Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

Trang 1

NGUYỄN DUY HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LABMIX VÀ BACIMIX

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

Trang 2

NGUYỄN DUY HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT

VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM KHI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LABMIX VÀ BACIMIX

Trang 3

Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y; Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Khoa Vi sinh vật - Học viện Quân y,

Bộ môn Khoa Dược lý - Học viện Quân y, Viện nghiên cứu Y dược học quân sự - Học viện Quân y và Phòng Sau Đại học - Học viện Quân y, đã cho phép và tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu;

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Chu Đình Tới và PGS TS Nguyễn Thái Sơn những người thầy đã dành nhiều thời gian, công sức, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án;

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Hoàng Văn Vinh, Trưởng phòng- Phòng Sinh học phân tử Ứng dụng - Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội là chủ nhiệm đề tài và các cộng sự trong đề tài luôn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu;

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo luôn tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Bố mẹ, vợ và các con, anh chị em trong gia đình, bạn bè đồng nghiệp luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án.

Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2024

Tác giả

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ vi sinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic” mã số ĐTĐL.CN 61/19 Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà

tôi là một thành viên tham gia chính Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộcác thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệunghiên cứu của đề tài này đưa vào trong luận án tiến sĩ Các số liệu, kết quảnêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳcông trình nào khác

Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2024

Tác giả

Nguyễn Duy Hà

Trang 5

Trang phụ bìa

Lời cảm ơn

Lời cam đoan

Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận án

Danh mục các bảng

Danh mục các hình

Danh mục biểu đ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về probiotic 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Vai trò, cơ chế tác động của probiotic 3

1.1.3 Chế phẩm LabMix và BaciMix 5

1.1.4 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam 7

1.2 Tổng quan về ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến đáp ứng miễn dịch 13

1.2.1 Khái niệm 13

1.2.2 Một số yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch 13

1.2.3 Vai trò của probiotic trong đáp ứng miễn dịch 14

1.3 Hệ vi khuẩn đường ruột 19

1.3.1 Khái niệm 19

1.3.2 Sự phân bố các vi khuẩn đường ruột 20

1.3.3 Vai trò của hệ vi khuẩn đường ruột 21

1.3.4 Phương pháp xác định hệ vi khuẩn đường ruột 24

Trang 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Chế phẩm LabMix và BaciMix 31

2.1.2 Động vật nghiên cứu 31

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

2.3 Thuốc, hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33

2.3.1 Thuốc và hóa chất 33

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm 35

2.4.2 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 36

2.4.3 Đánh giá sự thay đổi của một số chỉ số miễn dịch trên chuột sau 28 ngày sử dụng chế phẩm 40

2.4.4 Đánh giá sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên mô hình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 41

2.4.5 Các phương pháp lấy mẫu nghiên cứu 42

2.4.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu 52

2.5 Phân tích và xử lý số liệu 53

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 Kết quả độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 54

3.1.1 Kết quả độc tính cấp của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix .54

Trang 7

3.2 Kết quả trên mô hình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 67

3.2.1 Tác dụng trên trọng lượng của chuột cống trắng 67

3.2.2 Tình trạng tiêu chảy của chuột ở các lô nghiên cứu 67

3.2.3 Trọng lượng gan, thận, lách chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 69 3.2.4 Hình ảnh vi thể ruột và bề dày niêm mạc manh tràng chuột tiêu chảy 69

3.3 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên chuột cống trắng khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix 72

3.3.1 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên mô hình chuột sau 28 ngày sử dụng chế phẩm 72

3.3.2 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên chuột tiêu chảy do kháng sinh 75

3.4 Kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix 80

3.4.1 Kết quả tách chiết DNA trực tiếp từ phân 80

3.4.2 Kết quả về dữ liệu thô của các mẫu nghiên cứu 81

3.4.3 Kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix trên mô hình thực nghiệm 82

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 100

4.1 Về tính an toàn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 100

4.1.1 Độc tính cấp bằng đường uống trên chuột nhắt trắng 100

4.1.2 Độc tính bán trường diễn 103

4.2 Về kết quả thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên chuột cống trắng 110

4.2.1 Về thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên chuột sử dụng 28 ngày chế phẩm LabMix và BaciMix 110

Trang 8

4.3 Về kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu

chảy do dùng kháng sinh 120

4.3.1 Về việc lựa chọn phương pháp metagenomics 120

4.3.2 Về kết quả tách chiết DNA trực tiếp từ phân 120

4.3.3 Về việc lựa chọn vùng gen V3-V4 và đơn vị phân loại ASV 122

4.3.4 Về kết quả sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu chảy 123

KẾT LUẬN 130

1 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 130

2 Sự thay đổi một số chỉ số miễn dịch IL-6, TNF- , IgA máu, IgA niêm mạc ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm 130

3 Sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LaMix và BaciMix 131

KIẾN NGHỊ 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO 134

Trang 9

TT Phần viết tắt Phần viết đầy đủ

1 AAD Antibiotic associated diarrhea

(Tiêu chảy liên quan đến kháng sinh)

13 DĐVN Dược điển Việt Nam

15 EHEC Enterohemorrhagic Escherichia coli

16 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

17 FAO Food and Agriculture Organization of the United

Nations

(Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

Trang 10

25 IBD Inflammatory bowel disease

29 NCBI National Center for Biotechnology Information

31 NFAT Nuclear factor of activated T-cells

32 OECD Organization for Economic Cooperation and

Development

37 SCFA Short chain fatty acids

41 VTCC Vietnam Type Culture Collection

42 WGO World Gastroenterology Organisation

43 WHO World Health Organization (tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần, công thức bào chế LabMix và BaciMix 6

Bảng 1.2 Định danh, phân lập vi khuẩn sử dụng làm chế phẩm LabMix và BaciMix 10

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix 11

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix (tiếp) 12 Bảng 2.1 Chủng vi khuẩn nghiên cứu 31

Bảng 2.2 Động vật nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Nồng độ của hỗn dịch chế phẩm 35

Bảng 2.4 Thể tích hỗn dịch probiotic sử dụng cho chuột nhắt trắng 37

Trang 11

Bảng 2.7 Trình tự mồi khuếch đại gen 16S rDNA 47

Bảng 2.8 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 47

Bảng 2.9 Trình tự mồi khuếch đại vùng V3-V4 của gen 16S rDNA 48

Bảng 3.1 Độc tính cấp theo đường uống của chế phẩm LabMix và BaciMix .54

Bảng 3.2 Trọng lượng chuột nhắt trắng sử dụng LabMix và BaciMix 55

Bảng 3.3 Trọng lượng chuột cống trắng 56

Bảng 3.4 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố trong máu chuột cống trắng 57

Bảng 3.5 Chỉ số bạch cầu và tiểu cầu chuột cống trắng 58

Bảng 3.6 Hoạt độ enzym AST, ALT trong máu chuột cống trắng 59

Bảng 3.7 Nồng độ bilirubin, cholesterol trong máu chuột cống trắng 60

Bảng 3.8 Hàm lượng protein và creatinin trong máu chuột cống trắng 61

Bảng 3.9 Trọng lượng gan, thận, lách chuột cống trắng 62

Bảng Tên bảng Trang Bảng 3.10 Trọng lượng gan, thận, lách trên mô hình chuột tiêu chảy 69

Bảng 3.11 Kết quả giải phẫu vi thể manh tràng chuột tiêu chảy 70

Bảng 3.12 Độ dày niêm mạc manh tràng ở các lô chuột tiêu chảy 71

Bảng 3.13 Nồng độ IL-6 trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 72

Bảng 3.14 Nồng độ TNF- trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 73

Bảng 3.15 Nồng độ IgA trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 74

Bảng 3.16 Nồng độ IgA niêm mạc ruột chuột sau 28 ngày thử nghiệm 75

Bảng 3.17 Nồng độ IL-6 trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 76

Bảng 3.18 Nồng độ TNF- trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 77

Bảng 3.19 Nồng độ IgA trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 78

Bảng 3.20 Nồng độ IgA niêm mạc ruột chuột tiêu chảy do kháng sinh 79

Trang 12

Bảng 3.23 Tỷ lệ trình tự còn lại sau gộp và lọc dữ liệu 82

Bảng 3.24 Kết quả đa dạng alpha hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy 83

Bảng 3.25 Thành phần các ngành vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu chảy 86

Bảng 3.26 Thành phần một số chi vi khuẩn có lợi trong đường ruột chuột tiêu chảy do kháng sinh 91

Bảng 3.27 Thành phần một số chi vi khuẩn có hại trong đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 92

Y DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 35

Hình 2.2 Quá trình phân tích dữ liệu metagenomics 48

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột khi sử dụng LabMix 63

Hình 3.2 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột khi sử dụng BaciMix 63

Hình 3.3 Hình ảnh vi thể gan chuột khi sử dụng LabMix 64

Hình 3.4 Hình ảnh vi thể gan chuột khi sử dụng BaciMix 64

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể thận chuột cống trắng sử dụng LabMix 65

Hình 3.6 Hình ảnh vi thể thận chuột sử dụng BaciMix 65

Hình 3.7 Hình ảnh vi thể lách chuột sử dụng LabMix 66

Hình 3.8 Hình ảnh vi thể lách chuột sử dụng BaciMix 66

Hình 3.9 Trọng lượng chuột cống trắng ở các lô nghiên cứu 66

Trang 13

Hình 3.11 Hình ảnh vi thể manh tràng chuột bị tiêu chảy do kháng sinh 71

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 16S rDNA vi khuẩn 881

Hình 3.13 Tỷ lệ ở mức độ ngành vi khuẩn đường ruột 88

Hình 3.14 Tỷ lệ một số ngành vi khuẩn đường ruột 89

Hình 3.15 Tỷ lệ các chi vi khuẩn trong các lô nghiên cứu 90

Hình 3.16 Tỷ lệ một số chi có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 93

Hình 3.17 Tỷ lệ một số chi có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh (tiếp) 94

Hình 3.18 Tỷ lệ một số chi có hại trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 95

Hình 3.19 Tỷ lệ một số chi có hại trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh (tiếp) 97

Hình 3.20: Dấu ấn sinh học ở mức độ chi giữa các lô nghiên cứu trên mô hình chuột tiêu chảy 98 DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang 14

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic là các vi sinh vật có lợi, được bổ sung vào đường tiêu hóa củacon người với một lượng vừa đủ nhằm cải thiện và cân bằng hệ vi sinh vậtđường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại, từ đó cải thiện sức khỏe của conngười [1] Sự có mặt của probiotic trong đường tiêu hóa có tác dụng cạnhtranh, ức chế và loại trừ các vi sinh vật có hại trong đường ruột, duy trì hệ visinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng Vì vậy bổ sung probiotic mang lạinhiều tác dụng trong phòng và điều trị các bệnh có liên quan đến sự suy giảmchức năng của hàng rào bảo vệ tại ruột như tiêu chảy cấp, tiêu chảy do sửdụng kháng sinh và các bệnh lý viêm đường ruột [2] Hiện nay, những chếphẩm probiotic trên thị trường Việt Nam còn tồn tại một số hạn chế như dữliệu về chủng dùng làm probiotic, các yêu cầu khoa học về thử nghiệm độctính; khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa; khả năng đối kháng với vi khuẩngây bệnh, hiệu quả tác dụng trên người [3] Trong khi đó, quá trình phân lập

và tuyển chọn chủng sản xuất chế phẩm probiotic trong nước gặp nhiều khókhăn, nên các chủng này chủ yếu là nhập ngoại và giá thành cao Ngoài ra, cóít các nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của probiotic đến đa dạng hệ vi khuẩnđường ruột và đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch trên động vật thực nghiệm.Chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix là sản phẩm của đề tài nghiên cứukhoa học cấp Quốc gia, có chứa các lợi khuẩn được phân lập trực tiếp từ thức

ăn lên men và đường tiêu hóa của người Việt Nam Các chủng sử dụng làmchế phẩm LabMix và BaciMix đã được đánh giá về đặc tính làm probiotictrong phòng thí nghiệm [4], [5] Hơn nữa, các chủng này cũng được chứngminh có vai trò trong phòng và điều trị một số bệnh liên quan đến rối loạn hệ

vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên tác dụng dưới dạng bột khi kết hợp các chủngthì chưa được chứng minh Mặc dù các chủng chứa trong hai chế phẩm trên

Trang 15

đều thuộc nhóm an toàn khi sử dụng, nhưng để sử dụng trên người vẫn cầnđánh giá tính an toàn và tác dụng trên động vật thực nghiệm.

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và một số chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix” được thực hiện với

các mục tiêu sau:

1 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩmLabMix và BaciMix trên động vật thực nghiệm

2 Đánh giá sự thay đổi nồng độ IL-6, TNF-α, IgA huyết thanh, IgAniêm mạc ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probioticLabMix và BaciMix

3 Phân tích sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thựcnghiệm bằng phương pháp metagenomics khi sử dụng chế phẩm probioticLabMix và BaciMix

Trang 16

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Định nghĩa

FAO/WHO (2001) định nghĩa probiotic gồm các vi sinh vật có lợi, khiđưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ Từđịnh nghĩa có thể thấy hai yếu tố quan trọng của chế phẩm probiotic cần đạtđược là chủng vi khuẩn và liều lượng của chế phẩm probiotic khi sử dụng

Các loài vi khuẩn thường được sử dụng để sản xuất probiotic gồm: L acidophilus, L casei, L fermentum, L plantarum, B lactis, B longum, B bifidum, B subtilis, B clausii, B coagulans và B cereus [6] Liều lượng sử

dụng của chế phẩm probiotic để đạt được hiệu quả tùy thuộc vào chủng vikhuẩn, công nghệ sản xuất và mục đích sử dụng của chế phẩm [7]

1.1.2 Vai trò, cơ chế tác động của probiotic

Theo hướng dẫn của WGO (World Gastroenterology Organisation)(2017), probiotic có vai trò chủ yếu là ức chế sự phát triển của vi khuẩn gâybệnh và kích thích tăng cường miễn dịch cho cơ thể [2]

* Lợi khuẩn trong chế phẩm probiotic ức chế sự phát triển của vi sinhvật gây bệnh trong đường tiêu hóa thông qua các cơ chế khác nhau như:

Cơ chế sinh ra các chất bacteriocin: Các bacteriocin được sản xuất bởi

lợi khuẩn (thường là vi khuẩn nhóm LAB) là một trong những cơ chế được sửdụng để ức chế mầm bệnh trong đường tiêu hóa Bacteriocin như nisin,plantaricin và lacticin B có hoạt tính chống lại mầm bệnh ở đường ruột như

Listeria, Clostridium, S aureus và Enterococci [8] Nhờ hoạt tính kháng

khuẩn các bacteriocin giúp các lợi khuẩn có lợi thế cạnh tranh trong môitrường đường tiêu hóa Các bacteriocin thấm qua màng tế bào chất của vikhuẩn gây bệnh dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp các acid nucleic và quá

trình tổng hợp protein của thành tế bào vi khuẩn Một số lợi khuẩn như E.

Trang 17

faecium CCM7420 có khả năng tổng hợp bacteriocin và đã được chứng minh

là làm giảm đáng kể Staphylococci spp trong manh tràng của thỏ [9] Các nghiên cứu khác phát hiện ra rằng chủng E faecium EK13 sản sinh ra enterocin A có tác dụng làm giảm số lượng tế bào Salmonella ở chim và giảm sự xâm nhập của Staphylococcus gây bệnh trong đường tiêu hóa ở thỏ [10].

Vi khuẩn LAB sản xuất nisin và pediocin làm giảm sự xâm lấn của cầu khuẩngây bệnh tại niêm mạc ruột ở chuột

Cơ chế cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột: Lợi khuẩn có tác dụng

bảo vệ niêm mạc ruột nhờ cơ chế ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn gâybệnh Các nghiên cứu trên niêm mạc của người và động vật đã chứng minhtác dụng của lợi khuẩn LAB đối với việc loại trừ mầm bệnh qua cơ chế cạnh

tranh Vi khuẩn L rhamnosus GG có đặc tính bám dính và ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn có hại như Salmonella và E coli gây xuất huyết ruột

Tác nhân gây bệnh đường ruột như EHEC, sử dụng fimbriae loại 1 nhạy cảmvới mannose để gắn vào oligosacarit dư của glycoprotein hoặc glycolipid trên

bề mặt tế bào biểu mô ruột Các chủng lợi khuẩn Lactobacilli và Bifidobacteria cũng gắn vào cùng một vị trí thụ thể và từ đó loại trừ mầm

bệnh khỏi niêm mạc đường tiêu hóa Các protein bám dính trên bề mặt tế bàocủa một số chủng liên kết với các gốc carbohydrate trong lớp chất nhầy chẳng

hạn như cơ chế bám dính đặc hiệu của L johnsonii La1 [11] Vì vậy, các vi

khuẩn có hại không có vị trí bám trên niêm mạc đường tiêu hóa và bị đào thải

ra ngoài cơ thể

Cơ chế sinh ra các acid hữu cơ: Một số lợi khuẩn thuộc nhóm LAB có

khả năng lên men carbohydrate trong đường tiêu hóa dẫn đến sản xuất cácchất chuyển hóa như acid axetic, acid formic, acid succinic và acid lactic làmcho môi trường đường ruột có tính acid và ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Trang 18

gây bệnh ví dụ lợi khuẩn Lactobacillus GG sinh acid lactic để ngăn chặn sự xâm nhập của S enterica vào tế bào Caco 2 [12]

Cơ chế cạnh tranh nguồn thức ăn: Hệ vi khuẩn đường ruột được chia thành 3 nhóm: nhóm có lợi như Lactobacilii, Bifidobacterium, Bacilli; nhóm có hại như Staphylococcus, Clostridium và nhóm vừa có lợi vừa có hại như Enterococii, E coli Các lợi khuẩn chứa trong probiotic có tác dụng cạnh

tranh nguồn thức ăn với các vi khuẩn có hại, phục hồi sự cân bằng hệ vi sinhvật đường ruột, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh [13]

* Vai trò kích thích lên hệ miễn dịch

Lợi khuẩn có trong chế phẩm probiotic có khả năng tạo thành môitrường có pH thấp với các thành phần bacteriocin, các peptid và các loại acidbéo chuỗi ngắn hay việc bám của vi khuẩn vào nhu mô ruột sẽ kích thích hệthống miễn dịch tập nhiễm của cơ thể [14]

* Tăng hiệu quả của quá trình tiêu hóa thức ăn thông qua việc cung cấpcác enzyme, vitamin và hormone sinh trưởng cho cơ thể thúc đẩy quá trìnhtiêu hóa polysacarit và hấp thu chất dinh dưỡng của các tế bào niêm mạctrong đường tiêu hóa Các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn thuộc nhómLAB có khả năng sinh β-galactosidase có khả năng thủy phân đường lactosethành đường đơn (galactose và glucose) để tăng cường khả năng tiêu hóa thức

ăn của cơ thể

1.1.3 Chế phẩm LabMix và BaciMix

Thành phần của chế phẩm LabMix bao gồm hỗn hợp 3 chủng L acidophilus LA 304.17; L casei LC 304.08; B bifidum BF 304.98 và tá dược Chế phẩm BaciMix bao gồm hỗn hợp 2 chủng B subtilis BS304.04; B coagulans BC 304.06 và tá dược bao gồm kẽm, manitol, aerosil (Bảng 1.1).

Trang 19

Bảng 1.1 Thành phần, công thức bào chế LabMix và BaciMix

người Việt Nam Các chủng đã được tiến hành nghiên cứu in vitro theo các

khuyến cáo của FAO/WHO về chủng vi khuẩn sử dụng trong chế phẩmprobiotic Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic là: antoàn; chủng vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vậtchủ; ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quảtrao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ [1] Theo khuyến cáo củaWHO, vi khuẩn probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng và thuộcnhóm GRAS (General Recornized as Safe) Theo tổ chức FDA của Mỹkhuyến cáo các chủng vi sinh vật được xếp vào nhóm GRAS là các chủng visinh vật được xem là an toàn Các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từruột người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men và được định danh thuộc

Trang 20

đối tượng an toàn Nhóm các vi sinh vật được các tổ chức khoa học có nănglực bảo quản trong bộ sưu tập vi sinh vật có tên khoa học, nguồn gốc và kếtquả nghiên cứu đảm bảo an toàn sinh học Các chủng probiotic có tác dụng thìcác chủng lựa chọn phải thích ứng với môi trường sinh thái trong hệ tiêu hóavật chủ như pH thấp, chịu enzyme tiêu hóa, acid và muối mật và có mặt củakháng sinh Ngoài ra, lợi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Khảnăng bám dính và tạo khuẩn lạc tại thành ruột được xem là một đặc tính quantrọng có tác dụng kích thích miễn dịch cũng như ức chế vi sinh vật gây hạithông qua cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột và khả năng loại vi sinh vậtgây hại và độc tố thông qua cơ chế hấp phụ Các nghiên cứu này bao gồm:định danh chủng, phân loại bằng giải trình tự và đăng ký mã chủng trên ngânhàng genbank Nghiên cứu đặc điểm an toàn (hoạt tính tan huyết, đặc tínhkháng kháng sinh), nghiên cứu đặc tính probiotic (khả năng sống sót trongmôi trường có pH thấp, muối mật, sinh tổng hợp enzyme, khả năng bám dính,khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh) và nghiên cứu một số đặc tính kỹthuật để sản xuất Các chủng làm probiotic LabMix và BaciMix đã đượcnghiên cứu về các đặc tính chủng làm chế phẩm probiotic [4], [5] Ngoài ra,các chủng này còn được nghiên cứu độc tính ở phòng nghiên cứu Dược lý,Trường Đại học Y Hà Nội Các thông tin chi tiết về định danh và phân lập vikhuẩn trong 2 chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix được biểu thị quaBảng 1.2 Các chủng được sử dụng làm chế phẩm probiotic LabMix vàBaciMix đều được đánh giá về tính an toàn và đặc tính chủng trong phòng thínghiệm được biểu thị qua Bảng 1.3.

1.1.4 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam

Chế phẩm probiotic được sử dụng rộng rãi cùng các chế phẩm sinh họckhác (enzyme, acid amin, vitamin) bổ sung vào thực phẩm chức năng, thựcphẩm sữa lên men Trong nước đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập

và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men dùng cho nghiên

Trang 21

cứu phát triển probiotic cho người Nghiên cứu của Đào Thị Lương và CS

(2020) về đặc tính probiotic trong điều kiện in vitro của chủng vi khuẩn L acidophilus VTCC 12257 phân lập từ tôm lên men đã được đánh giá dựa vào

các đặc điểm sinh học và khả năng chống chịu trong môi trường ruột môphỏng Trong nghiên cứu này, chủng VTCC 12257 được nghiên cứu cho sảnxuất sinh khối ở quy mô phòng thí nghiệm và trong thiết bị lên men 30 L Đâyđược coi là bước khởi đầu để sản xuất ở quy mô công nghiệp cho vi khuẩnprobiotic này [15] Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và CS (2019) đã phân

lập được 12/15 chủng Lactobacillus từ các mẫu phân của những trẻ em bú sữa

mẹ có tiềm năng làm chế phẩm probiotic [16] Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc

Thanh Tâm và CS (2019) đã phân lập được chủng Lactobacillus có tiềm năng

làm probiotic từ cây môn ngọt là loài cây thuộc họ khoai môn, có thể làm đadạng nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic và tuyển chọn được những dòng vikhuẩn có tiềm năng probiotic tốt do cây môn ngọt có khả năng sống được ởnhiều vùng môi trường khác nhau Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Bình và

CS (2021) được thực hiện nhằm đánh giá an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trịviêm ruột mạn tính của sản phẩm LiveSpo® Colon chứa bào tử lợi khuẩn

Bacillus thế hệ LS-III nồng độ cao 3 tỷ /ống 5 mL, kết quả cho thấy các triệu

chứng và mức độ viêm loét đại tràng giảm ở nhóm thử nghiệm sau 7 ngày vàsau ngày 30 sử dụng chế phẩm [17] Nghiên cứu của Bạch Thị Như Quỳnh và

CS (2022) đã phân lập được lợi khuẩn B infantis từ phân của trẻ em, có đầy

đủ các tính chất để làm chế phẩm probiotic sử dụng trên người [18] Nghiên

cứu của Phạm Thùy Dương và CS (2023) đã phân lập được lợi khuẩn W coagulans từ các nguồn khác nhau, lợi khuẩn đã được chứng minh có tiềm

năng làm chế phẩm probiotic trên người [19] Trong nông nghiệp probiotic cómột vai trò vô cùng quan trọng, nhiều ứng dụng được đưa vào thực tiễn vàcho hiệu quả cao Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Cảnh và CS (2018) đã phân

lập được 22 chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu acid và muối mật

Trang 22

cao, trong đó 02 chủng R2.3 và R3.3 có khả năng chịu cao nhất và ổn địnhnhất và có khả năng đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột vàcó khả năng làm chế phẩm probiotic cho chăn nuôi [20] Theo tác giả TrầnAnh Tuyên và CS (2019) khi sử dụng chế phẩm probiotic làm thức ăn cho gà.Kết quả cho thấy việc sử dụng 0,3% chế phẩm probiotics trong khẩu phần ảnhhưởng rõ rệt tới khả năng tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn, phòng bệnhcủa gà thí nghiệm và năng suất thân thịt, tăng trọng bình quân trên ngày tăng11,81%, tỷ lệ sống 100%, nâng cao tỷ lệ thịt [21] Nghiên cứu của NguyễnThị Lâm Đoàn và CS (2018) đã sàng lọc được chủng vi khuẩn thuộc chi

Bacillus có tiềm năng probiotic nhằm sản xuất chế phẩm ứng dụng trong chăn

nuôi gia cầm Bằng các phương pháp xác định một số đặc tính probiotic nhưkhả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào, kháng khuẩn gâybệnh, bám dính trên biểu mô ruột gà [22] Hiện nay, Viện Vi sinh vật và Côngnghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tuyển chọn được 10 chủng

probiotic thuộc chi Bacillus, Lactobacillus và Bifidobacterium cho nghiên cứu

phát triển sản phẩm probiotic phù hợp với giai đoạn 1 của tiến trình thực hiệntheo quy trình nghiên cứu phát triển sản phẩm probiotic của WHO/FAO Vớiyêu cầu thực tiễn của chủng sản xuất thương mại theo hướng dẫn và tiêuchuẩn quốc tế như trên, các chủng vi sinh vật này cần phải tiếp tục được

nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu an toàn và hiệu quả ở các cấp độ in vitro, in vivo thuộc giai đoạn 2 và 3 theo hướng dẫn của WHO/FAO Đánh giá hiệu

quả của probiotic trên động vật và người tình nguyện Đây là những dẫn liệukhoa học để chúng ta tiến hành sản xuất chế phẩm probiotic theo đúng hướngdẫn của WHO/FAO

Trang 23

Bảng 1.2 Định danh, phân lập vi khuẩn sử dụng làm chế phẩm LabMix và BaciMix

Đặc tính B subtilis BS 304.04 B coagulans BC

Thực phẩm lên men Đường tiêu hóa

người Việt Nam

Thực phẩm lên men Đường tiêu hóa

người Việt Nam

[4],[5]phụlục 1

Hình dạng Trực khuẩn bắt màu Gram dương Trực khuẩn bắt màu Gram dương Trực khuẩn bắt màu Gram dương Trực khuẩn bắt màu Gram dương Trực khuẩn bắt màu Gram dương

Khuẩn lạc

Trên môi trường Luria Bertani (LB) khuẩn lạc dạng S, tròn, nhẵn

Trên môi trường LB khuẩn lạc dạng S, tròn, nhẵn

Trên môi trường MRS hình thành khuẩn lạc dạng S tròn, nhẵn

Trên môi trường MRS khuẩn lạc dạng

B subtilis

NBRC 13719 (NR 112629.1)

Tương đồng 100%

(1344/1344 bp) so với chủng chuẩn

B coagulans

NBRC 12583 (NR 041523.1)

L acidophilus NBRC 13951

(NR_113638.1)

L casei subsp casei

ATCC 393 (NR_041893.1)

(1453/1453bp) so với chủng chuẩn

B bifidum

NBRC 100015 (NR_113873.1)

Trang 24

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix

pH và muối

mật

Chịu pH thấp vàmuối mật 8%

trong 48 giờ

Chịu pH thấp vàmuối mật 8% trong

48 giờ

3 giờ

Chịu pH thấp vàmuối mật 4%

trong 3 giờ

48 giờMôi trường

dịch ruột Sinh trưởng tốt Sinh trưởng tốt Sinh trưởng tốt Sinh trưởng tốt Sinh trưởng tốt

Chịu nhiệt

độ

Sống sót trên90% ở 70oC trong

Tốt với tế bào niêmmạc ruột và các tế

bào của chủng vớinhau

Tốt với tế bào niêmmạc ruột và các tế

bào của chủng vớinhau

Tốt với tế bàoniêm mạc ruột vàcác tế bào củachủng với nhau

Tốt với tế bàoniêm mạc ruột vàcác tế bào củachủng với nhauHoạt tính

Trang 25

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix (tiếp)

Lưu giữ và bảo quảntrong ống đông khô

và điều kiện lạnhsâu trong nitơ lỏng(-196oC)

Lưu giữ và bảo quảntrong ống đông khô

và điều kiện lạnhsâu trong nitơ lỏng(-196oC)

Lưu giữ và bảoquản trong ốngđông khô và điềukiện lạnh sâu trongnitơ lỏng (-196oC)

[4],[5]phụlục 1[23]

nhạy cảm vớikháng sinh và đặctính probiotic

Tương đồng với kếtquả thu được so vớichủng gốc về cácđặc tính hình tháihọc, di truyền học,đặc điểm sinh hóa,độ nhạy cảm vớikháng sinh và đặctính probiotic

Tương đồng vớikết quả thu được

so với chủng gốcvề các đặc tínhhình thái học, ditruyền học, đặcđiểm sinh hóa, độ

Tương đồng vớikết quả thu được

so với chủng gốcvề các đặc tínhhình thái học, ditruyền học, đặcđiểm sinh hóa, độ

Trang 26

1.2 Tổng quan về ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến đáp ứng miễn dịch

1.2.1 Khái niệm

Đáp ứng miễn dịch là một quá trình bảo vệ quan trọng và phức tạp của

cơ thể sinh vật Các yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch bao gồm: các cơquan lympho trung ương (tủy xương, tuyến ức) và ngoại vi (hạch lympho,lách, các mô lympho không có vỏ bọc); các tế bào lympho T, B; các tế bàothực bào đơn nhân và một số tế bào máu khác như bạch cầu (BC) trung tính,

BC ái toan, BC ái kiềm và tiểu cầu Ở cơ thể người đáp ứng miễn dịch chialàm hai loại: miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu được Miễn dịch tự nhiên

là khả năng tự bảo vệ sẵn có và mang tính di truyền trong các cơ thể cùngmột loài Các hàng rào của đáp ứng miễn dịch tự nhiên bao gồm hàng ràovật lý, hàng rào hóa học, các tế bào và các cytokine Miễn dịch thu được làtrạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể đã tiếp xúc với kháng nguyên Cácthành phần tham gia miễn dịch thu được như các tế bào B, T và các globulinmiễn dịch [24]

1.2.2 Một số yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch

* Niêm mạc ruột

Niêm mạc ruột được xem như một hàng rào bảo vệ vật lý và tham giavào đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể, bao gồm một số yếu tố như lớpchất nhầy bên ngoài tiếp xúc với hệ vi sinh vật đường ruột, protein khángkhuẩn và các phân tử immunoglobulin A bài tiết (sIgA) Lớp tế bào đơn vớicác biểu mô chuyên biệt Lớp đệm bên trong, nơi các tế bào miễn dịch thíchnghi cư trú (tế bào T, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai) Lớp chấtnhầy là tuyến bảo vệ đầu tiên mà các tác nhân gây bệnh bên ngoài gặp phảikhi đến lòng ruột, giúp ngăn vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với tế bào biểu mô[24]

* Cytokine IL-6, TNF-

Trang 27

Cytokine là các polypeptid được sản xuất khi có kích thích của vi sinhvật hoặc các kháng nguyên khác Nó có vai trò làm trung gian điều hòa cácphản ứng miễn dịch và viêm [24] Cytokine vừa làm chất trung gian và thamgia điều hòa miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được Các cytokine trongđáp ứng miễn dịch tự nhiên có vai trò quan trọng trong đề kháng của vật chủ[25] IL-6 là cytokin có các hoạt tính sinh học đa dạng, nhưng chủ yếu làmtăng tổng hợp IL-1 và TNF- để phối hợp kích thích đáp ứng miễn dịch, làmtăng sao chép, tăng biệt hoá, tăng tiết kháng thể của tế bào B, tăng phối hợpkích thích sinh máu và sản xuất thrombopoietin, kích thích phát triển tế bàogan và tế bào myeloma ở tổ chức nuôi cấy IL-6 có một số tác dụng sinh họcnhư tham gia vào đáp ứng miễn dịch, sản xuất ra các yếu tố đề kháng khôngđặc hiệu giống như tác dụng của IL-1 và TNF-, phát triển tế bào B và tươngbào để tăng tạo kháng thể dịch thể, phối hợp với IL-1 và TNF- tác dụng làmtăng sản xuất IL-2 IL-6 phối hợp với IL-1 và TNF- kích thích phát triển tếbào xương, tế bào da, tham gia kích thích tạo máu, tham gia vào quá trìnhđiều động bạch cầu trung tính và tế bào mono đến vị trí nhiễm vi sinh vật[25]

* IgA máu và niêm mạc ruột

Kháng thể IgA chiếm 10 -15% tổng lượng kháng thể trong huyết thanhnhưng nó là lớp kháng thể chính trong dịch ngoại tiết như nước bọt, nướcmắt, dịch nhầy đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường sinh dục [25] IgA trongdịch ngoại tiết gọi là các IgA tiết và các IgA tiết này có chức năng hết sứcquan trọng trong việc sinh miễn dịch tại chỗ ở đường tiêu hóa, đường hô hấp,tiết niệu sinh dục, vì đây là những con đường chính để các vi khuẩn xâmnhập Do vậy, IgA tiết là tuyến phòng thủ vô cùng quan trọng của cơ thểchống lại các tác nhân gây bệnh Các kháng thể này gắn trực tiếp lên bề mặt

vi khuẩn hoặc virus và ngăn không cho chúng gắn với tế bào màng nhầy do

Trang 28

vậy ức chế quá trình xâm nhập của vi khuẩn và tác dụng ngăn cản sự lâynhiễm của virus [25]

1.2.3 Vai trò của probiotic trong đáp ứng miễn dịch

Những lợi khuẩn làm probiotic có khả năng kích thích các đáp ứngmiễn dịch của cơ thể thông qua các cơ chế khác nhau Một số lợi khuẩn cókhả năng điều chỉnh các chức năng của tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân,đại thực bào và tế bào lympho, giúp tăng cường quá trình thực bào mầm bệnh

tế bào lympho T để sinh ra các loại cytokine khác nhau như IFN-γ, 10,

IL-4, IL-12 Nghiên cứu của Fumico N và CS (2000) trên 10 người khỏe mạnh

khi sử dụng sữa lên men chứa chủng L casei với liều dùng 1×1010 CFU mỗi

ngày trong thời gian 3 tháng, cho thấy chủng L casei làm tăng hoạt tính tế

bào NK (Natural Killer) trong thời gian thí nghiệm và tiếp tục tăng sau 3 tuầnliên tiếp [26] Nghiên cứu của Chen C.Y và CS (2013) nhận thấy sử dụng tếbào vi khuẩn thuộc nhóm LAB bất hoạt bằng nhiệt ở 100oC trong 30 phút hay

121oC trong 15 phút có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch trên chuột Cụthể là kích thích cơ thể sản xuất IL-12 và IL-10 trong khi đó lại ức chế sảnxuất TNF- và IL-6 [27] Nghiên cứu hoạt tính miễn dịch của gà đối với độc

tố tetanus toxoid (TT) và alpha toxin, tác giả Hamid R H và CS (2006) cho

thấy kháng thể IgG và IgM tăng lên khi sử dụng L acidophilus, B biﬁdum và

S faecalis so với trường hợp không sử dụng probiotic [28] Nghiên cứu của

Trần Minh Diên và CS (2022), khi đánh giá tác dụng của chế phẩm dạng xịt

chứa 5 tỷ bào tử Bacillus (LiveSpo Navax) là phương pháp hiệu quả trong

một nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng với trẻ em bị nhiễm RSV.Kết quả cho thấy chế phẩm làm giảm các triệu chứng của bệnh, giảm tảilượng virus và các cytokine tiền viêm [29]

Hiện nay có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch củachế phẩm probiotic trên động vật thực nghiệm Nghiên cứu của Galdeano C

Trang 29

M và CS (2009) đã đánh giá tác dụng của các lợi khuẩn L delbrueckii subsp bulgaricus, S thermophilus và L casei DN 114001 lên hệ miễn dịch của

chuột BALB/c 6 tuần tuổi khỏe mạnh trong 5 ngày liên tiếp Kết quả nồng độIL-6 ở nhóm sử dụng chế phẩm giảm so với nhóm chứng [30] Tác giảWebberley T S và CS (2021) đánh giá tác dụng của chế phẩm Lab4 có chứa

các lợi khuẩn L acidophilus CUL21, L acidophilus CUL60, B bifidum CUL20, B animalis subsp lactis CUL34 mật độ 3x1010CFU trên chuộtWistar 6-7 tuần tuổi, khỏe mạnh trong 90 ngày Kết quả là nồng độ cáccytokine IL-6 và TNF-α trong máu chuột ở nhóm sử dụng chế phẩm giảm sovới nhóm chứng [31] Nghiên cứu của Salazar N và CS (2014) đánh giá tác

dụng của hai chủng Bifidobacterium lên hệ miễn dịch của chuột Wistar Tác

giả đã sử dụng 3 nhóm, mỗi nhóm 8 con chuột Wistar 12 tuần tuổi, khỏe

mạnh và sử dụng các lợi khuẩn B animalis subsp lactics IPLA-R1 và B longum IPLA-E44 trong 24 ngày Kết quả là nồng độ IL-6 trong máu giảm và

nồng độ TGF-β trong máu tăng lên [32] Tác giả Harata G và CS (2009) đãsử dụng chuột BALB/c cái 6-10 tuần tuổi để đánh giá tác dụng lên hệ miễn

dịch của lợi khuẩn Lactobacillus GG và L gasseri TMC0356 trong 7 ngày Nghiên cứu cho thấy lợi khuẩn Lactobacillus GG làm tăng nồng độ các

cytokine và IgA ở các nhóm sử dụng lợi khuẩn so với nhóm không được sửdụng lợi khuẩn [33] Nghiên cứu của Karamese M và CS (2016) đã sử dụng

hỗn hợp chế phẩm probiotic chứa 12 lợi khuẩn thuộc nhóm Bifidobacterium

và Lactobacillus trên mô hình chuột Wistar 12 tuần tuổi khỏe mạnh liên tục

trong 12 ngày Chế phẩm làm giảm nồng độ IL-6, TNF-α và FGF-β và làmtăng nồng độ IL-10, IgG và IgA trong huyết thanh của chuột [34]

Vai trò của chế phẩm probiotic trong mô hình suy giảm miễn dịch, môhình chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh, mô hình chuột nhiễm khuẩn do vikhuẩn và hóa chất gây ra cũng được báo cáo trong nhiều nghiên cứu Cácnghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic trên mô hình chuột suy

Trang 30

giảm miễn dịch Longxian L và CS (2021) nghiên cứu tác dụng điều hòa

miễn dịch của chế phẩm probiotic (gồm các lợi khuẩn Bifidobacterium, Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus (CBLEB)) trên chuột bị ức chế miễn

dịch bằng cyclophosphamide (CTX) Tác giả sử dụng 27 con chuột Dawley đực, trọng lượng 200-300g, chia thành 3 nhóm Vào các ngày 1, 2, 3,

Spague-10 các con chuột của nhóm nghiên cứu CTX và CTX + CBLEB được tiêmcyclophosphamide (40mg/kg) vào phúc mạc chuột Đến ngày thứ 4 nhữngcon chuột nhóm CTX + CBLEB được sử dụng chế phẩm CBLEB trong 15ngày Kết quả cho thấy CBLEB làm giảm mức độ viêm và tổn thương miễndịch cho CTX gây ra Ngoài ra, chế phẩm có tác dụng làm giảm nồng độ M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), MIP-3α (macrophageinflammatory protein 1α) trong huyết thanh chuột là các yếu tố kích thích đạithực bào và protein tham gia vào phản ứng viêm [35] Nghiên cứu của Salva

S và CS (2014) đánh giá tác dụng bảo vệ chống suy tủy và ức chế miễn dịch

của các chủng Lactobacillus trên mô hình chuột cũng bị ức chế miễn dịch

bằng CTX Tác giả đã sử dụng chuột đực Swiss 6 tuần tuổi, chia làm 3 nhóm

Lợi khuẩn L casei CRL431 (Lc431) và L rhamnosus CRL1506 (Lr1506)

được sử dụng trước khi tiêm CTX lần lượt trong 2 ngày và 5 ngày Sau đó cáccon chuột được tiêm CTX dưới phúc mạc với liều 150 mg/kg cân nặng vàtheo dõi trong 15 ngày tiếp theo Ngày thứ 3 sau khi tiêm CTX các con chuột

được tiêm Candida albicans dưới phúc mạc Kết quả cho thấy điều trị dự phòng bằng Lactobacillus như Lc431 và Lr1506 có tác dụng làm tăng các tế

bào tiền thân tủy chưa trưởng thành và phục hồi sớm các tế bào tủy sau khitiêm CTX Ngoài ra, chế phẩm probiotic làm tăng khả năng phục hồi sớmbạch cầu trung tính trong máu, tăng khả năng thực bào đến vị trí nhiễm trùng

[36] Tác giả Choi D.W và CS (2018) nghiên cứu về tác dụng của L plantarum nF1 (nLp-nF1) trên mô hình chuột bị suy giảm miễn dịch do CTX.

Trong mô hình tác giả sử dụng chuột ICR đực, 6 tuần tuổi, chia làm 4 nhóm,

Trang 31

mỗi nhóm 5 con Các liều nLp-nF1 được sử dụng là 4×109 CFU/kg, 4×1010CFU/kg Các nhóm được tiêm CTX (150 mg/kg) vào ngày 0 và ngày thứ 2.Các nhóm uống nLp-nF1 từ ngày 3 đến ngày 17 (15 ngày) Kết quả cho thấylợi khuẩn làm tăng sản xuất IgG và các cytokine trên mô hình thực nghiệm[37] Nghiên cứu của tác giả Xie Y và CS (2016) về tác dụng của lợi khuẩn

L plantarum NCU116 cũng được thực hiện trên mô hình chuột suy giảm

miễn dịch do CTX Mô hình sử dụng chuột BALB/c 6-8 tuần tuổi, nặng 22g, chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm 10 chuột Các chuột được tiêm dưới phúcmạc CTX (80mg/kg trọng lượng) trong 3 ngày Sau đó các nhóm chuột đượcsử dụng lợi khuẩn với các liều 108, 109, 1010 CFU/ml trong 20 ngày Kết quảcho thấy nồng độ các cytokine IL-17 và IL-21 tăng đáng kể sau 10 ngày điềutrị với liều cao, còn IL-23, TGB-β3 tăng ở cả 3 liều Ngoài ra lợi khuẩn làmtăng số lượng tế bào CD4, T, tế bào đuôi gai và tăng biểu hiện mRNA đượcđiều hòa bởi các thụ thể TLR (Toll-like receptors ) [38]

18-Một số nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng lên hệ miễndịch của lợi khuẩn trên mô hình chuột bị nhiễm khuẩn do vi khuẩn, hóa chấtgây ra Tác giả Mazkour S và CS (2020) đã nghiên cứu tác dụng của hai bào

tử lợi khuẩn B subtilis, B coagulans đối với chuột bị nhiễm S typhimurium Kết quả cho thấy lợi khuẩn làm giảm sự xâm nhập của vi khuẩn Salmonella

vào hạch bạch huyết và làm giảm các chất trung gian gây viêm và giảm chấtoxi hóa do stress [39] Nghiên cứu của tác giả Ayyanna R và CS (2018) đánh

giá đặc tính chống viêm của 2 chủng Lactobacillus trên chuột Wistar Kết quả

là lợi khuẩn làm tăng nồng độ các cytokine chống viêm và giảm các cytokinetiền viêm [40] Nghiên cứu của Ciobanu L và CS (2020) đánh giá tác dụng

của L plantarum ACTT 8014 đối với chuột bị viêm niêm mạc ruột do

5-fluorouracil (5-FU) Chuột Wistar được cho uống 3,32×109 CFU/ml L plantarum trong 9 ngày, sau đó tiêm 5-FU (400mg) dưới phúc mạc vào ngày

Trang 32

thứ 7 Kết quả cho thấy lợi khuẩn làm giảm tổn thương niêm mạc do hóa chấtgây ra và làm tăng sự biểu hiện của TLR4 [41].

Một số nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic lên hệmiễn dịch trên mô hình chuột tiêu chảy do sử dụng kháng sinh Nghiên cứucủa tác giả Guo H và CS (2021) đánh giá vai trò của các chủng lợi khuẩn vàhỗn hợp chủng lợi khuẩn trên mô hình chuột bị tiêu chảy khi sử dụnglincomycine với liều 3g/kg ngày 2 lần Kết quả cho thấy sử dụng

Bacteroides hoặc kết hợp giữa Bacteroides và Bifidobacterium có tác dụng

làm giảm tình trạng viêm, tăng tốc độ phục hồi cấu trúc mô và tăng nồng độSCFA Hơn nữa, hỗn hợp chủng lợi khuẩn có hiệu quả hơn so với chủng đơn

lẻ trong việc làm giảm các đặc điểm bệnh lý của ruột kết, điều chỉnh giảmnồng độ interleukin (IL-6) và điều chỉnh tăng biểu hiện của chất kết dínhtrong mô hình chuột bị AAD [42] Nghiên cứu của tác giả Shi Y và CS(2017) thực hiện trên mô hình chuột sử dụng kháng sinh ampicillin trong 2

tuần Kết quả là chế phẩm JUP-Y4 cũng làm giảm đáng kể nồng độ D-lactate

và nội độc tố trong huyết thanh của chuột và cũng như tăng biểu hiện của cácprotein liên kết đồng thời giảm sản xuất các cytokine gây viêm (TNF-, IL-6,MCP-1, IFN-c và IL-1b) trong hồi tràng và ruột kết của chuột sử dụng khángsinh [43] Nghiên cứu của tác giả Li W và CS (2023) đánh giá tác dụng của

chế phẩm probiotic đa chủng gồm các lợi khuẩn B lactis XLTG11, L casei Zhang, L plantarum CCFM 8661 và L rhamnosus Probio-M9 ở các liều trên

mô hình chuột sử dụng kháng sinh ampicillin liều 11,2 g/kg cân nặng Kết quả

là chế phẩm probiotic làm giảm nồng độ các cytokin IL-6, IL-1β, TNF-α vàtăng nồng độ các cytokin IL-10 và SIgA trên mô hình chuột bị AAD [44]

1.3 Hệ vi khuẩn đường ruột

1.3.1 Khái niệm

Cơ thể con người có khoảng 1013 - 1014 tế bào, trong khi đó tổng số vikhuẩn đường ruột gấp khoảng mười lần số tế bào trong cơ thể, trải đều trong

Trang 33

lòng ruột với độ dày khoảng 1 mm và tổng số vi khuẩn lên tới 1012 vi khuẩntrong 1 gam phân [1] Các ngành vi khuẩn được tìm thấy trong đường ruộtcủa con người bao gồm các ngành như Bacteroidetes, Firmicutes,Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria và Verrucomicrobia trong đó 2ngành Firmicutes và Bacteroidetes chiếm đến 90% hệ vi khuẩn đường ruột

[2] Ngành Firmicutes bao gồm hơn 200 chi khác nhau như Lactobacillus, Bacillus, Clostridium, Enterococcus và Ruminicoccus; trong đó chi Clostridium chiếm 95% trong ngành Firmicutes Ngành Bacteroidetes bao gồm chi Bacteroides và Prevotella là các chi chiếm đa số trong ngành này

[45] Ngoài ra, hệ vi sinh vật đường ruột có một vai trò vô cùng quan trọngnhư là một bộ phận hay một cơ quan trong cơ thể người Trong cơ thể, các tếbào miễn dịch tập trung nhiều nhất ở hệ tiêu hóa và hệ vi khuẩn đường ruộtđóng một vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa các tế bào miễn dịch đó Khisự mất cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột xuất hiện sẽ dẫn đến rối loạn chứcnăng hệ thống niêm mạc và các tế bào miễn dịch bên trong đường tiêu hóa[2]

1.3.2 Sự phân bố các vi khuẩn đường ruột

Vi khuẩn đường ruột cư trú theo chiều dài đường tiêu hóa nhưng khácnhau về chủng loại và mức độ phong phú tùy theo từng khu vực Số lượng vikhuẩn có trong dịch ở dạ dày và tá tràng là 10 – 103 CFU/g, ở ruột non là 104– 107 CFU/g, ở đại tràng là 1011 – 1012 CFU/g [1] Sự phân bố và thành phầnhệ vi khuẩn bên trong đường tiêu hóa như sau:

Khoang miệng: chứa một lượng lớn vi khuẩn vì ở đây có các điều kiệnthuận lợi cho vi khuẩn phát triển như nhiệt độ phù hợp, thức ăn và pH phùhợp Vi khuẩn trong khoang miệng có khoảng 150 chi, 700 loài vi khuẩn;trong đó 51% vi khuẩn đã được định danh, 13% vi khuẩn chưa được đặt tênnhưng phân lập được và 28% vi khuẩn chưa được định danh [46] Khoảng96% các vi khuẩn trong khoang miệng thuộc các ngành vi khuẩn Firmicutes,

Trang 34

Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes và Spirochaetes

với các chi Actinomyces, Atopobium, Corynebacterium, Rothia, Bergeyella, Capnocytophaga, Prevotella, Granulicatella, Streptococcus, Veillonella, Campylobacter, Cardiobacterium, Haemophilus, Neisseria và Fusobacteria; trong số đó Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Veillonella, Prevotella

là các chi chiếm ưu thế [47]

Thực quản: Hệ vi khuẩn ở khoang miệng và thực quản có nhiều điểm

tương đồng với nhau Các loài Streptococcus (S salivarius, S sanguinis , S oralis và S mutans) có ở cả hai vị trí Điều này cho thấy hệ vi khuẩn ở thực quản có nguồn gốc từ khoang miệng Các loài vi khuẩn S viridans, H influenzae, N catarrhalis, Streptococcus spp và K pneumonia là các loài

chiếm ưu thế lớn trong thực quản [48]

Dạ dày: Các nghiên cứu chỉ ra rằng dạ dày có hệ vi khuẩn đa dạng vàphức tạp với 266 chi vi khuẩn đã được xác định; trong đó 57 chi vi khuẩnđược đặt tên và phân bố trong các ngành Proteobacteria, Firmicutes,

Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria Trong đó các chi Helicobacter, Streptococcus và Prevotella là phổ biến nhất [49]

Đại tràng: là nơi có số lượng lớn và nhiều loài vi khuẩn nhất Hoạtđộng của các loài vi khuẩn ở đây làm cho đại tràng trở thành cơ quan chuyểnhóa tích cực của cơ thể Vi khuẩn trong đại tràng chiếm hơn 70% tổng số vikhuẩn trong cơ thể và chủ yếu thuộc ngành Firmicutes và Bacteroidetes Phầnlớn vi khuẩn ở ruột non là vi khuẩn Gram dương, trong khi đó ở đại tràng là

vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn phát triển nhanh ở manh tràng và phần đi lêncủa đại tràng và phát triển chậm ở kết tràng [50]

1.3.3 Vai trò của hệ vi khuẩn đường ruột

Hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò liên quan đến quá trình trao đổi chất

và chức năng bảo vệ thông qua tác động lên hệ miễn dịch của cơ thể

1.3.3.1 Tham gia vào quá trình trao đổi chất và tiêu hoá thức ăn

Trang 35

Hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình trao đổi chất và tiêu hoáthức ăn bằng cách sinh ra các enzym không được mã hóa bởi bộ gen ngườinhư enzym phân hủy polysaccharid, polyphenol và tổng hợp vitamin Các loài

vi khuẩn như Bacteroides, Roseburia, Bifidobacterium, Fecalibacterium và Enterobacteria giúp chuyển hoá carbohydrate thành các acid béo mạch ngắn

(SCFA), được cơ thể sử dụng như một nguồn năng lượng và các chất dinhdưỡng hữu ích Các SCFA như acid propionic, acid butyric… được tạo thành

do quá trình lên men đường Một số vi khuẩn đường ruột tham gia vào quátrình chuyển hóa protein thông qua hoạt động của các proteinase và peptidasecủa vi khuẩn cùng với các proteinase của cơ thể người Ví dụ enzym

histamine decarboxylase được mã hóa bởi gen hdcA của vi khuẩn tham gia

vào quá trình chuyển đổi L-histidine thành histamine [51] Glutamate

decarboxylases được mã hóa bởi gen gadB của vi khuẩn tham gia vào quá

trình chuyển glutamate thành axit γ-amino butyric [52] Ngoài ra, hệ vi khuẩnđường ruột còn thực hiện chức năng tổng hợp vitamin K và một số thành phần

của vitamin B Các thành viên của chi Bacteroides đã được chứng minh là có

khả năng tổng hợp acid linoleic liên hợp có tác dụng chống đái tháo đường,kháng vi khuẩn, giảm acid máu và có đặc tính điều hòa miễn dịch [53] Vi

khuẩn B intestinalis, B fragilis và E coli có khả năng tách và khử nước từ

các acid mật chính và chuyển đổi chúng thành các acid mật thứ cấp trong đạitràng [54]

1.3.3.2 Ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh

Hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình ngăn chặn sự phát triểncủa các vi sinh vật gây bệnh cho cơ thể thông qua cơ chế trực tiếp và giántiếp Các vi khuẩn có lợi còn sản xuất ra các bacteriocin (bao gồm cảlantibiotic) như nisin, enteriocin, subtilisin…có tác dụng kháng lại vi khuẩngây bệnh Một số vi khuẩn trong nhóm LAB sinh ra các acid hữu cơ như acidlactic, acid acetic, ethanol có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây

Trang 36

bệnh Sự có mặt của vi khuẩn LAB làm giảm pH theo hướng bất lợi chonhóm vi khuẩn có hại do đó làm thay đổi cân bằng quần xã vi sinh vật đường

ruột theo hướng có lợi cho vật chủ Ngoài ra, một số lợi khuẩn có tác dụng giải độc tố ammonia và phenol ví dụ như chủng Lactobacilii và S cerevisiae vì vậy chúng có tác dụng ức chế sự phát triển của nhóm Clostridium gây bệnh

ở đường tiêu hóa [55]

1.3.3.3 Điều hoà hệ miễn dịch

Hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trong việc kích thích hệmiễn dịch của cơ thể Các vi khuẩn cộng sinh bên trong đường ruột thúc đẩyquá trình tạo hạt và huy động bạch cầu trung tính trong tủy xương khi bịnhiễm trùng thông qua thụ thể TLRs (Toll-like receptor) Hệ vi khuẩn đườngruột có khả năng huy động các tế bào tiền thân dòng tủy đến các cơ quan khácnhau, để tạo ra các tế bào trưởng thành ở đó [55] Sự có mặt của vi khuẩncộng sinh đường ruột kích thích biểu hiện của các cytokine để thúc đẩy phảnứng viêm thích hợp Các cytokine như IL-1, IL-23 và IL-6 từ đại thực bàoruột đã thúc đẩy quá trình hoạt hóa tế bào Th17 của niêm mạc; IL-10 và cácSCFA ảnh hưởng đến sự phát triển của Tregs (tế bào T điều hòa) trong niêm

mạc đường tiêu hóa [56] Trong quá trình nhiễm C rodentium hoặc C difficile IL-22 hầu hết được sản xuất bởi các tế bào ILC3, có tác dụng kích

thích tế bào gan sản xuất hemopexin và bổ thể C3 để ức chế sự phát triển của

vi khuẩn này [55] Hệ vi khuẩn đường ruột ảnh hưởng đến quá trình sản xuấtkháng thể IgA trong lòng ruột để ngăn vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vượt quahàng rào biểu mô Các kháng thể IgA từ niêm mạc ruột tham gia vào quá trìnhchống xâm nhập của tác nhân gây bệnh vào cơ thể [24]

1.3.3.4 Tham gia vào trục não ruột

Các thành phần tham gia vào trục não ruột bao gồm hệ thần kinh trungương, hệ thần kinh giao cảm, hệ thần kinh phó giao cảm, dây thần kinh phế

vị, hệ thần kinh ở đường ruột và hệ vi sinh vật đường ruột [57] Mối quan hệ

Trang 37

giữa hệ vi sinh vật đường ruột và não bộ được dẫn truyền qua dây thần kinhnội tiết thông qua trục hạ đồi - tuyến yên - tuyến thượng thận và điều hòaserotonin Sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột sẽ gây ảnh hưởng đến mốiquan hệ giữa ruột và não thông qua các con đường trên [58] Trong mối quanhệ này thì dây thần kinh phế vị có vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệugiữa hệ thần kinh đường ruột và hệ thần kinh trung ương Một số nghiên cứuchứng minh rằng giảm hoạt động của dây thần kinh phế vị có liên quan đếntình trạng bệnh lý của một số bệnh như hội chứng ruột kích thích hoặc bệnhtrầm cảm [59] Sự ảnh hưởng của hệ vi sinh vật đường ruột lên trục hạ đồi -tuyến yên - tuyến thượng thận thông qua một cơ chế điều hòa phức tạp Hệ visinh vật đường ruột tác động lên dây thần kinh phế vị, vùng hạ đồi và vùnghải mã dẫn đến kích hoạt trục hạ đồi -tuyến yên Ngoài ra, hệ vi khuẩn đườngruột có vai trò trong điều chỉnh serotonin, ảnh hưởng đến chức năng não vàruột Các vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình tổng hợp và giải phóngserotonin Vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ thần kinh thông qua các chất trung gianđiều hòa hệ thần kinh như tryptophan, serotonin, GABA và catecholamine.

Do đó, hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào trục não - ruột và là cơ chế chínhtrong một số bệnh lý ở người [60]

1.3.4 Phương pháp xác định hệ vi khuẩn đường ruột

1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy là phương pháp truyền thống định danh vi khuẩndựa trên đặc điểm về hình thể, kích thước và các tính chất sinh vật hóa họccủa vi khuẩn trên các môi trường nuôi cấy đặc hiệu Tuy nhiên, phương phápnuôi cấy không thích hợp để phân tích microbiome trong đường tiêu hóa bởivì trong hệ vi khuẩn đường ruột chứa rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau Vìvậy, việc xác định từng loài vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy sẽ rất tốnkém và mất nhiều thời gian Ngoài ra, một số vi khuẩn sống trong những điềukiện đặc biệt và rất khó nuôi cấy bằng môi trường nhân tạo Các nhà khoa học

Trang 38

ước tính rằng hơn 99% các vi khuẩn trong nhiều môi trường vẫn chưa nuôicấy được [61]

1.3.4.2 Phương pháp định danh bằng phát hiện gen đích

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là sự ra đời công nghệPCR (Polymerase Chain Reaction), do vậy việc định danh các vi sinh vật nóichung và vi khuẩn nói riêng ngày càng trở nên dễ dàng với độ chính xác caohơn Đây là phương pháp định danh bằng cách sử dụng các cặp mồi đặc hiệuđể phát hiện gen đích cho từng loài vi khuẩn Phương pháp PCR dựa vào cácchu kỳ nhiệt để khuếch đại tạo ra một số lượng lớn các bản sao của vật chất

di truyền Chỉ từ một lượng DNA rất nhỏ có thể khuếch đại lên hàng triệubản nhằm phục vụ cho quá trình chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Cácphương pháp cơ bản dựa trên nguyên lý PCR như RT PCR, Multiplex PCR,Nested PCR, PFRE (điện di trên gel trường xung)… Kỹ thuật này được coi là

kỹ thuật cơ bản nhất của các nghiên cứu sinh học phân tử với nhiều ưu điểmlớn như tính chính xác cao, nhạy, nhanh và dễ thực hiện Thời gian trả lời kếtquả nhanh Tuy nhiên đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại, con người được đàotạo về sinh học phân tử Trong quá trình thực hiện kỹ thuật dễ bị nhiễm chéodẫn đến kết quả sai lệch [62]

1.3.4.3 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự là phương pháp xác định trình tự DNA hoặcRNA một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí Phương pháp giải trình tựcho phép xác định hàng triệu đoạn trình tự DNA hoặc RNA cùng một lúc[63] Trong khi giải trình tự, các phân tử huỳnh quang được phân tách theo vịtrí riêng biệt trên phiến kính thay vì phân tách theo kích thước của các phân tửnày [64] Quy trình bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chế tạo thư viện, cắt nhỏDNA/RNA thành các đoạn ngắn, ghép nối các đoạn này thành các cụm và sauđó xác định trình tự của chúng bằng cách sử dụng các kỹ thuật quang học vàphân tích dữ liệu [65] Hiện nay, phương pháp giải trình tự bao gồm các

Trang 39

phương pháp cơ bản như giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS),phương pháp gắn nối (SBL) và phương pháp Sanger Phương pháp SBS liênquan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTP được biến đổi tại vị trí 2’OHbao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang Quá trìnhxác định trình tự sẽ diễn ra tương tự như phản ứng PCR Phương pháp SBL làmột phương pháp giải trình tự DNA thay vì sử dụng enzyme polimerase nhưhầu hết các phương pháp, chúng sử dụng enzyme DNA ligase để xác địnhnucleotide có mặt tại một vị trí nhất định trong trình tự DNA Phương phápgiải trình tự cổ điển Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide(ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro)vẫn được thực hiện xen kẽ với các phương pháp giải trình tự thế hệ mới khicần thiết Giải trình tự là một phương pháp quan trọng trong lĩnh vực sinh họcphân tử và y sinh học Nó có hiệu quả trong việc xác định trình tự, phân tíchcấu trúc và chức năng của DNA và RNA của vi sinh vật, cho phép xác địnhnhanh chóng và chính xác mầm bệnh như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinhtrùng Phương pháp này có thể phát hiện ra mầm bệnh đã biết hoặc nhữngmầm bệnh mới xuất hiện, xác định gen kháng kháng sinh và cung cấp thôngtin về lây truyền gen kháng thuốc Ngoài ra, giải trình tự cho phép lập hồ sơtoàn diện và vai trò của các cộng đồng vi sinh vật đối với sức khỏe và bệnh tậtcủa con người như các tình trạng như béo phì, bệnh viêm ruột và rối loạn sứckhỏe tâm thần [66].

1.3.4.4 Phương pháp metagenomics

Thuật ngữ “Metagenomics” lần đầu tiên được mô tả vào năm 1998 bởiHandelsman và Rodon và trở thành một trong những phương pháp nghiên cứuhệ vi sinh vật phức tạp Phương pháp này với mục đích xác định thành phầnloài trong hệ vi sinh vật dựa trên gen thu được từ phương pháp giải trình tự.Metagenomics là kĩ thuật cho phép khai thác được tối đa thông tin dựa trêncác gen của vi sinh vật trong các quần thể sinh vật Metagenomics nghiên cứu

Trang 40

metagenome quần xã sinh vật thông qua bốn bước gồm (1) thu thập mẫu, (2)tách chiết acid nucleic trong mẫu thu thập, (3) giải trình tự và xử lý đoạn trìnhtự dựa trên nhằm thiết lập hồ sơ đa dạng loài dựa trên một hoặc một đoạn gen,nhiều gen hay toàn bộ hệ gen, (4) sử dụng các công cụ tin sinh học để phântích và khai thác dữ liệu từ vật liệu di truyền [67]

Phương pháp metagenomics là phương pháp hiệu quả trong việc nghiêncứu toàn diện hệ vi sinh vật đường ruột của con người bởi vì phương pháp cóđộ nhạy cao với mục tiêu dự đoán, tìm kiếm các mối tương quan thông qua dữliệu trình tự Ngoài ra, phương pháp giúp chúng ta khai thác thông tin toàndiện về các mầm bệnh mới, các tác nhân gây bệnh; và các cơ chế chuyển hóaliên quan đến hệ vi sinh vật kể cả những vi sinh vật chưa thể nuôi cấy đượctrong điều kiện phòng thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn tồntại một số hạn chế Thứ nhất, metagenomics có thể không xác định được một

số vi sinh vật có mật độ thấp trong môi trường Thứ hai, phương phápmetagenomics yêu cầu phân tích lượng trình tự lớn nên chi phí giải trình tựDNA metagenomics của hệ vi sinh vật đường ruột là tương đối lớn Thứ ba,phương pháp metagenomics yêu cầu phải có đủ số lượng DNA trong mẫucũng như chất lượng DNA cần được đảm bảo Cuối cùng, thông tin về cơ sở

dữ liệu tham chiếu của metagenomics là vô cùng quan trọng, và có rất nhiềunghiên cứu thực tế chỉ ra rằng có hơn 80% các đoạn trình tự được phân tíchkhông được gán với bất kỳ thông tin nào trên dữ liệu tham chiếu [68]

1.3.5 Các nghiên cứu về sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật

Vai trò của chế phẩm probiotic với một số bệnh đã được chứng minhqua một số mô hình nghiên cứu trên động vật Các nghiên cứu này đã đánhgiá vai trò của lợi khuẩn trong một số bệnh ở đường tiêu hóa như tiêu chảy dosử dụng kháng sinh, viêm ruột và táo bón

Tiêu đề	Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và một số chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix
Tác giả	Nguyễn Duy Hà
Người hướng dẫn	TS. Chu Đình Tới, PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
Trường học	Học viện Quân y
Chuyên ngành	Khoa học y sinh
Thể loại	Luận án Tiến sĩ Y học
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	165
Dung lượng	3,07 MB