KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: TÌM HIỂU MỨC ĐỘ NHIỄM KHUẨN VÀ SỰ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA ESCHERICHIA COLI VÀ SALMONELLA TRONG THỊT GÀ TẠI CÁC CƠ SỞ GIẾT MỔ Ở TP.. SVTH: Trần Phạm Minh Khoa
Dư lượng kháng sinh trong thực phẩm
Theo Lã Văn Kính và cộng sự (1996), từ 75% số mẫu thịt gà kiểm tra cho thấy đều có tồn dư kháng sinh với mức tồn dư từ 3,67 - 122 ppm, cao hơn hàng chục đến hàng nghìn lần so với tiêu chuẩn cho phép của EU (0,01 ppm) và Mỹ
Theo Võ Thị Trà An điều tra năm 2003 tại 6 quận huyện của Tp HCM ở tất cả các trang trại và 70% nông hộ trong khu vực chăn nuôi tập trung có bổ sung kháng sinh vào thức ăn cho gà để phòng bệnh và kích thích tăng trưởng, có
54,8% hộ sử dụng thuốc theo kinh nghiệm, 39,1% theo khuyến cáo của nhà sản xuất và 20% theo khuyến cáo của thú y viên Tỷ lệ các cơ sở chăn nuôi gà sử dụng kháng sinh không hợp lí là 32,6%, trong đó sử dụng sai về liều lượng là
23,2% Tỷ lệ các cơ sở chăn nuôi gà sử dụng kháng sinh không đảm bảo an toàn thực phẩm (không ngưng thuốc đúng thời hạn qui định) là 44,5% tương ứng với số mẫu có tồn dư kháng sinh là 60% [1]
Theo một báo cáo của đại học Nông lâm Tp HCM, trong 149 mẫu thịt gà bán tại các chợ có 50% mẫu có dư lượng với 26 loại kháng sinh khác nhau, gồm ampicillin (7,24%), tetracyllin (7,95%), gentamycin (8,35%), norfloxacin (10%), colistin (13,24%), tylosin (15%), chloramphenicol (15,35%) [29]
Báo cáo đề tài nghiên cứu khoa học năm 2003 của Bộ Nông nghiệp và
Phát triển Nông thôn cho thấy độ nhiễm kháng sinh trong thịt gà lấy tại các chợ ở Hà Nội có 2 loại là oxytetracycline (cao hơn cho phép của Codex và các nước Âu Mỹ, song ở Việt Nam không quy định dư lượng tối đa) và furazonidon (có quy chế cấm sử dụng) [30]
Theo Nguyễn Thị Hoa Lý và cộng sự (2004), tỷ lệ kháng sinh sử dụng ở
19 trại gà: norfloxacin (5,26%), streptomycin (5,26%), amoxicillin (21,05%), tetracyclin (21,05%), trimethoprim (21,05%), gentamycin (26,31%) [11]
Vi khuẩn kháng kháng sinh trong thực phẩm
Theo Phùng Quốc Chướng (2003), nghiên cứu khả năng mẫn cảm và kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi ở Đắc Lắc qua 3 giai đoạn: 1993-1995, 1996-1998 và 1999-2003 Giai đoạn 1993-1995, các loại thuốc chloramphenicol, gentamycin và nitrofurazone không bị Salmonella kháng; penixillin, streptomycin và sunfaguanidin có số lượng mẫu kháng cao (32-36%)
Trong giai đoạn 1996-1998, Salmonella có tính kháng với chloramphenicol, gentamycin và nitrofurazone Các loại thuốc có tỷ lệ kháng thấp (6-27%) gồm: ampicillin, biomycin, kanamycin, neomycin và tetramycin Sulfaguanidin penicillin và streptomycin có tỷ lệ bị vi khuẩn Salmonella kháng cao (36-56%)
Giai đoạn 1999-2003, các chủng Salmonella có tỷ lệ kháng cao với streptomycin
(50%), erythromycin (81,35%), ampicillin (93,75%) và nhạy cảm mạnh với norfloxacin, ciprofloxacin và ceftriaxon [4]
Theo Tô Liên Thu (2004), Salmonella phân lập từ thịt gà với 20 chủng ngẫu nhiên tại Hà Tây và Hà Nội thì chúng đề kháng cao (hơn 60%) với tetracyclin, ampicillin, streptomycin, chloramphenicol, doxycyclin Mức độ kháng thuốc thấp hơn (dưới 15%) với neomycin, gentamycin, norfloxacin Nhiều chủng E coli và Salmonella có đặc tính đa kháng, có những chủng kháng lại 8 loại kháng sinh [15]
Theo thống kê của EMEA (1999), Salmonella phân lập từ thịt gia cầm tại
Bỉ có tỷ lệ kháng với spectinomycin (12%), chloramphenicol (17%), nalidixic acid (27%), ampicillin (36%) và tetracycline (36%)ứ Tại Đức, tỷ lệ Salmonella kháng nhiều hơn 1 loại kháng sinh gia tăng từ 33% (1992) lên 61,2% (1996) Tại
Hà Lan (1994-1999), Salmonella có tỷ lệ kháng với neomycin (1%), trimethoprim (8%), ampicillin (16%), tetracycline (43%) [26]
Cũng theo EMEA (1999), E.coli phân lập từ thịt gia cầm tại Đan Mạch
(1997) có tỷ lệ kháng với nalidixic acid (32%), sulfonamides (64%), không có chủng kháng với enrofloxacin Tại Đức (1992-1996), E.coli có tỷ lệ kháng với gentamycin (10-15%), tetracycline (59-66%), sulfonamides (44-77%), ampicillin
(48-54%) Tại Hà Lan (1981-1992), E.coli có tỷ lệ kháng với tetracycline (63-
Tại Tây Ban Nha (1992-1993), E.coli có tỷ lệ kháng với streptomycin (78%), tetracycline (94%), trimethoprim/ sulfamethoxazole (63%), không có chủng kháng với cefoxitin và cefotaxime [26]
Theo Mastour S Al-Ghamdi (2001), E.coli phân lập từ thịt gà có tỷ lệ kháng với chloramphenicol (54,5%), trimethoprim/ sulfamethoxazole (84,7%), gentamycin (84,7%), erythromycin (98,5%), tetracycline (99%) [22]
Theo NARMS (national antimicrobial resistance monitoring system)
(2002), 1070 chủng E.coli phân lập từ 1074 mẫu thịt khảo sát có tỷ lệ đề kháng với gentamycin (14%), ampicillin (19%), sulfamethoxazole (28%), streptomycin
Theo Yashpal S Malik (2002), E coli có tỉ lệ đề kháng thấp với ceftiofur
(3,8-8%), enrofloxacin (4-9,7%), and trimethoprim sulfa (7,5-19,2%), đề kháng cao với gentamicin (48,4-69,2%), spectinomycin, tetracycline, sulfadimethoxine
(88,7-100%) Salmonella đề kháng thấp với trimethoprim (0-14,3%), ceftiofur (0-
20,8%)ứ, tỷ lệ đề khỏng ngày càng cao với gentamicin (21,4-61,1%), tetracycline
A study conducted by Theo H I Kim (2002) analyzed 631 isolates of E coli and Salmonella spp from chicken meat collected between January 1999 and December 2002 in Ansan, South Korea The results showed that E coli exhibited high resistance rates to kanamycin (44%), ciprofloxacin (51%), amoxicillin (78%), and tetracycline (91%) In contrast, Salmonella spp demonstrated higher resistance rates against kanamycin (44%) and tetracycline (55%), but lower resistance towards ciprofloxacin (6%) and amoxicillin (77%).
Kháng sinh và tính kháng thuốc của vi khuẩn
Thuốc kháng sinh
Theo quan niệm ngày nay, thuốc kháng sinh là tất cả những chất hóa học có khả năng kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn hoặc tiêu diệt vi khuẩn bằng cách tác động chuyên biệt lên một giai đoạn chuyển hóa cần thiết của vi sinh vật Kháng sinh có nhiều nguồn gốc khác nhau, có thể tổng hợp bằng phương pháp hoá học hay ly trích từ động vật, thực vật hoặc vi sinh vật
Một số thuốc kháng sinh có cấu trúc hoá học giống nhau, do đó chúng có chung cơ chế tác động và hoạt phổ tương tự nhau Dựa trên cấu trúc hóa học, người ta có thể xếp kháng sinh theo các nhóm như sau:
- Nhóm β- lactam: penicillin, ampicillin, amoxicillin, cephalosporin…
- Nhóm Tetracyclines: tetracyclin, oxytetracyclin, chlortetracyclin…
- Nhóm Aminoglycosides: gentamycin, kanamycin, streptomycin…
- Nhóm kháng sinh gần gũi với Macrolides: lycomycin, virginiamycin…
- Nhóm Polypeptid: colistin, bacitracin, polymycin…
- Nhóm Quinolones: enrofloxacin, flumequin, norfloxacin, acid nalidixic…
Ngoài ra còn có một số nhóm khác như Glycopeptid, Nitrofuran…
Bên cạnh việc phân loại theo cấu trúc hóa học, ta cũng có thể phân loại kháng sinh theo tác động kháng khuẩn:
Nhóm kháng sinh kiềm khuẩn: tetracyclin, macrolid, phenicol, sulfamid, licosamid…
- Nhóm kháng sinh diệt khuẩn: β- lactam, amynosid, quynolones, polypeptid, ryfamycin…
- Ức chế tổng hợp vách tế bào: gồm các kháng sinh: penicillin, cephalosporins, bacitracin, cycloserins, vancomycin, rostocetin…
Khác với tế bào động vật, vi khuẩn có một lớp vỏ cứng bên ngoài gọi là vách tế bào, có nhiệm vụ giữ hình dạng tế bào được nguyên vẹn trước áp lực thẩm thấu cao ở bên trong tế bào Khi sự tổng hợp vách tế bào bị ức chế do tác dụng của thuốc kháng sinh, các vi khuẩn gram (+) biến thành dạng hình cầu không có vách (protoplast) và vi khuẩn gram (-) có vách không hoàn chỉnh
(spheroplast) Những hình thức này làm cho tế bào bị vỡ trong điều kiện có trương lực bình thường
Giai đoạn tác động đầu tiên của thuốc là gắn vào các thụ thể PBP
Thuốc kháng sinh penicillin gắn vào các thụ thể penicillin-binding protein (PBP) trên màng tế bào vi khuẩn Trong số các thụ thể PBP, có một số là enzyme transpeptidase chịu trách nhiệm tổng hợp peptidoglycan, thành phần chính của thành tế bào Khi penicillin liên kết với các thụ thể PBP, nó sẽ ức chế enzyme transpeptidase, ngăn chặn quá trình tổng hợp peptidoglycan và từ đó làm tổn thương khả năng xây dựng thành tế bào của vi khuẩn.
Giai đoạn tiếp theo có liên quan đến việc hoạt hóa các men tự tiêu
(autolytic enzymes) gây ra sự ly giải của tế bào ở môi trường đẳng trương
(isotonic) Trong môi trường ưu trương, những tế bào bị biến thành protoplast hay soheroplast chỉ được bao bọc bởi một màng nên rất dễ bị vỡ
- Ức chế nhiệm vụ của màng tế bào: gồm nhóm thuốc chống nấm imidazol, polymycin, nistatin, amphotericin B, colistin…
Tế bào chất của tất cả tế bào sống đều được bao bọc bởi một màng tế bào chất Màng này được xem như một hàng rào có khả năng thẩm thấu chọn lọc, thực hiện chức năng vận chuyển chủ động và như vậy kiểm soát các thành phần ở bên trong tế bào Nếu sự toàn vẹn chức năng của màng tế bào chất bị phá vỡ thì những đại phân tử và những ion sẽ thoát ra khỏi tế bào làm tế bào chết
- Ức chế sự tổng hợp protein: gồm các họ chloramphenicol, erythromycins, lincomycins, tetracilines
Vi khuẩn có ribosom 70 S, gồm 2 đơn vị là 30 S và 50 S Kháng sinh có thể gắn lên các đơn vị này để ngăn cản sự tạo thành polysom trong dịch mã
- Ức chế tổng hợp acid nucleic: Kháng sinh tác động vào quá trình sao chép ADN (nhóm quinolones), ức chế sao mã ARN (nhóm rifampicin) và ức chế tổng hợp các nucleotid (nhóm sulfamid và trimethoprim).
Tính kháng thuốc của vi khuẩn
Sự đề kháng kháng sinh của vi khuẩn bao gồm đề kháng tự nhiên và đề kháng thu nhận Đề kháng tự nhiên là do bản chất nội tại của vi khuẩn và qua trung gian nhiễm sắc thể Đề kháng thu nhận là trường hợp vi khuẩn trước đây nhạy cảm với kháng sinh thế nhưng sau một thời gian tiếp xúc với kháng sinh thì nó trở nên đề kháng với kháng sinh đó Nguyên nhân của đề kháng thu nhận là do đột biến nhiễm sắc thể hoặc do sự thu nhận gen mã hóa đề kháng từ bên ngoài qua plasmid hoặc tranposon
Cơ chế đề kháng kháng sinh của vi khuẩn có thể do một trong những cơ cheá sau:
- Thay đổi tính thấm đối với kháng sinh:
Dựa vào việc làm biến đổi màng tế bào vi khuẩn, dẫn đến làm thay đổi khả năng kháng sinh thấm vào hoặc thoát ra khỏi tế bào và làm cho kháng sinh không đến được vị trí đích phù hợp Đối với β- lactam là sự thay đổi ống dẫn protein (porins) của vi khuẩn gram (-) để giảm kháng sinh đi vào tế bào Đối với aminoglycosides thì làm giảm áp lực di chuyển proton, giảm kháng sinh đi vào tế bào Đối với tetrecyclines, erythromycin làm tăng thải kháng sinh khỏi tế bào
- Biến đổi cấu trúc đích đối với kháng sinh:
Antimicrobial resistance mechanisms involve interfering with the access of antibiotics to their target sites Tetracyclines, erythromycin, and aminoglycosides alter ribosome structure, while quinolones modify DNA gyrase Sulfonamides and trimethoprim disrupt enzymes, and β-lactams target penicillin-binding proteins (PBPs).
- Tạo ra enzyme phá hủy kháng sinh:
Vi khuẩn tạo ra enzyme phá hủy hoặc biến đổi phân tử kháng sinh và làm cho kháng sinh mất tác dụng Vi khuẩn có thể tiết ra các enzyme như β- lactamase (làm mất hoạt tính của những kháng sinh nhóm β- lactam), chloramphenicol-acetyl-tranferrase (làm bất hoạt nhóm chloramphenicol), aminoglycoside-modifying (làm bất hoạt nhóm aminoglycoside)
- Thay đổi con đường biến dưỡng:
Vi khuẩn vượt qua các giai đoạn chuyển hóa bị kháng sinh ức chế
Ví dụ: Enterococci đề kháng trimethoprim/ sulfamethoxazole bằng cách sử dụng folic acid mà không cần tổng hợp folic acid
Bảng 2.1: Cơ chế kháng kháng sinh của Enterobacteriaceae [7]
Kháng sinh Cơ chế thường gặp Cơ chế khác β- lactam
Biến đổi porin Biến đổi penicillin- binding-protein β- lactamase Giảm lực chuyển proton
ESBL (extended spectrum β- lactamase) Aminoglycosides
Giảm tính thấm Biến đổi porin Enzyme biến đổi kháng sinh Quinolon Biến đổi DNA gyrase Biến vận chuyển qua màng ngoài Tetracyclines Tăng thải
Sulfamethoxazole Biến đổi enzyme đích
Tình hình nhiễm vi khuẩn trong thực phẩm
Năm 2002, thú y thành phố đã thực hiện xét nghiệm 1104 mẫu thịt tươi tại các cơ sở giết mổ, trạm kinh doanh động vật, đầu mối giao thông và các chợ Kết quả: chỉ có 15,3% số mẫu đạt yêu cầu vi sinh, số còn lại nhiễm E.coli,
Năm 2003, theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, tỷ lệ nhiễm khuẩn trong thịt lợn, thịt gà, thịt bò đã lấy ở chợ Hà Nội là 100%, trong đó nhiễm E.coli (100%), Salmonella (40%) Kết quả xét nghiệm 299 mẫu thịt tươi tại các chợ của Chi cục Thú y Tp HCM đã phát hiện có đến 86,62% mẫu bị nhieãm E.coli [30]
Năm 2004, theo báo cáo giám sát chất lượng thực phẩm thịt của Chi cục
Thú y, qua kiểm nghiệm 107 mẫu thịt tươi tại bảy chợ thuộc khu vực Tp HCM cho thấy tỷ lệ chưa đạt yêu cầu về vi sinh còn khá cao Staphylococcus (56%),
Salmonella (58,8%), E.coli (5,6%) Chủ yếu là do qui trình giết mổ thủ công, điều kiện vận chuyển, bảo quản, kinh doanh trên thị trường còn nhiều hạn chế, chưa đảm bảo yêu cầu vệ sinh [30]
Năm 2005, kết quả xét nghiệm của Chi cục Thú y Tp HCM cho thấy các mẫu thịt gà trong số 1,5 tấn thịt gà hư thối bị bắt giữ ở quận Tân Bình tháng 4-
2005 của cơ sở Trường An đều không đạt tiêu chuẩn vệ sinh về vi sinh vật Cụ thể là nhiễm vi khuẩn Salmonella, E.coli, Staphylococcus aureus [29]
Theo Nguyễn Duy Nam (2005), tỷ lệ nhiễm vi sinh vật trên thịt gà tươi bán tại các chợ và siêu thị ở Tp HCM là E.coli (100%), Salmonella (9,75%) [12]
Khảo sát của Chi cục Thú y về tình trạng ô nhiễm vi sinh vật trong thịt và sữa tại một số điểm giết mổ, chợ, cửa hàng kinh doanh ở Hà Nội và thành phố
Hồ Chí Minh năm 2005 cho thấy: tình hình ô nhiễm vi sinh vật ở thịt và sữa là đáng lo ngại Tỷ lệ mẫu thịt (gà, bò, lợn) không đạt tiêu chuẩn về cả 4 chỉ tiêu vi sinh vật (E.coli, Coliforms, Salmonella, Clostridium) ở địa bàn Hà Nội là 81,3%, ở Tp HCM là 32% [2]
Theo B M Hang’ombe (1997), kết quả khảo sát 521 mẫu thử thịt gà tươi tại các siêu thị ở Lusaka (Zambia) cho thấy tỷ lệ nhiễm E.coli là 41,7% (217 mẫu), Salmonella là 20,5% (107 mẫu) Các chủng Salmonella phân lập được gồm
Salmonella enteritidis, Salmonella infantis và Salmonella gallinarum [18]
Năm 1999, một nghiên cứu ở Hàn Quốc cho thấy 25,9% mẫu thịt gà bị nhiễm Salmonella Ở Hà Lan, 23% thịt heo được kiểm tra bị nhiễm Salmonella spp [29]
Năm 2001, nghiên cứu của Swanen Burg và cộng sự cho thấy 26% thịt heo được kiểm tra bị nhiễm Salmonella [28]
Theo Yashpal S Malik và cộng sự (2002) trong một nghiên cứu trên gà tây ở Minnesota từ năm 1998 đến năm 2002 cho thấy tỷ lệ nhiễm E.coli là 58,4%
(191/ 326 mẫu thử), Salmonella spp là 58,6% (87/ 326 mẫu thử) [27]
Theo K R Forward (2002) khảo sát trên 75 mẫu cánh gà tươi ở Nova
Scotia (Canada), tỷ lệ nhiễm E.coli (57,3%) và Salmonella (7%) [21]
Theo thống kê ở Mỹ, hàng năm có khoảng 4.000 trường hợp bị bệnh do thực phẩm nhiễm Salmonella spp [31]
Vi khuaồn trong thũt
Escherichia coli (E.coli)
2.4.1.1 Lịch sử, phân loại và sự phân bố:
Năm 1885, tại Munich, Theodor Escherich trong luận văn “Vi khuẩn đường ruột của trẻ em sơ sinh và trẻ em” đã nêu tên đầu tiên của vi khuẩn này là Bacterium coli commune
Năm 1889, người ta gọi nó là Escherichia để kỷ niệm người có công phát hieọn
Năm 1895, người ta gọi nó là Bacillus coli
Năm 1896, người ta gọi nó là Bacterium coli Đến năm 1991, trong quyển “Sổ tay y học nhiệt đới”, vi khuẩn này được gọi tên chính thức là Escherichia coli
Theo hệ thống phân loại của Bergey, E.coli thuộc
Giới: Bacteria Ngành: Proteobacteria Lớp: Gamma Proteobacteria Họ: Enterobacteriaceae Gioáng: Escherichia Loài: E.coli
Tên khoa học là: Escherichia coli
Vi khuẩn E.coli có nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc Vi khuẩn nhiễm vào đất, nước… từ phân của động vật Nếu trong quá trình giết mổ, chế biến, phân phối, bảo quản, vận chuyển thịt động vật mà các sản phẩm này không đảm bảo vệ sinh thì tỷ lệ nhiễm E.coli sẽ rất cao và gây ngộ độc cho người tiêu dùng
E.coli có dạng trực khuẩn, gram âm, hai đầu tròn, thường đứng riêng lẻ, đụi khi tạo thành chuỗi ngắn Kớch thước trung bỡnh 0,5 àm x 1-3 àm Vi khuẩn có giáp mô mỏng, có lông quanh thân, có khả năng di động nhờ tiên mao quanh tế bào, không tạo bào tử, loại có độc lực thì có capsul, loại không độc lực không có capsul Một số loài có lông bám (pili)
E.coli là vi khuẩn hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi Nhiệt độ thích hợp là 37 0 C nhưng cũng có thể mọc trên 40 0 C, pH thích hợp 7,2-7,4
Trên môi trường NA: E.coli tạo khóm tròn ướt dạng S (smooth) màu trắng đục Để lâu, khóm trở nên khô nhăn dạng R (rough), kích thước khóm 2-3 mm
Trên môi trường BA: khuẩn lạc có dạng tròn gọn, trơn láng, màu trắng đục ở phần tâm, đường kính 1-2 mm, có chủng gây dung huyết, có chủng không
Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt như EMB: tạo khóm tròn gọn, có màu tím ánh kim, trên MC, Endo, SS: tạo khóm màu hồng đỏ, trên BGA: tạo khóm có màu xanh lá mạ, trên KIA hay TSI: tạo màu vàng/ vàng (phần nghiêng và phần đứng đều có màu vàng)
Trên môi trường canh thịt: vi khuẩn phát triển tốt, làm đục đều môi trường, để lâu sẽ lắng cặn, canh có mùi phân thối
Trên các môi trường đường: lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose, lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen
Phản ứng dương tính: Indol, MR, LDC, hoàn nguyên nitrat thành nitric
Phản ứng âm tính: H2S, VP, citrate
2.4.1.5 Kháng nguyên và độc tố:
E.coli có cấu trúc kháng nguyên phức tạp, chia làm 4 loại: O, H, K, F
Kháng nguyên O là kháng nguyên vách tế bào, có cấu tạo lipo-polysaccharid-protein Đặc điểm của kháng nguyên O là bền với nhiệt, kháng cồn 50%, nhưng bị hủy bởi formol 5% Kháng nguyên O chia làm 4 nhóm lớn với 164 loại, có tác dụng gây sốt, làm giảm rồi tăng bạch cầu, gây đông máu nội mạch lan tỏa, có thể dẫn đến tử vong.
Kháng nguyên H (flagella antigen): là kháng nguyên chiên mao, cấu tạo là protein Không bền với nhiệt, bị hủy bởi cồn 50%, không bị hủy bởi formol
5% Gồm 50 loại và ít gây bệnh
Kháng nguyên K (surface actigen): là kháng nguyên nang, giúp vi khuẩn bám vào tế bào biểu mô trước khi xâm lấn (cơ quan tiêu hóa, niệu), cấu tạo là polysaccharid Kém chịu nhiệt Chia thành 4 nhóm lớn với trên 100 loại, trong đó loại có giáp mô gây ngộ độc mạnh hơn loại không có giáp mô
Kháng nguyên F (lông bám): đặc thù cho một số loại E.coli gây bệnh, giúp cho vi khuẩn bám vào niêm mạc ruột và tiết độc tố
E.coli có 2 loại độc tố:
Nội độc tố: vi khuẩn tiết nội độc tố (enterotoxin) gây bệnh tiêu chảy, gồm
2 loại chịu nhiệt ST (thermostable hay heat labile toxin) và không chịu nhiệt LT
(thermolabiles hay heat stable toxin)
- Độc tố LT (gồm LT1, LT2): hoạt hóa men adenyl cyclase trong tế bào ruột làm gia tăng yếu tố C.AMP (cyclic adenozin 5’monophosphat) Yếu tố này sẽ kích thích ion Cl - và bicarbonat tách khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na + bên trong tế bào Hậu quả gây tiêu chảy mất nước
- Độc tố ST (gồm STa, STb): hoạt hóa men guanyl cyclase làm tăng yếu tố C.GMP (cyclic guanozin 5’monophosphat) bên trong tế bào dẫn đến kích thích bài tiết muối và nước gây ra tiêu chảy
Ngoại độc tố: vi khuẩn tiết ngoại độc tố (verotoxin) gây tan huyết và phù thủng, tác động đến hệ thần kinh
E.coli là loại vi khuẩn có sẵn trong đường ruột động vật và người Bình thường, chúng là vi khuẩn thuộc hệ sinh thái ruột không gây bệnh, chỉ gây bệnh khi sức đề kháng của người và động vật yếu Chúng gây ngộ độc cho người khi người ăn phải thức ăn bị nhiễm một lượng lớn vi khuẩn và vi khuẩn này tiết ra độc tố Vi khuẩn theo thức ăn vào ruột Ở đây, chúng sẽ tiết ra độc tố, độc tố thấm vào máu gây ngộ độc Biểu hiện thường là tiêu chảy, sốt cao, mệt mỏi, chân tay co quắp, nặng hơn là viêm dạ dày Thời gian ủ bệnh dài 8-44 giờ, tùy thuộc dòng E.coli gây bệnh Ngoài ra, E.coli còn gây nhiễm bộ phận niệu sinh dục, viêm màng bụng, nhiễm trùng huyết ở người, gây phân trắng ở heo con, bò con…
Dựa vào tính kháng nguyên và tính gây bệnh, người ta chia E.coli làm các nhóm điển hình sau:
- Enterotoxigenic E.coli (ETEC): gồm các chủng E.coli có lông bám và một số chủng khác Các chủng này sản sinh nội độc tố LT và ST Hai loại độc tố này gây tiêu chảy ở heo sơ sinh, heo cai sữa, tiêu chảy ở trẻ em Liều gây bệnh ở người lớn được ước lượng tối thiểu là 10 8 tế bào Những nghiên cứu về
ETEC chỉ thực hiện khi thức ăn nghi nhiễm lượng E.coli cao
- Enteropathogenic E.coli (EPEC): là nguyên nhân chính gây bệnh tiêu chảy cho trẻ em dưới 2 tuổi Không sản sinh độc tố enterotoxin Liều ước lượng gây bệnh đối với người lớn là 10 6 tế bào Cơ chế gây bệnh chưa rõ Các týp thường gặp: O44, O124…
- Enteroinvasine E.coli (EIEC): gây bệnh nhờ khả năng xâm lấn và phá hủy mô tế bào Do đó nhóm này còn có tên gọi là E.coli xâm lấn Các chủng
E.coli thuộc nhóm này xâm nhập vào tế bào của phần dưới ruột non, đi sâu vào lớp niêm mạc ruột gây tróc và loét niêm mạc ruột, gây tiêu chảy có đàm lẫn máu Các chủng thuộc nhóm EIEC sống kị khí, không di động, có thể lên men hay không lên men đường lactose và có phản ứng LDC âm tính Các týp thường gặp: O125, O144…
- Enterohemorrhagic E.coli (EHEC): nhóm này còn được gọi là E.coli tấn công và tiêu hủy (attaching effacing E.coli (AEEC)) hay verocytoxin producing E.coli (VTEC) EHEC đặc trưng bởi khả năng sản sinh độc tố verotoxin và shigatoxin Các độc tố này tấn công vào tế bào ruột và hủy hoại chúng, gây tác động đến hệ thần kinh Ở người, nhóm EHEC gây hội chứng viêm đại tràng xuất huyết (hermorhagie colilis) Ở heo, chúng làm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù (ederma) Các týp thường gặp: O26, O111,
O113, O157:H7… Liều gây bệnh của O157:H7 là 10-100 tế bào
E.coli sẽ chết ở nhiệt độ 55 0 C sau 1 giờ, chỉ tồn tại ở 60 0 C trong vòng 10-
Nhiệt độ đông lạnh trong 2 giờ có thể tiêu diệt tới 95% vi khuẩn trong 15 phút (tối đa 30 phút) E.coli rất nhạy cảm với các hóa chất và chất sát trùng như acid formic, clorua thủy ngân, acid ferric và formol Những chất này có khả năng diệt E.coli chỉ trong vòng 5 phút.
Nhạy cảm với các loại kháng sinh như cloramphenicol, streptomycin, sulfamid…
Thời gian ủ bệnh dài 8-44 giờ, tùy thuộc dòng E.coli gây bệnh
Người trúng độc thấy đau bụng dữ dội, đi phân lỏng nhiều lần trong ngày
NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THỰC HIỆN 3.1 Thời gian và địa điểm
Vật liệu dùng trong nghiên cứu
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm:
- Máy trộn vortex mixer, máy dập mẫu Stomatcher
- Tủ cấy vô trùng, cân định lượng, tủ lạnh thường, tủ ấm…
- Erlen 250 ml, pipet (1ml, 2ml, 5ml, 10ml), ủúa petri ị 90-100 mm
- Ống nghiệm, que cấy, giá đựng ống nghiệm, khay đựng mẫu…
3.2.2 Thuốc thử và môi trường:
Môi trường kiểm tra E.coli: BGBL, EMB
Môi trường kiểm tra Salmonella: Selenit Cystein, Rappaport Vassiliadis,
Môi trường thực hiện kháng sinh đồ: MHA
Môi trường tăng sinh và thử phản ứng sinh hóa: pepton đệm, nước muối
9‰, KIA, NB, Clark Lubs, Simmon Citrate, LDC, Ure, Api 10 S…
Một số loại thuốc thử: Kovac’s, Methyl red, dung dịch KOH 40%, α – naphton, thuốc nhuộm gram… Đĩa giấy kháng sinh:
Bảng 3.1: Kháng sinh dùng cho thử nghiệm với E.coli [23]
STT Kí hiệu Tên kháng sinh Nồng độ
Bảng 3.2: Kháng sinh dùng cho thử nghiệm với Salmonella [23]
STT Kí hiệu Tên kháng sinh Nồng độ
Vật liệu, môi trường, thuốc thử trên được cung cấp bởi Bio Rad, Bio
Phương pháp thực hiện
Các bước chính trong thực nghiệm:
- Phân lập vi khuẩn Salmonella và E.coli theo phương pháp nuối cấy cổ ủieồn cuỷa AFNOR (association franỗaise de normalisation)
- Chọn khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc của từng vi khuẩn, xác định tính chất sinh hóa và đặc trưng của loài
- Xác định khả năng kháng thuốc của vi khuẩn theo phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch Kirby Bauer và biện luận kết quả theo hướng dẫn của NCCLS
- Xử lý số liệu theo thống kê Chi-square
Mẫu thịt gà tươi được lấy trực tiếp và ngẫu nhiên tại các địa điểm khảo sát vào buổi sáng Mẫu được cho vào bao polyetylen vô trùng có ghi đầy đủ những thông tin cần thiết liên quan đến mẫu (số thứ tự, địa điểm, thời gian lấy mẫu) Sau đó cho bao gói mẫu vào bình trữ lạnh và vận chuyển nhanh về phòng xét nghiệm càng sớm càng tốt
3.3.2 Kiểm tra E.coli từ mẫu thực phẩm : [24]
Dựa vào một số tính chất đặc trưng của vi khuẩn E.coli như phát triển được trong môi trường có muối mật, có khả năng sinh indol, sinh acid (phản ứng
Vi khuẩn E coli nghi ngờ được xác định bằng phản ứng sinh hóa qua thử nghiệm IMViC Vi khuẩn này không tạo ra aceton (phản ứng VP âm), không sử dụng citrat làm nguồn cacbon duy nhất (phản ứng citrat âm), có khả năng lên men đường lactose và glucose sinh hơi Phép thử MPN được sử dụng để định lượng số lượng E coli có trong mẫu thực phẩm.
Sử dụng dao, kéo và kẹp vô khuẩn đã khử trùng bề mặt bao gói để mở bao bì bên ngoài của mẫu Đặt mẫu thịt lên khay inox vô trùng Sử dụng dao, kéo và kẹp vô trùng để cắt mẫu trong điều kiện vô trùng Chọn mẫu ngẫu nhiên và cân.
25g thịt cho vào túi polyetylen vô trùng, rót thêm 225ml dung dịch pepton đệm
Cho túi polyetylen này vào máy dập mẫu stomatcher, dập trong 60 giây ở tốc độ trung bình để mẫu thử đạt được sự đồng nhất Sau cùng, ta được dung dịch mẫu thử 10 -1
Từ dung dịch mẫu thử 10 -1 , ta pha loãng dần thành dung dịch có nồng độ
10 -2 , 10 -3 bằng cách hút 1ml dung dịch mẫu thử pha với 9ml dung dịch NaCl 9‰, ta thu được dung dịch 10 -2 , tương tự, hút 1ml dung dịch 10 -2 pha với 9ml dung dịch
NaCl 9‰, ta thu được dung dịch 10 -3
Hút 1ml dung dịch mẫu thử 10 -2 , 10 -3 , 10 -4 vào các ống nghiệm có chứa sẵn 10ml canh BGBL Mỗi nồng độ cấy 3 ống Sau đó đem ủ ở 45 0 C/ 24-48 giờ
Từ các ống BGBL cho kết quả dương tính: có sinh hơi trong ống durham và vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, ta cấy canh trùng sang môi trường
EMB Ủ ở 37 0 C/ 24 giờ để tìm khuẩn lạc E.coli giả định
Chọn các khuẩn lạc tròn dẹt, hình đĩa, có màu tím ánh kim đem nhuộm gram Sau khi xác định đúng kết quả nhuộm gram, cấy khuẩn lạc sang môi trường KIA, NB, Clark Lubs, Simmon Citrate Ủ các môi trường trên ở 37 0 C/ 24 giờ rồi quan sát kết quả
Ta có thể kết luận là vi khuẩn E.coli nếu đạt các kết quả sau:
- Nhuộm gram: trực khuẩn, gram (-), hai đầu tròn
- Trên KIA: vàng/ vàng (phần đứng và phần nghiêng của thạch đều màu vàng)
- Trên môi trường NB: nhỏ thuốc thử Kovac’s thấy tạo vòng màu hồng đỏ (phản ứng indol dương tính)
- Trên môi trường Clark Lubs: thử phản ứng MR (dương tính: môi trường màu đỏ) và VP (âm tính: không chuyển màu môi trường)
- Trên môi trường Simmon Citrate: phản ứng citrate âm tính: môi trường vẫn giữ màu xanh lục
25g mẫu + 225ml pepton đệm 1ml 10 -1
Có sẵn 9ml NaCl 9‰/ ống
1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
2 Hút 1 ml mẫu thử vào ống có sẵn
10ml BGBL, moãi noàng độ 3 ống Ủ ở 45 0 C/ 24-48 giờ (+) (+) (+) (+) (+) (-) (-) (-) (-)
3 Chọn ống nghiệm (+) caỏy sang ủúa EMB Ủ ở 37 0 C/ 24 giờ
4 Chọn khóm tím ánh kim nhuộm gram và thử phản ứng sinh hóa Kết quả:
Nhuộm gram: Trực khuẩn, gram (-), hai đầu tròn
KIA: vàng/vàng, Indol (+), MR (+), VP (-), Citrate (-)
Sơ đồ 3.1: Kiểm tra vi khuẩn E.coli trong thực phẩm
3.3.3 Kiểm tra Salmonella từ mẫu thực phẩm: [25]
Dựa vào một số tính chất đặc trưng của vi khuẩn Salmonella như có khả năng di động, lên men sinh hơi glucose, không lên men lactose, không phân giải ure, sinh H2S để kiểm tra Salmonella trong thực phẩm bằng các thử nghiệm sinh hóa
Salmonella thường hiện diện ít hơn vi khuẩn khác trong mẫu thử nên phải tăng sinh trong môi trường có chất ức chế tạp khuẩn và sau đó sử dụng môi trường chọn lọc để phân lập và xác định
Chuẩn bị mẫu: dùng dao, kéo và kẹp vô khuẩn để mở bao gói bên ngoài mẫu sau khi đã khử trùng bề mặt bao gói Đặt mẫu thịt lên khay inox vô trùng, dùng dao, kéo và kẹp vô khuẩn cắt mẫu trong điều kiện vô trùng và chọn mẫu ngẫu nhiên Cân 25g thịt cho vào túi polyetylen vô trùng, rót thêm 225ml dung dịch pepton đệm Cho túi polyetylen này vào máy dập mẫu stomatcher, dập trong 60 giây ở tốc độ trung bình để mẫu thử đạt được sự đồng nhất Sau cùng, ta được dung dịch mẫu thử 10 -1
Tiền tăng sinh: từ dung dịch mẫu thử 10 -1 , ta đem ủ ở 37 0 C/ 16 - 18 giờ
Tăng sinh: từ dung dịch mẫu đã ủ trên:
- Hút 1ml dung dịch cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml môi trường Selenit Cystein và đem ủ ở 37 0 C/ 24 giờ
- Hút 0,1ml dung dịch cấy chuyển vào ống nghiệm có chứa sẵn 10ml môi trường Rappaport Vassiliadis và đem ủ ở 43 0 C/ 24 giờ
Phân lập: từ môi trường Selenit Cystein và Rappaport Vassiliadis trên, cấy phân lập canh trùng sang môi trường thạch HE, ủ ở 37 0 C/ 24 giờ Định danh: trên môi trường HE, chọn khuẩn lạc màu xanh, tròn, nhỏ, bờ đều, có tâm đen đem nhuộm gram Sau khi xác định đúng kết quả nhuộm gram, cấy khuẩn lạc sang môi trường KIA, ure, LDC Ủ tất cả môi trường trên ở 37 0 C/
24 giờ rồi quan sát kết quả
Bên cạnh đó, ta có thể xác định thêm một số phản ứng sinh hóa với API
10S (Bio Mérieux sản xuất) để định danh vi khuẩn Đây là hệ thống định danh dành cho các vi khuẩn thuộc nhóm Enterobacteriaceae và một số vi khuẩn gram
(-) khác Nguyên tắc của bộ định danh này là thực hiện 12 thử nghiệm sinh hóa cuỷa vi khuaồn
Ta có thể kết luận là vi khuẩn Salmonella nếu đạt các kết quả sau:
- Nhuộm gram: trực khuẩn, gram (-), hai đầu tròn
- KIA: đỏ/ vàng (phần đứng thạch màu đỏ, phần nghiêng màu vàng), và có màu đen do sản sinh H2S
- Ure (-): môi trường không chuyển màu, vẫn giữ màu vàng
- Lysin decarboxylase (+): môi trường không chuyển màu, vẫn giữ màu tím
Và kết quả từ API 10S cho phép định danh chính xác Salmonella spp
ONPG (-), GLU (+), ARA (+), LDC (+), ODC (+), CIT (+)
H2S (+), URE (-), TDA (-), IND (-), OX (-), NO2 (+)
25g mẫu + 225ml pepton đệm Ủ 37 0 C/ 24 giờ
Rappaport Vassiliadis Selenit Cystein Ủ 43 0 C/ 24 giờ Ủ 37 0 C/ 24 giờ
4 Chọn khóm màu xanh, tâm đen nhuộm gram rồi thử phản ứng sinh hóa:
Nhuộm gram: trực khuẩn, gram (-), hai đầu tròn
KIA đỏ/ vàng, H2S (+), Ure (-), LDC (+) Định danh chính xác Salmonella spp với kết quả API 10 S:
ONPG (-), GLU (+), ARA (+), LDC (+), ODC (+), CIT (+)
H2S (+), URE (-), TDA (-), IND (-), OX (-), NO2 (+)
Sơ đồ 3.2: Kiểm tra vi khuẩn Salmonella trong thực phẩm
Phương pháp kháng sinh đồ trong khoá luận này được chúng tôi thực hiện theo phương pháp khuếch tán kháng sinh trong thạch Kirby Bauer trên môi trường MHA theo chuẩn mực của NCCLS (phiên bản tháng 1 năm 2005) Đĩa kháng sinh là những đĩa giấy vô khuẩn có đường kính 6mm được tẩm một dung dịch thuốc kháng sinh với nồng độ tiêu chuẩn Đĩa kháng sinh phải được bảo quản trong các ống có chứa chất chống ẩm ở nhiệt độ dưới 4 0 C Khi chuẩn bị dùng thì lấy ra và để ở nhiệt độ phòng
Các tiêu chuẩn chính để lựa chọn kháng sinh thử nghiệm:
Chọn kháng sinh đại diện cho nhóm có cùng phổ hoạt động
Tùy thuộc vào loại vi khuẩn thử nghiệm
Tùy theo chiến lược và chính sách sử dụng kháng sinh ở từng vùng, ủũa phửụng
Kháng sinh được tẩm vào đĩa giấy với nồng độ xác định sẽ khuếch tán ra mặt thạch xung quanh và ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn Đường kính vòng kháng khuẩn bị ức chế sẽ thể hiện tính nhạy cảm của vi khuẩn đối với kháng sinh Trường hợp không có vòng ức chế có nghĩa là vi khuẩn đề kháng với kháng sinh
Môi trường dùng trong phương pháp này là môi trường MHA được chế trong hộp petri nhựa loại þ 90 mm, môi trường thạch có bề dày 4 mm để đảm bảo kháng sinh khuếch tán đồng đều Môi trường sau khi pha chế chứa trong các túi plastic và bảo quản trong tủ lạnh Trước khi dùng phải lấy ra khỏi tủ lạnh và để cho đến khi đạt được nhiệt độ phòng
Mức độ nhiễm khuẩn trên thịt gà tại các cơ sở giết mổ
Kết quả khảo sát được chúng tôi biện luận theo TCVN 7046:2002 về tiêu chuẩn vệ sinh của thịt, sản phẩm thịt và quyết định của Bộ Y tế 867/1998 (ban hành ngày 4-4-1998) yêu cầu về vệ sinh thịt tươi và sản phẩm chế biến trong thịt tươi đối với lương thực thực phẩm Trong đó, giới hạn cho phép với E.coli = 10 2 / g thực phẩm và Salmonella = 0/ 25g thực phẩm
Bảng 4.1: Kết quả kiểm tra E.coli trên thịt gà
Cơ sở Toồng soỏ mẫu Số mẫu không đạt Tỉ lệ
Bảng 4.2: Kết quả kiểm tra Salmonella trên thịt gà
Cơ sở Tổng số mẫu Số mẫu không đạt Tỉ lệ
Kết quả kiểm tra từ bảng 4.1 và 4.2 cho thấy mức độ nhiễm khuẩn E.coli và Salmonella trên thịt gà tại các cơ sở giết mổ đạt tỉ lệ khá cao: E.coli (34/ 42 mẫu - 81%) và Salmonella (21/ 42 mẫu - 50%) gồm 19 chủng Salmonella spp và
2 chủng Salmonella arizonae Trong 42 mẫu thị gà được kiểm tra, tỷ lệ nhiễm
E.coli (81%) cao hơn Salmonella (50%), sự khác biệt này hoàn toàn có ý nghĩa về mặt thống kê (P