỗi ngày 1 lần vào buổi sáng Sau đó theo dõi tình trạng chung, đánh giá các chỉ số huyết học (hồng cầu, huyết sắc tố, bạch cầu và tiểu cầu), chỉ số

sinh hóa (ALT, AST, protein, creatinin, cholesterol, bilirubin) Cuối thí nghiệm đánh giá đại thể và vi thể của 40% số động vật ở mỗi nhóm.

2.4.3 Đánh giá sự thay đổi của một số chỉ sốmiễn dịch trên chuột sau 28 ngày sử dụng chếphẩm

Sau 28 ngày uống chế phẩm LabMix và BaciMix của thử nghiệm độc tính bán trường điễn, lấy ra ngẫu nhiên 8 chuột cống trắng (trong 10 con chuột) ở mỗi lô bao gồm lô 1 (lô chứng sinh lý), lô 2 (lô LabMix liều 1), lô 3 (lô LabMix liều 2), lô 4 (lô BaciMix liều 1), lô 5 (lô BaciMix liều 2) được lấy máu xác định các chỉ số IL-6, TNF- và IgA máu bằng phương pháp ELISA.

2.4.4 Đánh giá sự biến động hệ vi khuẩn đườngruột và thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên môhình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh

+ Mô hình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh: Chuột cống trắng được gây tiêu chảy bằng lincomycin 500mg liều 5g/kg/24h trong 4 ngày trừ lô chứng sinh lý, sau đó được chia vào 6 lô (8 con/lô): với các lô chứng kháng sinh (mổ ngày thứ 5), tự hồi phục (uống nước cất), LabMix (uống chế phẩm LabMix liều 2,52×109CFU/kg), BaciMix (uống chế phẩm BaciMix liều 1,68 ×109CFU/kg) và lô chứng dương (uống chế phẩm Fermented liều 2,5 ×109CFU/kg) trong 5 ngày tiếp theo

2.4.5 Các phương pháp lấy mẫu nghiên cứu

2.4.5.1 Phương pháp lấy máu và tách huyết thanh: Máu

được lấy tại thời điểm ban đầu và sau 14 ngày tại vị trí

xoang hốc mắt Máu lấy thời điểm cuối thí nghiệm ở tim Máu toàn phần của chuột cống trắng sau khi được thu thập vào ống chứa không có chất chống đông, được để tĩnh cho máu đông trong 30 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó tách huyết thanh thành 3 phần lưu trữ vào 3 ống eppendorf và bảo quản ở -800C đến khi phân tích.

2.4.5.2 Phương pháp nghiền mô niêm mạc manhtràng: niêm mạc manh tràng được lấy và xử lý bằng

máy nghiền mô, sau đó ly tâm hỗn dịch để lấy dịch thể làm định lượng IgA niêm mạc.

2.4.5.3 Phương pháp ELISA định lượng IL-6, TNF- vàIgA

* Định lượng IL6: Định lượng IL-6 trong huyết

thanh chuột cống trắng được thực hiện bằng phương pháp ELISA, sử dụng kít Rat IL-6 ELISA Kit, Thermo Fisher và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

* Định lượng TNF-: Định lượng TNF- trong huyết thanh chuột cống trắng được thực hiện bằng phương pháp ELISA, sử dụng kít Rat TNF- ELISA Kit, Thermo Fisher và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

* Định lượng IgA: Định lượng IgA trong huyết

thanh và niêm mạc chuột cống trắng được thực hiện bằng phương pháp ELISA, sử dụng kít Rat IgA Uncoated ELISA Kit, Thermo Fisher và tiến hành theo hướng dẫn của nhà sản xuất.

2.4.5.4 Phương pháp metagenomics phân tích biếnđộng hệ vi khuẩn đường ruột

Phương pháp metagenomics trong nghiên cứu hệ vi khuẩn đường ruột gồm 3 bước gồm: 1) Tách chiết DNA trong mẫu thu thập; 2) Thiết lập thư viện metagenome và giải trình tự DNA metagenome; 3) Phân tích kết quả dựa vào dữ liệu giải trình tự gen và ngân hàng gen.

Tách chiết DNA tổng số trong phân: Tách chiết

DNA từ phân được thực hiện theo hướng dẫn của bộ kit QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (QIAgen, Đức).

Chuẩn bị thư viện và giải trình tự: Thư viện được

chuẩn bị theo hướng dẫn của hãng Illumina

Phân tích dữ liệu giải trình tự

Dữ liệu sau khi giải trình tự được lưu dưới dạng các file nén có dung lượng lớn Quá trình phân tích metagenomics gồm 3 bước chính, đó là: (i) Tiền xử lý dữ liệu thô; (ii) Xác định vị trí phân loại và (iii) Phân tích đa dạng và biểu thị hóa kết quả dưới dạng biểu đồ, hình ảnh trực quan Phân tích đa dạng hệ vi khuẩn

được thực hiện nhờ công cụ Qiime 2 phiên bản 2022.8.

2.4.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu

2.5 Phân tích và sử lý số liệu

Tính toán các kết quả nghiên cứu dựa vào kết quả in trực tiếp từ máy hoặc tính toán dựa trên phần mềm Microsoft Excel Các số liệu được trình bày dưới dạng giá trị trung bình (X´), độ lệch chuẩn (SD), trung vị kèm khoảng tứ phân vị (25% - 75%) hoặc giá trị nhỏ nhất - lớn nhất sử dụng thuật toán thống kê với số liệu thu được, cách tính như sau:

- So sánh sự khác biệt về giá trị trung bình của 2 biến định lượng có phân phối chuẩn bằng cách sử dụng kiểm định “Independent – samples T test” và của 3 biến trở lên bằng cách sử dụng kiểm định Anova với độ tin cậy 95%.

- So sánh trung vị của 2 biến định lượng không có phân phối chuẩn bằng cách sử dụng kiểm định “Mann Whitney” và của 3 biến trở lên bằng cách sử dụng kiểm định “Kruskal Wallis” với độ tin cậy 95%

Các kết quả thống kê được tính toán trên phần mềm IBM SPSS Statistics 26.0 và phần mền R studio 4.2.3 Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê khi p ≤ 0,05.

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu

Luận án thuộc đề tài nghiên cứu khoa học cấp

Quốc gia, mã số ĐTĐL.CN 61/19 đã được thông qua

Hội đồng đạo đức trong nghiên cứu y sinh của Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội số 03:2021/VNU-IMBT

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1 Kết quả độc tính cấp và độc tính bán trườngdiễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix3.1.1 Kết quả độc tính cấp của chế phẩm probiotic

phẩm chuột (CFU/kg/24h) Sau 24

Kết quả của chế phẩm LabMix, BaciMix cho thấy với các mức liều khác nhau chuột không có dấu hiệu nhiễm độc, không bị chết sau sau 14 ngày sau khi uống chế phẩm ở tất cả các lô

3.1.2 Kết quả độc tính bán trường diễn của chế phẩm LabMix và BaciMix

Trọng lượng của chuột cống trắng giữa các lô trong cùng một thời điểm cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Chuột cống trắng ở tất cả các lô nghiên cứu có sự tăng trọng lượng đều nhau và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p<0,05).

3.2 Kết quả thay đổi một số chỉ số miễn dịchtrên chuột cống trắng khi sử dụng chế phẩm

Lô nghiên cứu IL-6 (pg/ml), n=8

Trung vị (25%- chứng sinh lýGiảm so với p

Nồng độ IL-6, TNF- trong máu chuột cống trắng ở lô LabMix liều 1, liều 2 và lô BaciMix liều 1, liều 2 đều thấp hơn so với lô chứng sinh lý và sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê (p<0,05) Ngoài ra, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p>0,05) về nồng độ IL-6, TNF- giữa lô LabMix liều 1 và liều 2; giữa lô BaciMix liều 1 và liều 2.

Nồng độ IgA trong máu và niêm mạc ruột của chuột cống trắng ở các lô LabMix liều 1, liều 2 và lô BaciMix liều 1, liều 2 đều cao hơn so với lô chứng sinh lý và sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) Ngoài ra, không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) về nồng độ IgA trong máu và niêm mạc ruột chuột cống trắng giữa lô LabMix liều 1 và liều 2; giữa lô BaciMix liều 1 và liều 2.