nghiên cứu biến đổi hệ vi sinh đường ruột và hiệu quả điều trị tiêu chảy kéo dài ở trẻ em từ 3 24 tháng tuổi bằng liệu pháp probiotics tại bệnh viện nhi trung ương 2022 2023

Đánh giá tác động của probiotics lên hệ vi sinh đường ruột trẻ mắc tiêu chảy kéo dài - phân tích chỉ số nghiên cứu phụ ngày 5 can thiệp .... Từ những cơ sở trên, chúng tôi tiến hành “Ngh

TỔNG QUAN

Đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng tiêu chảy kéo dài ở trẻ em

1.1.1 Định nghĩa và tình hình nghiên cứu tiêu chảy kéo dài ở trẻ em

1.1.1.1 Định nghĩa tiêu chảy kéo dài

Tiêu chảy kéo dài (TCKD) được Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và Hiệp hội Tiêu hóa Nhi khoa Châu Âu (ESPGHAN/ESPID) định nghĩa là tình trạng tiêu chảy kéo dài từ 2 tuần đến dưới 4 tuần Định nghĩa này có ý nghĩa quan trọng trong việc phân biệt TCKD với các bệnh lý khác như dị ứng thực phẩm, bệnh lý đường ruột bẩm sinh và bệnh Celiac, đồng thời tạo cơ sở cho việc nghiên cứu và quản lý lâm sàng hiệu quả [1], [11], [12]

1.1.1.2 Tình hình nghiên cứu tiêu chảy kéo dài ở trẻ em

Nghiên cứu về TCKD ở trẻ em cho thấy sự khác biệt đáng kể giữa các khu vực trên thế giới, phản ánh những chênh lệch về điều kiện kinh tế - xã hội, vệ sinh môi trường và khả năng tiếp cận dịch vụ y tế Tại các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình, tỷ lệ mắc TCKD dao động từ 1,4% đến 28,4%, với trung bình khoảng 3,2 đợt mỗi trẻ mỗi năm Ngược lại, tại các nước phát triển như Hoa Kỳ, mặc dù dữ liệu còn hạn chế, một nghiên cứu đã chỉ ra rằng khoảng 8% các trường hợp tiêu chảy cấp tiến triển thành TCKD [11] Tiêu chảy kéo dài đóng góp đáng kể vào tỷ lệ tử vong ở trẻ em, đặc biệt tại các quốc gia đang phát triển Tại một số nước như Bangladesh, Ethiopia và Uganda, TCKD chiếm hơn 35% số trường hợp tử vong do tiêu chảy ở trẻ từ 1-11 tháng tuổi và 12-56% ở nhóm trẻ 1-4 tuổi [2], [11]

Tại Việt Nam, dịch tễ học TCKD ở trẻ em đã ghi nhận những thay đổi đáng kể trong hai thập kỷ qua Từ năm 2000 đến 2008, trung bình trẻ dưới 5 tuổi mắc 2,2 đợt tiêu chảy/năm Đến năm 2003, con số này đã giảm xuống còn 1,3 đợt/trẻ/năm, Tỷ lệ tiêu chảy cấp chuyển thành TCKD dao động từ 2,8% đến 5,3%, với tỷ lệ cao nhất được ghi nhận ở các thành phố lớn như Hà Nội và Hồ Chí Minh (khoảng 4%) [13]

1.1.2 Nguyên nhân gây tiêu chảy kéo dài ở trẻ em

Tác nhân gây bệnh trong tiêu chảy kéo dài (TCKD) đã chỉ ra sự đa dạng và phức tạp của cơ chế bệnh sinh, bao gồm cả yếu tố vi sinh vật (VSV) gây bệnh trực tiếp và những thay đổi trong hệ vi sinh đường ruột (VSĐR)

1.1.2.1 Nguyên nhân do vi sinh vật

Các tác nhân gây TCKD ở trẻ em bao gồm một phổ rộng các vi khuẩn, vi rút và ký sinh trùng Trong số đó, một số loài đóng vai trò quan trọng bao gồm

Escherichia coli spp , Shigella spp., Campylobacter jejuni, Yersinia spp hoặc Cryptosporidium spp., Giardia lamblia (bảng 1.1) [11], [14] Trong đó, E coli gây bệnh tiêu chảy nổi bật là tác nhân phổ biến nhất, chiếm 10-25% các trường hợp, với hai chủng EAEC và EPEC chiếm ưu thế Đáng lo ngại, xu hướng kháng thuốc gia tăng ở các chủng E coli này đang tạo ra thách thức đáng kể trong kiểm soát và điều trị [14], [15]

Bên cạnh đó, các vi rút như Rotavirus, Adenovirus và Norovirus cũng đóng vai trò quan trọng Mặc dù nhiễm vi rút thường gây tiêu chảy cấp tính và tự khỏi, nhưng trong một số trường hợp nặng, chúng có thể dẫn đến TCKD [11], [14], [15] Tuy nhiên, một phát hiện đáng chú ý từ nghiên cứu của Vernacchio và cộng sự (2006) tại các nước phát triển cho thấy có tới 60% trường hợp TCKD không xác định được nguyên nhân nhiễm trùng rõ ràng [16]

Các nghiên cứu dịch tễ học đã chỉ ra mối liên hệ phức tạp giữa sử dụng kháng sinh và nguy cơ mắc TCKD Đáng chú ý, nguy cơ viêm ruột do Salmonella tăng cao ở những bệnh nhân sử dụng kháng sinh Ngoài ra, tỷ lệ tiêu chảy liên quan đến kháng sinh do Clostridium difficile dao động từ 9 đến 37% trong các nghiên cứu [5], [16]

Tại Việt Nam, nghiên cứu của Nguyễn Thị Kim Tiến và cộng sự (2022) đã cung cấp bức tranh toàn cảnh về các tác nhân gây bệnh trong TCKD Các vi khuẩn và ký sinh trùng như Entamoeba, Giardia, Salmonella spp., Shigella spp., Campylobacter spp, E coli, Cryptosporidium spp đều được tìm thấy trong phân của trẻ TCKD, trong đó Rotavirus chiếm tỷ lệ đáng kể là 11% [17]

Bảng 1.1 Nghiên cứu về các mầm bệnh liên quan đến tiêu chảy kéo dài [14]

Nguyên cứu Quốc gia/Bệnh phẩm/Loại nghiên cứu Số trẻ được nghiên cứu

Tác nhân gây bệnh đã xác định

(1992) Peru/ phân/Thuần tập 700 Không có tác nhân gây bệnh cụ thể Penny

(1986) Peru/Tá tràng/Ca bệnh 40 TCKD: E coli tăng Penny

(1990) Peru/tá tràng/Ca bệnh 89 Không khác biệt

(1991) Brazil/phân/Ca bệnh EAEC liên quan đến

(1992) Brazil/phân/Ca bệnh 36% EAEC,

(1995) Brazil/phân/Ca bệnh 68,46% EAEC liên quan đến TCKD

(1989) Brazil/phân/tá tràng/Ca bệnh 29 Tá tràng: đa dạng mầm bệnh tăng

(1986) Brazil/phân/Thuần tập 10 năm 414 Đa vi khuẩn trong

(2000) Brazil/phân/Thuần tập 10 năm 414

Cryptosporidium, ETEC tăng trong TCKD Moore

(2010) Brazil/phân/Thuần tập 10 năm 414 TCKD: Shigella,

(1991) Mexico/phân/Thuần tập 2 năm 72 EAEC liên quan đến

TCKD Bartlett Guatemala/phân/ca bệnh 92 TCKD: 46% EAEC Henry

(1992) Banglades/phân/Thuần tập 360 EAEC trong TCKD >

(1988) Bangladesh/phân/Mô tả Shigella, Giardia

(1992) Banglades/Thuần tập 705 EAEC trong TCKD >

(2002) Banglades/phân/Mô tả 100 66% liên quan E coli

(1998) Banglades/phân/Ca bệnh 100 Klebsiella, Aeromanas,

1.1.2.2 Nguyên nhân không do vi sinh vật

Mặc dù, các tác nhân VSV được xác định là nguyên nhân hàng đầu gây TCKD ở trẻ em nhưng các yếu tố không liên quan đến VSV cũng đóng vai trò quan trọng đáng kể trong bệnh sinh của tình trạng này Hai nguyên nhân nổi bật trong nhóm này là tiêu chảy sau viêm ruột và tiêu chảy liên quan đến kháng sinh

Tiêu chảy sau viêm ruột (Post-infectious diarrhea - PID) là một biến chứng thường gặp sau các đợt nhiễm trùng đường ruột cấp tính Nó được định nghĩa là tình trạng tiêu chảy kéo dài sau khi nhiễm trùng ruột cấp tính đã qua đi, nhưng các tổn thương niêm mạc ruột vẫn còn tồn tạimột biến chứng phổ biến của các đợt nhiễm trùng đường ruột cấp tính [11], [18] Cơ chế bệnh sinh của PID bao gồm: (i) Tổn thương niêm mạc ruột do tác nhân nhiễm trùng; (ii) Thiếu hụt các enzyme tiêu hoá quan trọng, đặc biệt là lactase; (iii) Tăng áp lực thẩm thấu trong lòng ruột, dẫn đến TCKD PID thường xảy ra sau các đợt viêm dạ dày ruột cấp tính do vi rút như Rotavirus hay Norovirus Ngoài ra, các ký sinh trùng đường ruột như Giardia, Cryptosporidium và các tác nhân khác cũng góp phần gây ra PID [11], [19], [18]

Tiêu chảy liên quan đến sử dụng kháng sinh (Antibiotic – associated diarrhea, AAD) là tình trạng đi ngoài phân lỏng bất thường từ 3 lần/ngày trở lên, xảy ra sau khi sử dụng kháng sinh Thời gian khởi phát có thể từ vài giờ đến 8 tuần sau khi bắt đầu điều trị kháng sinh Cơ chế chính của AAD là do kháng sinh làm mất cân bằng hệ VSĐR bình thường Nghiên cứu cho thấy tỷ lệ mắc AAD dao động từ 5 - 30% ở trẻ em, với hầu hết các loại kháng sinh đường uống và tĩnh mạch đều có khả năng gây ra tình trạng này [5], [20]

Ngoài PID và AAD, một số nguyên nhân khác ít phổ biến cần xem xét khi đánh giá TCKD ở trẻ em bao gồm: Rối loạn chuyển hoá bẩm sinh, bệnh celiac, bệnh lý ruột viêm, các bệnh lý nột tiết Sự đa dạng của các nguyên nhân không do VSV này đòi hỏi một cách tiếp cận toàn diện và có hệ thống trong chẩn đoán và điều trị TCKD ở trẻ em Như vậy, đây là kết quả của sự tương tác phức tạp giữa nhiều yếu tố, bao gồm tác nhân gây bệnh truyền nhiễm, rối loạn hệ VSĐR, và tác động của kháng sinh

1.1.3 Các yếu tố nguy cơ gây tiêu chảy kéo dài

Việc xác định và kiểm soát các yếu tố nguy cơ gây TCKD đóng vai trò quan trọng trong việc xây dựng các biện pháp can thiệp phù hợp và toàn diện Các yếu tố nguy cơ chính bao gồm tuổi, chế độ dinh dưỡng, tiền sử bệnh lý, và các yếu tố môi trường - xã hội

Yếu tố tuổi: Tuổi được xác định là một trong những yếu tố nguy cơ quan trọng nhất của TCKD Nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ mắc TCKD cao nhất ở nhóm trẻ từ 6 đến 24 tháng tuổi, trong đó nguy cơ cao nhất tập trung ở trẻ dưới 12 tháng tuổi [21] Chế độ dinh dưỡng: Đóng vai trò quan trọng trong việc phát triển TCKD Cụ thể, trẻ không được nuôi dưỡng hoàn toàn bằng sữa mẹ hoặc sử dụng sữa công thức có nguy cơ TCKD cao gấp 2-4 lần Trẻ SDD có nguy cơ mắc TCKD gấp đôi so với trẻ không SDD Thiếu hụt các vi chất dinh dưỡng như vitamin A, kẽm, acid folic và sắt cũng làm tăng nguy cơ TCKD [19], [21]

Hệ vi sinh đường ruột

1.2.1 Giải trình tự gen 16S rRNA trong nghiên cứu hệ vi sinh đường ruột

Thập kỷ qua đã chứng kiến một cuộc cách mạng trong nghiên cứu hệ vi sinh đường ruột, chủ yếu nhờ sự ra đời của công nghệ Giải trình tự Thế hệ mới (NGS) Trong số đó, giải trình tự gen 16S rRNA sử dụng công nghệ Illumina đã trở thành công cụ không thể thiếu trong phân tích hệ vi sinh Gen 16S rRNA đóng vai trò như một mã vạch phân tử để nhận dạng và phân loại vi khuẩn, với nhiều đặc điểm lý tưởng cho mục đích này [25], [26], [27]:

- Tính phổ biến: Có mặt trong tất cả các loài vi khuẩn, cho phép so sánh rộng rãi giữa các taxon đa dạng

- Bảo tồn tiến hóa: Cấu trúc được bảo tồn cao, tạo điều kiện thuận lợi cho việc thiết kế các mồi PCR phổ quát

- Độ dài tối ưu: Với khoảng 1500 cặp base, chứa đủ thông tin phân loại mà không quá dài để gây khó khăn trong giải trình tự

- Cấu trúc: Chứa vùng bảo tồn và vùng biến đổi, cho phép phân biệt ở mức độ loài

Hình 1.2 Giải trình tự gen thế hệ mới vùng V3-V4 16S rRNA [26]

Gen 16S rRNA bao gồm chín vùng siêu biến đổi (V1-V9) xen kẽ với các vùng bảo tồn [26] Vùng V3-V4 đã trở thành tiêu chuẩn vàng trong nghiên cứu hệ vi sinh đường ruột vì: (i) Đa dạng cao giữa các loài, cho phép phân biệt chính xác về mặt phân loại; (ii) Độ dài lý tưởng (~460 bp) cho giải trình tự Illumina, cho phép chồng lấp đáng kể trong đọc hai đầu; (iii) Đủ bảo tồn để thiết kế mồi PCR hiệu quả, đồng thời duy trì tính biến đổi để phân biệt loài; (iv) Hiệu suất vượt trội trong nhận dạng vi khuẩn ở mức độ chi và loài so với các vùng khác; (v) Cơ sở dữ liệu tham chiếu phong phú, nâng cao độ chính xác trong nhận dạng vi khuẩn [27], [28]

So với phương pháp Sanger truyền thống, công nghệ NGS như Illumina có nhiều ưu điểm: (i) Thông lượng cao, cho phép giải trình tự đồng thời nhiều mẫu; (ii) Độ chính xác cao hơn, giảm thiểu lỗi giải trình tự; (iii) Xử lý nhanh, rút ngắn thời gian phân tích; (iv) Chi phí giải trình tự trên mỗi base thấp hơn Mặc dù Illumina chiếm ưu thế, các nền tảng NGS khác như Ion Torrent, PacBio và Oxford Nanopore cũng có những ưu điểm riêng trong nghiên cứu hệ vi sinh [25], [26]

Việc ứng dụng giải trình tự gen 16S rRNA, đặc biệt là nhắm vào vùng V3-V4, sử dụng công nghệ NGS đã mở ra một kỷ nguyên mới trong nghiên cứu hệ VSĐR của con người Phương pháp này không chỉ cung cấp cái nhìn chi tiết và toàn diện về thành phần VKĐR mà còn mở ra cơ hội phát triển các chiến lược chẩn đoán và điều trị mới dựa trên hiểu biết sâu sắc hơn về tương tác giữa con người và hệ vi sinh

1.2.2 Thành phần và vai trò của hệ vi sinh đường ruột

1.2.2.1 Thành phần của hệ vi sinh đường ruột

Hệ vi sinh đường ruột (VSĐR) là một hệ sinh thái phức tạp và đa dạng, được ví như một "siêu sinh vật" với hơn 3 triệu gen, vượt xa bộ gen người Hệ VSĐR bao gồm hàng trăm loài vi khuẩn thuộc hơn 50 ngành khác nhau [29]

Sự phát triển của hệ VSĐR trong 1000 ngày đầu đời đóng vai trò quyết định đối với sức khỏe lâu dài của trẻ Mật độ vi khuẩn đường ruột (VKĐR) tăng nhanh chóng từ khoảng 10 8 CFU/gram phân sau sinh lên đến 10 11 – 10 12 CFU/gram phân trong vài tháng tiếp theo Về phân loại, vi khuẩn được sắp xếp theo các cấp bậc: ngành (phylum), lớp (class), bộ (order), họ (family), chi (genus) và loài (species) [30], [31] Về thành phần, hệ VSĐR ở trẻ nhũ nhi chủ yếu bao gồm ba ngành vi khuẩn chính gồm: Firmicutes, Bacteroidetes và Actinobacteria [32]

Hình 1.3 Thành phần và vai trò hệ vi sinh đường ruột [32]

Ngành Firmicutes bao gồm các chi quan trọng như Lactobacillus và Clostridium Các loài Lactobacillus định cư và phát triển mạnh trong đường ruột trẻ nhũ nhi, chúng chuyển hoá carbohydrate, đặc biệt lactose trong sữa mẹ để sản xuất axit lactic giúp duy trì pH acid trong ruột, tạo môi trường thuận lợi cho các vi khuẩn lactic, đồng thời ức chế vi khuẩn có hại Lactobacillus còn sản xuất chất kháng khuẩn, chống viêm và hỗ trợ hệ miễn dịch non nớt trẻ nhũ nhi Các loài Clostridium có khả năng tạo ra các axit béo chuỗi ngắn (SCFA) như butyrate và propionate làm nguồn năng lượng cho các tế bào biểu mô ruột, giúp duy trì sức khoẻ và chức năng của lớp niêm mạc ruột non SCFA còn có tác dụng chống viêm, điều hòa hệ miễn dịch, từ đó hỗ trợ quá trình phát triển của hệ VSĐR và hệ miễn dịch ở trẻ nhũ nhi [29], [32], [33]

Ngành Bacteroidetes đại diện bởi các chi Bacteroides và Prevotella, đóng vai trò then chốt trong việc tiêu hoá và lên men chất xơ phức tạp Chúng sản xuất SCFA như propionate và acetate từ việc phân giải các chất xơ thực vật Bacteroidetes còn tham gia điều hòa và tăng cường hệ miễn dịch của vật chủ [34]

Ngành Actinobacteria điển hình là chi Bifidobacterium, chiếm ưu thế trong hệ VSĐR trẻ nhũ nhi Chúng phân giải lactose và các oligosaccharit trong sữa mẹ (HMOs), sản xuất axit lactic và axit acetic Các axit này duy trì môi trường acid, ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây hại [35]

Ngoài ba ngành chính, còn có các ngành khác đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái VSĐR: (i) Ngành Proteobacteria, chứa nhiều chi vi khuẩn Gram âm như

Escherichia, Klebsilella, Helicobacter Một số thành viên trong ngành này có khả năng gây bệnh nếu phát triển quá mức, nhưng cũng có những thành phần có lợi; (ii) Ngành Fusobacteria, đại diện chính là chi Fusobacterium, là thành phần bình thường của hệ VSĐR Tuy nhiên, khi mật độ tăng cao, chúng có thể liên quan đến các bệnh lý viêm và ung thư; (iii) Ngành Verrucomicrobia chiếm tỷ lệ thấp nhất nhưng đóng vai trò quan trọng, trong đó Akkermansia muciniphila sản xuất enzyme phân giải các glycoprotein trong niêm mạc ruột để cung cấp nguồn dinh dưỡng cho các vi khuẩn khác và duy trì lớp niêm mạc ruột khỏe mạnh [7], [29], [32], [36]

Ngành Proteobacteria, Fusobacteria và Verrucomicrobia cùng với các nhóm vi khuẩn chính khác đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì sự cân bằng, đa dạng và sức khỏe của hệ VSĐR ở trẻ nhũ nhi [29], [32]

1.2.2.2 Vai trò của hệ vi sinh đường ruột đối với sức khoẻ trẻ nhũ nhi

Hỗ trợ tiêu hóa và hấp thu dinh dưỡng: Các VKĐR, đặc biệt là các chủng thuộc ngành Bacteroidetes và Firmicutes, có khả năng phân hủy các chất xơ khó tiêu hóa thành các phân tử nhỏ hơn, dễ hấp thu Hệ VSV còn tham gia tổng hợp các axit amin thiết yếu, vitamin nhóm B, vitamin K và liên quan đến quá trình tổng hợp axit mật, giúp cơ thể sử dụng các dưỡng chất hiệu quả hơn [29], [32], [36]

Bảo vệ cơ thể khỏi các tác nhân gây bệnh: Lớp nhầy bọc lót bên trong đường tiêu hóa, cùng với các chất kháng khuẩn như bacteriocin do vi sinh vật tiết ra, đóng vai trò như một rào cản vật lý và hóa học để ngăn chặn sự xâm nhập của vi khuẩn, vi rút và các tác nhân gây bệnh khác [29], [31], [32] Điều hòa hệ miễn dịch: Các phân tử điều hòa miễn dịch thuộc hệ VSĐR giúp kích thích sự phát triển và trưởng thành của các tế bào miễn dịch, duy trì cân bằng môi trường đường ruột và ngăn ngừa tình trạng viêm ruột, rối loạn tự miễn [29], [32]

1.2.3 Quá trình hình thành hệ vi sinh đường ruột khỏe mạnh

Giai đoạn "1000 ngày đầu đời", từ thụ thai đến 2 tuổi, là thời kỳ quan trọng trong sự phát triển của hệ VSĐR Trong giai đoạn này, thành phần hệ VSĐR của trẻ trải qua những thay đổi nhanh chóng và sâu sắc, chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố nội sinh và ngoại sinh [10], [37]

1.2.3.1 Quá trình hình thành hệ vi sinh đường ruột giai đoạn đầu đời

Hình 1.4 Quá trình phát triển hệ vi sinh đường ruột giai đoạn đầu đời [38]

Trong tử cung và khi sinh nở: Quan điểm truyền thống cho rằng ruột của trẻ sơ sinh là vô trùng đã bị thách thức bởi các nghiên cứu gần đây Các phát hiện về sự hiện diện của vi khuẩn trong máu dây rốn, nước ối và nhau thai của thai nhi khỏe mạnh đã mở ra khả năng thai nhi tiếp xúc với vi khuẩn từ trước khi sinh [39] Tuy nhiên, vấn đề này vẫn còn gây tranh cãi trong cộng đồng khoa học Phương thức sinh nở có ảnh hưởng quan trọng đến nguồn vi khuẩn ban đầu mà trẻ sơ sinh tiếp xúc Sinh thường tạo điều kiện cho sự lây truyền vi khuẩn có lợi từ mẹ sang con, trong khi sinh mổ có thể làm giảm hoặc trì hoãn sự colonization của một số loài vi khuẩn quan trọng như Bifidobacteria, Lactobacillus và Bacteroides Sự khác biệt về thành phần hệ VSĐR giữa hai phương thức sinh nở thường rõ rệt trong 6 tháng đầu và giảm dần theo thời gian [37], [40], [41]

Liệu pháp probiotics trong điều trị tiêu chảy kéo dài

Mất cân bằng hệ VSĐR gây tiêu chảy, trong khi hệ VSĐR cân bằng giúp ngăn ngừa bệnh và duy trì chức năng tiêu hóa Nhiều nghiên cứu chứng minh probiotics hiệu quả trong điều trị tiêu chảy bằng cách phục hồi cân bằng hệ VSĐR, mặc dù cơ chế chính xác trong TCKD vẫn chưa được hiểu rõ

1.3.1 Định nghĩa, phân loại và các yếu tố ảnh hưởng probiotics

1.3.1.1 Định nghĩa và phân loại probiotics

Thuật ngữ “probiotics” bắt nguồn từ tiếng Latinh “pro” và tiếng Hy Lạp “bios”, có nghĩa là “vì cuộc sống” Khái niệm này được phát triển từ quan sát của Hippocrates về tác dụng trị liệu của sữa lên men đối với rối loạn đường ruột [64] Vào đầu thế kỷ 20, Elie Metchnikoff đề xuất khái niệm “thay thế vi khuẩn có hại bằng vi khuẩn có lợi để cải thiện sức khỏe” [65], [66]

Theo tuyên bố đồng thuận năm 2014 của Hiệp hội Quốc tế Phát triển Probiotics và Prebiotics (International Society for Advancement of Probiotics and

Prebiotics, ISAPP), probiotics được định nghĩa là “các vi sinh vật sống, khi được bổ sung với liều lượng thích hợp, mang lại lợi ích cho sức khỏe vật chủ" [66] Định nghĩa này nhấn mạnh hai yếu tố quan trọng: đặc tính của vi sinh vật và liều lượng đủ để phát huy hiệu quả

Các chủng probiotics phổ biến bao gồm: Lactobacillus, Bifidobacterium, bào tử

Bacillus và nấm men Saccharomyces boulardii [67] Ngoài ra, probiotics được phân loại dựa trên số lượng chủng: đơn chủng hoặc đa chủng Nghiên cứu đánh giá có hệ thống so sánh hiệu quả của chế phẩm probiotics một chủng so với hỗn hợp nhiều chủng cho thấy trong hầu hết các trường hợp, các chủng probiotics đơn chủng tương đương với hỗn hợp đa chủng [68] Liều lượng probiotics thường dao động từ

1 tỷ đến 50 tỷ đơn vị hình thành khuẩn lạc (CFU) mỗi ngày [68]

1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến probiotics

Hiệu quả của probiotics phụ thuộc vào bốn yếu tố chính [69], [70]:

- Khả năng sống sót và bám dính vào lớp biểu mô ruột

- Đặc tính di truyền và chuyển hoá như không mang gen kháng kháng sinh, khả năng sản xuất chất kháng khuẩn và axit béo chuỗi ngắn

- Tính an toàn (không gây nhiễm khuẩn và dị ứng hoặc không chuyển gen ngang

- Liều lượng, tần suất và thời gian sử dụng phù hợp

Về tính an toàn của probiotics:

- Cơ quan Nghiên cứu và Chất lượng Y tế (Hoa Kỳ) đánh giá cho thấy phần lớn các chủng probiotics đều an toàn, chỉ một số ít gây tác dụng phụ nhẹ ở bệnh nhân có sức khỏe yếu [70]

- Hội Dinh dưỡng và Tiêu hoá Nhi khoa Châu Âu (ESPGHAN) năm 2023 đưa ra khuyến nghị mạnh mẽ về việc sử dụng probiotics trong điều trị và phòng ngừa các bệnh lý đường ruột ở trẻ em dựa trên phân tích tổng hợp 55 nghiên cứu ngẫu nhiên có đối chứng [71]

- Hệ thống giám sát biến cố bất lợi của Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) không ghi nhận sự gia tăng đáng kể các biến cố nghiêm trọng liên quan đến việc sử dụng probiotics [72]

- Mặc dù các đánh giá hiện tại khẳng định tính an toàn của probiotics, việc nghiên cứu liên tục về nguy cơ thực tế của chuyển gen vẫn rất cần thiết để đảm bảo an toàn di truyền lâu dài của probiotics đối với sức khỏe [72]

1.3.2 Cơ chế tác động của probiotics trong tiêu chảy

Probiotics đối phó với tiêu chảy thông qua nhiều cơ chế phức tạp, phản ánh sự tương tác đa chiều giữa probiotics, vi khuẩn cộng sinh có khả năng gây bệnh (pathobiont) và hệ miễn dịch vật chủ Ba cơ chính bao gồm:

Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của probiotics [69]

Thứ nhất, probiotics có khả năng đối kháng trực tiếp với tác nhân gây bệnh thông qua: (i) Cạnh tranh chất dinh dưỡng và vị trí bám dính Ví dụ, Lactobacillus rhamnosus GG cạnh tranh với E coli và Salmonella gây bệnh để bám vào các thụ thể mannose trên bề mặt tế bào biểu mô ruột; (ii) Tạo môi trường không thuận lợi bằng việc sản sinh axit hữu cơ như axit lactic và axit acetic, làm giảm pH đường ruột ức chế sự phát triển của nhiều pathobiont; (iii) Tiết ra các bacteriocin như clausin từ Bacillus spp để ức chế hoặc tiêu diệt các pathobiont Clausin do B clausii UBBC07 có hoạt tính kháng khuẩn chống lại vi khuẩn Gram dương mà còn ức chế độc tính của C difficile [69], [73], [74]

Thứ hai, probiotics tăng cường tính toàn vẹn hàng rào niêm mạc ruột bằng cách kích thích biểu hiện gen sản xuất chất nhầy, củng cố liên kết giữa các tế bào biểu mô và thúc đẩy biệt hoá tế bào gốc ruột thành tế bào Paneth và tế bào đài bảo vệ hàng rào niêm mạc ruột [69], [75], [76]

Thứ ba, probiotics có khả năng tương tác và điều chỉnh hệ miễn dịch của vật chủ thông qua các con đường như phục hồi cân bằng Th1/Th2; sản xuất TGF-β, IL-

10 từ tế bào Treg; tăng IgA tiết từ tế bào B và giảm IgE đặc hiệu; điều hòa giảm đáp ứng viêm, ức chế con đường NF-κB, một yếu tố phiên mã quan trọng trong đáp ứng viêm và giảm sản xuất các cytokine gây viêm [65], [69]

1.3.3 Bằng chứng lâm sàng về hiệu quả của probiotics trong tiêu chảy kéo dài 1.3.3.1 Tổng quan các thử nghiệm lâm sàng và đánh giá có hệ thống

Hệ VSĐR cân bằng đóng vai trò quan trọng trong duy trì sức khỏe đường tiêu hóa Tình trạng mất cân bằng VSĐR hay “dysbiosis” tạo điều kiện cho sự phát triển mạnh mẽ các vi khuẩn gây bệnh như E coli, Salmonella và Shigella, dẫn đến viêm ruột mạn tính và làm trầm trọng thêm tình trạng TCKD [74], [77] Mặc dù các biện pháp điều trị truyền thống như bù nước điện giải, bổ sung kẽm, điều chỉnh chế độ ăn uống và sử dụng kháng sinh nhưng hiệu quả kiểm soát TCKD vẫn còn hạn chế [2] Hơn nữa, việc lạm dụng kháng sinh có thể làm trầm trọng thêm tình trạng

“dysbiosis”, dẫn đến nguy cơ kháng thuốc và nhiễm trùng tái phát [78]

Hướng dẫn mới nhất năm 2023 của Hiệp hội Dinh dưỡng Nhi khoa Châu Âu (ESPGHAN) đã đưa ra các khuyến nghị cụ thể dựa trên bằng chứng khoa học về việc sử dụng các chủng probiotics trong điều trị tiêu chảy như: Lacticaseibacillus rhamnosus GG (còn gọi Lactobacillus GG) với liều ≥10 tỷ CFU/ngày trong 5-7 ngày Đây là một trong những chủng probiotic được nghiên cứu rộng rãi nhất, chứng minh có khả năng làm giảm thời gian và mức độ nặng của tiêu chảy

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

- Trẻ em từ 3 - 24 tháng tuổi được chẩn đoán mắc tiêu chảy kéo dài từ 2 đến 4 tuần, với đặc điểm phân lỏng hoặc nước bất thường, tần suất đi ngoài  3 lần/ ngày

- Trẻ không có dấu hiệu thuyên giảm triệu chứng và cần nhập viện điều trị

- Cha mẹ hoặc người giám hộ đồng ý cho trẻ tham gia nghiên cứu và cam kết tuân thủ quy trình nghiên cứu

- Trẻ nhập viện trong tình trạng nặng (sốc, co giật, suy hô hấp) cần chăm sóc đặc biệt hoặc có bệnh lý nhiễm trùng ngoài đường ruột kèm theo

- Trẻ mắc các bệnh lý mạn tính khác như suy giảm miễn dịch bẩm sinh, bệnh lý rối loạn chuyển hoá, viêm ruột mạn tính (bệnh Crohn, viêm loét đại trực tràng chảy máu), lao, HIV hoặc các dị tật bẩm sinh hay dị ứng

- Trẻ có tiền sử sinh non hoặc suy dinh dưỡng nặng

- Trẻ đã sử dụng probiotics chứa các chủng vi khuẩn (Bacillus clausii, Bacillus sublitis, Bacillus coagulans) trước khi tham gia nghiên cứu.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: Nghiên cứu thực hiện trong giai đoạn từ năm 2022 đến năm 2023

- Địa điểm: Nghiên cứu tiến hành tại Khoa Tiêu hóa, Bệnh viện Nhi Trung ương.

Phương pháp nghiên cứu

Nghiên cứu này áp dụng phương pháp tiếp cận đa chiều để khảo sát toàn diện về TCKD ở trẻ em

- Mục tiêu 1: Nghiên cứu mô tả cắt ngang nhằm xác định đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của TCKD

- Mục tiêu 2: Nghiên cứu mô tả cắt ngang có so sánh để phân tích hệ vi sinh đường ruột thông qua giải trình tự 16S rRNA ở trẻ mắc TCKD và trẻ khỏe mạnh

- Mục tiêu 3: Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên, mù đôi, có đối chứng với giả dược để đánh giá hiệu quả của các chủng probiotics trong điều trị TCKD

2.3.2 Tính toán cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu

2.3.2.1 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 1

Mục tiêu 1: Nghiên cứu mô tả cắt ngang Áp dụng công thức tính cỡ mẫu cho ước tính một tỷ lệ trong quần thể với độ chính xác xác định [89]:

- : Hệ số tin cậy, mức ý nghĩa thống kê  = 0,05 (tương đương với mức tin cậy 95%), giá trị thống kê chuẩn Z(1-α/2)= 1,96

- p = 0,25 (tỷ lệ ước tính phát hiện tác nhân gây bệnh)

- d: Mức sai số tuyệt đối chấp nhận, chọn d = 0,07 (7%)

Cỡ mẫu tối thiểu tính toán được: n  147

2.3.2.2 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 2

Mục tiêu 2: Nghiên cứu so sánh hệ VSĐR Sử dụng công thức tính cỡ mẫu để phát hiện hiệu ứng lớn trong so sánh hai nhóm độc lập [89], [90]

Cỡ mẫu cho nhóm trẻ mắc tiêu chảy kéo dài:

- Z(1-α/2) = 1,96 (α = 0,05, tương đương mức độ tin cậy 95%)

- Z(1-β) = 1,28 (β = 0,10, tương đương hiệu lực thống kê 90%)

- ES (effect size) = 0,8, đại diện cho "hiệu ứng kích thước lớn" theo d ‘ Cohen [90]

Cỡ mẫu tối thiểu tính toán được: n  17 cho nhóm trẻ mắc TCKD

Cỡ mẫu cho nhóm trẻ khỏe mạnh (nhóm tham chiếu): Áp dụng công thức tương tự nhưng điều chỉnh

- Z(1-α/2) = 1,96 (α = 0,05, tương đương mức độ tin cậy 95%)

- Z(1-β) = 0,84 (β = 0,20, tương đương hiệu lực thống kê 80%)

Cỡ mẫu tối thiểu tính toán được: n  13 cho nhóm trẻ khoẻ mạnh

Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu ngẫu nhiên phân tầng để đảm bảo sự phân bố cân bằng của các yếu tố quan trọng giữa hai nhóm

2.3.2.3 Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu cho mục tiêu 3

Mục tiêu 3: Thử nghiệm lâm sàng ngẫu nhiên có đối chứng Áp dụng công thức cỡ mẫu cho thử nghiệm lâm sàng vượt trội [91] n2 = (𝑍 1−𝛼 + 𝑍 1−𝛽 )

- n1: Cỡ mẫu của nhóm can thiệp (nhóm điều trị phối hợp probiotics)

- n2: Cỡ mẫu của nhóm đối Chứng (nhóm điều trị phối hợp giả dược)

- k: Tỷ lệ cỡ mẫu giữa nhóm can thiệp và nhóm đối chứng, k = n1/n2 = 2

- Mức ý nghĩa α = 0,05 (độ tin cậy 95%), giá trị thống kê chuẩn Z(1-α)= 1,96

- Lực mẫu mong muốn 1-  = 0,90 (90%),  = 0,1 và giá trị Z(1-β) = 1,28

- Phương sai chung σ 2 = 4,41 của cả hai nhóm, được tính từ độ lệch chuẩn σ = 2,1 của nghiên cứu Basu [92]

- 𝜖: Hiệu số trung bình kỳ vọng μ2 - μ1 = 3,9 ngày giữa hai nhóm probiotic (5,3 ngày) và nhóm giả dược (9,2 ngày) theo nghiên cứu của Basu [92]

- Sự khác biệt có ý nghĩa lâm sàng là δ = 2,7 ngày

Cỡ mẫu cần thiết: nhóm Chứng (giả dược) n2 = 49; nhóm can thiệp (nhóm điều trị probiotics) n1 = 98 Tổng cỡ mẫu: n 1 + n 2  147

Phương pháp chọn mẫu: Phân nhóm ngẫu nhiên nhằm tối ưu hóa số lượng bệnh nhân được nhận liệu pháp probiotics tiềm năng, đồng thời đảm bảo giá trị thống kê

2.3.3 Quy trình thu thập số liệu

2.3.3.1 Quy trình tuyển chọn đối tượng nghiên cứu

- Sàng lọc ban đầu: Trẻ từ 3 - 24 tháng tuổi nhập viện vì TCKD tại Khoa Tiêu hoá, Bệnh viện Nhi Trung ương, giai đoạn 2022 - 2023

- Tiêu chuẩn lựa chọn: Áp dụng tiêu chuẩn lựa chọn và tiêu chuẩn loại trừ (chi tiết tại mục 2.1) để xác định đối tượng phù hợp

+ Sàng lọc hàng ngày các trường hợp nhập viện

+ Đánh giá lâm sàng toàn diện

+ Giải thích về nghiên cứu cho cha mẹ/người giám hộ

+ Lấy chấp thuận nghiên nghiên cứu bằng văn bản

+ Ghi nhận thông tin cơ bản vào bệnh án nghiên cứu

- Cỡ mẫu và thời gian tuyển chọn

+ Mục tiêu tối thiểu: 147 trẻ mắc TCKD

+ Tuyển chọn liên tục cho đến khi đạt cỡ mẫu yêu cầu

2.3.3.2 Thu thập dữ liệu cho mục tiêu 1

- Sử dụng bệnh án nghiên cứu chuẩn hóa (Phụ lục 1A) để thu thập

+ Thông tin nhân khẩu học: Tuổi, giới tính, địa chỉ

+ Chỉ số nhân trắc: Cân nặng, chiều dài

+ Tiền sử: Bệnh lý, tiêm chủng, dinh dưỡng

+ Bệnh sử: Thời gian tiêu chảy, đặc điểm phân, triệu chứng kèm theo

+ Khám toàn thân: dấu hiệu sinh tồn, tình trạng mất nước

+ Đánh giá tình trạng dinh dưỡng: cân nặng theo tuổi

+ Ghi nhận triệu chứng lâm sàng (tần suất đi ngoài, độ đặc của phân theo thang Diapered, tính chất phân và các triệu chứng đi kèm như sốt, nôn, đau bụng) theo các công cụ và thang đo tham chiếu theo phụ lục 5

+ Máu: Tổng phân tích tế bào máu ngoại vi, CRP, điện giải đồ

+ Phân: Soi phân, cấy phân, real-time PCR 24 tác nhân gây bệnh (Phụ lục 3A)

+ Các xét nghiệm bổ sung khi cần để loại trừ nguyên nhân khác gây bệnh như bệnh lý ruột viêm, lao và HIV…

- Quy trình thu thập và bảo quản mẫu:

+ Máu: Lấy 2 ml máu tĩnh mạch, bảo quản theo quy trình phòng xét nghiệm + Phân: Thu thập theo quy trình ST.XN.4.4 của Bệnh viện Nhi trung ương

2.3.3.3 Phân nhóm ngẫu nhiên, lựa chọn mẫu và thu thập dữ liệu cho mục tiêu 2 Quy trình phân nhóm ngẫu nhiên

- Phần mềm GraphPad (https://www.graphpad.com/quickcalcs/randomize2/) được sử dụng để tạo danh sách phân nhóm ngẫu nhiên trước khi bắt đầu nghiên cứu

- Gán mã số duy nhất cho mỗi đối tượng tham gia

- Phân bổ vào ba nhóm: Chứng, Clausy và Dia30

- Bảo mật kết quả phân nhóm cho đến khi hoàn tất quá trình tuyển chọn

Lựa chọn mẫu phân tích hệ vi sinh đường ruột

- Phương pháp: Lấy mẫu phân tầng ngẫu nhiên

+ Sử dụng phần mềm thống kê R để thực hiện lấy mẫu

+ Lựa chọn tổng cộng ít nhất 17 trẻ mắc TCKD từ cả ba nhóm

+ Đảm bảo tỷ lệ các tầng tương đương với tỷ lệ trong tổng thể mẫu theo nhóm tuổi; giới tính và phương thức sinh theo tỷ lệ 1:1

Lựa chọn nhóm tham chiếu: Để đảm bảo tính so sánh giữa nhóm bệnh và nhóm tham chiếu, nghiên cứu tiến hành tuyển chọn song song một nhóm trẻ khỏe mạnh làm nhóm tham chiếu Quy trình tuyển chọn nhóm tham chiếu được thực hiện như sau:

- Đối tượng tuyển chọn: Trẻ 3-24 tháng tuổi khỏe mạnh đến kiểm tra sức khỏe và tiêm chủng định kỳ tại Bệnh viện Nhi Trung ương

+ Chỉ số nhân trắc đạt chuẩn theo khuyến cáo của WHO

+ Không có dấu hiệu bệnh lý nào được phát hiện qua thăm khám

+ Trẻ có tiền sử bệnh lý và/hoặc sử dụng bất kỳ loại thuốc đặc biệt nào (bao gồm kháng sinh, chất xơ, men vi sinh, thuốc ức chế bài tiết axit dạ dày hoặc thuốc chống viêm) trong vòng 2 tháng trước thời điểm nghiên cứu

+ Mẹ của trẻ mắc bệnh mạn tính hoặc có tiền sử biến chứng sản khoa

Thu thập và bảo quản mẫu phân

- Tuân thủ theo quy trình ST.XN.4.4 của Bệnh viện Nhi Trung ương

- Bảo quản ở -80°C tại Khoa Sinh học phân tử và các bệnh Truyền nhiễm

Quy trình phân tích 16S rRNA (Phụ lục 3B):

- Tách chiết DNA từ các mẫu phân đã được lựa chọn

- Vận chuyển mẫu DNA đến công ty Macrogen, Seol, Hàn Quốc

- Giải trình tự gen 16S rRNA bằng công nghệ Illumina Miseq

- Phân tích dữ liệu theo quy trình chuẩn

- Tiêu chí phân tầng: tuổi (3 -< 6 tháng, 6-