thử nghiệm sản xuất chế phẩm bacillus subtilis sinh enzyme proteaza

Khảo sát khả năng tăng sinh khối và sản xuất enzyme proteaza của Bacillus subtilis từ các chủng phân lập được ..... Được sự chấp nhận của khoa Công Nghệ Sinh Học trường Đại học Mở Bán Cô

TOÅNG QUAN

SƠ LƯỢC VỀ ENZYME

Enzyme hay còn gọi là men là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein Enzyme có trong mọi tế bào cơ thể sinh vật Enzyme không những làm nhiệm vụ xúc tác đặc hiệu cho các phản ứng hóa học nhất định trong cơ thể sinh vật ( phản ứng của các quá trình trao đổi chất trong tế bào cơ thể sống ) gọi là “in vivo” mà còn xúc tác cho các phản ứng ngoài tế bào “in vitro”

Enzyme có hiệu suất xúc tác cực kỳ lớn Hoạt độ xúc tác của enzyme lớn gấp hàng trăm, hàng nghìn hoặc hàng triệu lần các chất xúc tác vô cơ và hữu cơ khác

Enzyme có khả năng và hiệu lực xúc tác rất lớn ở nhiệt độ thường và có tính đặc hiệu rất cao nên cấu tạo phân tử của enzyme rất tinh vi và phức tạp

Enzyme được cấu tạo từ các L –α – axit amin , kết hợp với nhau qua liên kết peptit Chúng có phân tử lượng rất lớn từ 20.000 đến 1.000.000 dalton

Enzyme được chia thành hai loại:

Enzyme đơn giản: là enzyme mà trong cấu trúc chỉ có protein thuần tuý Enzyme phức tạp :là enzyme mà trong cấu trúc ngoài protein còn có các thành phần khác Phần protein còn được gọi là apoenzyme, phần không phải protein là coenzyme Coenzyme thường chứa một số vitamin hòa tan trong nước, một số kim loại có vai trò quan trọng trong hoạt động của enzyme Coenzyme có thể liên kết chặt chẽ với apoenzyme hoặc có thể dễ dàng được tách ra

2.1.2.Tính chaát cuûa enzyme Đặc tính quan trọng nhất của enzyme đó là tính đặc hiệu Tính đặc hiệu của enzyme là khả năng xúc tác chọn lọc, xúc tác cho sự chuyển hoá một hay một số chất nhất định theo một kiểu phản ứng nhất định Đặc hiệu phản ứng: mỗi enzyme chỉ có khả năng lựa chọn và xúc tác cho một kiểu phản ứng nhất định Đặc tính cơ chất: mỗi một loại cơ chất có một loại enzyme tương tác tương ứng

Mức độ đặc hiệu cơ chất của các nhóm enzyme khác nhau rất khác nhau, được phân thành các nhóm: Đặc hiệu tương đối: là khả năng của enzyme tác động lên kiểu liên kết hoá học nhất định của phân tử cơ chất mà không phụ thuộc vào cấu tạo của các thành phần tham gia tạo thành các mối liên kết đó Đặc hiệu tuyệt đối: enzyme trong nhóm này có tính đặc hiệu cao, nghĩa là chỉ xúc tác cho sự phân giải một cơ chất hoặc một liên kết nhất định Đặc hiệu nhóm : là khả năng của enzyme tác động lên một kiểu liên kết hóa học với điều kiện một trong hai phần tham gia tạo thành liên kết phải có cấu tạo xác định Đặc hiệu quang học: nếu có hai dạng đồng phân quang học thì enzyme chỉ tác dụng lên một trong hai dạng đồng phân quang học đó

2.1.3.Cơ chế tác động của enzyme

Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa của cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn

E + S – ES- P+ E Trong đó :E :enzyme ;S :cơ chất ;P :sản phẩm

Giai đoạn 1 : enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu Kết quả là tạo thành một phức hợp ES, phức hợp này không bền Phản ứng này xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng

Giai đoạn 2 :cơ chất bị biến đổi, dẫn tới làm căng và phá vỡ các liên kết đồng hoá trị

Giai đoạn 3: sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do Liên kết giữa E và S để tạo thành phức hợp ES là liên kết hidro, tương tác tĩnh điện, tương tác vander waals

Nguyên liệu để thu nhận enzyme rất đa dạng, phong phú nhưng đa phần là các nguồn động vật, thực vật, vi sinh vật

Nguồn động vật: từ tuyến tụy, màng nhày dạ dày động vật có thể thu nhận được các chế phẩm enzyme như amilaza, lipaza, proteinaza, đặc biệt là thu được các enzyme có độ tinh sạch và tính đặc hiệu cao như trypsin, chimotrypsin Tuy nhiên, các enzyme từ nguồn động vật ít được khai thác vì bị hạn chế về số lượng nguyeõn lieọu

Các nguồn thực vật là nguồn cung cấp enzyme dồi dào, chẳng hạn như enzyme papain có trong nhựa đu đủ, enzyme bromelain có trong quả dứa và enzyme ficin có trong cây họ Ficus.

Tuy nhiên đa số các enzyme được thu từ nguồn vi sinh vật do các ưu thế từ vi sinh vật như :

- Các enzyme của vi sinh vật có hoạt tính rất mạnh vượt xa các enzyme của các sinh vật khác

- Vi sinh vật rất nhạy cảm với tác động của môi trường nên khi thay đổi điều kiện sống hoặc tác động bằng các yếu tố khác có thể làm thay đổi dễ dàng hệ enzyme và hoạt tính enzyme của chúng

- Vi sinh vật sinh sản cực kỳ nhanh chóng, có thể thu đựơc một khối lượng tế bào lớn trong khoảng thời gian rất ngắn

- Phần lớn thức ăn để nuôi cấy vi sinh vật là dễ kiếm và rẻ tiền

- Có thể dễ dàng điều khiển các điều kiện tối ưu trong quá trình nuôi cấy để có thể thu được hiệu suất cao trong sản xuất

- Hệ enzyme vi sinh vật rất phong phú

- Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và phát triển rất ngắn

- Sản xuất enzyme vi sinh vật có thể thực hiện ở qui mô công nghiệp

Quá trình sinh tổng hợp enzyme là một quá trình rất phức tạp Cơ chế của quá trình gồm bốn giai đoạn :

✶Vận tải acid amin đã được hoạt hoá đến riboxom để tổng hợp protein

✶Sắp xếp các acid amin trên khuôn ARN thông tin và hình thành liên kết peptit

✶Giải phóng mạch polypeptit đã được tổng hợp và thiết lập cấu trúc không gian của phân tử enzyme đặc hiệu trong không gian 3 chiều.

ENZYME PROTEAZA

2.2.1 Sơ lược về lịch sử

Protease, hay peptit-hydrolaza, là một loại enzyme đóng vai trò thúc đẩy quá trình phân hủy protein và polypeptit Quá trình này tạo ra các sản phẩm bao gồm axit amin, peptit và polypeptit chuỗi ngắn, với tốc độ và thời gian thủy phân phụ thuộc vào từng loại enzyme cụ thể.

Các nghiên cứu về enzyme tiêu hóa là lĩnh vực sớm nhất trong nghiên cứu về protease Ngay từ thế kỷ 18, nhà tự nhiên học người Pháp Réaumur đã tiến hành thí nghiệm đơn giản mà thông minh, phát hiện dịch dạ dày của chim ăn thịt có khả năng tiêu hóa thịt Dù vậy, phải mất hơn 30 năm sau đó các enzyme này mới được phân lập thành công.

Các proteaza thực vật được phát hiện muộn hơn Năm 1874, Group – Besanes công bố đã thu nhận được proteaza từ hạt của một loại đậu(ù Trích dẫn bởi Lê Ngọc Tú, enzyme vi sinh vật tập 1, năm 1982 )

Năm 1879, Wurtz được xem là người đầu tiên tách được proteaza thực vật : ông cho rằng các phần khác nhau của cây đu đủ có proteaza khi dùng cồn kết tủa sẽ nhận được chế phẩm ( không tinh khiết ) gọi là papain ( Trích dẫn bởi Lê Ngọc Tú, 1982)

Các proteaza của vi sinh vật mới được chú ý nghiên cứu nhiều từ năm 1950, mặc dù từ năm 1918 – 1919 Waksman đã phát hiện được khả năng phân giải protein của xạ khuẩn ( Trích dẫn bởi Lê Ngọc Tú, 1982)

Từ năm 1950 đến nay, nhờ sử dụng một số phương pháp mới để tinh chế protein và enzyme nên người ta đã tách được các dạng khác nhau của nhiều proteaza

Trong hơn 10 năm nay, số công trình nghiên cứu proteaza vi sinh vật tăng lên đáng kể, những kết quả này đã góp phần mở rộng qui mô sản xuất chế phẩm enzyme và ứng dụng enzyme trong thực tế

Gần đây, các phương pháp thích hợp đã được phát triển để chiết tách các chế phẩm proteaza không hòa tan Phát hiện này mở ra triển vọng lớn lao trong nghiên cứu và ứng dụng của proteaza.

Enzyme proteaza có khá phổ biến ở động vật , thực vật, vi sinh vật, nhưng sự phân bố của chúng không đồng đều ở các loài, các mô và các cơ quan khác nhau

Vi sinh vật có khả năng tổng hợp mạnh proteaza như :

Vi khuaồn :Bacillus subtilis, Bac circulans, Bac cereus, Clostridium perfringens

Xạ khuẩn : Streptomyces griseus, Str rimosus…

Proteases are enzymes that catalyze the hydrolysis of peptide bonds They can be classified as either intracellular (proteases intracellular) or extracellular (proteases extracellular), depending on their location within the cell Proteases extracellular are produced by a variety of microorganisms, including Aspergillus oryzae, Asp niger, Asp flavus, and Mucor pusillus.

Cho đến nay các proteaza ngoại bào được nghiên cứu kỹ hơn nhiều so với proteaza nội bào Một số proteaza ngoại bào đã sản xuất trong qui mô công nghiệp và được sử dụng rộng rãi trong nhiều ngành kỹ nghệ khác nhau trong nông nghiệp, công nghiệp, y học

2.2.3 Chức năng sinh học của proteaza vi sinh vật Đối với hoạt động sống của vi sinh vật thì proteaza ngoại bào và proteaza nội bào có những vai trò khác nhau

Proteaza ngoại bào phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật có thể dễ dàng hấp thụ

Protease nội bào thường là peptidase và một số proteinase Các enzyme này có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào chất, và chỉ được tìm thấy trong môi trường xung quanh khi tế bào bị phá hủy.

2.2.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp proteaza của vi sinh vật

Quá trình sinh tổng hợp enzyme nói chung cũng như tổng hợp proteaza ở vi sinh vật chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác nhau :độ ẩm, nhiệt độ, pH, độ thông khí , thành phần môi trường v.v…

ĐẠI CƯƠNG VỀ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS

Bacillus subtilis được phát hiện đầu tiên trong phân ngựa (1941) bởi tổ chức y Đức chiến đấu ở Bắc Phi Việc điều trị bệnh phải đợi đến những năm 1949 – 1950 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Từ đó, “Subtilistherapie “ có nghĩa là thuốc Subtilis ra đời trị các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, chống tiêu chảy do rối loạn tiêu hoá

Ngày nay vi khuẩn này đã trở nên rất phổ biến, được sử dụng rộng rãi trong y học, trong chăn nuôi , thực phẩm ( Lorie Kramer, 2004; Lê Văn Hiệp, 2004)

Theo khoá phân loại của Bergey vi khuẩn Bacillus Subtilis thuộc :

Họ : Bacillaceae Gioáng : Bacillus Loài : Bacillus subtilis

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi khuẩn bắt buộc ở đường ruột, được phân bố hầu hết trong tự nhiên như : cỏ khô, bụi , đất nước, rau quả , thực phẩm… Tuy nhiên, phần lớn Bacillus subtilis cư trú trong đất, chúng tiết ra các enzyme thủy phaân

Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, gram dương, hiếu khí, kích thước 0,5 – 0,8 àm x 1,8 – 3 àm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, di động, cú 8 – 12 lông, sinh bào tử nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào, kích thước bào tử 0,8 – 1,8 àm phỏt triển bằng cỏch nẩy chồi do sự nứt của bào tử

Phát triển tốt trên môi trường thạch sau 24 – 48h, môi trường nuôi cấy gồm các thành phần cơ bản là nguồn nitơ từ pepton, cao thịt… nguồn cacbon từ glucose và lactose, chất khoáng từ muối K + , Mg ++ và Na +

Môi trường thạch đĩa : khuẩn lạc tròn, nhăn nheo, khô, bờ không đều phân tán rộng, đường kính khoảng 3 – 5 mm, khuẩn lạc màu vàng xám ở giữa xậm, rìa có dạng răng cưa và có hình gợn sóng

Trên môi trường thạch nghiêng, dễ mọc tạo thành đám có màu trắng xám, đôi khi khuẩn lạc có rìa nhăn gợn sóng

Môi trường canh: phát triển làm đục môi trường, tạo thành màng nhăn, lắng cặn, ít hoặc không nhớt

Môi trường thạch khoai tây: phát triển đều, màu vàng trắng, lấm tấm hạt Môi trường gelatin: phát triển và làm tan chảy gelatin sau 24 – 48h , tan chảy mạnh nhất sau 48h

2.3.6 Đặc điểm sinh lý , sinh hoá

Khi nuôi cấy vi sinh vật trên những môi trường dinh dưỡng khác nhau nhưng ở cùng điều kiện nhiệt độ như nhau sẽ cho ta lượng sinh khối khác nhau Dựa vào đặc điểm này để chọn một số môi trường thích hợp để thu sinh khối và chọn được môi trường rẻ tiền nhưng hiệu quả kinh tế cao

Lên men không sinh hơi các loại đường: glucose, mannitol, saccharose, xylose…

Indol (-), VP ( + ), nitrate ( + ), H2S ( - ), NH3 ( + ), catalase ( + ), amilaza ( + ), casein ( + ), citrat ( + ), di động ( + )

Dung huyết: một số dòng gây dung huyết dạng β trên thạch máu ngựa và thỏ do tác động của hemolysin

2.3.7 Đặc điểm sinh học Điều kiện phát triển: hiếu khí, nhiệt độ tối ưu 37 o C, biến thiên từ 12 – 45 o C, thường tấn công vào những hợp chất hữu cơ tạo mùi

Nguồn dinh dưỡng cần thiết cho quá trình hoạt động của vi khuẩn là : C, H,

O, N và vài nguyên tố khoáng khác để:

- Tạo ra những chất là thành phần của tế bào

- Sản sinh ra năng lượng sinh học cần thiết cho các hoạt động sống

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cấu trúc kháng nguyên dạng D và

Bệnh học : đa số chủng Bacillus subtilis không gây bệnh

Sản sinh kháng sinh subtilin và bacitracin có tác dụng ức chế vi khuẩn G+ và G-

2.3.9 Tính chất đối kháng của Bacillus subtilis với một số vi sinh vật gây beọnh

Mỗi loài sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện môi trường khác nhau, sinh khuẩn lạc khác nhau Thay đổi môi trường hoặc các yếu tố môi trường bất lợi tức là làm thay đổi điều kiện sống, làm hạn chế hoặc ức chế sự phát triển của vi sinh vật Thực tế khi môi trường nuôi cấy nấm bệnh có sự hiện diện của Bacillus subtilis với một số lượng lớn sẽ cạnh tranh dinh dưỡng, cạnh tranh không gian sinh sống giữa vi khuẩn và nấm Do vi khuẩn phát triển nhanh hơn ( trong 24 giờ )sẽ sử dụng phần lớn các chất dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra kháng sinh subtilin nên sự sinh trưởng của nấm mốc bị ức chế

2.3.10 Tình hình nghiên cứu và ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn

Trong y học và chăn nuôi:

Trong chiến tranh chống Pháp Bacillus subtilis được các giáo sư Đặng Đức

Trạch, Hoàng Thủy Nguyên ( là các bác sĩ quân y ) đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis để đưa ra chiến trường nhằm giải quyết dịch tiêu chảy

Năm 1949, tại Pháp đã lưu hành thuốc uống dạng ống chứa toàn vi khuẩn

Bacillus subtilis chủng IP 5832, đến năm 1955 có thêm thuốc dạng bột đóng ống và vieân nang

Năm 1962, Guy Albot phát hiện Bacillus subtilis có tác dụng điều trị tiêu chảy do lạm dụng kháng sinh và viêm đại tràng mãn, trộn thêm với các vi khuẩn lên men lactic khác, Bacillus subtilis chữa loạn khuẩn đường ruột rất hiệu quả

1958 -1960: bác sĩ Phạm Ngọc Thạch đã sản xuất đồng loạt chế phẩm

Bacillus subtilis dùng trị bệnh đường ruột

Khoa vệ sinh y học bệnh viện Bạch Mai Hà Nội đã nghiên cứu và sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng điều trị tiêu chảy ở người

Viện bào chế Pharimex Tp.HCM, Viện Pasteur Nha Trang đã nghiên cứu sản xuất thử chế phẩm Bacillus subtilis

1971: Trần Minh Hùng, Lê Thị Ba, Nguyễn Văn Hùng đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dạng viên nuôi cấy trên môi trươ(ng đậu tương, cua

1982: Vũ Văn Ngữ và các cộng sự đã sản xuất thử nghiệm chế phẩm coli_subtyl ( Escherichia coli và Bacillus subtilis ) đã làm giảm tái phát do bệnh tiêu chảy gây ra ở lợn so với phương pháp điều trị bằng kháng sinh, kết quả heo tăng trọng tốt

Ngoài ra Bacillus subtilis còn được phối trộn với một số chủng nấm mốc , nấm men, và một số vi khuẩn khác dùng trong chế phẩm probiotic

Chế phẩm Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm Rhizoetonia solani, Fusarium sp, Pyriculariaoryzae,… và trong công tác bảo vệ nông sản thu hoạch

Trung tâm sinh học thuộc liên hiệp sản xuất hóa chất thuộc bộ công nghịêp nặng Tp.HCM, đã nghiên cứu sản xuất chế phẩm Bactophyl từ Bacillus subtilis để phòng trừ các loại nấm trên rau cải

Hồ Thị Mỹ Hồng , Nguyễn Thanh Bình, trung tâm ứng dụng sinh học Hà Nội đã sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis dùng để phòng trừ nấm gây bệnh trên bắp Ostrinia furnacalis

1940 :Norio Kimura Yokohama đã sử dụng chế phẩm Bacillus subtilis để ngăn chặn sự phát triển và sinh độc tố của chủng nấm mốc Aspergillus flavus, Aspergillus paraciticus

Roman và các cộng sự đã nghiên cứu Bacillus subtilis (ATCC_ 6633,

ATCC_9372 ) làm giảm đi 40 – 50% aflatoxin trong dịch chứa aflatoxin trong vòng

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH ĐỀ TÀI

Thời gian thực hiện đề tài: 6/2005 – 10/2005 Địa điểm thực hiện đề tài: Phòng Thực Hành Vi Sinh, Khoa Chăn Nuôi Thú

Y, Trường Đại học Nông Lâm, Tp.HCM

VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Chủng vi khuẩn Bacillus subtilis được phân lập từ tự nhiên ( phân lập từ đất) Số mẫu đất phân lập: 10 mẫu

3.2.2 Thieỏt bũ duùng cuù thớ nghieọm

Thiết bị: tủ sấy, tủ ấm, nồi hấp tiệt trùng ( autoclave ), máy lắc ngang, máy vortex, cân điện tử, tủ lạnh, kính hiển vi, máy sục khí, máy cất nước, bếp điện…

Dụng cụ: đĩa petri, ống nghiệm, erlen, becher, lame, đèn cồn, ống đong, các loại que cấy, que trang; các loại pipet…

Tất cả dụng cụ thủy tinh dùng để nuôi cấy vi sinh vật phải được xử lý, bao gói và sấy tiệt trùng ở 170 0 C/120 phút

Hoá chất cơ bản: H2O, cồn 70 0 , NaOH 1N, HCl 1%, NaCl…

Hoá chất dùng khảo sát đặc tính sinh hóa: dầu soi kính, xylen, NaOH 40%, α – naphtol 10% trong coàn, HgCl2, HCl, H2O2…

Hoá chất dùng thử hoạt độ enzyme: dung dịch casein 0,1%,dung dịch acid acetic – ethanol

Môi trường giữ giống: môi trường thạch nghiêng NA

Môi trường khảo sát đặc điểm sinh hóa: tinh bột, casein, thạch bán lỏng, gelatin, môi trường lên men các loại đường, nutrient broth, Clark - Lubs, Simmons Citrate Agar

Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza: môi trường casein, casein + glucose

Các môi trường được vô trùng ở điều kiện thích hợp

( Thành phần môi trường được trình bày ở phần phụ lục )

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.3.1 Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis

3.3.1.1.Mẫu phân lập: chúng tôi chọn những mẫu đất ở nơi trồng cây, mẫu đất được lấy ở gần tầng mặt, không lấy ở phần đất sâu

3.3.1.2 Quy trình phân lập (Sơ đồ 3.1)

Giám định đặc tính sinh hóa: catalaza (+), nitrate (+), VP (+), citrate (+), methyred (+), maltose (-)

Phân lập trên môi trường NA

Chọn khuẩn lạc điển hình

Giữ giống trên môi trường NA

Để xác định Bacillus subtilis, tiến hành pha loãng mẫu đất từ 10-1 đến 10-5 Sau đó, nuôi các nồng độ pha loãng 10-3, 10-4 và 10-5 trên môi trường thạch NA và ủ ở 37 độ C trong 24 giờ Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ Bacillus subtilis dựa trên hình thái đặc trưng (tròn, không đều, rìa răng cưa, bề mặt nhăn hoặc mịn, tâm sậm màu) Tiếp theo, tiến hành nhuộm Gram và thử các phản ứng sinh hóa để xác định chính xác.

3.3.1.3.Xác định vi khuẩn Bacillus subtilis

Quan sát đặc điểm hình thái cuả Bacillus subtilis

Khi chọn được khuẩn lạc nghi ngờ là Bacillus subtilis, tiến hành nhuộm Gram và xem dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần ( xem phương pháp nhuộm Gram ở phần phụ lục )

Sau khi quan sát vi thể nếu nhận thấy tiêu bản nhuộm có đặc điểm giống vi khuẩn Bacillus subtilis (Gram dương, có dạng hình trực, hai đầu tròn, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, có bào tử), thì cấy chuyền khuẩn lạc nghi ngờ của Bacillus subtilis vào môi trường thạch nghiêng NA để giữ giống thử test sinh hóa tiếp theo

Giai đoạn thử test sinh hóa để đảm bảo chủng thu được đúng là Bacillus subtilis

Giám định đặc tính sinh hóa

Các đặc tính sinh hóa cơ bản của vi khuẩn Bacillus subtilis

Phương pháp thử trên phiến kính: Dùng que cấy vòng, lấy đầy một vòng cấy vi khuẩn, phết lên lam kính sạch và khô, nhỏ một giọt H2O2 lên vệt vi khuẩn vừa phết Ghi nhận sự sủi bọt nếu có

- Phản ứng dương tính (+): giọt H2O2 sủi bọt mạnh hoặc yếu

- Phản ứng âm tính (-): không có hiện tượng sủi bọt

• Thử khả năng lên men các loại đường ( glucose, lactose, maltose, manitol, saccharose )

Môi trường để thử nghiệm được phân phối khoảng 4 – 5 ml vào các ống nghiệm vô trùng có chứa ống Durham rồi đem hấp tiệt trùng Sau khi nguội, tiến hành cấy vi khuẩn Bacillus subtilis, nuôi ở 37 0 C/48 h Đọc kết quả

- Lên men, sinh hơi: phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ống durham có hơi Ký hiệu: (+, h) hoặc (+, G)

- Lên men, không sinh hơi: phenol red trong ống môi trường chuyển từ đỏ sang vàng, ống Durham không có hơi Ký hiệu: (+)

- Không lên men: phenol red vẫn giữ nguyên màu đỏ, ống Durham không có hụi Kyự hieọu: (-)

• Thử nghiệm MR ( Methyl Red ): (+)

Thử nghiệm được thực hiện với môi trường Clark-Lubs, có 1% glucose Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn Bacillus subtilis cho vào môi trường, ủ ở

37 0 C/24 h Thêm vài giọt thuốc thử đỏ methyl red vào trong ống nghiệm chứa dịch nuôi cấy, đọc kết quả:

- Phản ứng ( +): Môi trường có màu đỏ

- Phản ứng ( - ): Môi trường có màu vàng

Môi trường sử dụng cho thử nghiệm VP là môi trường Clark_ lubs Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn Bacillus subtilis cho vào môi trường, ủ ở 37 0 C/24h, nhỏ vào ống nghiệm chứa vi khuẩn 0,5 ml dung dịch NaOH 40%, có thể hơ nóng nhẹ, hoặc để ở nhiệt độ phòng 10 phút, nhỏ thêm 1 ml dung dịch α- naphtol 10% trong cồn Lắc đều, đọc kết quả:

- Phản ứng ( + ): Môi trường có màu đỏ cam

- Phản ứng ( - ): Môi trường có màu vàng hoặc màu nâu đất , dơ

• Thử nghiệm khả năng tạo indol: (-)

Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là môi trường NB Cấy một ít vi khuẩn Bacillus subtilis vào ống môi trường, ủ ở 37 0 C/24 h Khi đọc kết quả dùng ống nhỏ giọt sạch, nhỏ vào ống nghiệm canh khuẩn vài giọt dung dịch thuốc thử Kowac’s

- Phản ứng ( + ): Có vòng màu đỏ trên bề mặt môi trường

- Phản ứng ( - ): Vòng không có màu đỏ trên bề mặt môi trường

• Thử nghiệm khả năng sử dụng nitrat ( khử NO - 3 ): (+)

Cấy vi khuẩn vào môi trường nitrat ( môi trường NB pepton, bổ sung 0,2% KNO3 và agar ) Nuôi ở nhiệt độ 37 0 C/24 h Sau đó nhỏ 2- 3 giọt Griess A và Griess

- Phản ứng ( + ): Môi trường xuất hiện màu đỏ nâu

- Phản ứng ( - ): Môi trường xuất hiện màu vàng

• Thử nghiệm khả năng sử dụng citrate: (+)

Môi trường sử dụng cho thử nghiệm này là Simmon’s Citrat Agar ( SCA ) Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn, cấy sang ống thạch nghiêng SCA, ủ

- Phản ứng ( + ): Môi trường có màu xanh dương

- Phản ứng ( - ): Môi trường có màu xanh lá cây

• Thử nghiệm tính di động: (+)

Một số vi khuẩn có tiêm mao nên có khả năng di động trong môi trường bán lỏng Dùng que cấy thẳng lấy vi khuẩn trong ống giống, cấy sang ống nghiệm thạch bán lỏng, trích thẳng từ trên xuống dưới Nuôi ở nhiệt độ 37 0 /24-48 h Đọc kết quả:

- Phản ứng ( + ): Vi khuẩn mọc lan ra xung quanh

- Phản ứng ( - ): Vi khuẩn mọc theo đường cấy

• Khả năng phân giải protein: (+)

- Khả năng phân giải casein

Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có enzyme caseinaza, do đó có thể phân giải casein thành các acid amin Xung quanh khuẩn lạc của vi khuẩn này ( khi cấy vi khuẩn trên môi trường casein ) sẽ hình thành các vòng phân giải trong suốt

Phương pháp tiến hành: Cấy vi khuẩn Bacillus subtilis thành các khóm nhỏ trên môi trường thạch đĩa casein Nuôi ở nhiệt độ 37 0 /48 h Đọc kết quả bằng cách quan sát vòng phân giải trong suốt xung quanh khóm

- Khả năng phân giải gelatin

Nguyên tắc: một số vi khuẩn có khả năng sinh enzyme gelatinaza làm tan chảy gelatin

Trong nghiên cứu này, môi trường canh NB bổ sung 10% gelatin được sử dụng để tiến hành thử nghiệm Mẫu vi khuẩn được lấy từ ống giống cấy bằng que cấy thẳng, sau đó được trích sâu từ trên mặt xuống đáy ống môi trường Quá trình nuôi cấy được thực hiện trong điều kiện thích hợp.

37 0 /48 h Đọc kết quả: Cho ống nghiệm nuôi cấy vào tủ lạnh nhiệt độ 4 -8 0 C, khoảng

- Phản ứng tan chảy gelatin ( + ):ở t 0 < 20 0 C, gelatin vẫn lỏng

- Phản ứng tan chảy gelatin ( - ): ở t 0 < 20 0 C, gelatin đông đặc lại

• Khả năng phân giải tinh bột: (+)

Nguyên tắc: Một số vi sinh vật có các enzyme amylaza có khả năng phân giải tinh bột thành đường Bình thường khi cho iod tác động lên tinh bột sẽ thấy xuất hiện màu xanh Trong trường hợp chúng ta nhỏ dung dịch iod vào môi trường có chứa tinh bột đã nuôi cấy vi sinh vật mà không thấy xuất hiện màu xanh nữa, có nghĩa là tinh bột đã bị phân giải bởi enzyme amylaza được sinh ra bởi vi sinh vật

Phương pháp tiến hành: Dùng que cấy lấy một ít sinh khối vi khuẩn Bacillus subtilis cấy thành khóm nhỏ lên môi trường thạch tinh bột, ủ ở 37 0 C/48 h Khi đọc kết quả dùng iod nhỏ lên môi trường để quan sát đường kính vòng phân giải tinh bột Vòng phân giải càng lớn, khả năng thủy phân tinh bột của vi sinh vật càng mạnh

3.3.2.Khảo sát khả năng tăng sinh khối và sản xuất enzyme proteaza của các chủng Bacillus subtilis từ các chủng phân lập được

3.3.2.1.Khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza của một số chủng Bacillus subtilis trên môi trường casein

Nguyên tắc: khi nuôi cấy vi sinh vật sinh enzyme trên cùng một môi trường nhưng ở các khoảng thời gian khác nhau sẽ cho hoạt độ enzyme khác nhau Dựa vào đặc điểm này, chúng tôi khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza của một số chủng Bacillus subtilis đã phân lập được để chọn ra thời gian thích hợp và chủng

Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme cao nhất Điều kiện khảo sát:

Nhiệt độ :nhiệt độ phòng

Môi trường: sữa loại béo

Sơ đồ 3.2: Qui trình khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza

Tiến hành nuôi cấy vi khuẩn trong môi trường NB ở nhiệt độ 37 độ C trong 24 giờ để nhân giống Sau đó, cấy vi khuẩn vào môi trường casein 1% và nuôi sục khí ở nhiệt độ phòng Kiểm tra hoạt độ enzyme sau 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ để xác định thời gian nuôi cấy tối ưu và chủng vi khuẩn có hoạt độ enzyme cao nhất Thí nghiệm được lặp lại hai lần để đảm bảo độ tin cậy của kết quả.

Gioỏng vi khuaồn Bacillus subtilis

Môi trường nhân giống (NB)

Môi trường khảo sát khả năng sinh enzyme caseinaza (môi trường sữa loại béo)

Kiểm tra số lượng vi khuẩn và hoạt độ proteaza

Chọn chủng cho hoạt độ proteaza cao nhất

-Kiểm tra hoạt độ proteaza bằng phương pháp Gross + Fuld ( xem phần phụ luùc )

-Kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp trang đĩa, đếm số lượng, tính số vi khuẩn / 1ml dịch mẫu ( hay trong 1g mẫu )

3.2.2.2.Tìm điều kiện thích hợp cho sự sản xuất enzyme và sinh khối tế bào của chủng đã lựa chọn

Từ kết qủa của mục 3.2.2.1 chọn chủng có khả năng tạo sinh khối enzyme proteaza cao nhất để tiến hành thí nghiệm mục 3.2.2.2

KẾT QUẢ THẢO LUẬN

KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC CỦA BACILLUS SUBTILIS

Áp dụng quy trình phân lập theo sơ đồ 3.1, từ 10 mẫu đất, chúng tôi đã ly trích được 38 chủng vi khuẩn Sau đó, chúng tôi đã tiến hành giám định các đặc điểm của từng chủng vi khuẩn này.

4.1.1 Đặc điểm hình thái của B subtilis

Sau khi phân lập trên môi trường thạch đĩa NA ở 37 o C/24 h Chúng tôi chọn khuẩn lạc có hình dạng như sau: khuẩn lạc tròn, bờ không đều rìa có dạng răng cưa, bề mặt hơi khô, nhăn, có màu xám nhạt trắng, tâm sậm màu Đường kính khuẩn lạc trung bình 2- 4 mm

Hình 4.1: Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis nghi ngờ trên môi trường NA

Hình 4.2: Khuẩn lạc vi khuẩn Bacillus subtilis thuần trên môi trường NA 4.1.1.2 Quan sát vi thể

Sau khi nhuộm Gram và quan sát ở độ phóng đại 1000 lần, chúng tôi nhận thấy Bacillus subtilis là những trực khuẩn ngắn và nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu Gram dương, đứng riêng lẻ hoặc tạo thành chuỗi, bào tử không làm phình tế bào

Hình 4.3:Tế bào vi khuẩn Bacillus subtilis được phóng đại x1000 dưới kính hiển vi

4.1.2 Đặc điểm sinh hóa của chủng Bacillus subtilis

Từ các chủng Bacillus subtilis phân lập đươc chúng tôi tiến hành thử phản ứng sinh hóa Kết quả có 20 chủng có đặc điểm phù hợp với vi khuẩn Bacillus subtilis được trình bày qua bảng 4.1

Bảng 4.1: Đặc điểm sinh hóa của các chủng Bacillus subtilis phân lập được từ đất

Qua bảng 4.1, chúng tôi nhận thấy trong 38 chủng phân lập được có 20 chủng có tính chất phù hợp với tính chất sinh hóa của chủng Bacillus subtilis

Trong 20 chủng này, chúng tôi nhận thấy tất cả 20 chủng đều có khả năng phân giải gelatin mạnh, và khả năng phân giải tinh bột cao (giá trị vòng phân giải

Catalaza + trung bình là 1,6 – 1,8 cm ) Riêng khả năng phân giải casein chỉ có 6 chủng là có khả năng phân giải casein cao ( giá trị vòng phân giải là 0,8 – 1,3 cm ), các chủng còn lại có khả năng phân giải casein kém hơn Do đó chúng tôi chọn 6 chủng này ( lần lượt được kí hiệu là B1, B2, B3, B4, B5, B6 ), tiếp tục tiến hành định lượng khả năng sinh enzyme proteaza để chọn được chủng Bacillus subtilis cho khả năng sinh enzyme cao nhaát

Bảng 4.2: Kết quả khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza của 6 chủng Bacillus subtilis phân lập được

STT Kí hiệu chủng Đường kính khuẩn lạc ( d1 ) Đường kính vòng phân giải ( d2 )

Giá trị vòng phân giải ( d = d1 – d2 )

Hình 4.4: Vi khuẩn Bacillus subtilis tạo vòng phân giải casein trên môi trường thạch cazein

KHẢO SÁT KHẢ NĂNG TĂNG SINH KHỐI VÀ SẢN XUẤT CHẾ PHẨM

4.2.1 Khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza của 6 chủng Bacillus subtilis đã chọn trên môi trường casein

Thể tích dịch nuôi cấy được lựa chọn là 200 ml trong bình tam giác dung tích 500 ml Tuổi giống được sử dụng là 24 giờ, với lượng giống chiếm 1% so với thể tích dịch nuôi cấy.

Các điều kiện nuôi cấy dùng để khảo sát:

Nhiệt độ: nhiệt độ phòng pH: 7,0

Thời gian: 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ

Môi trường: sữa loại béo( casein )

Bên cạnh phương pháp định lượng Gross + Fuld để xác định hoạt độ protease, nhóm nghiên cứu còn tiến hành kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp trang đĩa Các kết quả này được thể hiện chi tiết trong Bảng 4.3 và Bảng 4.4.

Bảng 4.3: Kết quả khảo sát hoạt độ proteaza trung bình

Chủng Thời gian nuôi cấy

B6 64 36 20 Đơn vị hoạt độ proteaza: Hđp/ml

Bảng 4.4: Kết quả khảo sát số lượng tế bào

Chủng Thời gian nuôi cấy

Kết quả nghiên cứu trình bày ở bảng 4.3 và 4.4 cho thấy số lượng tế bào vi khuẩn và hoạt độ proteaza cao nhất ở thời điểm 24 giờ Trong khi đó, những chủng có số lượng tế bào cao thì cũng có hoạt độ proteaza cao tương ứng Đặc biệt, chủng vi khuẩn B1 nổi bật với số lượng tế bào và hoạt độ proteaza đạt mức tối ưu nhất trong số các chủng vi khuẩn được xét nghiệm.

Vì vậy chúng tôi chọn chủng B1 để tiếp tục khảo sát khả năng sinh enzyme và sinh khối ở các điều kiện môi trường, tỉ lệ nạp giống và chế độ nuôi cấy khác nhau 4.2.2.Tìm điều kiện thích hợp cho sự sản xuất enzyme và sinh khối tế bào của chủng đã lựa chọn

4.2.2.1 Kết quả khảo sát điều kiện và môi trường nuôi cấy với tỉ lệ nạp giống 1%

Chúng tôi tiến hành nuôi khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza và sinh khối của chủng B1 trên ba môi trường ( casein, casein + 1% glucose, casein + 2% glucose ) ở mức pH 7,0 trong thời gian 24 giờ ở nhiệt độ phòng, và ở hai điều kiện: nuôi cấy tĩnh và nuôi cấy sục khí Kết quả khảo sát được trình bày qua bảng 4.5 và bảng 4.6

Bảng 4.5: Hoạt độ proteaza cuả chủng B1

Môi trường nuôi cấy Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy sục khí

Casein + 2% glucose 24 32 Đơn vị hoạt độ proteaza: Hđp/ml

Bảng 4.6: Số lượng tế bào của chủng B1

Môi trường nuôi cấy Nuôi cấy tĩnh Nuôi cấy sục khí

Casein + 2% glucose 13,5 22,4 ẹụn vũ: 10 7 tb/ml Qua kết quả ở bảng 4.4 và bảng 4.5: chúng tôi nhận thấy chủng B1 ở môi trường casein + 1% glucose và điều kiện nuôi cấy là sục khí cho hoạt độ proteaza và số lượng tế bào cao nhất Chọn hai điều kiện này tiếp tục vào khảo sát ở thí nghieọm hai

4.2.2.2 Kết quả khảo sát tỉ lệ nạp giống

Từ thí nghiệm 1 chúng tôi chọn được môi trường nuôi cấy là casein + 1% glucose ở điều kiện là nuôi cấy sục khí Kết hợp hai điều kiện này và khảo sát với tỉ lệ 1%, 3%, 5% giống Kết quả khảo sát được trình bày qua bảng 4.7 và bảng 4.8

Bảng 4.7: Hoạt độ proteaza cuả chủng B1 ẹụn vũ :Hủp/ml

Tỉ lệ nạp giống Casein + 1% glucose

Bảng 4.8:Số lượng tế bào của chủng B1

Tỉ lệ nạp giống Casein + 1% glucose

5% 141,2 ẹụn vũ: 10 7 tb/ml Qua bảng 4.7 và bảng 4.8: chúng tôi nhận thấy hoạt độ proteaza và số lượng tế bào của chủng B1 ở tỉ lệ nạp giống 3% là cao nhất

Qua bảng 4.7 cho thấy kết quả khảo sát của chúng tôi cao hơn kết quả mà Nguyễn Thị Công Dung đã khảo sát (2004): nuôi trên máy lắc ở nhiệt độ phòng, pH 7,0, thời gian 48 h , môi trường canh bột đậu nành cho hoạt độ proteaza trung bình cao nhất là 106,67 (Hđp/ml), điều này có thể là do: chủng chúng tôi khảo sát có khả năng sinh enzyme proteaza cao, tỷ lệ nạp giống và môi trường nuôi cấy thích hợp với khả năng sinh enzyme proteaza

Kết quả nghiên cứu của chúng tôi về sinh khối vi khuẩn cao hơn đáng kể so với ghi nhận của Nguyễn Văn Dũng năm 2001, có thể do sự khác biệt giữa các chủng khảo sát, điều kiện nuôi cấy, thời gian nuôi, tỷ lệ giống ban đầu và môi trường nuôi cấy.

Qua kết quả khảo sát, chúng tôi nhận thấy điều kiện thích hợp cho khả năng sinh enzyme proteaza và sinh khối tế bào của chủng B1 ở mức pH 7,0 trong 24 giờ, ở nhiệt độ phòng là: môi trường casein + 1% glucose, nuôi cấy sục khí, với tỉ lệ nạp giống là 3% Do đó, chúng tôi chọn các điều kiện trên để sản xuất thử nghiệm chế phaồm

Hình 4.5: Giai đọan nuơi cấy sục khí sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis

4.3 Kết quả sản xuất thử nghiệm chế phẩm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza

Chúng tôi sử dụng các điều kiện thích hợp cho Bacillus subtilis sinh proteaza là: môi trường casein + 1% glucose, nhiệt độ phòng, nuôi cấy sục khí, hàm lượng giống 3%, pH 7,0 và sau 24 giờ nuôi cấy

Quy trình sản xuất được đề nghị như sau:

Môi trường Casein + 1% glucose pH =7,0 (V = 200ml)

Gioáng Bacillus subtilis Bột đậu nành

Sấy khô 100 o C/2h (độ aồm cheỏ phaồm baống

Nuôi sục khí ở nhiệt độ phòng /24 giờ

Caáy gioáng 3% theồ tớch dũch moõi trường

Ly tâm tách sinh khối

Trộn đều ( sinh khối + 100 g bột ) Đóng gói, bảo quản

Sơ đồ 4.1: Quy trình sản xuất chế phẩm Bacillus subtilis

Chế phẩm vi sinh hữu cơ dạng thô bao gồm các thành phần chính là thành phần môi trường, hệ enzyme và hệ vi khuẩn Chế phẩm có dạng bột mịn, màu vàng hoặc màu trắng ngà và có mùi thơm đặc trưng của đậu nành, cám mì tinh.

Trong điều kiện phòng thí nghiệm chưa có những thiết bị thu hồi chế phẩm thích hợp thì phương pháp hấp thụ enzyme trên bột đậu nành, bột mì tinh của chúng tôi cho phép thu được chế phẩm Bacillus subtilis ở dạng bột tương đối sạch , giá rẻ

Tuy nhiên, bột đậu nành hay mì tinh là nguồn dinh dưỡng rất tốt nên trong quá trình bảo quản cần tránh chế phẩm không bị hút ẩm sẽ tạo điều kiện cho vi sinh vật khác phát triển, làm thay đổi tính chất của chế phẩm

Hình 4.6: Chế phẩm Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza

4.3.2 Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis

Sử dụng các phương pháp đã mô tả chúng tôi kiểm tra số lượng tế bào vi khuẩn của chế phẩm Bacillus subtilis sau một thời gian bảo quản

Bảng 4.9: Kết quả kiểm tra chế phẩm Bacillus subtilis

Thơì điểm Số lượng (tb/ml(g)) Đậu nành Mì tinh Đậu nành + mì tinh Sau khi thu hoạch 28 x 10 7 35 x10 7 25 x10 7

Kết quả trình bày ở bảng 4.8 cho thấy :

Số lượng tế bào vi khuẩn giảm dần theo thời gian

Do bảo quản ở nhiệt độ phòng, số lượng tế bào bị hao hụt nhiều

Mặc dù bột mì tinh không có nhiều chất dinh dưỡng như bột đậu nành nhưng lại thích hợp trong việc duy trì khả năng nảy mầm của bào tử đối với vi khuẩn

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

Qua phân lập và khảo sát ảnh hưởng của môi trường, thời gian, điều kiện nuôi cấy, tỉ lệ giống đến khả năng sinh enzyme proteaza và tạo sinh khối của chủng

Bacillus subtilis Chúng tôi có những kết luận và đề nghị sau:

- Chúng tôi phân lập được 20 chủng Bacillus subtilis từ 10 loại mẫu đất qua khảo sát đặc tính sinh học, sinh hóa

- Khảo sát khả năng sinh proteaza của 6 chủng trên môi trường casein, ở nhiệt độ phòng, pH =7,0, nuôi cấy sục khí và ba mức thời gian ( 24 h , 48 h , 72 h ) cho thấy: chủng B1 cho hoạt độ proteaza và số lượng tế bào cao nhất trong khoảng thời gian 24 giờ

- Khảo sát khả năng sinh enzyme proteaza và tạo sinh khối của chủng B1 trên 3 môi trường ( casein, casein + 1% glucose, casein + 2% glucose ), hai điều kiện nuôi cấy ( nuôi cấy tĩnh, nuôi cấy sục khí ), tỉ lệ nạp giống ( 1%, 3%, 5% giống ) cho thấy: điều kiện thích hợp để chủng B1 sinh enzyme proteaza và tạo sinh khối cao nhất là: môi trường casein + 1% glucose, nuôi cấy sục khí, tỉ lệ 3% giống ẹieàu kieọn toỏi ửu nuoõi caỏy chuỷng Bacillus subtilis sinh proteaza:

- Phân lập các chủng Bacillus subtilis có khả năng sinh enzyme proteaza cao từ các loại mẫu khác nhau: đất, rơm rạ, phân gia súc,…

- Khảo sát thêm nhiều loại môi trường, nhiều mức thời gian, pH, nhiệt độ, chế độ nuôi cấy, tỉ lệ nạp giống để xác định điều kiện thích hợp cho Bacillus subtilis sinh enzyme proteaza cao và tạo sinh khối tối ưu

- Khảo sát thêm thời gian và phương pháp bảo quản chế phẩm

- Tìm hiểu thêm các phương pháp xác định hoạt độ proteaza nhằm tìm ra phương pháp phù hợp và cho kết quả chính xác nhất

- Chưa so sánh việc bảo quản chế phẩm ở các nhiệt độ khác nhau

- Chưa thử nghiệm độ an toàn của chế phẩm cũng như sự thay đổi hoạt độ enzyme của chế phẩm trong thời gian dài bảo quản

1 Tô Minh Châu, Phan Hữu Nghĩa ( 2001 ), “Giáo trình thực tập vi sinh cơ sở “, Khoa Công Nghệ Sinh học, Đại Học Mở Bán Công Tp Hồ Chí Minh

2 Nguyễn Thị Công Dung ( 2004 ), “Tìm điều kiện môi trường thích hợp để sản xuất enzyme proteaza và amylaza từ Bacillus subtilis”, Luận văn tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Bán Công, Tp Hồ Chí Minh

3 Nguyễn Văn Dũng ( 2001 ), “Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng

Bacillus subtilis dùng để sản xuất chế phẩm vi sinh cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột phòng chống tiêu chảy ở quy mô phòng thí nghiệm”, Luận văn tốt nghiệp khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại học Mở Bán Công, Tp Hồ Chí Minh

4 Nguyễn Thị Hiền, Vũ Thị Thu ( 2000 ),” Hóa sinh học Nông nghiệp”, Nhà xuất bản giáo dục

5 Nguyễn Đức Lượng ( 2001 ),” Công Nghệ sinh học “, Nhà xuất bản Đại học Quoác Gia Tp Hoà Chí Minh

6 Lê Minh Cẩm Ngọc ( 2005 ), “ Phân lập vi khuẩn Bacillus subtilis từ chế phẩm probiotic Tìm hiểu môi trường nuôi cấy thích hợp và sản xuất thử nghiệm “, Luận văn tốt nghiệp khoa Chăn Nuôi Thú Y, Trường Đại học Noâng Laâm, Tp Hoà Chí Minh

7 Lê Xuân Phương ( 2001 ), “ Vi sinh vật học công nghiệp “, Đại học Đà Nẵng

9 Trần Minh Tâm ( 2000), “ Công nghệ vi sinh ứng dụng “, Nhà xuất bản Nông nghieọp Tp Hoà Chớ Minh

10 Lê ngọc Tú, La Văn Chú, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng ( 1982 ), “ Enzyme vi sinh vật “( Tập 1 ), Nhà xuất bản Khoa Học và Kỹ Thuật – Hà Nội

11 Đồng Thị Thanh Thu,” Giáo trình sinh hóa cơ bản “, Tủ sách Đại học Khoa Học Tự Nhiên

Dùng để sát khuẩn tay, bàn ghế, tủ cấy…

Cách pha: cồn 70 0 từ cồn 96 0 Vì không đòi hỏi chính xác, nên có thể áp dụng công thức:

2 Nước muối sinh lý 9 0 / 00 vô khuẩn

Cân chính xác 9g NaCl tinh khiết cho vào cốc rồi cho nước cất vào vừa đủ 1000ml, dùng đũa thủy tinh khuấy đều Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 ( 1atm )/

Cân 45g NaOH tinh thể hoà vào 50ml nước cất lắc đều để yên 24 giờ, gạn lấy nước trong ở trên rồi bổ sung cho đủ 1000ml

Cân 0,1g casein, trộn lẫn với 5ml dung dịch NaOH 0,1N ( dung dịch NaOH

6 Dung dòch acid acetic – ethanol acid acetic đặc 1 ml

Ethanol 96 0 50 ml Đựng trong chai thủy tinh kín và tối

Trộn hai dung dịch a và b lại với nhau Khuấy cho hòa tan đều rồi đem lọc

Chú ý: dung dịch thuốc nhuộm này luôn bảo quản trong chai màu, tránh ánh sáng

Trộn dung dịch a và b với nhau rồi khuấy cho hòa tan đều, đem lọc Bảo quản trong chai màu

Trước khi dùng pha loãng 5 lần ( dịch pha loãng không giữ được lâu còn dịch đặc có thể giữ được trong nhiều tháng )

C THUỐC THỬ VÀ CHỈ THỊ MÀU

Cân chính xác 40g NaOH tinh thể hoà tan nước cất cho vừa đủ 100ml khuấy cho tan đều

Cân chính xác 10g KOH tinh thể, hoà tan nứơc cất cho vừa đủ 100ml khuấy cho tan đều

3 Thuốc thử KOWAC p – dimethylaminobenzaldehyde ( p – DMABA ) 10g

Rượu amilic hay butylic 150ml

5.Thuốc thử xác định khả năng khử nitrate

Nước vất vừa đủ 100ml

Dung dịch được đựng trong chai màu tránh tiếp xúc ánh sáng ( dung dịch này bảo quản được trong một tháng )

Hoà tan 0,8g α – naphtylamin trong 100ml nước cất đun sôi Để nguội rồi bổ sung thêm 30ml acid acetic, đem lọc Đựng trong chai màu Dung dịch này chỉ bảo quản được trong một tuần

1 Môi trường Nutrient Agar ( NA )

Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

2 Môi trường Nutrient Broth ( NB )

Nước cất 1000ml pH 7,0 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

3 Môi trường Clark – Lubs pepton 7g

Nước cất 1000ml pH 6,9 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

4 Môi trường lên men đường

NaCl 5g pH 7,4 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 115 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

5 Môi trường simmons citrate Agar

Agar 18g pH 6,9 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

6 Môi trường Starch agar ( tinh bột )

Nước cất 1000ml pH 7,4 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

8 Môi trường thạch bán lỏng

Nước cất 1000ml pH 7,2 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

Nước cất 1000ml pH 7,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 121 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

10 Môi trường casein ( thạch đĩa )

Nước cất 1000ml pH 7,2 ± 0,2 Đem hấp vô khuẩn ở nhiệt độ 115 0 C ( 1atm )/ 15- 20 phút

E CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Đặt giấy lọc lên vết bôi

- Nhuộm bằng fuchsine kiềm loãng 1 phút

- Chậm khô, soi kính hiển vi

2 Định lượng proteaza bằng phương pháp Gross + Fuld

Phương pháp này dựa trên cơ sở xác định nồng độ enzyme tối thiểu cần thiết để phân giải 2mg casein đến mức không kết tủa do axit axetic tạo ra trong điều kiện thí nghiệm.

Chuẩn bị 12 ống nghiệm sạch khô, cho vào mỗi ống nghiệm 1ml nứơc cất ( trừ ống 1 là ống đối chứng ( + ) )

Cho vào ống 1 và 2 mỗi ống 1ml dịch nuôi cấy có enzyme lắc đều, lấy 1ml dung dịch của ống thứ hai chuyển vào ống thứ ba, lắc đều, và lại lấy 1ml dung dịch từ ống thứ ba chuyển vào ống thứ tư….cho đến ống thứ 11, lấy 1ml dung dịch của ống thứ 11 bỏ đi, không cho vào ống thứ 12 ( đối chứng ( - ) chỉ có 1ml nứơc cất ) Đặt tất cả ống nghiệm vào tủ ấm 38 0 C, 10 – 15 phút Thêm vào mỗi ống 2ml dung dịch casein 0,1% ( ủ 38 0 C lắc đều ) Tiếp tục đặt tất cả 12 ống vào tủ ấm trong 30 phút ở 38 0 C để enzyme tác động lên casein Lấy ra cho vào mỗi ống vài giọt ( 3 –

Kết quả: đọc kết quả dựa vào đối chứng ( + ) và đối chứng ( - ) ống 1 ( đối chứng ( + ) ): casein bị phân giải hết không tạo kết tủa trắng ống 12 ( đối chứng ( - ) ): casein chưa bị phân giải hết tạo kết tủa trắng ở mặt tiếp xúc

Hoạt độ enzyme proteaza trong 1ml dung dịch

A1: hoạt độ enzyme proteaza trong 1ml dung dịch enzyme

A2: hoạt độ enzyme proteaza trong 1g chế phẩm rắn

2 n : hệ số pha loãng ở ống thứ n cho kết quả ( + )

2: soỏ miligam casein trong moói oỏng nghieọm m: số ml nước cất để pha 1g chế phẩm enzyme

3 Phương pháp đếm khuẩn lạc trên môi trường thạch đĩa

Chuẩn bị các đĩa môi trường NA đã hấp tiệt trùng và để ráo mặt thạch Lấy 1ml dịch vi khuẩn cần đếm pha loãng ở nhiều nồng độ liên tiếp nhau ( theo phương pháp pha loãng thập phân ) bằng dung dịch nứơc muối sinh lý Cấy trang 0,1ml dịch pha loãng lên môi trường NA ( mỗi nồng độ trang 2 đĩa ), ủ ở nhiệt độ 37 0 C trong

24 giờ Đếm số lượng khóm vi khuẩn mọc

X: số lượng khuẩn lạc trong 1g mẫu hay 1ml dịch mẫu

A: số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa h: độ pha loãng

V: thể tích dịch nuôi cấy một đĩa

✴ Số khuẩn lạc trung bình trong 1g mẫu hay 1ml dịch mẫu ở 3 độ pha loãng liên tieáp nhau