Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMixNghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix

Trang 1

NGUYỄN DUY HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

KHI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LABMIX VÀ BACIMIX

LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC

HÀ NỘI - 2024

Trang 2

NGUYỄN DUY HÀ

NGHIÊN CỨU SỰ BIẾN ĐỘNG HỆ VI KHUẨN ĐƯỜNG RUỘT VÀ MỘT SỐ CHỈ SỐ MIỄN DỊCH TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM

KHI SỬ DỤNG CHẾ PHẨM PROBIOTIC LABMIX VÀ BACIMIX

Trang 3

Đảng ủy, Ban giám đốc Học viện Quân y; Viện Vi sinh vật và Công nghệ sinhhọc - Đại học Quốc gia Hà Nội, Bộ môn Khoa Vi sinh vật - Học viện Quân y,Bộ môn Khoa Dược lý - Học viện Quân y, Viện nghiên cứu Y dược học quânsự - Học viện Quân y và Phòng Sau Đại học - Học viện Quân y, đã cho phépvà tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiêncứu;

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Chu Đình Tớivà PGS TS Nguyễn Thái Sơn những người thầy đã dành nhiều thời gian,công sức, trực tiếp hướng dẫn tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu vàhoàn thành luận án;

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Tiến sĩ Hoàng Văn Vinh, Trưởngphòng- Phòng Sinh học phân tử Ứng dụng - Viện Vi sinh vật và Công nghệsinh học - Đại học Quốc gia Hà Nội là chủ nhiệm đề tài và các cộng sự trongđề tài luôn tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong quá trình học tập vànghiên cứu;

Tôi xin trân trọng cảm ơn các Thầy Cô giáo luôn tạo mọi điều kiệnthuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thànhluận án.

Tôi xin trân trọng cảm ơn Bố mẹ, vợ và các con, anh chị em trong giađình, bạn bè đồng nghiệp luôn động viên, khích lệ, tạo mọi điều kiện thuậnlợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luậnán.

Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2024

Tác giả

Trang 4

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu trong đề tài luận án là một phần số liệu trong

đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu đánh giá vai trò cải thiện tích cực hệ visinh vật đường ruột và tăng cường miễn dịch của chế phẩm probiotic” mã sốĐTĐL.CN 61/19 Kết quả đề tài này là thành quả nghiên cứu của tập thể mà

tôi là một thành viên tham gia chính Tôi đã được Chủ nhiệm đề tài và toàn bộ các thành viên trong nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng số liệu nghiên cứu của đề tài này đưa vào trong luận án tiến sĩ Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác

Hà Nội, ngày 02 tháng 5 năm 2024

Tác giả

Nguyễn Duy Hà

Trang 5

Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Mục lục

Danh mục chữ viết tắt trong luận án Danh mục các bảng

Danh mục các hình Danh mục biểu đ

ĐẶT VẤN ĐỀ 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Tổng quan về probiotic 3

1.1.1 Định nghĩa 3

1.1.2 Vai trò, cơ chế tác động của probiotic 3

1.1.3 Chế phẩm LabMix và BaciMix 5

1.1.4 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam 7

1.2 Tổng quan về ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến đáp ứng miễn dịch 13

1.2.1 Khái niệm 13

1.2.2 Một số yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch 13

1.2.3 Vai trò của probiotic trong đáp ứng miễn dịch 14

1.3 Hệ vi khuẩn đường ruột 19

1.3.1 Khái niệm 19

1.3.2 Sự phân bố các vi khuẩn đường ruột 20

1.3.3 Vai trò của hệ vi khuẩn đường ruột 21

1.3.4 Phương pháp xác định hệ vi khuẩn đường ruột 24

Trang 6

CHƯƠNG 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31

2.1 Đối tượng nghiên cứu 31

2.1.1 Chế phẩm LabMix và BaciMix 31

2.1.2 Động vật nghiên cứu 31

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32

2.3 Thuốc, hóa chất, dụng cụ và thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 33

2.3.1 Thuốc và hóa chất 33

2.3.2 Dụng cụ và thiết bị 34

2.4 Phương pháp nghiên cứu 34

2.4.1 Phương pháp chuẩn bị chế phẩm 35

2.4.2 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 36

2.4.3 Đánh giá sự thay đổi của một số chỉ số miễn dịch trên chuột sau 28 ngày sử dụng chế phẩm 40

2.4.4 Đánh giá sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên mô hình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 41

2.4.5 Các phương pháp lấy mẫu nghiên cứu 42

2.4.6 Các chỉ tiêu nghiên cứu 52

2.5 Phân tích và xử lý số liệu 53

2.6 Đạo đức trong nghiên cứu 53

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 54

3.1 Kết quả độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 54

3.1.1 Kết quả độc tính cấp của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 54

Trang 7

3.2 Kết quả trên mô hình chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 67

3.2.1 Tác dụng trên trọng lượng của chuột cống trắng 67

3.2.2 Tình trạng tiêu chảy của chuột ở các lô nghiên cứu 67

3.2.3 Trọng lượng gan, thận, lách chuột tiêu chảy sau dùng kháng sinh 69 3.2.4 Hình ảnh vi thể ruột và bề dày niêm mạc manh tràng chuột tiêu chảy 69

3.3 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên chuột cống trắng khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix 72

3.3.1 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên mô hình chuột sau 28 ngày sử dụng chế phẩm 72

3.3.2 Kết quả thay đổi chỉ số miễn dịch trên chuột tiêu chảy do kháng sinh 75

3.4 Kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix 80

3.4.1 Kết quả tách chiết DNA trực tiếp từ phân 80

3.4.2 Kết quả về dữ liệu thô của các mẫu nghiên cứu 81

3.4.3 Kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột khi sử dụng chế phẩm LabMix và BaciMix trên mô hình thực nghiệm 82

CHƯƠNG 4 BÀN LUẬN 100

4.1 Về tính an toàn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 100

4.1.1 Độc tính cấp bằng đường uống trên chuột nhắt trắng 100

4.1.2 Độc tính bán trường diễn 103

4.2 Về kết quả thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên chuột cống trắng 110

4.2.1 Về thay đổi một số chỉ số miễn dịch trên chuột sử dụng 28 ngày chế phẩm LabMix và BaciMix 110

Trang 8

4.3 Về kết quả biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu

chảy do dùng kháng sinh 120

4.3.1 Về việc lựa chọn phương pháp metagenomics 120

4.3.2 Về kết quả tách chiết DNA trực tiếp từ phân 120

4.3.3 Về việc lựa chọn vùng gen V3-V4 và đơn vị phân loại ASV 122

4.3.4 Về kết quả sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu chảy 123

KẾT LUẬN 130

1 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix 130

2 Sự thay đổi một số chỉ số miễn dịch IL-6, TNF- , IgA máu, IgA niêm mạc ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm 130

3 Sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LaMix và BaciMix 131

KIẾN NGHỊ 132

TÀI LIỆU THAM KHẢO 134

Trang 9

TTPhần viết tắtPhần viết đầy đủ

1 AAD Antibiotic associated diarrhea

(Tiêu chảy liên quan đến kháng sinh)

13 DĐVN Dược điển Việt Nam

15 EHEC Enterohemorrhagic Escherichia coli 16 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay

17 FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations

(Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ

Trang 10

25 IBD Inflammatory bowel disease

31 NFAT Nuclear factor of activated T-cells

32 OECD Organization for Economic Cooperation and Development

37 SCFA Short chain fatty acids

41 VTCC Vietnam Type Culture Collection 42 WGO World Gastroenterology Organisation

43 WHO World Health Organization (tổ chức Y tế thế giới)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Thành phần, công thức bào chế LabMix và BaciMix 6

Bảng 1.2 Định danh, phân lập vi khuẩn sử dụng làm chế phẩm LabMix và BaciMix 10

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix 11

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix (tiếp) 12 Bảng 2.1 Chủng vi khuẩn nghiên cứu 31

Bảng 2.2 Động vật nghiên cứu 32

Bảng 2.3 Nồng độ của hỗn dịch chế phẩm 35

Bảng 2.4 Thể tích hỗn dịch probiotic sử dụng cho chuột nhắt trắng 37

Trang 11

Bảng 2.7 Trình tự mồi khuếch đại gen 16S rDNA 47

Bảng 2.8 Các thành phần tham gia phản ứng PCR 47

Bảng 2.9 Trình tự mồi khuếch đại vùng V3-V4 của gen 16S rDNA 48

Bảng 3.1 Độc tính cấp theo đường uống của chế phẩm LabMix và BaciMix 54

Bảng 3.2 Trọng lượng chuột nhắt trắng sử dụng LabMix và BaciMix 55

Bảng 3.3 Trọng lượng chuột cống trắng 56

Bảng 3.4 Chỉ số hồng cầu, huyết sắc tố trong máu chuột cống trắng 57

Bảng 3.5 Chỉ số bạch cầu và tiểu cầu chuột cống trắng 58

Bảng 3.6 Hoạt độ enzym AST, ALT trong máu chuột cống trắng 59

Bảng 3.7 Nồng độ bilirubin, cholesterol trong máu chuột cống trắng 60

Bảng 3.8 Hàm lượng protein và creatinin trong máu chuột cống trắng 61

Bảng 3.9 Trọng lượng gan, thận, lách chuột cống trắng 62

BảngTên bảng Trang Bảng 3.10 Trọng lượng gan, thận, lách trên mô hình chuột tiêu chảy 69

Bảng 3.11 Kết quả giải phẫu vi thể manh tràng chuột tiêu chảy 70

Bảng 3.12 Độ dày niêm mạc manh tràng ở các lô chuột tiêu chảy 71

Bảng 3.13 Nồng độ IL-6 trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 72

Bảng 3.14 Nồng độ TNF- trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 73

Bảng 3.15 Nồng độ IgA trong máu chuột sau 28 ngày thử nghiệm 74

Bảng 3.16 Nồng độ IgA niêm mạc ruột chuột sau 28 ngày thử nghiệm 75

Bảng 3.17 Nồng độ IL-6 trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 76

Bảng 3.18 Nồng độ TNF- trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 77

Bảng 3.19 Nồng độ IgA trong máu chuột tiêu chảy do kháng sinh 78

Bảng 3.20 Nồng độ IgA niêm mạc ruột chuột tiêu chảy do kháng sinh 79

Trang 12

Bảng 3.23 Tỷ lệ trình tự còn lại sau gộp và lọc dữ liệu 82

Bảng 3.24 Kết quả đa dạng alpha hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy 83

Bảng 3.25 Thành phần các ngành vi khuẩn đường ruột trên mô hình chuột tiêu chảy 86

Bảng 3.26 Thành phần một số chi vi khuẩn có lợi trong đường ruột chuột tiêu chảy do kháng sinh 91

Bảng 3.27 Thành phần một số chi vi khuẩn có hại trong đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 92

Y DANH MỤC CÁC HÌNHHìnhTên hình Trang Hình 2.1 Sơ đồ nội dung nghiên cứu 35

Hình 2.2 Quá trình phân tích dữ liệu metagenomics 48

Hình 3.1 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột khi sử dụng LabMix 63

Hình 3.2 Hình ảnh đại thể gan, thận, lách chuột khi sử dụng BaciMix 63

Hình 3.3 Hình ảnh vi thể gan chuột khi sử dụng LabMix 64

Hình 3.4 Hình ảnh vi thể gan chuột khi sử dụng BaciMix 64

Hình 3.5 Hình ảnh vi thể thận chuột cống trắng sử dụng LabMix 65

Hình 3.6 Hình ảnh vi thể thận chuột sử dụng BaciMix 65

Hình 3.7 Hình ảnh vi thể lách chuột sử dụng LabMix 66

Hình 3.8 Hình ảnh vi thể lách chuột sử dụng BaciMix 66

Hình 3.9 Trọng lượng chuột cống trắng ở các lô nghiên cứu 66

Trang 13

Hình 3.11 Hình ảnh vi thể manh tràng chuột bị tiêu chảy do kháng sinh 71

Hình 3.12 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen 16S rDNA vi khuẩn 881

Hình 3.13 Tỷ lệ ở mức độ ngành vi khuẩn đường ruột 88

Hình 3.14 Tỷ lệ một số ngành vi khuẩn đường ruột 89

Hình 3.15 Tỷ lệ các chi vi khuẩn trong các lô nghiên cứu 90

Hình 3.16 Tỷ lệ một số chi có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 93

Hình 3.17 Tỷ lệ một số chi có lợi trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh (tiếp) 94

Hình 3.18 Tỷ lệ một số chi có hại trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh 95

Hình 3.19 Tỷ lệ một số chi có hại trong hệ vi khuẩn đường ruột chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh (tiếp) 97

Hình 3.20: Dấu ấn sinh học ở mức độ chi giữa các lô nghiên cứu trên mô hình chuột tiêu chảy 98 DANH MỤC BIỂU ĐỒ

Trang 14

ĐẶT VẤN ĐỀ

Probiotic là các vi sinh vật có lợi, được bổ sung vào đường tiêu hóa của con người với một lượng vừa đủ nhằm cải thiện và cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế các vi sinh vật có hại, từ đó cải thiện sức khỏe của con người [1] Sự có mặt của probiotic trong đường tiêu hóa có tác dụng cạnh tranh, ức chế và loại trừ các vi sinh vật có hại trong đường ruột, duy trì hệ vi sinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng Vì vậy bổ sung probiotic mang lại nhiều tác dụng trong phòng và điều trị các bệnh có liên quan đến sự suy giảm chức năng của hàng rào bảo vệ tại ruột như tiêu chảy cấp, tiêu chảy do sử dụng kháng sinh và các bệnh lý viêm đường ruột [2] Hiện nay, những chế phẩm probiotic trên thị trường Việt Nam còn tồn tại một số hạn chế như dữ liệu về chủng dùng làm probiotic, các yêu cầu khoa học về thử nghiệm độc tính; khả năng tồn tại trong đường tiêu hóa; khả năng đối kháng với vi khuẩn gây bệnh, hiệu quả tác dụng trên người [3] Trong khi đó, quá trình phân lập và tuyển chọn chủng sản xuất chế phẩm probiotic trong nước gặp nhiều khó khăn, nên các chủng này chủ yếu là nhập ngoại và giá thành cao Ngoài ra, có ít các nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của probiotic đến đa dạng hệ vi khuẩn đường ruột và đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch trên động vật thực nghiệm Chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix là sản phẩm của đề tài nghiên cứu khoa học cấp Quốc gia, có chứa các lợi khuẩn được phân lập trực tiếp từ thức ăn lên men và đường tiêu hóa của người Việt Nam Các chủng sử dụng làm chế phẩm LabMix và BaciMix đã được đánh giá về đặc tính làm probiotic trong phòng thí nghiệm [4], [5] Hơn nữa, các chủng này cũng được chứng minh có vai trò trong phòng và điều trị một số bệnh liên quan đến rối loạn hệ vi khuẩn đường ruột, tuy nhiên tác dụng dưới dạng bột khi kết hợp các chủng thì chưa được chứng minh Mặc dù các chủng chứa trong hai chế phẩm trên

Trang 15

đều thuộc nhóm an toàn khi sử dụng, nhưng để sử dụng trên người vẫn cần đánh giá tính an toàn và tác dụng trên động vật thực nghiệm.

Xuất phát từ những lý do trên, đề tài “Nghiên cứu sự biến động hệ vikhuẩn đường ruột và một số chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệmkhi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix” được thực hiện với

các mục tiêu sau:

1 Xác định độc tính cấp và độc tính bán trường diễn của chế phẩm LabMix và BaciMix trên động vật thực nghiệm.

2 Đánh giá sự thay đổi nồng độ IL-6, TNF-α, IgA huyết thanh, IgA niêm mạc ruột trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix.

3 Phân tích sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên động vật thực nghiệm bằng phương pháp metagenomics khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix.

Trang 16

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1 Tổng quan về probiotic

1.1.1 Định nghĩa

FAO/WHO (2001) định nghĩa probiotic gồm các vi sinh vật có lợi, khi đưa vào cơ thể với một số lượng thích hợp sẽ có lợi cho sức khỏe vật chủ Từ định nghĩa có thể thấy hai yếu tố quan trọng của chế phẩm probiotic cần đạt được là chủng vi khuẩn và liều lượng của chế phẩm probiotic khi sử dụng.

Các loài vi khuẩn thường được sử dụng để sản xuất probiotic gồm: L.acidophilus, L casei, L fermentum, L plantarum, B lactis, B longum, B.bifidum, B subtilis, B clausii, B coagulans và B cereus [6] Liều lượng sử

dụng của chế phẩm probiotic để đạt được hiệu quả tùy thuộc vào chủng vi khuẩn, công nghệ sản xuất và mục đích sử dụng của chế phẩm [7].

1.1.2 Vai trò, cơ chế tác động của probiotic

Theo hướng dẫn của WGO (World Gastroenterology Organisation) (2017), probiotic có vai trò chủ yếu là ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh và kích thích tăng cường miễn dịch cho cơ thể [2].

* Lợi khuẩn trong chế phẩm probiotic ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh trong đường tiêu hóa thông qua các cơ chế khác nhau như:

Cơ chế sinh ra các chất bacteriocin: Các bacteriocin được sản xuất bởi

lợi khuẩn (thường là vi khuẩn nhóm LAB) là một trong những cơ chế được sử dụng để ức chế mầm bệnh trong đường tiêu hóa Bacteriocin như nisin, plantaricin và lacticin B có hoạt tính chống lại mầm bệnh ở đường ruột như

Listeria, Clostridium, S aureus và Enterococci [8] Nhờ hoạt tính kháng

khuẩn các bacteriocin giúp các lợi khuẩn có lợi thế cạnh tranh trong môi trường đường tiêu hóa Các bacteriocin thấm qua màng tế bào chất của vi khuẩn gây bệnh dẫn đến ức chế quá trình tổng hợp các acid nucleic và quá

trình tổng hợp protein của thành tế bào vi khuẩn Một số lợi khuẩn như E.

Trang 17

faecium CCM7420 có khả năng tổng hợp bacteriocin và đã được chứng minhlà làm giảm đáng kể Staphylococci spp trong manh tràng của thỏ [9] Cácnghiên cứu khác phát hiện ra rằng chủng E faecium EK13 sản sinh raenterocin A có tác dụng làm giảm số lượng tế bào Salmonella ở chim và giảmsự xâm nhập của Staphylococcus gây bệnh trong đường tiêu hóa ở thỏ [10].

Vi khuẩn LAB sản xuất nisin và pediocin làm giảm sự xâm lấn của cầu khuẩn gây bệnh tại niêm mạc ruột ở chuột

Cơ chế cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột: Lợi khuẩn có tác dụng

bảo vệ niêm mạc ruột nhờ cơ chế ngăn chặn sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh Các nghiên cứu trên niêm mạc của người và động vật đã chứng minh tác dụng của lợi khuẩn LAB đối với việc loại trừ mầm bệnh qua cơ chế cạnh

tranh Vi khuẩn L rhamnosus GG có đặc tính bám dính và ngăn chặn sự xâmnhập của vi khuẩn có hại như Salmonella và E coli gây xuất huyết ruột

Tác nhân gây bệnh đường ruột như EHEC, sử dụng fimbriae loại 1 nhạy cảm với mannose để gắn vào oligosacarit dư của glycoprotein hoặc glycolipid trên

bề mặt tế bào biểu mô ruột Các chủng lợi khuẩn Lactobacilli vàBifidobacteria cũng gắn vào cùng một vị trí thụ thể và từ đó loại trừ mầm

bệnh khỏi niêm mạc đường tiêu hóa Các protein bám dính trên bề mặt tế bào của một số chủng liên kết với các gốc carbohydrate trong lớp chất nhầy chẳng

hạn như cơ chế bám dính đặc hiệu của L johnsonii La1 [11] Vì vậy, các vi

khuẩn có hại không có vị trí bám trên niêm mạc đường tiêu hóa và bị đào thải ra ngoài cơ thể.

Cơ chế sinh ra các acid hữu cơ: Một số lợi khuẩn thuộc nhóm LAB có

khả năng lên men carbohydrate trong đường tiêu hóa dẫn đến sản xuất các chất chuyển hóa như acid axetic, acid formic, acid succinic và acid lactic làm cho môi trường đường ruột có tính acid và ức chế sự phát triển của vi khuẩn

Trang 18

gây bệnh ví dụ lợi khuẩn Lactobacillus GG sinh acid lactic để ngăn chặn sựxâm nhập của S enterica vào tế bào Caco 2 [12]

Cơ chế cạnh tranh nguồn thức ăn: Hệ vi khuẩn đường ruột được chiathành 3 nhóm: nhóm có lợi như Lactobacilii, Bifidobacterium, Bacilli; nhómcó hại như Staphylococcus, Clostridium và nhóm vừa có lợi vừa có hại nhưEnterococii, E coli Các lợi khuẩn chứa trong probiotic có tác dụng cạnh

tranh nguồn thức ăn với các vi khuẩn có hại, phục hồi sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, giúp cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh [13].

* Vai trò kích thích lên hệ miễn dịch

Lợi khuẩn có trong chế phẩm probiotic có khả năng tạo thành môi trường có pH thấp với các thành phần bacteriocin, các peptid và các loại acid béo chuỗi ngắn hay việc bám của vi khuẩn vào nhu mô ruột sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tập nhiễm của cơ thể [14].

* Tăng hiệu quả của quá trình tiêu hóa thức ăn thông qua việc cung cấp các enzyme, vitamin và hormone sinh trưởng cho cơ thể thúc đẩy quá trình tiêu hóa polysacarit và hấp thu chất dinh dưỡng của các tế bào niêm mạc trong đường tiêu hóa Các vi khuẩn probiotic đặc biệt là vi khuẩn thuộc nhóm LAB có khả năng sinh β-galactosidase có khả năng thủy phân đường lactose thành đường đơn (galactose và glucose) để tăng cường khả năng tiêu hóa thức ăn của cơ thể.

1.1.3 Chế phẩm LabMix và BaciMix

Thành phần của chế phẩm LabMix bao gồm hỗn hợp 3 chủng L.acidophilus LA 304.17; L casei LC 304.08; B bifidum BF 304.98 và tá dược.Chế phẩm BaciMix bao gồm hỗn hợp 2 chủng B subtilis BS304.04; B.coagulans BC 304.06 và tá dược bao gồm kẽm, manitol, aerosil (Bảng 1.1).

Trang 19

Bảng 1.1 Thành phần, công thức bào chế LabMix và BaciMix

Chế phẩm LabMix và BaciMix dùng cho nghiên cứu là sản phẩm đạt tiêu chuẩn cơ sở và có quy trình sản xuất được thẩm định đầy đủ (phụ lục 2.1 và phụ lục 2.2).

Các chủng trong chế phẩm LabMix và BaciMix đã được phân lập từ nguồn bản địa bao gồm nguồn thực phẩm lên men và từ đường tiêu hóa của

người Việt Nam Các chủng đã được tiến hành nghiên cứu in vitro theo các

khuyến cáo của FAO/WHO về chủng vi khuẩn sử dụng trong chế phẩm probiotic Có 4 yêu cầu quan trọng cho một chủng vi khuẩn probiotic là: an toàn; chủng vi sinh vật có thể tồn tại và phát triển trong hệ tiêu hóa của vật chủ; ức chế vi sinh vật có hại cho vật chủ; chủng vi sinh vật làm tăng hiệu quả trao đổi chất và khả năng miễn dịch của vật chủ [1] Theo khuyến cáo của WHO, vi khuẩn probiotic cần có nguồn gốc, tên khoa học rõ ràng và thuộc nhóm GRAS (General Recornized as Safe) Theo tổ chức FDA của Mỹ khuyến cáo các chủng vi sinh vật được xếp vào nhóm GRAS là các chủng vi sinh vật được xem là an toàn Các chủng vi sinh vật có nguồn gốc phân lập từ ruột người và động vật hoặc từ thực phẩm lên men và được định danh thuộc

Trang 20

đối tượng an toàn Nhóm các vi sinh vật được các tổ chức khoa học có năng lực bảo quản trong bộ sưu tập vi sinh vật có tên khoa học, nguồn gốc và kết quả nghiên cứu đảm bảo an toàn sinh học Các chủng probiotic có tác dụng thì các chủng lựa chọn phải thích ứng với môi trường sinh thái trong hệ tiêu hóa vật chủ như pH thấp, chịu enzyme tiêu hóa, acid và muối mật và có mặt của kháng sinh Ngoài ra, lợi khuẩn có khả năng ức chế vi khuẩn gây bệnh Khả năng bám dính và tạo khuẩn lạc tại thành ruột được xem là một đặc tính quan trọng có tác dụng kích thích miễn dịch cũng như ức chế vi sinh vật gây hại thông qua cạnh tranh vị trí bám trên nhu mô ruột và khả năng loại vi sinh vật gây hại và độc tố thông qua cơ chế hấp phụ Các nghiên cứu này bao gồm: định danh chủng, phân loại bằng giải trình tự và đăng ký mã chủng trên ngân hàng genbank Nghiên cứu đặc điểm an toàn (hoạt tính tan huyết, đặc tính kháng kháng sinh), nghiên cứu đặc tính probiotic (khả năng sống sót trong môi trường có pH thấp, muối mật, sinh tổng hợp enzyme, khả năng bám dính, khả năng đối kháng vi sinh vật gây bệnh) và nghiên cứu một số đặc tính kỹ thuật để sản xuất Các chủng làm probiotic LabMix và BaciMix đã được nghiên cứu về các đặc tính chủng làm chế phẩm probiotic [4], [5] Ngoài ra, các chủng này còn được nghiên cứu độc tính ở phòng nghiên cứu Dược lý, Trường Đại học Y Hà Nội Các thông tin chi tiết về định danh và phân lập vi khuẩn trong 2 chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix được biểu thị qua Bảng 1.2 Các chủng được sử dụng làm chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix đều được đánh giá về tính an toàn và đặc tính chủng trong phòng thí nghiệm được biểu thị qua Bảng 1.3.

1.1.4 Tình hình nghiên cứu probiotic ở Việt Nam

Chế phẩm probiotic được sử dụng rộng rãi cùng các chế phẩm sinh học khác (enzyme, acid amin, vitamin) bổ sung vào thực phẩm chức năng, thực phẩm sữa lên men Trong nước đã có nhiều nghiên cứu liên quan đến phân lập và tuyển chọn các chủng vi khuẩn từ thực phẩm lên men dùng cho nghiên

Trang 21

cứu phát triển probiotic cho người Nghiên cứu của Đào Thị Lương và CS

(2020) về đặc tính probiotic trong điều kiện in vitro của chủng vi khuẩn L.acidophilus VTCC 12257 phân lập từ tôm lên men đã được đánh giá dựa vào

các đặc điểm sinh học và khả năng chống chịu trong môi trường ruột mô phỏng Trong nghiên cứu này, chủng VTCC 12257 được nghiên cứu cho sản xuất sinh khối ở quy mô phòng thí nghiệm và trong thiết bị lên men 30 L Đây được coi là bước khởi đầu để sản xuất ở quy mô công nghiệp cho vi khuẩn probiotic này [15] Nghiên cứu của Hoàng Quốc Khánh và CS (2019) đã phân

lập được 12/15 chủng Lactobacillus từ các mẫu phân của những trẻ em bú sữa

mẹ có tiềm năng làm chế phẩm probiotic [16] Nghiên cứu của Huỳnh Ngọc

Thanh Tâm và CS (2019) đã phân lập được chủng Lactobacillus có tiềm năng

làm probiotic từ cây môn ngọt là loài cây thuộc họ khoai môn, có thể làm đa dạng nguồn nguyên liệu sản xuất probiotic và tuyển chọn được những dòng vi khuẩn có tiềm năng probiotic tốt do cây môn ngọt có khả năng sống được ở nhiều vùng môi trường khác nhau Nghiên cứu của Nguyễn Thanh Bình và CS (2021) được thực hiện nhằm đánh giá an toàn và tác dụng hỗ trợ điều trị viêm ruột mạn tính của sản phẩm LiveSpo® Colon chứa bào tử lợi khuẩn

Bacillus thế hệ LS-III nồng độ cao 3 tỷ /ống 5 mL, kết quả cho thấy các triệu

chứng và mức độ viêm loét đại tràng giảm ở nhóm thử nghiệm sau 7 ngày và sau ngày 30 sử dụng chế phẩm [17] Nghiên cứu của Bạch Thị Như Quỳnh và

CS (2022) đã phân lập được lợi khuẩn B infantis từ phân của trẻ em, có đầy

đủ các tính chất để làm chế phẩm probiotic sử dụng trên người [18] Nghiên

cứu của Phạm Thùy Dương và CS (2023) đã phân lập được lợi khuẩn W.coagulans từ các nguồn khác nhau, lợi khuẩn đã được chứng minh có tiềm

năng làm chế phẩm probiotic trên người [19] Trong nông nghiệp probiotic có một vai trò vô cùng quan trọng, nhiều ứng dụng được đưa vào thực tiễn và cho hiệu quả cao Nghiên cứu của Nguyễn Xuân Cảnh và CS (2018) đã phân

lập được 22 chủng vi khuẩn Lactobacillus có khả năng chịu acid và muối mật

Trang 22

cao, trong đó 02 chủng R2.3 và R3.3 có khả năng chịu cao nhất và ổn định nhất và có khả năng đối kháng với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột và có khả năng làm chế phẩm probiotic cho chăn nuôi [20] Theo tác giả Trần Anh Tuyên và CS (2019) khi sử dụng chế phẩm probiotic làm thức ăn cho gà Kết quả cho thấy việc sử dụng 0,3% chế phẩm probiotics trong khẩu phần ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng tăng trọng, hệ số chuyển hóa thức ăn, phòng bệnh của gà thí nghiệm và năng suất thân thịt, tăng trọng bình quân trên ngày tăng 11,81%, tỷ lệ sống 100%, nâng cao tỷ lệ thịt [21] Nghiên cứu của Nguyễn Thị Lâm Đoàn và CS (2018) đã sàng lọc được chủng vi khuẩn thuộc chi

Bacillus có tiềm năng probiotic nhằm sản xuất chế phẩm ứng dụng trong chăn

nuôi gia cầm Bằng các phương pháp xác định một số đặc tính probiotic như khả năng chịu axit, chịu muối mật, sinh enzyme ngoại bào, kháng khuẩn gây bệnh, bám dính trên biểu mô ruột gà [22] Hiện nay, Viện Vi sinh vật và Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tuyển chọn được 10 chủng

probiotic thuộc chi Bacillus, Lactobacillus và Bifidobacterium cho nghiên cứu

phát triển sản phẩm probiotic phù hợp với giai đoạn 1 của tiến trình thực hiện theo quy trình nghiên cứu phát triển sản phẩm probiotic của WHO/FAO Với yêu cầu thực tiễn của chủng sản xuất thương mại theo hướng dẫn và tiêu chuẩn quốc tế như trên, các chủng vi sinh vật này cần phải tiếp tục được

nghiên cứu đánh giá các chỉ tiêu an toàn và hiệu quả ở các cấp độ in vitro, invivo thuộc giai đoạn 2 và 3 theo hướng dẫn của WHO/FAO Đánh giá hiệu

quả của probiotic trên động vật và người tình nguyện Đây là những dẫn liệu khoa học để chúng ta tiến hành sản xuất chế phẩm probiotic theo đúng hướng dẫn của WHO/FAO.

Trang 23

Bảng 1.2 Định danh, phân lập vi khuẩn sử dụng làm chế phẩm LabMix và BaciMix

Đặc tính B subtilis BS 304.04B coagulans BC

Đường tiêu hóa người Việt Nam

Thực phẩm lên men Đường tiêu hóa người Việt Nam

Thực phẩm lên men Đường tiêu hóa người Việt Nam với chủng chuẩn

L casei subsp casei

Trang 24

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix các tế bào của chủng với nhau

Tốt với tế bào niêm mạc ruột và các tế bào của chủng với nhau

Trang 25

Bảng 1.3 Các đặc tính của chủng làm probiotic LabMix và BaciMix (tiếp) đông khô và điều kiện lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196oC)

Lưu giữ và bảo quản trong ống đông khô và điều kiện lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196oC)

Lưu giữ và bảo quản trong ống đông khô đông khô và điều kiện lạnh sâu trong nitơ lỏng (-196oC)

Lưu giữ và bảo quản trong ống đông khô và điều kiện lạnh sâu trong

Tương đồng với kết quả thu được so với chủng gốc về các đặc tính hình thái học, di truyền học, đặc điểm sinh hóa, độ nhạy cảm với kháng sinh và đặc tính probiotic

Trang 26

1.2 Tổng quan về ảnh hưởng của chế phẩm probiotic đến đáp ứng miễn dịch

1.2.1 Khái niệm

Đáp ứng miễn dịch là một quá trình bảo vệ quan trọng và phức tạp của cơ thể sinh vật Các yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch bao gồm: các cơ quan lympho trung ương (tủy xương, tuyến ức) và ngoại vi (hạch lympho, lách, các mô lympho không có vỏ bọc); các tế bào lympho T, B; các tế bào thực bào đơn nhân và một số tế bào máu khác như bạch cầu (BC) trung tính, BC ái toan, BC ái kiềm và tiểu cầu Ở cơ thể người đáp ứng miễn dịch chia làm hai loại: miễn dịch tự nhiên và miễn dịch thu được Miễn dịch tự nhiên là khả năng tự bảo vệ sẵn có và mang tính di truyền trong các cơ thể cùng một loài Các hàng rào của đáp ứng miễn dịch tự nhiên bao gồm hàng rào vật lý, hàng rào hóa học, các tế bào và các cytokine Miễn dịch thu được là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể đã tiếp xúc với kháng nguyên Các thành phần tham gia miễn dịch thu được như các tế bào B, T và các globulin miễn dịch [24]

1.2.2 Một số yếu tố tham gia đáp ứng miễn dịch

* Niêm mạc ruột

Niêm mạc ruột được xem như một hàng rào bảo vệ vật lý và tham gia vào đáp ứng miễn dịch tự nhiên của cơ thể, bao gồm một số yếu tố như lớp chất nhầy bên ngoài tiếp xúc với hệ vi sinh vật đường ruột, protein kháng khuẩn và các phân tử immunoglobulin A bài tiết (sIgA) Lớp tế bào đơn với các biểu mô chuyên biệt Lớp đệm bên trong, nơi các tế bào miễn dịch thích nghi cư trú (tế bào T, tế bào B, đại thực bào và tế bào đuôi gai) Lớp chất nhầy là tuyến bảo vệ đầu tiên mà các tác nhân gây bệnh bên ngoài gặp phải khi đến lòng ruột, giúp ngăn vi khuẩn tiếp xúc trực tiếp với tế bào biểu mô [24]

* Cytokine IL-6, TNF-

Trang 27

Cytokine là các polypeptid được sản xuất khi có kích thích của vi sinh vật hoặc các kháng nguyên khác Nó có vai trò làm trung gian điều hòa các phản ứng miễn dịch và viêm [24] Cytokine vừa làm chất trung gian và tham gia điều hòa miễn dịch bẩm sinh và miễn dịch thu được Các cytokine trong đáp ứng miễn dịch tự nhiên có vai trò quan trọng trong đề kháng của vật chủ [25] IL-6 là cytokin có các hoạt tính sinh học đa dạng, nhưng chủ yếu làm tăng tổng hợp IL-1 và TNF- để phối hợp kích thích đáp ứng miễn dịch, làm tăng sao chép, tăng biệt hoá, tăng tiết kháng thể của tế bào B, tăng phối hợp kích thích sinh máu và sản xuất thrombopoietin, kích thích phát triển tế bào gan và tế bào myeloma ở tổ chức nuôi cấy IL-6 có một số tác dụng sinh học như tham gia vào đáp ứng miễn dịch, sản xuất ra các yếu tố đề kháng không đặc hiệu giống như tác dụng của IL-1 và TNF-, phát triển tế bào B và tương bào để tăng tạo kháng thể dịch thể, phối hợp với IL-1 và TNF- tác dụng làm tăng sản xuất IL-2 IL-6 phối hợp với IL-1 và TNF- kích thích phát triển tế bào xương, tế bào da, tham gia kích thích tạo máu, tham gia vào quá trình điều động bạch cầu trung tính và tế bào mono đến vị trí nhiễm vi sinh vật [25]

* IgA máu và niêm mạc ruột

Kháng thể IgA chiếm 10 -15% tổng lượng kháng thể trong huyết thanh nhưng nó là lớp kháng thể chính trong dịch ngoại tiết như nước bọt, nước mắt, dịch nhầy đường tiêu hóa, đường hô hấp, đường sinh dục [25] IgA trong dịch ngoại tiết gọi là các IgA tiết và các IgA tiết này có chức năng hết sức quan trọng trong việc sinh miễn dịch tại chỗ ở đường tiêu hóa, đường hô hấp, tiết niệu sinh dục, vì đây là những con đường chính để các vi khuẩn xâm nhập Do vậy, IgA tiết là tuyến phòng thủ vô cùng quan trọng của cơ thể chống lại các tác nhân gây bệnh Các kháng thể này gắn trực tiếp lên bề mặt vi khuẩn hoặc virus và ngăn không cho chúng gắn với tế bào màng nhầy do

Trang 28

vậy ức chế quá trình xâm nhập của vi khuẩn và tác dụng ngăn cản sự lây nhiễm của virus [25]

1.2.3 Vai trò của probiotic trong đáp ứng miễn dịch

Những lợi khuẩn làm probiotic có khả năng kích thích các đáp ứng miễn dịch của cơ thể thông qua các cơ chế khác nhau Một số lợi khuẩn có khả năng điều chỉnh các chức năng của tế bào đuôi gai, bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và tế bào lympho, giúp tăng cường quá trình thực bào mầm bệnh

tế bào lympho T để sinh ra các loại cytokine khác nhau như IFN-γ, 10, IL-4, IL-12 Nghiên cứu của Fumico N và CS (2000) trên 10 người khỏe mạnh

khi sử dụng sữa lên men chứa chủng L casei với liều dùng 1×1010 CFU mỗi

ngày trong thời gian 3 tháng, cho thấy chủng L casei làm tăng hoạt tính tế

bào NK (Natural Killer) trong thời gian thí nghiệm và tiếp tục tăng sau 3 tuần liên tiếp [26] Nghiên cứu của Chen C.Y và CS (2013) nhận thấy sử dụng tế bào vi khuẩn thuộc nhóm LAB bất hoạt bằng nhiệt ở 100oC trong 30 phút hay 121oC trong 15 phút có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch trên chuột Cụ thể là kích thích cơ thể sản xuất IL-12 và IL-10 trong khi đó lại ức chế sản xuất TNF- và IL-6 [27] Nghiên cứu hoạt tính miễn dịch của gà đối với độc tố tetanus toxoid (TT) và alpha toxin, tác giả Hamid R H và CS (2006) cho

thấy kháng thể IgG và IgM tăng lên khi sử dụng L acidophilus, B biﬁdum vàS faecalis so với trường hợp không sử dụng probiotic [28] Nghiên cứu của

Trần Minh Diên và CS (2022), khi đánh giá tác dụng của chế phẩm dạng xịt

chứa 5 tỷ bào tử Bacillus (LiveSpo Navax) là phương pháp hiệu quả trong

một nghiên cứu lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng với trẻ em bị nhiễm RSV Kết quả cho thấy chế phẩm làm giảm các triệu chứng của bệnh, giảm tải lượng virus và các cytokine tiền viêm [29]

Hiện nay có nhiều nghiên cứu đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch của chế phẩm probiotic trên động vật thực nghiệm Nghiên cứu của Galdeano C.

Trang 29

M và CS (2009) đã đánh giá tác dụng của các lợi khuẩn L delbrueckii subsp.bulgaricus, S thermophilus và L casei DN 114001 lên hệ miễn dịch của

chuột BALB/c 6 tuần tuổi khỏe mạnh trong 5 ngày liên tiếp Kết quả nồng độ IL-6 ở nhóm sử dụng chế phẩm giảm so với nhóm chứng [30] Tác giả Webberley T S và CS (2021) đánh giá tác dụng của chế phẩm Lab4 có chứa

các lợi khuẩn L acidophilus CUL21, L acidophilus CUL60, B bifidumCUL20, B animalis subsp lactis CUL34 mật độ 3x1010CFU trên chuột Wistar 6-7 tuần tuổi, khỏe mạnh trong 90 ngày Kết quả là nồng độ các cytokine IL-6 và TNF-α trong máu chuột ở nhóm sử dụng chế phẩm giảm so với nhóm chứng [31] Nghiên cứu của Salazar N và CS (2014) đánh giá tác

dụng của hai chủng Bifidobacterium lên hệ miễn dịch của chuột Wistar Tác

giả đã sử dụng 3 nhóm, mỗi nhóm 8 con chuột Wistar 12 tuần tuổi, khỏe

mạnh và sử dụng các lợi khuẩn B animalis subsp lactics IPLA-R1 và B.longum IPLA-E44 trong 24 ngày Kết quả là nồng độ IL-6 trong máu giảm và

nồng độ TGF-β trong máu tăng lên [32] Tác giả Harata G và CS (2009) đã sử dụng chuột BALB/c cái 6-10 tuần tuổi để đánh giá tác dụng lên hệ miễn

dịch của lợi khuẩn Lactobacillus GG và L gasseri TMC0356 trong 7 ngày.Nghiên cứu cho thấy lợi khuẩn Lactobacillus GG làm tăng nồng độ các

cytokine và IgA ở các nhóm sử dụng lợi khuẩn so với nhóm không được sử dụng lợi khuẩn [33] Nghiên cứu của Karamese M và CS (2016) đã sử dụng

hỗn hợp chế phẩm probiotic chứa 12 lợi khuẩn thuộc nhóm Bifidobacteriumvà Lactobacillus trên mô hình chuột Wistar 12 tuần tuổi khỏe mạnh liên tục

trong 12 ngày Chế phẩm làm giảm nồng độ IL-6, TNF-α và FGF-β và làm tăng nồng độ IL-10, IgG và IgA trong huyết thanh của chuột [34]

Vai trò của chế phẩm probiotic trong mô hình suy giảm miễn dịch, mô hình chuột tiêu chảy do dùng kháng sinh, mô hình chuột nhiễm khuẩn do vi khuẩn và hóa chất gây ra cũng được báo cáo trong nhiều nghiên cứu Các nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic trên mô hình chuột suy

Trang 30

giảm miễn dịch Longxian L và CS (2021) nghiên cứu tác dụng điều hòa

miễn dịch của chế phẩm probiotic (gồm các lợi khuẩn Bifidobacterium,Lactobacillus, Enterococcus, Bacillus (CBLEB)) trên chuột bị ức chế miễn

dịch bằng cyclophosphamide (CTX) Tác giả sử dụng 27 con chuột Spague-Dawley đực, trọng lượng 200-300g, chia thành 3 nhóm Vào các ngày 1, 2, 3, 10 các con chuột của nhóm nghiên cứu CTX và CTX + CBLEB được tiêm cyclophosphamide (40mg/kg) vào phúc mạc chuột Đến ngày thứ 4 những con chuột nhóm CTX + CBLEB được sử dụng chế phẩm CBLEB trong 15 ngày Kết quả cho thấy CBLEB làm giảm mức độ viêm và tổn thương miễn dịch cho CTX gây ra Ngoài ra, chế phẩm có tác dụng làm giảm nồng độ M-CSF (macrophage colony-stimulating factor), MIP-3α (macrophage inflammatory protein 1α) trong huyết thanh chuột là các yếu tố kích thích đại thực bào và protein tham gia vào phản ứng viêm [35] Nghiên cứu của Salva S và CS (2014) đánh giá tác dụng bảo vệ chống suy tủy và ức chế miễn dịch

của các chủng Lactobacillus trên mô hình chuột cũng bị ức chế miễn dịch

bằng CTX Tác giả đã sử dụng chuột đực Swiss 6 tuần tuổi, chia làm 3 nhóm.

Lợi khuẩn L casei CRL431 (Lc431) và L rhamnosus CRL1506 (Lr1506)

được sử dụng trước khi tiêm CTX lần lượt trong 2 ngày và 5 ngày Sau đó các con chuột được tiêm CTX dưới phúc mạc với liều 150 mg/kg cân nặng và theo dõi trong 15 ngày tiếp theo Ngày thứ 3 sau khi tiêm CTX các con chuột

được tiêm Candida albicans dưới phúc mạc Kết quả cho thấy điều trị dựphòng bằng Lactobacillus như Lc431 và Lr1506 có tác dụng làm tăng các tế

bào tiền thân tủy chưa trưởng thành và phục hồi sớm các tế bào tủy sau khi tiêm CTX Ngoài ra, chế phẩm probiotic làm tăng khả năng phục hồi sớm bạch cầu trung tính trong máu, tăng khả năng thực bào đến vị trí nhiễm trùng

[36] Tác giả Choi D.W và CS (2018) nghiên cứu về tác dụng của L.plantarum nF1 (nLp-nF1) trên mô hình chuột bị suy giảm miễn dịch do CTX.

Trong mô hình tác giả sử dụng chuột ICR đực, 6 tuần tuổi, chia làm 4 nhóm,

Trang 31

mỗi nhóm 5 con Các liều nLp-nF1 được sử dụng là 4×109 CFU/kg, 4×1010 CFU/kg Các nhóm được tiêm CTX (150 mg/kg) vào ngày 0 và ngày thứ 2 Các nhóm uống nLp-nF1 từ ngày 3 đến ngày 17 (15 ngày) Kết quả cho thấy lợi khuẩn làm tăng sản xuất IgG và các cytokine trên mô hình thực nghiệm [37] Nghiên cứu của tác giả Xie Y và CS (2016) về tác dụng của lợi khuẩn

L plantarum NCU116 cũng được thực hiện trên mô hình chuột suy giảm

miễn dịch do CTX Mô hình sử dụng chuột BALB/c 6-8 tuần tuổi, nặng 18-22g, chia làm 6 nhóm, mỗi nhóm 10 chuột Các chuột được tiêm dưới phúc mạc CTX (80mg/kg trọng lượng) trong 3 ngày Sau đó các nhóm chuột được sử dụng lợi khuẩn với các liều 108, 109, 1010 CFU/ml trong 20 ngày Kết quả cho thấy nồng độ các cytokine IL-17 và IL-21 tăng đáng kể sau 10 ngày điều trị với liều cao, còn IL-23, TGB-β3 tăng ở cả 3 liều Ngoài ra lợi khuẩn làm tăng số lượng tế bào CD4, T, tế bào đuôi gai và tăng biểu hiện mRNA được điều hòa bởi các thụ thể TLR (Toll-like receptors ) [38]

Một số nghiên cứu đã được thực hiện để đánh giá tác dụng lên hệ miễn dịch của lợi khuẩn trên mô hình chuột bị nhiễm khuẩn do vi khuẩn, hóa chất gây ra Tác giả Mazkour S và CS (2020) đã nghiên cứu tác dụng của hai bào

tử lợi khuẩn B subtilis, B coagulans đối với chuột bị nhiễm S typhimurium.Kết quả cho thấy lợi khuẩn làm giảm sự xâm nhập của vi khuẩn Salmonella

vào hạch bạch huyết và làm giảm các chất trung gian gây viêm và giảm chất oxi hóa do stress [39] Nghiên cứu của tác giả Ayyanna R và CS (2018) đánh

giá đặc tính chống viêm của 2 chủng Lactobacillus trên chuột Wistar Kết quả

là lợi khuẩn làm tăng nồng độ các cytokine chống viêm và giảm các cytokine tiền viêm [40] Nghiên cứu của Ciobanu L và CS (2020) đánh giá tác dụng

của L plantarum ACTT 8014 đối với chuột bị viêm niêm mạc ruột do

5-fluorouracil (5-FU) Chuột Wistar được cho uống 3,32×109 CFU/ml L.plantarum trong 9 ngày, sau đó tiêm 5-FU (400mg) dưới phúc mạc vào ngày

Trang 32

thứ 7 Kết quả cho thấy lợi khuẩn làm giảm tổn thương niêm mạc do hóa chất gây ra và làm tăng sự biểu hiện của TLR4 [41].

Một số nghiên cứu đánh giá tác dụng của chế phẩm probiotic lên hệ miễn dịch trên mô hình chuột tiêu chảy do sử dụng kháng sinh Nghiên cứu của tác giả Guo H và CS (2021) đánh giá vai trò của các chủng lợi khuẩn và hỗn hợp chủng lợi khuẩn trên mô hình chuột bị tiêu chảy khi sử dụng lincomycine với liều 3g/kg ngày 2 lần Kết quả cho thấy sử dụng

Bacteroides hoặc kết hợp giữa Bacteroides và Bifidobacterium có tác dụng

làm giảm tình trạng viêm, tăng tốc độ phục hồi cấu trúc mô và tăng nồng độ SCFA Hơn nữa, hỗn hợp chủng lợi khuẩn có hiệu quả hơn so với chủng đơn lẻ trong việc làm giảm các đặc điểm bệnh lý của ruột kết, điều chỉnh giảm nồng độ interleukin (IL-6) và điều chỉnh tăng biểu hiện của chất kết dính trong mô hình chuột bị AAD [42] Nghiên cứu của tác giả Shi Y và CS (2017) thực hiện trên mô hình chuột sử dụng kháng sinh ampicillin trong 2

tuần Kết quả là chế phẩm JUP-Y4 cũng làm giảm đáng kể nồng độ D-lactate

và nội độc tố trong huyết thanh của chuột và cũng như tăng biểu hiện của các protein liên kết đồng thời giảm sản xuất các cytokine gây viêm (TNF-, IL-6, MCP-1, IFN-c và IL-1b) trong hồi tràng và ruột kết của chuột sử dụng kháng sinh [43] Nghiên cứu của tác giả Li W và CS (2023) đánh giá tác dụng của

chế phẩm probiotic đa chủng gồm các lợi khuẩn B lactis XLTG11, L caseiZhang, L plantarum CCFM 8661 và L rhamnosus Probio-M9 ở các liều trên

mô hình chuột sử dụng kháng sinh ampicillin liều 11,2 g/kg cân nặng Kết quả là chế phẩm probiotic làm giảm nồng độ các cytokin IL-6, IL-1β, TNF-α và tăng nồng độ các cytokin IL-10 và SIgA trên mô hình chuột bị AAD [44].

1.3 Hệ vi khuẩn đường ruột

1.3.1 Khái niệm

Cơ thể con người có khoảng 1013 - 1014 tế bào, trong khi đó tổng số vi khuẩn đường ruột gấp khoảng mười lần số tế bào trong cơ thể, trải đều trong

Trang 33

lòng ruột với độ dày khoảng 1 mm và tổng số vi khuẩn lên tới 1012 vi khuẩn trong 1 gam phân [1] Các ngành vi khuẩn được tìm thấy trong đường ruột của con người bao gồm các ngành như Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria và Verrucomicrobia trong đó 2 ngành Firmicutes và Bacteroidetes chiếm đến 90% hệ vi khuẩn đường ruột

[2] Ngành Firmicutes bao gồm hơn 200 chi khác nhau như Lactobacillus,Bacillus, Clostridium, Enterococcus và Ruminicoccus; trong đó chiClostridium chiếm 95% trong ngành Firmicutes Ngành Bacteroidetes baogồm chi Bacteroides và Prevotella là các chi chiếm đa số trong ngành này

[45] Ngoài ra, hệ vi sinh vật đường ruột có một vai trò vô cùng quan trọng như là một bộ phận hay một cơ quan trong cơ thể người Trong cơ thể, các tế bào miễn dịch tập trung nhiều nhất ở hệ tiêu hóa và hệ vi khuẩn đường ruột đóng một vai trò quan trọng trong việc hoạt hóa các tế bào miễn dịch đó Khi sự mất cân bằng hệ vi khuẩn đường ruột xuất hiện sẽ dẫn đến rối loạn chức năng hệ thống niêm mạc và các tế bào miễn dịch bên trong đường tiêu hóa [2]

1.3.2 Sự phân bố các vi khuẩn đường ruột

Vi khuẩn đường ruột cư trú theo chiều dài đường tiêu hóa nhưng khác nhau về chủng loại và mức độ phong phú tùy theo từng khu vực Số lượng vi khuẩn có trong dịch ở dạ dày và tá tràng là 10 – 103 CFU/g, ở ruột non là 104 – 107 CFU/g, ở đại tràng là 1011 – 1012 CFU/g [1] Sự phân bố và thành phần hệ vi khuẩn bên trong đường tiêu hóa như sau:

Khoang miệng: chứa một lượng lớn vi khuẩn vì ở đây có các điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát triển như nhiệt độ phù hợp, thức ăn và pH phù hợp Vi khuẩn trong khoang miệng có khoảng 150 chi, 700 loài vi khuẩn; trong đó 51% vi khuẩn đã được định danh, 13% vi khuẩn chưa được đặt tên nhưng phân lập được và 28% vi khuẩn chưa được định danh [46] Khoảng 96% các vi khuẩn trong khoang miệng thuộc các ngành vi khuẩn Firmicutes,

Trang 34

Actinobacteria, Proteobacteria, Fusobacteria, Bacteroidetes và Spirochaetes

với các chi Actinomyces, Atopobium, Corynebacterium, Rothia, Bergeyella,Capnocytophaga, Prevotella, Granulicatella, Streptococcus, Veillonella,Campylobacter, Cardiobacterium, Haemophilus, Neisseria và Fusobacteria;trong số đó Streptococcus, Haemophilus, Neisseria, Veillonella, Prevotella

là các chi chiếm ưu thế [47].

Thực quản: Hệ vi khuẩn ở khoang miệng và thực quản có nhiều điểm

tương đồng với nhau Các loài Streptococcus (S salivarius, S sanguinis , S.oralis và S mutans) có ở cả hai vị trí Điều này cho thấy hệ vi khuẩn ở thựcquản có nguồn gốc từ khoang miệng Các loài vi khuẩn S viridans, H.influenzae, N catarrhalis, Streptococcus spp và K pneumonia là các loài

chiếm ưu thế lớn trong thực quản [48]

Dạ dày: Các nghiên cứu chỉ ra rằng dạ dày có hệ vi khuẩn đa dạng và phức tạp với 266 chi vi khuẩn đã được xác định; trong đó 57 chi vi khuẩn được đặt tên và phân bố trong các ngành Proteobacteria, Firmicutes,

Bacteroidetes, Actinobacteria, Fusobacteria Trong đó các chi Helicobacter,Streptococcus và Prevotella là phổ biến nhất [49]

Đại tràng: là nơi có số lượng lớn và nhiều loài vi khuẩn nhất Hoạt động của các loài vi khuẩn ở đây làm cho đại tràng trở thành cơ quan chuyển hóa tích cực của cơ thể Vi khuẩn trong đại tràng chiếm hơn 70% tổng số vi khuẩn trong cơ thể và chủ yếu thuộc ngành Firmicutes và Bacteroidetes Phần lớn vi khuẩn ở ruột non là vi khuẩn Gram dương, trong khi đó ở đại tràng là vi khuẩn Gram âm Vi khuẩn phát triển nhanh ở manh tràng và phần đi lên của đại tràng và phát triển chậm ở kết tràng [50]

1.3.3 Vai trò của hệ vi khuẩn đường ruột

Hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò liên quan đến quá trình trao đổi chất và chức năng bảo vệ thông qua tác động lên hệ miễn dịch của cơ thể

1.3.3.1 Tham gia vào quá trình trao đổi chất và tiêu hoá thức ăn

Trang 35

Hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình trao đổi chất và tiêu hoá thức ăn bằng cách sinh ra các enzym không được mã hóa bởi bộ gen người như enzym phân hủy polysaccharid, polyphenol và tổng hợp vitamin Các loài

vi khuẩn như Bacteroides, Roseburia, Bifidobacterium, Fecalibacterium vàEnterobacteria giúp chuyển hoá carbohydrate thành các acid béo mạch ngắn

(SCFA), được cơ thể sử dụng như một nguồn năng lượng và các chất dinh dưỡng hữu ích Các SCFA như acid propionic, acid butyric… được tạo thành do quá trình lên men đường Một số vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình chuyển hóa protein thông qua hoạt động của các proteinase và peptidase của vi khuẩn cùng với các proteinase của cơ thể người Ví dụ enzym

histamine decarboxylase được mã hóa bởi gen hdcA của vi khuẩn tham gia

vào quá trình chuyển đổi L-histidine thành histamine [51] Glutamate

decarboxylases được mã hóa bởi gen gadB của vi khuẩn tham gia vào quá

trình chuyển glutamate thành axit γ-amino butyric [52] Ngoài ra, hệ vi khuẩn đường ruột còn thực hiện chức năng tổng hợp vitamin K và một số thành phần

của vitamin B Các thành viên của chi Bacteroides đã được chứng minh là có

khả năng tổng hợp acid linoleic liên hợp có tác dụng chống đái tháo đường, kháng vi khuẩn, giảm acid máu và có đặc tính điều hòa miễn dịch [53] Vi

khuẩn B intestinalis, B fragilis và E coli có khả năng tách và khử nước từ

các acid mật chính và chuyển đổi chúng thành các acid mật thứ cấp trong đại tràng [54].

1.3.3.2 Ức chế sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh

Hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình ngăn chặn sự phát triển của các vi sinh vật gây bệnh cho cơ thể thông qua cơ chế trực tiếp và gián tiếp Các vi khuẩn có lợi còn sản xuất ra các bacteriocin (bao gồm cả lantibiotic) như nisin, enteriocin, subtilisin…có tác dụng kháng lại vi khuẩn gây bệnh Một số vi khuẩn trong nhóm LAB sinh ra các acid hữu cơ như acid lactic, acid acetic, ethanol có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây

Trang 36

bệnh Sự có mặt của vi khuẩn LAB làm giảm pH theo hướng bất lợi cho nhóm vi khuẩn có hại do đó làm thay đổi cân bằng quần xã vi sinh vật đường

ruột theo hướng có lợi cho vật chủ Ngoài ra, một số lợi khuẩn có tác dụnggiải độc tố ammonia và phenol ví dụ như chủng Lactobacilii và S cerevisiaevì vậy chúng có tác dụng ức chế sự phát triển của nhóm Clostridium gây bệnhở đường tiêu hóa [55]

1.3.3.3 Điều hoà hệ miễn dịch

Hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò quan trọng trong việc kích thích hệ miễn dịch của cơ thể Các vi khuẩn cộng sinh bên trong đường ruột thúc đẩy quá trình tạo hạt và huy động bạch cầu trung tính trong tủy xương khi bị nhiễm trùng thông qua thụ thể TLRs (Toll-like receptor) Hệ vi khuẩn đường ruột có khả năng huy động các tế bào tiền thân dòng tủy đến các cơ quan khác nhau, để tạo ra các tế bào trưởng thành ở đó [55] Sự có mặt của vi khuẩn cộng sinh đường ruột kích thích biểu hiện của các cytokine để thúc đẩy phản ứng viêm thích hợp Các cytokine như IL-1, IL-23 và IL-6 từ đại thực bào ruột đã thúc đẩy quá trình hoạt hóa tế bào Th17 của niêm mạc; IL-10 và các SCFA ảnh hưởng đến sự phát triển của Tregs (tế bào T điều hòa) trong niêm

mạc đường tiêu hóa [56] Trong quá trình nhiễm C rodentium hoặc C.difficile IL-22 hầu hết được sản xuất bởi các tế bào ILC3, có tác dụng kích

thích tế bào gan sản xuất hemopexin và bổ thể C3 để ức chế sự phát triển của vi khuẩn này [55] Hệ vi khuẩn đường ruột ảnh hưởng đến quá trình sản xuất kháng thể IgA trong lòng ruột để ngăn vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vượt qua hàng rào biểu mô Các kháng thể IgA từ niêm mạc ruột tham gia vào quá trình chống xâm nhập của tác nhân gây bệnh vào cơ thể [24]

1.3.3.4 Tham gia vào trục não ruột

Các thành phần tham gia vào trục não ruột bao gồm hệ thần kinh trung ương, hệ thần kinh giao cảm, hệ thần kinh phó giao cảm, dây thần kinh phế vị, hệ thần kinh ở đường ruột và hệ vi sinh vật đường ruột [57] Mối quan hệ

Trang 37

giữa hệ vi sinh vật đường ruột và não bộ được dẫn truyền qua dây thần kinh nội tiết thông qua trục hạ đồi - tuyến yên - tuyến thượng thận và điều hòa serotonin Sự thay đổi hệ vi sinh vật đường ruột sẽ gây ảnh hưởng đến mối quan hệ giữa ruột và não thông qua các con đường trên [58] Trong mối quan hệ này thì dây thần kinh phế vị có vai trò quan trọng trong việc truyền tín hiệu giữa hệ thần kinh đường ruột và hệ thần kinh trung ương Một số nghiên cứu chứng minh rằng giảm hoạt động của dây thần kinh phế vị có liên quan đến tình trạng bệnh lý của một số bệnh như hội chứng ruột kích thích hoặc bệnh trầm cảm [59] Sự ảnh hưởng của hệ vi sinh vật đường ruột lên trục hạ đồi -tuyến yên - -tuyến thượng thận thông qua một cơ chế điều hòa phức tạp Hệ vi sinh vật đường ruột tác động lên dây thần kinh phế vị, vùng hạ đồi và vùng hải mã dẫn đến kích hoạt trục hạ đồi -tuyến yên Ngoài ra, hệ vi khuẩn đường ruột có vai trò trong điều chỉnh serotonin, ảnh hưởng đến chức năng não và ruột Các vi khuẩn đường ruột tham gia vào quá trình tổng hợp và giải phóng serotonin Vi khuẩn ảnh hưởng đến hệ thần kinh thông qua các chất trung gian điều hòa hệ thần kinh như tryptophan, serotonin, GABA và catecholamine Do đó, hệ vi khuẩn đường ruột tham gia vào trục não - ruột và là cơ chế chính trong một số bệnh lý ở người [60]

1.3.4 Phương pháp xác định hệ vi khuẩn đường ruột

1.3.4.1 Phương pháp nuôi cấy

Phương pháp nuôi cấy là phương pháp truyền thống định danh vi khuẩn dựa trên đặc điểm về hình thể, kích thước và các tính chất sinh vật hóa học của vi khuẩn trên các môi trường nuôi cấy đặc hiệu Tuy nhiên, phương pháp nuôi cấy không thích hợp để phân tích microbiome trong đường tiêu hóa bởi vì trong hệ vi khuẩn đường ruột chứa rất nhiều loài vi khuẩn khác nhau Vì vậy, việc xác định từng loài vi khuẩn bằng phương pháp nuôi cấy sẽ rất tốn kém và mất nhiều thời gian Ngoài ra, một số vi khuẩn sống trong những điều kiện đặc biệt và rất khó nuôi cấy bằng môi trường nhân tạo Các nhà khoa học

Trang 38

ước tính rằng hơn 99% các vi khuẩn trong nhiều môi trường vẫn chưa nuôi cấy được [61]

1.3.4.2 Phương pháp định danh bằng phát hiện gen đích

Với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, đặc biệt là sự ra đời công nghệ PCR (Polymerase Chain Reaction), do vậy việc định danh các vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng ngày càng trở nên dễ dàng với độ chính xác cao hơn Đây là phương pháp định danh bằng cách sử dụng các cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen đích cho từng loài vi khuẩn Phương pháp PCR dựa vào các chu kỳ nhiệt để khuếch đại tạo ra một số lượng lớn các bản sao của vật chất di truyền Chỉ từ một lượng DNA rất nhỏ có thể khuếch đại lên hàng triệu bản nhằm phục vụ cho quá trình chẩn đoán các tác nhân gây bệnh Các phương pháp cơ bản dựa trên nguyên lý PCR như RT PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, PFRE (điện di trên gel trường xung)… Kỹ thuật này được coi là kỹ thuật cơ bản nhất của các nghiên cứu sinh học phân tử với nhiều ưu điểm lớn như tính chính xác cao, nhạy, nhanh và dễ thực hiện Thời gian trả lời kết quả nhanh Tuy nhiên đòi hỏi các trang thiết bị hiện đại, con người được đào tạo về sinh học phân tử Trong quá trình thực hiện kỹ thuật dễ bị nhiễm chéo dẫn đến kết quả sai lệch [62]

1.3.4.3 Phương pháp giải trình tự gen

Phương pháp giải trình tự là phương pháp xác định trình tự DNA hoặc RNA một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí Phương pháp giải trình tự cho phép xác định hàng triệu đoạn trình tự DNA hoặc RNA cùng một lúc [63] Trong khi giải trình tự, các phân tử huỳnh quang được phân tách theo vị trí riêng biệt trên phiến kính thay vì phân tách theo kích thước của các phân tử này [64] Quy trình bao gồm các bước chuẩn bị mẫu, chế tạo thư viện, cắt nhỏ DNA/RNA thành các đoạn ngắn, ghép nối các đoạn này thành các cụm và sau đó xác định trình tự của chúng bằng cách sử dụng các kỹ thuật quang học và phân tích dữ liệu [65] Hiện nay, phương pháp giải trình tự bao gồm các

Trang 39

phương pháp cơ bản như giải trình tự bằng phương pháp tổng hợp (SBS), phương pháp gắn nối (SBL) và phương pháp Sanger Phương pháp SBS liên quan đến việc sử dụng một hỗn hợp các dNTP được biến đổi tại vị trí 2’OH bao gồm các dNTP bổ sung tự nhiên và có đánh dấu huỳnh quang Quá trình xác định trình tự sẽ diễn ra tương tự như phản ứng PCR Phương pháp SBL là một phương pháp giải trình tự DNA thay vì sử dụng enzyme polimerase như hầu hết các phương pháp, chúng sử dụng enzyme DNA ligase để xác định nucleotide có mặt tại một vị trí nhất định trong trình tự DNA Phương pháp giải trình tự cổ điển Sanger (dựa trên cơ sở kết hợp của các dideoxynucleotide (ddNTP) bằng DNA polymerase trong quá trình khuếch đại DNA in vitro) vẫn được thực hiện xen kẽ với các phương pháp giải trình tự thế hệ mới khi cần thiết Giải trình tự là một phương pháp quan trọng trong lĩnh vực sinh học phân tử và y sinh học Nó có hiệu quả trong việc xác định trình tự, phân tích cấu trúc và chức năng của DNA và RNA của vi sinh vật, cho phép xác định nhanh chóng và chính xác mầm bệnh như vi khuẩn, vi rút, nấm và ký sinh trùng Phương pháp này có thể phát hiện ra mầm bệnh đã biết hoặc những mầm bệnh mới xuất hiện, xác định gen kháng kháng sinh và cung cấp thông tin về lây truyền gen kháng thuốc Ngoài ra, giải trình tự cho phép lập hồ sơ toàn diện và vai trò của các cộng đồng vi sinh vật đối với sức khỏe và bệnh tật của con người như các tình trạng như béo phì, bệnh viêm ruột và rối loạn sức khỏe tâm thần [66].

1.3.4.4 Phương pháp metagenomics

Thuật ngữ “Metagenomics” lần đầu tiên được mô tả vào năm 1998 bởi Handelsman và Rodon và trở thành một trong những phương pháp nghiên cứu hệ vi sinh vật phức tạp Phương pháp này với mục đích xác định thành phần loài trong hệ vi sinh vật dựa trên gen thu được từ phương pháp giải trình tự Metagenomics là kĩ thuật cho phép khai thác được tối đa thông tin dựa trên các gen của vi sinh vật trong các quần thể sinh vật Metagenomics nghiên cứu

Trang 40

metagenome quần xã sinh vật thông qua bốn bước gồm (1) thu thập mẫu, (2) tách chiết acid nucleic trong mẫu thu thập, (3) giải trình tự và xử lý đoạn trình tự dựa trên nhằm thiết lập hồ sơ đa dạng loài dựa trên một hoặc một đoạn gen, nhiều gen hay toàn bộ hệ gen, (4) sử dụng các công cụ tin sinh học để phân tích và khai thác dữ liệu từ vật liệu di truyền [67]

Phương pháp metagenomics là phương pháp hiệu quả trong việc nghiên cứu toàn diện hệ vi sinh vật đường ruột của con người bởi vì phương pháp có độ nhạy cao với mục tiêu dự đoán, tìm kiếm các mối tương quan thông qua dữ liệu trình tự Ngoài ra, phương pháp giúp chúng ta khai thác thông tin toàn diện về các mầm bệnh mới, các tác nhân gây bệnh; và các cơ chế chuyển hóa liên quan đến hệ vi sinh vật kể cả những vi sinh vật chưa thể nuôi cấy được trong điều kiện phòng thí nghiệm Tuy nhiên, phương pháp này vẫn còn tồn tại một số hạn chế Thứ nhất, metagenomics có thể không xác định được một số vi sinh vật có mật độ thấp trong môi trường Thứ hai, phương pháp metagenomics yêu cầu phân tích lượng trình tự lớn nên chi phí giải trình tự DNA metagenomics của hệ vi sinh vật đường ruột là tương đối lớn Thứ ba, phương pháp metagenomics yêu cầu phải có đủ số lượng DNA trong mẫu cũng như chất lượng DNA cần được đảm bảo Cuối cùng, thông tin về cơ sở dữ liệu tham chiếu của metagenomics là vô cùng quan trọng, và có rất nhiều nghiên cứu thực tế chỉ ra rằng có hơn 80% các đoạn trình tự được phân tích không được gán với bất kỳ thông tin nào trên dữ liệu tham chiếu [68].

1.3.5 Các nghiên cứu về sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột trên độngvật

Vai trò của chế phẩm probiotic với một số bệnh đã được chứng minh qua một số mô hình nghiên cứu trên động vật Các nghiên cứu này đã đánh giá vai trò của lợi khuẩn trong một số bệnh ở đường tiêu hóa như tiêu chảy do sử dụng kháng sinh, viêm ruột và táo bón

Tiêu đề	Nghiên cứu sự biến động hệ vi khuẩn đường ruột và một số chỉ số miễn dịch trên động vật thực nghiệm khi sử dụng chế phẩm probiotic LabMix và BaciMix
Tác giả	Nguyễn Duy Hà
Người hướng dẫn	TS. Chu Đình Tới, PGS. TS. Nguyễn Thái Sơn
Trường học	Học viện Quân y
Chuyên ngành	Khoa học y sinh
Thể loại	Luận án Tiến sĩ Y học
Năm xuất bản	2024
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	165
Dung lượng	3,07 MB