BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI TỪ VI KHUẨN BAC.
BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Giáo viên hướng dẫn: Th.S Đỗ Thị Hiền Sinh viên thực hiện: LÊ CÔNG TRÀ MY LÊ CHÂU THỦY TIÊN PHẠM HỒNG TIẾN Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.S Đỗ Thị Hiền LÊ CÔNG TRÀ MY LÊ CHÂU THỦY TIÊN PHẠM HOÀNG TIẾN Tp.Hồ Chí Minh, tháng năm 2017 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành đề tài tốt nghiệp này, tơi xin chân thành cảm ơn: ii Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền - GVHD Th.S Đỗ Thị Hiền, người trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ chúng tơi suốt q trình làm đề tài - Chúng xin cảm ơn quý thầy, cô khoa Công nghệ sinh học Kỹ thuật môi trường trường ĐH Công Nghiệp Thực Phẩm Tp.HCM dạy dỗ truyền đạt kiến thức cho suốt khóa học - Các thầy, phụ trách Trung tâm thí nghiệm thực hành trường ĐH Cơng Nghiệp Thực Phẩm TP.HCM tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình làm thí nghiệm Tp.HCM, ngày tháng năm 2017 Sinh viên thực Lê Công Trà My Lê Châu Thủy Tiên Phạm Hoàng Tiến iii LỜI CAM ĐOAN Chúng cam đoan báo cáo đồ án tốt nghiệp chúng tơi thực Các số liệu thu thập kết phân tích báo cáo trung thực, không chép từ đề tài nghiên cứu khoa học Sinh viên thực Lê Công Trà My Lê Châu Thủy Tiên Phạm Hoàng Tiến iv Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN iii LỜI CAM ĐOAN iv DANH MỤC BẢNG .vii DANH MỤC HÌNH .viii PHẦN MỞ ĐẦU .1 Lý chọn đề tài Mục tiêu đề tài .1 Chương 1: TỔNG QUAN .2 1.1 Sơ lược Bacillus subtilis 1.1.1 Lịch sử phát 1.1.2 Đặc điểm phân loại 1.1.3 Đặc điểm hình thái 1.1.4 Đặc điểm sinh hóa .2 1.1.5 Tính đối kháng B.subtilis số vi sinh vật gây bệnh 1.1.6 Khả sinh enzyme 1.2 Giới thiệu chung probiotic .5 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Vai trò probiotic 1.3 Sơ lược số vi sinh vật gây bệnh chăn nuôi 1.3.1 E.coli 1.3.2 Salmonella 1.4 Tình hình nghiên cứu ứng dụng chế phẩm chứa vi khuẩn B.subtilis .7 1.5 Quy trình tạo chế phẩm vấn đề liên quan Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 11 2.1 Địa điểm thời gian thực .11 2.2 Nguyên liệu môi trường nuôi cấy 11 2.3 Dụng cụ, thiết bị, hóa chất 12 v 2.3.1 Dụng cụ, thiết bị 12 2.3.2 Hóa chất 12 2.4 Phương pháp 13 2.4.1 Quy trình sản xuất .13 2.4.2 Kiểm tra đặc tính probiotic B.subtilis 15 2.4.3 Kiểm tra hoạt lực enzyme 19 2.4.4 Khảo sát thời gian cho trình lên men 21 2.4.5 Khảo sát tỉ lệ phối trộn sinh khối chất mang 22 2.4.6 Kiểm tra đặc tính sản phẩm .23 2.4.7 Xử lý số liệu 23 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN .24 3.1 Kiểm tra đặc tính probiotic B.subtilis 24 3.1.1 Thử nghiệm khả đối kháng với E.coli Salmonella 24 3.1.2 Thử nghiệm khả chịu pH thấp dày 27 3.1.3 Thử nghiệm khả chịu đựng muối mật 29 3.2 Khảo sát thời gian cho trình lên men 32 3.3 Kiểm tra số lượng tế bào B.subtilis sau sấy 34 3.4 Kiểm tra tiêu chế phẩm tạo 35 3.4.1 Khảo sát tỉ lệ phối trộn sinh khối chất mang 35 3.4.2 Kiểm tra khả kháng khuẩn sản phẩm .36 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .41 4.1 Kết luận .41 4.2 Kiến nghị .41 TÀI LIỆU THAM KHẢO .42 PHỤ LỤC I: SỐ LIỆU KẾT QUẢ THÍ NGHIỆM 43 PHỤ LỤC II: HÌNH ĐẾM KHUẨN LẠC 60 vi Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Các phản ứng sinh hóa B.subtilis Bảng 3.1 Kết thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis E.coli Salmonella .24 Bảng 3.2 Tỷ lệ sống sót (%) B.subtilis pH 2, pH 2.5, pH .28 Bảng 3.3 Tỷ lệ sống sót (%) B.subtilis nồng độ muối mật 0.5%, 1%, 1.5%, 2% 29 Bảng 3.4 Khả sinh enzyme ngoại bào Bacillus subtilis 31 Bảng 3.5 Số lượng tế bào sau 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ, 60 72 lên men (x1015 CFU/g) .33 Bảng 3.6 Số lượng tế bào theo tỷ lệ phối trộn sau ngày, 10 ngày, 15 ngày (x1011 CFU/g) .35 Bảng 3.7 Đường kính vịng kháng E.coli Salmonella tỷ lệ phối trộn khác 36 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Quy trình tạo chế phẩm Hình 2.1 Quy trình sản xuất thức ăn chăn ni 14 Hình 2.2 Quy trình thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis với E.coli .15 Hình 2.3 Quy trình thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis với Salmonella 17 Hình 3.1 Thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis E.coli 26 Hình 3.2 Thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis Salmonella 27 Hình 3.3 Tỷ lệ sống sót Bacillus subtilis pH khác 28 Hình 3.4 Tỷ lệ sống sót (%) B.subtilis nồng độ muối mật khác 30 Hình 3.5 Vịng phân giải amylase trước sau nhỏ thuốc thử 32 Hình 3.6 Vịng phân giải cellulase trước sau nhỏ thuốc thử .32 Hình 3.7 Vòng phân giải protease trước sau nhỏ thuốc thử 32 Hình 3.8 Số lượng tế bào B.subtilis khoảng thời gian lên men khác (x1015 CFU/g) 33 Hình 3.9 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:85:5 E.coli 37 Hình 3.10 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:85:5 Salmonella .37 Hình 3.11 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:75:15 E.coli 38 Hình 3.12 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:75:15 Salmonella .38 Hình 3.13 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:65:25 E.coli 38 Hình 3.14 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:65:25 Salmonella .39 Hình 3.15 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:55:45 E.coli .39 Hình 3.16 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:55:45 Salmonella .39 viii Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền Hình 3.17 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:45:45 E.coli 40 Hình 3.18 Thử nghiệm khả đối kháng tỷ lệ phối trộn 10:45:45 Salmonella .40 ix Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền PHẦN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Trong chăn nuôi nuôi trồng thủy sản trước người ta thường dùng chất kháng sinh để phòng trị bệnh cho gia súc, gia cầm tôm, cá… Việc sử dụng kháng sinh thời gian dài để lại nhiều hậu không mong muốn kháng thuốc vi khuẩn rối loạn hệ vi sinh vật đường ruột làm bệnh tái phát nặng dẫn đến khó điều trị Nghiêm trọng tồn dư kháng sinh thịt dẫn đến phẩm chất thịt giảm làm hạ giá thành sản phẩm gây thiệt hại lớn chăn ni Để khắc phục tình trạng này, nhà khoa học nghiên cứu sử dụng trực tiếp vi sinh vật sống, có lợi thường gọi “probiotic” Kết chứng minh lợi ích vi khuẩn có lợi việc phịng điều trị số bệnh chăn nuôi, thủy sản người Điều quan trọng khơng để lại hậu hay di chứng sử dụng loại hóa chất thuốc kháng sinh Xuất phát từ vấn đề tiến hành đề tài “Thử nghiệm sản xuất thức ăn chăn nuôi từ Bacillus subtilis” Mục tiêu đề tài Sản xuất chế phẩm chăn nuôi thô với mật độ vi sinh vật sống cao, hoạt lực enzyme cao từ môi trường sản xuất rẻ tiền Khảo sát đặc tính probiotic B.subtilis: - Khả chịu pH thấp dày Khả chịu muối mật Khả kháng khuẩn (E.coli, Salmonella) Khả sinh enzyme Khảo sát thời gian lên men khảo sát tỷ lệ phối trộn sản phẩm tốt Đồ án tốt nghiệp Total GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền Source 173.444 14.5183 Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value 5.98 0.0373 Between groups 10106.9 5053.44 Within groups 5069.33 844.889 Total (Corr.) 15176.2 Nồng độ muối mật 2%: Thời gian Lần Lần Lần Trung bình Tỷ lệ sống sót (%) 0h 210 178 221 203 ± 13 100 2h 158 172 98 143 ± 23 70.44 4h 67 134 119 107 ± 20 52.71 Thời gian Count Average Standard error 203.0 12.897 142.667 22.6961 106.667 20.3005 Total 150.778 16.9876 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 14216.2 7108.11 6.50 0.0315 Within groups 6561.33 1093.56 Total (Corr.) 20777.6 3.1.4 Kiểm tra hoạt lực enzyme Enzyme Kích thước vịng phân giải (mm) 51 Lần Lần Lần Trung bình Amylase 5 4.67 ± 0.33 Protease 5 4.33 ± 0.67 Cellulase ± 0.58 Enzyme Count Average Standard error Amylase 4.66667 0.333333 Protease 4.33333 0.666667 Cellulase 7.0 0.57735 Total 5.33333 0.5 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 12.6667 6.33333 7.12 0.0260 Within groups 5.33333 0.888889 Total (Corr.) 18.0 3.2 Khảo sát thời gian cho trình lên men Thời gian lên men Lần Lần Lần Trung bình 75 62 84 74 ± 6d 12 95 82 102 93 ± 6d 24 137 154 144 145 ± 5c 36 181 213 195 196 ± 9b 48 231 244 229 235 ± 5a 60 225 214 199 213 ± 8ab 72 217 172 186 192 ± 13b 52 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền Thời gian Count Average Standard error 73.6667 6.38575 12 93.0 5.85947 24 145.0 4.93288 36 196.333 9.26163 48 234.667 4.70225 60 212.667 7.5351 72 191.667 13.2958 Total 15 196.067 8.55596 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 68205.2 11367.5 60.16 0.0000 Within groups 2645.33 14 188.952 Total (Corr.) 70850.6 20 Thời gian Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 24 145.0 9.05293 X 72 191.667 9.05293 X 36 196.333 9.05293 X 60 212.667 9.05293 XX 48 234.667 9.05293 X 3.3 Kiểm tra chế phẩm Lặp lại Lần Lần Lần Trung bình Số khuẩn lạc 215 224 245 228 ± Col_9 Count Average Standard error 53 228.0 8.88819 1.0 0.0 Total 114.5 50.9141 3.4 Khảo sát tỉ lệ phối trộn sinh khối chất mang Tỷ lệ 10:45:45 10:55:35 10:65:25 10:75:15 10:85:5 Ngày Lần Lần Lần Trung bình 188 206 179 191 ± 10 133 175 137 148 ± 13 15 134 151 98 128 ± 16 209 178 189 192 ± 10 173 142 166 160 ± 15 122 153 161 145 ± 12 209 203 189 200 ± 10 191 141 194 175 ± 17 15 156 149 121 142 ± 11 213 214 190 206 ± 10 158 194 182 178 ± 11 15 122 138 182 147 ± 18 189 213 226 209 ± 11 10 199 178 171 183 ± 15 160 182 143 162 ± 11 Tỷ lệ phối trộn Ngày Count Average Standard error F-Ratio P-Value 45:45 191.0 7.93725 6.44 0.0321 54 Đồ án tốt nghiệp 55:35 65:25 75:15 85:5 Source GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền 10 148.333 13.3832 15 127.667 15.6241 192.0 9.07377 10 160.333 9.38675 15 145.333 11.893 200.333 5.92546 10 175.333 17.1885 15 142.0 10.6927 205.667 7.83865 10 178.0 10.583 15 147.333 17.9382 209.333 10.8372 10 182.667 8.41295 15 161.667 11.2891 5.46 0.0446 5.78 0.0400 5.16 0.0497 5.42 0.0452 Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Ngày 22686.5 11343.3 33.23 0.0000 Tỷ lệ phối trộn 4349.87 1087.47 3.19 0.0237 RESIDUAL 12972.8 38 341.389 TOTAL (CORRECTED) 40009.2 44 MAIN EFFECTS Tỷ lệ Count LS Mean LS Sigma Homogeneous Groups 45:45 155.667 6.15891 X 55:35 165.889 6.15891 XX 65:25 172.556 6.15891 XXX 75:15 177.0 6.15891 XX 85:5 184.556 6.15891 X phối trộn 55 3.5 Kiểm tra khả kháng khuẩn sản phẩm Tỷ lệ phối trộn 10:45:45 Salmonella Nồng độ pha lỗng Lần Lần Lần Trung bình 100 16 21 17 18 ± 1.73 Tỷ lệ phối trộn 10:55:35 E.coli Nồng độ pha loãng Lần Lần Lần Trung bình 100 15 12 13 13.33 ± 0.88 Nồng độ pha loãng Lần Lần Lần Trung bình 100 22 26 29 26.67 ± 2.03 Nồng độ pha loãng Lần Lần Lần Trung bình 100 23 20 22 21.67 ± 0.88 10-1 13 14 16 14.33 ± 0.88 Salmonella Tỷ lệ phối trộn 10:65:25 E.coli Col_ Count Average Standard error 21.6667 0.881917 14.3333 0.881917 Total 18.0 1.73205 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 80.6667 80.6667 34.57 0.0042 56 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền Within groups 9.33333 Total (Corr.) 90.0 2.33333 Salmonella Nồng độ pha lỗng Lần Lần Lần Trung bình 100 23 22 25 23.33 ± 0.88 10-1 16 18 16 16.67 ± 0.67 Col_1 Count Average Standard error 23.3333 0.881917 16.6667 0.666667 Total 20.0 1.57056 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 66.6667 66.6667 36.36 0.0038 Within groups 7.33333 1.83333 Total (Corr.) 74.0 Tỷ lệ phối trộn 10:75:15 E.coli Nồng độ pha loãng Lần Lần Lần Trung bình 100 28 30 27 28.33 ± 0.88 10-1 20 18 21 19.67 ± 0.88 Col_5 Count Average Standard error 28.3333 0.881917 19.6667 0.881917 57 Total 24.0 2.0166 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 112.667 112.667 48.29 0.0023 Within groups 9.33333 2.33333 Total (Corr.) 122.0 Salmonella Nồng độ pha loãng Lần Lần Lần Trung bình 100 31 29 32 30.67 ± 0.88 10-1 24 26 23 24.33 ± 0.88 10-2 22 20 19 20.33 ± 0.88 10-3 16 14 13 14.33 ± 0.88 Col_3 Count Average Standard error 30.6667 0.881917 24.3333 0.881917 20.3333 0.881917 3 14.3333 0.881917 Total 12 22.4167 1.83178 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 424.25 141.417 60.61 0.0000 Within groups 18.6667 2.33333 Total (Corr.) 442.917 11 Tỷ lệ phối trộn 10:85:5 58 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền E.coli Nồng độ pha lỗng Lần Lần Lần Trung bình 100 31 29 31 30.33 ± 0.67 10-1 23 20 22 21.67 ± 0.88 Col_1 Count Average Standard error 30.3333 0.666667 21.6667 0.881917 Total 26.0 2.0 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 112.667 112.667 61.45 0.0014 Within groups 7.33333 1.83333 Total (Corr.) 120.0 Salmonella Nồng độ pha lỗng Lần Lần Lần Trung bình 100 35 35 31 33.67 ± 1.33 10-1 29 27 29 28.33 ± 0.67 10-2 21 19 22 20.67 ± 0.88 10-3 19 17 17 17.67 ± 0.67 Col_3 Count Average Standard error 33.6667 1.33333 28.3333 0.666667 20.6667 0.881917 3 17.6667 0.666667 59 Total 12 25.0833 1.94024 Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 476.25 158.75 61.45 0.0000 Within groups 20.6667 2.58333 Total (Corr.) 496.917 11 60 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền PHỤ LỤC II HÌNH ĐẾM KHUẨN LẠC pH pH pH Hình Số khuẩn lạc pH thời điểm 0h, 2h, 4h pH 2.5 pH 2.5 pH 2.5 Hình Số khuẩn lạc pH 2.5 thời điểm 0h, 2h, 4h pH pH pH Hình Số khuẩn lạc pH thời điểm 0h, 2h, 4h 61 Hình Số khuẩn lạc nồng độ muối mật 0.5% 0h, 2h, 4h M=0,5% M=0,5% M=0,5% Hình Số khuẩn lạc nồng độ muối mật 1% 0h, 2h, 4h M=1% M=1% M=1,5% M=1,5% M=1% M=1,5% Hình Số khuẩn lạc nồng độ muối mật 1.5% 0h, 2h, 4h 62 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền M=2% M=2% M=2% Hình Số khuẩn lạc nồng độ muối mật 2% 0h, 2h, 4h 48h 36h 24h 60h 72h Hình Số khuẩn lạc thời gian lên men 63 10:45:45 10:45:45 10:45:45 Hình Số khuẩn lạc tỉ lệ phối trộn 10:45:45 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày 10:55:35 10:55:35 10:55:35 Hình 10 Số khuẩn lạc tỉ lệ phối trộn 10:55:35 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày 10:65:25 10:65:25 10:65:25 Hình 11 Số khuẩn lạc tỉ lệ phối trộn 10:65:25 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày 64 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền 10:75:15 10:75:15 10:75:15 Hình 12 Số khuẩn lạc tỉ lệ phối trộn 10:75:15 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày 10:85:5 10:85:5 10:85:5 Hình 13 Số khuẩn lạc tỉ lệ phối trộn 10:85:5 sau ngày, 10 ngày, 15 ngày 65 ...TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM CHĂN NUÔI TỪ VI KHUẨN BACILLUS SUBTILIS. .. đề tài ? ?Thử nghiệm sản xuất thức ăn chăn nuôi từ Bacillus subtilis? ?? Mục tiêu đề tài Sản xuất chế phẩm chăn nuôi thô với mật độ vi sinh vật sống cao, hoạt lực enzyme cao từ môi trường sản xuất rẻ... minh Bacillus subtilis có khả kháng vi sinh vật gây bệnh tốt sử dụng làm probiotic 26 Đồ án tốt nghiệp GVHD: Th.S Đỗ Thị Hiền 100 10-2 10-4 10-1 10-3 10-5 Hình 3.1 Thử nghiệm khả đối kháng B.subtilis