Đánh giá tính kháng kháng sinh và các gene độc lực ở một số chủng Staphylococcus aureus được phân lập từ da người

ĐẠI HOC NGUYỄN TÁT THÀNH NGUYEN TAT THANH THỤC HỌC - THỤC HÀNH - THỰC DANH - THỤC NGHIỆP KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC KHĨA LUẬN TĨT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÍNH KHÁNG KHÁNG SINH VÀ CÁC GENE ĐỘC Lực Ở MỘT SỐ CHỦNG Staphylococcus aureus ĐƯỢC PHÂN LẶP TỪ DA NGƯỜI Sinh viên thực hiện: Lê Hoàng Thế Huy MSSV : 1600000785 GVHD : TS Nguyễn Hừu Hùng ThS.Thái Thị Tuyết Trinh TP HCM, 2020 MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN i MỤC LỤC ii TÓM TẮT iv SUMMARY V DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH vi DANH MỤC BẢNG BIẾU vii DANH MỤC CHŨ VIẾT TẮT viii ĐẶT VẤN ĐỀ ix CHƯƠNG TÓNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tông quan vể Staphylococus aureus 1.1.1 Đặc điểm chung Staphylococus aureus 1.1.2 Phân loại khoa học 1.1.3 Đặc tính sinh hóa 1.1.4 Các yếu tố kháng kháng sinh 1.1.5 Các yếu tố độc lực 1.2 Tổng quan bệnh viêm da dị ứng 1.2.1 Bệnh viêm da dị ứng 1.2.2 Triệu chứng viêm da dị ứng 1.3 Các nghiên cứu khoa học 1.3.1 Các nghiên cứu nước 1.3.2 Các nghiên cứu nước CHƯƠNG NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN củu 2.1 Noi thực ii 2.2 Nội dung nghiên cứu 2.3 Vật liệu nghiên cứu 2.3.1 Thiết bị, dụng cụ 2.3.2 Hoá chất thuốc thử 2.4 Phương pháp nghiên cứu 2.4.1 Phân lập định danh aureus phương pháp sinh hóa 2.4.2 Định danh s aureus xác định số gen gây độc sinh học phân từ (PCR) 12 2.4.3 Phương pháp kháng sinh đo 16 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Phân lập Staphylococcus aureus từ da bệnh nhân 18 3.2 Xác định số đặc điểm hình thái sinh hóa chủng s.aureus 19 3.3 Phân tích gene định danh gene mã hóa yếu tố bám dính s aureus phương pháp PCR 22 3.3.1 Nhóm gen bổ sung để định danh chủng s.aureus 22 3.3.2 Nhóm gen mã hóa yếu tố bám dính 23 3.4 Đánh giá tính kháng kháng sinh chủng s.aureus 24 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 27 TÀI LIỆU THAM KHẢO 28 PHỤ LỤC 30 iii TÓM TẤT Đe tài :“Đánh giá tính kháng kháng sinh gen độc lực số chủng Staphyloccocus aureus phân lập tù’ da người” thực từ tháng 10/2019 đen tháng 4/2020 Phịng thỉ nghiệm Sinh hố - Sinh dược - Ký sinh trùng Te bào gốc, Bộ môn Công nghệ sinh học Y dược, Khoa Công nghệ sinh học, Trường đại học Nguyễn Tất Thành toạ lạc 2347 Quốc lộ 1A, phường Trung Mỳ Tây, quận 12, Tp Hồ Chí Minh Đe tài phân lập 19 chùng aureus da người môi trường nuôi cấy chọn lọc xác định đặc diem sinh lý, sinh hóa sinh học phân tử Một số gen mã hóa yếu tố bám dính nhưspữ, clfa, clfb, cua, ebpS, bbp, fnbpA, fnbpB, sdrC, sdrD, sdrE, eap mà vi khuấn sử dụng đe gây bệnh da mơ Ngồi đánh giá tính kháng kháng sinh cho ta thấy đề kháng loại kháng sinh nhạy cảm với so loại kháng sinh Các chủng vi khuẩn sử dụng mơ hình phát trien thuốc kháng s aureus hệ thay dùng kháng sinh trị liệu IV DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Hình 3.1 Hình ảnh test âm dương cùa chủng đối chứng vi 21 DANH MỤC BANG BIÊU Bảng 2.1 Danh mục thiết bị nghiên cứu Bảng 2.2 Danh mục dụng cụ sử dụng nghiên cứu Bảng 2.3 Danh mục hóa chất bà thuốc thử nghiên cứu Bảng 2.4 Thử nghiệm Catalase phân biệt Staphylococci với Pneumococci Streptococci 10 Bảng 2.5 Thử nghiệm tăng truởng lên men Mannitol s aureus với s epidermidis saprophytỉcus 11 Bảng 2.6 Danh sách cặp mồi chu trình nhiệt tương ứng 13 12 Bảng 2.7 Các thành phần phản ứng PCR 15 Bảng 2.8 Bảng tham chiếu xác định tính kháng loại kháng sinh theo nhà sản xuất 17 Bảng 3.1 Danh sách mẫu phân lập s aureus .18 Bảng 3.2 Tổng hợp test sinh hóa nhuộm gram 21 Bảng 3.3 Bảng gen mã hóa yếu tố bám dính s aureus 24 Bảng 3.4 Tính kháng kháng sinh chủng aureus 26 vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẤT s aureus: Staphylococus aureus s epidermidis: Staphylococcus epidermidis s saprophyticus: Staphylococcus saprophyticus MRSA: Methycilin resistance.5 aureus IgG: ImmunoglobalinG SpA: Staphylococal protein clfA: Clumping factor A clfB : Clumping factor B EAP: Extracellular adherence protein PCR: Polymerase chain reaction CFU: Đơn vị đo khuan lạc Colong Forming Unit cna: Collagen adhesin bbp: Sialoprotein-binding protein ebpS: Elastin-binding protein of Staphylococcus aureus fnbpa: Fibronectin-binding protein A fnbpb: Fibronectin-binding protein B sdrC, sdrD, sdrE: Serine aspartate repeat protein viii ĐẶT VẤN ĐÈ Tính cấp thiết cũa đề tài Viêm da dị ứng tình trạng viêm mạn tính da, thường gặp, chiếm tỷ lệ từ 10-20% trẻ em 1-3% người lớn Bệnh thường xuất trẻ em có the kéo dài đến trưởng thành Bệnh biêu bao gồm mụn nước da bị đỏ kèm ngứa Bệnh hay tái phát có liên quan đến mơi trường sống ,vi khuấn ,suy yếu hàng rào bảo vệ da ,yếu tố miễn dịch the Nguyên nhân chủ yếu gây bệnh tăng số lượng tụ cầu vàng aureus, loại vi khuẩn thường trú da gây loại nhiễm trùng người, có khả làm suy yếu hàng rào bảo vệ, có khả bám dính tác động trực tiếp lên hệ thống miễn dịch Khoảng 50% - 60% cá nhân bị nhiễm khuẩn liên tục vinh viền aureus, tỷ lệ nhiễm khuẩn tương đối cao Tỉ lệ người bị viêm da dị ứng có liên quan den s aureus cao so với người bình thường aureus cịn có khả đề kháng kháng sinh cao Tụ cầu vàng kháng nhiều loại kháng kháng sinh oxacillin, ampicillin, cephalosporin the hệ 1, amoxicillin Vì thê, nước phát triển phát triển Việt Nam chi phí sử dụng kháng sinh để điều trị cao Đánh giá gen độc lực liên quan tính bám dính kháng kháng sinh dòng vi khuẩn hướng phát triển liệu pháp điều trị chan đốn xác Vì chúng tối mong muốn thực đề tài: “Đánh giá tính kháng kháng sinh gene độc lực số chủng Staphylococcus aureus phân lập từ da người” Nội dung nghiên cứu: Phân lập dòng aureus từ da người Định danh aureus hình thái vi khuân sinh hóa đặc trưng như: tan huyết, coagulase, catalase, manitol, nhuộm gram IX Xác định gen độc lực sinh học phân tử Đánh giá tính kháng kháng sinh chủng aureus Mục tiêu đề tài Phân lập chủng s aureus da người Xác định số gen độc lực đặc điểm kháng kháng sinh cùa s aureus X Chương Tổng quan tài liệu CHƯƠNG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Staphylococus aureus 1.1.1 Đặc điểm chung Staphylococus aureus Tụ cầu vàng có tên khoa học s aureus, theo tiếng Hy Lạp có nghía chùm nho, hạt s aureus thuộc giống Tụ cầu khuan (Staphylococcus) phát từ sớm phân bố rộng rài tự nhiên, phố biến da người ,là vi khuan gram dương, hình cầu có xu hướng xếp thành cụm trông giống chùm nho, vi khuẩn phát triển điều kiện hiếu khí kỵ khí tuỳ ý, nhiệt độ thích hợp từ 18-40 °C1 1.1.2 Phân loại khoa học Ngành (phylum): Firmicutes Lớp (class): Bacilli Bộ (ordo): Bacillales Họ (familia): Staphylococcacea Chi (genus): Staphylococcus Lồi (species): Staphylococcus aureus 1.1.3 Đặc tính sinh hóa Tụ cầu vàng có hệ thong enzyme phong phú, enzyme dùng chuẩn đoán Coagulase có khả làm đơng huyết tương người động vật đà chống đông Đây tiêu chuẩn quan trọng để phân biệt tụ cầu vàng với tụ cầu khác Coagulase có tất chủng tụ cầu vàng Hoạt động coagulase giống thrombokianase tạo thành “áo fibrinogen” huyết tương Coagulase có loại: loại tiết mơi trường - gọi coagulase tự loại bám vào vách tế bào - gọi coagulase cố định Trên mơi trường thạch máu aureus có khả làm tan huyết, vòng tan huyết phụ thuộc vào chủng chúng có vịng tan huyết hẹp so với đường kính khuẩn lạc Hầu hết s aureus tạo sắc tố vàng thấy rõ sau - ngày ni cấy nhiệt độ phịng Ngồi ra, aureus phản ứng DNAse, phosphatase dương PHỤ LỤC Phụ lục Hình ảnh thu mẫu từ bệnh nhân (H4) (H5) (H7) 10 13 11 15 14 30 (H8) 12 (H10) 16 (Hll) 17 (H12) 21 20 18 24 (H14) 23 (H13) 22 25 26 29 (H15) 30 31 31 Phụ lục Hình ảnh test sinh hóa 32 33 34 Phụ lục 3.Hình ảnh điện di gen mã hóa yếu tố bám dính Gen spa Gen eqp 35 Gen sdrD Gen sdrE 36 37 Gen fhbpA 38 Gen cna Gen bbp 39 Phụ lục Hình ảnh kháng sinh đồ H22 H2I H20 40 41 42 1119 43 44 ... định gen độc lực sinh học phân tử Đánh giá tính kháng kháng sinh chủng aureus Mục tiêu đề tài Phân lập chủng s aureus da người Xác định số gen độc lực đặc điểm kháng kháng sinh cùa s aureus X... cứu Phân lập aureus từ da người Định danh s aureus hình thái phản ứng sinh hoá Khẳng định lại s aureus xác định số gene mã hóa yếu tố bám dính sinh học phân từ Đánh giá khả kháng kháng sinh s aureus. .. bệnh ngồi da mơ Ngồi đánh giá tính kháng kháng sinh cho ta thấy đề kháng loại kháng sinh nhạy cảm với so loại kháng sinh Các chủng vi khuẩn sử dụng mơ hình phát trien thuốc kháng s aureus hệ