Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng phenacoccus manihoti gây hại trên cây sắn

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn TRẦN THỊ VÂN CƠ QUAN CHỦ TRÌ: TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/2017 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ THÀNH ĐỒN TP HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO NGHIỆM THU Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: Th.S Trần Thị Vân CƠ QUAN QUẢN LÝ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 04/ 2017 TÓM TẮT Đề tài "Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn" thực nhằm xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm L lecanii môi trường bán rắn để tạo chế phẩm, sau đánh giá hiệu chế phẩm lên rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn Nghiên cứu thực với nội dung chính: Nhân sinh khối nấm L lecanii môi trường bán rắn khảo sát ảnh hưởng số yếu tố (thời gian nuôi cấy, ẩm độ, nhiệt độ thời gian tồn trữ) đến mật số bào tử q trình nhân ni Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti sắn chế phẩm phịng thí nghiệm nhà lưới Qua trình nghiên cứu thu kết Xây dựng quy trình nhân ni nấm L lecanii đơn giản sử dụng gạo tấm, 10% khoáng Czapek, 10 ml giống ngày tuổi, pH 6,0, bổ sung ẩm độ 30%, nhiệt độ tối ưu 27oC, nuôi 12 ngày cho mật số bào tử L lecanii đạt mức trung bình 7,56 x 109 bào tử/g Chế phẩm L lecanii sau nhân nuôi, tách bào tử phối trộn giữ mức độ ẩm tương đương 10%, đóng gói túi thiếc có hàn miệng tồn trữ 27oC Sau tháng tồn trữ, chế phẩm L lecanii có 66,83% số lượng bào tử sống sót, đạt mật số trung bình 1,29 x 109 bào tử/g Khi phun chế phẩm L lecanii nồng độ 1x108 bào tử/g điều kiện phịng thí nghiệm, sau ngày xử lí chế phẩm có hiệu lực diệt rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti đạt 92% Trong điều kiện nhà lưới, phun chế phẩm L lecanii 1x108 bào tử/g lên rệp sáp bột hồng đạt hiệu lực 88,1%, gần tương đương với hiệu lực thuốc sinh học Actimax hoạt chất Emamectin benzoate (50g/kg) (90%) Sử dụng chế phẩm L lecanii 1x108 bào tử/g, phun lên rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn đồng ruộng nên áp dụng mức phun kg/ha cho hiệu lực diệt rệp đạt 67,11% i ABSTRACT Research “The pilot study produced Lecanicillium lecanii fungi to control cassava mealybugs (Phenacoccus manihoti) damage on cassava” is done in order to build processes of L lecanii fungal biomass, then evaluate the effectiveness of the fished product to cassava mealybugs (P manihoti) The study was conducted with three main components: Culturing L lecanii fungal biomass on semi-solid environment and investigate the influence of factors (culture time, humidity, temperature and storage time) to the density of spores in the culture Laboratory, greenhouse and field studies established the scientific basis for quantifying the impact of the fished product to control cassava mealybugs Results that: Established processes culturing L lecanii fungal biomass on semi-solid environment simple using broken rice, mineral Czapek 10%, 10 ml of the L lecanii 5day-old, pH 6.0, 30% humidity, the optimal temperature 27oC, after 12 days will to get L lecanii spore density averaged 7.56 x 109cfu/g After culture L lecanii on semi-solid environment, separation and mixing spores keep moisture levels equivalent to 10%, packed in tin solder mouth bags stored at 27oC After months, with 66.83% of the spores survived, the L lecanii product achieve average density of 1.29 x 109 cfu/g Spraying the L lecanii product in a concentration 1x108 cfu/ml on P.manihoti in laboratory, after days to control cassava mealybugs up to 92% In greenhouse, spraying 1x108 cfu/g L lecanii to cassava mealybugs reached 88.1% effect, roughly equivalent to the effect of biological drugs active ingredient Emamectin benzoate Actimax (50g /kg) Using the L lecanii product (1x108 cfu/g) at 5kg /ha sprayed on fields will to control cassava mealybugs with effect up to 67.11% ii MỤC LỤC Tựa mục Trang Tóm tắt I Abstract II Mục lục III Danh mục kí hiệu chữ viết tắt VI Danh sách bảng VII Danh sách hình VIII CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu sơ lược sắn 2 Tổng quan rệp hại trồng 2.1 Khái quát chung họ rệp Pseudococcidae 2.2 Rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti 2.2.1 Nguồn gốc, phân bố kí chủ P manihoti 2.2.2 Đặc điểm sinh học hình thái 2.2.3 Triệu chứng gây hại 2.2.4 Biện pháp phòng trừ Tổng quan nấm Lecanicillium lecanii 3.1 Giới thiệu sơ lược nấm ký sinh trùng 3.2 Vị trí phân loại chi nấm Lecanicillium 3.3 Cơ chế công Lecanicillium spp lên côn trùng 3.4 Một số đặc điểm hình thái sinh lý nấm Lecanicillium spp 3.5 Những nghiên cứu nước nấm L lecanii 10 CHƢƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 17 2.1 Nội dung 1: Nhân sinh khối nấm L lecanii môi trường bán rắn khảo sát ảnh hưởng ẩm độ, thời gian nuôi cấy, nhiệt độ, độ pH đến mật số bào tử trình nhân nuôi 17 2.2 Nội dung 2: Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng gây hại sắn chế phẩm L lecanii phịng thí nghiệm iii 20 2.3 Nội dung 3: Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn chế phẩm L lecanii nhà lưới 21 2.4 Nội dung 4: Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng gây hại sắn chế phẩm L lecanii diện hẹp huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh 22 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men L lecanii 24 3.1.1.Chọn lọc dòng nấm sử dụng nghiên cứu 24 3.1.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến phát triển L lecanii q trình nhân ni 25 3.1.3 Khảo sát ảnh hưởng ẩm độ môi trường đến phát triển nấm q trình nhân ni 26 3.1.4 Khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển L lecanii q trình nhân ni 28 3.1.5 Đánh giá thời gian tồn trữ chế phẩm nấm L lecanii sau nhân nuôi 29 3.2 Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) sắn chế phẩm L lecanii phòng thí nghiệm 33 3.3 Đánh giá hiệu lực phịng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) sắn chế phẩm L lecanii điều kiện nhà lưới 36 3.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn chế phẩm L lecanii diện hẹp huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh 38 3.4.1 Ảnh hưởng loại thuốc thí nghiệm đến số gây hại (%) rệp sáp bột hồng sắn huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh 38 3.4.2 Hiệu lực loại thuốc thí nghiệm rệp sáp bột hồng sắn huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh 40 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 44 4.1 Kết luận 44 4.2 Đề nghị 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 iv DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIỆT ĐC Đối chứng NT Nghiệm thức LLL Lần lặp lại L Lecanicillium PD Potato dextrose ctv Cộng tác viên P Phenacoccus v DANH MỤC CÁC BẢNG Tên bảng Trang Bảng 1.1 Một số sản phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii lưu hành 14 Bảng 2.1 Các nghiệm thức thí nghiệm 22 Bảng 3.1 Sự phát triển L lecanii mức ẩm độ khác 27 Bảng 3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển L lecanii 28 Bảng 3.3 Mật số bào tử L lecanii môi trường chất sau 12 ngày nuôi cấy sau giai đoạn sấy khô nhiệt độ phòng 30 Bảng 3.4 Mật số bào tử ngày tồn trữ sau phối trộn với phụ gia 31 Bảng 3.5 Tỷ lệ (%) bào tử L lecanii sống sót tạp nhiễm sau thời gian bảo quản khác 27oC 32 Bảng 3.6 Hiệu lực (%) chế phẩm L lecanii nồng độ dịch bào tử khác phun lên rệp sáp bột hồng (P manihoti) phịng thí nghiệm 34 Bảng 3.7 Hiệu lực (%) chế phẩm L lecanii loại thuốc P manihoti điều kiện nhà lưới 37 Bảng 3.8 Mức độ gây hại rệp sáp bột hồng vườn sắn huyện Hòa Thành, Châu Thành Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh 38 Bảng 3.9 Ảnh hưởng loại thuốc thí nghiệm đến số gây hại (%) rệp sáp bột hồng sắn xã Trường Đông, huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh 39 Bảng 3.10 Hiệu lực (%) thuốc thí nghiệm lên rệp sáp bột hồng sắn xã Trường Đông, huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh vi 40 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Tên hình Trang Hình 1.1 Hình thái nấm Lecanicillium (Humber, 2005) Hình 2.1 Các loại thuốc sử dụng thí nghiệm ngồi đồng ruộng 23 Hình 3.1 Bộ mẫu nấm L lecanii lưu trữ 4oC 24 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái mẫu nấm L lecanii quan sát kính hiển vi quang học vật kính 40X 25 Hình 3.3 Phân lập lại mẫu nấm L lecanii từ thể rệp sáp bột hồng 25 Hình 3.4 Ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh bào tử L lecanii 26 Hình 3.5 Nấm L lecanii phát triển môi trường bán rắn nghiệm thức ẩm độ khác sau 12 ngày nuôi cấy 27oC 29 Hình 3.6 Sinh khối L lecanii nghiệm thức nhiệt độ khác sau 12 ngày nuôi cấy, ẩm độ khơng khí 50-60% 29 Hình 3.7 Chế phẩm sau sấy khô nhiệt độ 37oC (A); chế phẩm sau chà xát, nghiền rây phối trộn (B); đếm mật số bào tử phương pháp sử dụng buồng đếm hồng cầu Thomas (Đức) (C) 33 Hình 3.8 Đếm khuẩn lạc chế phẩm nấm L lecanii kiểm tra vi sinh vật tạp nhiễm trình bảo quản 33 Hình 3.9 Bố trí thí nghiệm chủng chế phẩm L lecanii với mức nồng độ khác lên rệp sáp bột hồng (P manihoti) sắn phịng thí nghiệm 35 Hình 3.10 Các độ tuổi rệp sáp bột hồng (P manihoti) 36 Hình 3.11 Rệp sáp bột hồng (P manihoti) sắn bị nấm L lecanii ký sinh sau ngày chủng điều kiện phịng thí nghiệm 36 Hình 3.12 Bố trí thí nghiệm cấy sắn diện hẹp ngồi đồng ruộng 40 Hình 3.13 Cách đánh dấu tiêu 40 Hình 3.14 Phun thuốc cho nghiệm thức thí nghiệm ruộng sắn 40 vii PHẦN MỞ ĐẦU Tên đề tài/dự án: Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn Chủ nhiệm đề tài/dự án: Th.S Trần Thị Vân Cơ quan chủ trì: Trung tâm Phát triển Khoa học Công nghệ Trẻ Thời gian thực hiện: 18 tháng (từ tháng 04/ 2015 đến tháng 10/ 2016) Kinh phí duyệt: 80.000.000 Kinh phí cấp:40.000.000 theo TB số:TB-SKHCN ngày 10/06/2015 Mục tiêu: Xây dựng quy trình nhân sinh khối nấm L lecanii môi trường bán rắn để tạo chế phẩm thử nghiệm hiệu chế phẩm lên rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn Nội dung: Nhân sinh khối nấm L lecanii môi trường bán rắn khảo sát ảnh hưởng số yếu tố (ẩm độ, thời gian nuôi cấy thời gian tồn trữ) đến mật số bào tử trình nhân ni Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến phát triển nấm q trình nhân ni Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng ẩm độ môi trường đến phát triển nấm q trình nhân ni Thí nghiệm 3: Đánh giá thời gian tồn trữ sản phẩm sau nhân ni Đánh giá hiệu lực phịng trừ rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti sắn chế phẩm phịng thí nghiệm Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti sắn chế phẩm nhà lưới Sản phẩm đề tài/dự án Chế phẩm sinh học Lecanicillium lecanii dạng bột Quy trình tạo chế phẩm điều kiện bảo quản chế phẩm L lecanii dạng bột viii Trong nghiên cứu Đỗ Khắc Sáng (2014), chủng L lecanii nhân nuôi thử nghiệm hiệu lực nấm lên rệp ngô (Rhopalosiphum maidis), kết ghi nhận, sau ngày theo dõi điều kiện phịng thí nghiệm điều kiện nhà lưới đạt hiệu lực cao Ở điều kiện phịng thí nghiệm, mẫu nấm VPH – HM3 (L lecanii) có hiệu lực diệt rệp đạt 94,0% nồng độ x 107 bào tử/ml Như vậy, so với thuốc hóa học Maxfos 50EC NT1 thuốc sinh học Actimax NT2, chế phẩm từ nấm L lecanii mật số 1x108 bào tử/g đạt hiệu lực cao (88,1%) thử nghiệm lên rệp sáp bột hồng (P manihoti) nhà lưới Hiệu thuốc hóa học đạt cao nhất, sử dụng lâu dài gây kháng thuốc rệp, vậy, xét hiệu lực chế phẩm L lecanii q trình thí nghiệm mức độ an tồn mơi trường, coi chủng nấm có tiềm kiểm soát rệp gây hại sắn 3.4 Đánh giá hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng (P manihoti) gây hại sắn chế phẩm L lecanii diện hẹp 3.4.1 Ảnh hƣởng loại thuốc thí nghiệm đến số gây hại (%) rệp sáp bột hồng sắn huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh Bảng 3.8 Mức độ gây hại rệp sáp bột hồng vườn sắn huyện Hòa Thành, Châu Thành Dương Minh Châu, tỉnh Tây Ninh Mức độ gây hại (%) Số hộ dân Tỷ lệ (%) Không bị gây hại 16 30 20 (Nguyễn Hồng Thái, 2015) Thơng qua số liệu bảng 3.8 thấy có 16% số hộ dân trồng sắn không bị rệp sáp bột hồng gây hại Trong mức độ gây hại rệp sáp bột hồng từ 15% – 30% cao chiếm 40% số hộ dân điều tra Số hộ dân trồng sắn bị rệp sáp bột hồng gây hại nặng 30% chiếm 20% tổng số hộ điều tra Chứng tỏ phát triển rệp sáp bột hồng thời điểm mạnh, khơng có biện pháp can thiệp kịp thời phát triển thành dịch hại lớn 38 Số liệu bảng 3.9 cho thấy số gây hại rệp sáp bột hồng trước phun thuốc biến động từ 50,48% đến 61,90% khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê Bảng 3.9 Ảnh hưởng loại thuốc thí nghiệm đến số gây hại (%) rệp sáp bột hồng sắn xã Trường Đơng, huyện Hịa Thành, tỉnh Tây Ninh Ảnh hƣởng loại thuốc đến số gây hại (%) rệp sáp bột hồng sắn Nghiệm thức Trƣớc NSP NSP 10 NSP 14 NSP 21 NSP phun 56,19 50,47 46,67 25,71c 20,00c 21,90c NT1 61,90 56,19 46,67 25,71c 18,10c 23,81c NT2 54,29 40,95 29,52 29,52bc 31,43bc 35,24bc NT3 56,19 56,19 50,48 44,76ab 46,66ab 46,66ab NT4 50,48 50,48 50,48 50,48a 56,19a 61,90a ĐC 0,25ns 0,63ns 1,41ns 4,12* 17,56** 13,31** F tính 17,66 17,76 18,40 16,53 11,97 12,66 CV(%) Ghi chú: Trong cột giá trị có kí tự theo sau khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê NT1: L.lecanii x 108 bào tử/g (5 kg/ha); NT2: L lecanii x 108 bào tử/g (8 kg/ha); NT3: SafeStrike (2 lít/ha); NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g (2 kg/ha); ĐC: Đối chứng (phun nước) Giai đoạn ngày sau phun có số gây hại biến động từ 40,95% đến 56,19% khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê NT3 (SafeStrike (2 lít/ha)) có số gây hại thấp 40,95%, NT4 Metarhizium sp 108 bào tử/g (2 kg/ha) có số gây hại cao 56,19% Giai đoạn ngày sau phun có số gây hại biến động từ 29,52% đến 50,48% khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê, NT3 SafeStrike (2 lít/ha) có số gây hại thấp 29,52% NT4 Metarhizium sp 108 bào tử/g (2 kg/ha) đối chứng có số gây hại cao 50,48% Giai đoạn 10 ngày sau phun có số gây hại biến động từ 25,71% đến 50,48% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,05 Giai đoạn 14 ngày sau phun có số gây hại biến động từ 18,10% đến 56,19% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 Nghiệm thức đối chứng có số gây hại cao 56,19% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT2, NT1 NT3 khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê so với NT4 Giai đoạn 21 ngày sau phun có số gây hại biến động từ 21,90% đến 61,90% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT1: L lecanii 39 x 108 bào tử/g (5 kg/ha) có số gây hại thấp khác biệt có ý nghĩa thống kê so với đối chứng có số gây hại cao 61,90% Như vậy, thí nghiệm đồng để đánh giá số gây hại chế phẩm nấm L lecanii lên rệp sáp sắn cho thấy, NT1: L lecanii x 108 bào tử/g (5 kg/ha) NT2: L lecanii x 108 bào tử/g (8 kg/ha) có số gây hại thấp so với nghiệm thức khác 3.4.2 Hiệu lực loại thuốc làm thí nghiệm rệp sáp bột hồng sắn huyện Hòa Thành, tỉnh Tây Ninh Hình 3.12 Bố trí thí nghiệm phun lên rệp sắn ngồi đồng ruộng Hình 3.13 Cách đánh dấu tiêu Hình 3.14 Phun thuốc cho nghiệm thức thí nghiệm ruộng sắn Số liệu bảng 3.10 cho thấy giai đoạn ngày sau phun có hiệu lực rệp sáp bột hồng biến động từ 0,00% đến 24,73% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT3: SafeStrike (2 lít/ha) có hiệu cao 24,73% khác biệt 40 có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại NT1: L lecanii x 108 bào tử/g (5 kg/ha) 10,62% NT2: L lecanii x 108 bào tử/g (8 kg/ha) 9,81% khác biệt thống kê khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT3: SafeStrike (2l/ha) 21,73% NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g 0,00% Bảng 3.10 Hiệu lực (%) thuốc thí nghiệm lên rệp sáp bột hồng sắn xã Trường Đơng, huyện Hịa Thành, tỉnh Tây Ninh Nghiệm thức NT1 NT2 NT3 NT4 F tính CV(%) NSP 10,62b 9,81b 24,73a 0,00c 98,18** 10,14 Hiệu lực (%) thuốc thí nghiệm NSP 10 NSP 14 NSP 16,80bc 54,83a 68,14a 24,99b 57,82a 72,88a 46,80a 45,02a 46,87b 10,84c 21,67b 25,56c 27,89** 38,05** 52,49** 11,71 6,70 6,59 21 NSP 67,11a 67,24a 46,12b 32,55c 46,13** 5,43 Ghi chú: Trong cột giá trị có kí tự theo sau khác biệt khơng có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT1: L lecanii x 108 bào tử/g (5 kg/ha); NT2: L lecanii x 108 bào tử/g (8 kg/ha); NT3: SafeStrike (2 lít/ha); NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g (2 kg/ha) Giai đoạn ngày sau phun có hiệu lực loại thuốc thí nghiệm biến động từ 10,84% đến 46,80% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT3: SafeStrike (2 lít/ha) có hiệu lực cao 46,80% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Trong khi, NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g có hiệu lực thấp 10,84% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT3: SafeStrike (2 lít/ha) NT2: L lecanii x 108 bào tử/g (8 kg/ha) 24,99%, khơng có khác biệt so với NT1: L lecanii x 108 bào tử/g (5 kg/ha) Giai đoạn 10 ngày sau phun có hiệu loại thuốc thí nghiệm biến động từ 21,67% đến 57,82% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT1: L lecanii 108 bào tử/g (5 kg/ha) 54,83%, NT2: L lecanii 108 bào tử/g (8 kg/ha) 57,82% NT3: SafeStrike (2 lít/ha) 45,02% khơng có khác biệt thống kê khác biệt có ý nghĩa so với NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g có hiệu thấp 21,67% Giai đoạn 14 ngày sau phun có hiệu loại thuốc thí nghiệm biến động từ 25,56% đến 72,88% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 NT1: L lecanii 108 bào tử/g (5 kg/ha) 68,14% NT2: L lecanii 108 bào tử/g (8 kg/ha) 72,88% có hiệu cao có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm 41 thức lại Trong NT3: SafeStrike (2l/ha) 46,87% khác biệt có ý nghĩa thống kê so với NT4: Metarhizium sp 108 bào tử/g có hiệu lực thấp 25,56% Giai đoạn 21 ngày sau phun có hiệu lực loại thuốc thí nghiệm biến động từ 32,55% đến 67,24% khác biệt có ý nghĩa thống kê mức 0,01 Trong đó, NT1: L lecanii 108 bào tử/g (5 kg/ha) 67,11% NT2: L lecanii 108 bào tử/g (8 kg/ha) 67,24% có hiệu lực cao có khác biệt có ý nghĩa thống kê so với nghiệm thức lại Kết cho thấy, nghiệm thức phun L lecanii kg/ha L lecanii kg/ha có hiệu lực cao hiệu lực nghiệm thức lại Tuy nhiên, khác biệt hiệu lực thuốc nghiệm khơng đáng kể, xét hiệu kinh kế, nên áp dụng mức phun L lecanii 108 bào tử/g (5 kg/ha) sử dụng diện rộng Thảo luận chung: Quy trình nhân sinh khối nấm khâu quan trọng công nghệ lên men nấm tạo bào tử Việc lựa chọn phương pháp lên men tối ưu điều kiện lên men cần thiết để sản xuất nhiều bào tử với hiệu kinh tế cao Hiện có hai phương pháp lên men phổ biến lên men lỏng lên men rắn Phương pháp lên men rắn có số nhược điểm khó khăn q trình trộn mơi trường lên men, mơi trường lên men có độ đồng khơng cao, khó kiểm sốt giống phải nhân giống theo đợt, việc kiểm soát pH phức tạp, độ ẩm chất liên tục thay đổi trình lên men, khả truyền nhiệt chất Nhưng có nhiều ưu điểm quan trọng yêu cầu thiết bị vận hành đơn giản, tận dụng nguồn chất không tan nước sản phẩm phụ nơng nghiệp với chi phí thấp, bề mặt lên men rộng nên dễ trao đổi nhiệt khơng khí, khơng địi hỏi kiểm sốt nghiêm ngặt thơng số q trình lên men, tiêu thụ nước lượng, nước thải, dễ dàng kiểm sốt tạp nhiễm, chi phí đầu tư thiết bị vận hành rẻ Từ kết thích hợp cho sinh trưởng phát triển chủng nấm L lecanii khảo sát, quy trình nhân ni sản xuất thử L lecanii xây dựng sau: 42 Môi trường lên men (gạo ngâm giờ, bổ sung 10 % khoáng Czapek) ↓ Điều chỉnh độ ẩm (30%), điều chỉnh pH thích hợp (pH = 6.0) ↓ Cho vào bịch bóng (bình tam giác) có dung tích 500ml ↓ Khử trùng (1210C, 1atm, 15 phút) ↓ Để nguội, cho vào bình 10 ml nấm, lắc trộn ↓ Nuôi 270C 12 ngày ↓ Phơi khô nhiệt độ 33-37oC 72 h Nghiền + phối trộn Đóng gói, bảo quản, sử dụng Thuyết minh quy trình Bước 1: Chuẩn bị mơi trường: gạo ngâm giờ, bổ sung 10% khoáng Czapek, độ ẩm khoảng 30%, pH = 6.0, trộn phân phối vào bình tam giác (bịch bóng) Bước 2: Hấp khử trùng 1210C, 1atm, 15 phút để nguội Bước 3: Cho vào 10ml dung dịch nấm L lecanii (mật số 108 bảo tử/ml), trộn Bước 4: Để nhiệt độ phòng 27oC 12 ngày Bước 5: Phơi khô nhiệt độ 37oC 72 Bước 6: Nghiền, rây phối trộn với bột phụ gia tỷ lệ 20:80 Bước 7: Đóng gói, bảo quản nhiệt độ phòng Lưu ý: Trong bước bước phải thường xuyên lấy mẫu để kiểm tra tạp nhiễm mức độ sống sót bào tử 43 CHƢƠNG IV KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Đã xây dựng quy trình nhân ni nấm L lecanii đơn giản sử dụng gạo tấm, 10% khoáng Czapek, 10 ml giống ngày tuổi, pH 6,0, bổ sung ẩm độ 30%, nhiệt độ tối ưu 27oC, nuôi 12 ngày cho mật số bào tử L lecanii đạt mức trung bình 7,56 x 109 bào tử/g Chế phẩm L lecanii sau nhân nuôi, tách bào tử phối trộn giữ mức độ ẩm tương đương 10%, đóng gói túi thiếc có hàn miệng tồn trữ 27oC Sau tháng chế phẩm L lecanii đạt mật số 1,29 x 109 bào tử/g, có 66,83% số lượng bào tử sống sót Khi phun chế phẩm L lecanii nồng độ 1x108 bào tử/ml điều kiện phịng thí nghiệm, sau ngày xử lí chế phẩm có hiệu lực diệt rệp sáp bột hồng Phenacoccus manihoti đạt 92% Trong điều kiện nhà lưới, phun chế phẩm L lecanii 1x108 bào tử/g lên rệp sáp bột hồng đạt hiệu lực 88,1%, gần tương đương với hiệu lực thuốc sinh học Actimax hoạt chất Emamectin benzoate (50g/kg) (90%) Sử dụng chế phẩm L lecanii 1x108 bào tử/g, phun lên rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn đồng ruộng nên áp dụng mức phun kg/ha cho hiệu lực diệt rệp đạt 67,11% 4.2 Đề nghị Tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện quy trình sản xuất chế phẩm L lecanii quy mô lớn Thử nghiệm hiệu lực chế phẩm L lecanii lên rệp sáp bột hồng nhiều vùng trồng sắn Đưa chế phẩm vào ứng dụng thực tế sản xuất 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng việt Chu Hồng Quảng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi 2013 Tối ưu môi trường lên men rắn sản xuất bào tử nấm ký sinh côn trùng Lecanicillium lecanii Hội nghị Khoa học Cơng nghệ sinh học tồn quốc, tập 2, 2013 Đỗ Khắc Sáng 2014 Nghiên cứu khả gây bệnh nấm Lecanicillium spp lên rệp Rhopalosiphum maidis gây hại ngô Luận văn tốt nghiệp chuyên ngành Công nghệ sinh học Trường Đại học Nông Lâm Tp HCM Nguyễn Ngọc Ngoạn 2007 Giáo trình sắn Nhà xuất nông nghiệp Hà Nội Nguyễn Hoàng Thái 2015 Điều tra trạng hiệu lực số loại thuốc sinh học rệp sáp bột hồng Phenacocus manihoti hại khoai mì tỉnh Tây Ninh Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Nông học Nguyễn Thị Nguyệt, Chu Hồng Quảng, Vũ Văn Hạnh, Quyền Đình Thi 2013 Nghiên cứu sản xuất chế phẩm bào tử nấm ký sinh côn trùng Lecaniicillium lecanii L439 Hội nghị Khoa học Công nghệ sinh học toàn quốc, tập 2, 2013 Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia khảo nghiệm đồng ruộng hiệu luật thuốc bảo vệ thực vật phòng trừ sâu nhện hại trồng QCVN 01-1: 2009/BNNPTNT Trần Văn Mão 2008 Sử dụng côn trùng vi sinh vật có ích (tập 2) Sử dụng vi sinh vật có ích Nhà xuất Nơng nghiệp Hà Nội Trần Văn Mão 2008 Sử dụng sâu nấm có ích Giáo trình Đại học Lâm Nghiệp Trần Hồng Kim Phạm Văn Biên, 1995 Cây sắn Nhà xuất nơng nghiệp TP Hồ Chí Minh 10 Trần Thị Vân, Lê Đình Đơn, Bùi Cách Tuyến 2014 Điều tra thu thập nấm kí sinh loại trùng hại trồng Tây Nguyên, miền Đông Tây Nam Tạp chí Nơng nghiệp Phát Triển Nơng Thơn, số 241, năm 2014 11 Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6862 – 2001 Phương pháp tính ẩm độ nơng sản, thực phẩm Tổng cục Tiêu chuẩn đo lường chất lượng, Bộ Khoa học Công nghệ 12 Võ Thị Thu Oanh, Bùi Cách Tuyến, Lê Đình Đơn Nguyễn Thị Chắt 2007 Khả gây bệnh nấm Metarhizium anisopliae Metsh Sorokin rệp sáp giả (Dysmcoccus sp.) na (Anonasquamosa L.) Tạp chí BVTV số 3/2008, pp 24 13 Vũ Xuân Đạt 2011 Nghiên cứu sử dụng nấm Lecanicillium kí sinh trùng để kiểm sốt rệp hại rau Luận văn thạc sĩ Trường Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội 45 Tiếng anh 14 Bartlett, M C and Jaronski, S T 2004 Mass production of entomogenous fungi for biological control of insects In: Fungi in Biological Control System pp 61-85 15 Baysal, Z., Uyar, F and Aytekin, C 2003 Solid state fermentation for production of α-amylase by a thermotolerant Bacillus subtilis from hot-spring water Process Biochem 38:1665-1668 16 Bellotti, A C & A van Schoonhoven 1985 Cassava pests and their control, p 343-92 In: J H Cock & J A Reyes (eds.), Cassava: Research, Production and Utilization CIAT, Cali, Colombia 745 p 17 Bidochka M.L., St Leger M.L., Stuart A and Gowanlock K 1999 Nuclear rRNA phylogeny in the fungal genus Verticillium and its relationship to insect and plant virulence, extracellular proteases and carbohydrases Microbiology 145: 955 - 963 18 Cloyd, 1999 The Entomopathogen Verticillium lecanii Department of Entomology University of Illinois 19 Day Eric, Herbert Ames, Hull Cathy, Youngman and Roger 2009 Aphids in Virginia Small Grains: Life Cycles, Damage and Control Virginia cooperative extension Produced by Communications and Marketing, College of Agriculture and Life Sciences, Virginia Polytechnic Institute and State University 20 Day Eric and Spring Alexandra, 2002 Entomology Fact Sheet: Aphids Virginia Cooperative Extension Virginia Polytechnic Institute and State University 21 Derakhshan Ali., Rabindra R.J, Ramanujam B and Mehdi Rahimi 2008 Evaluate of Different Media and Methods of Cultivation the Production and Viability of Entonopathogenic Fungi, Verticillium lecanii (Zimm.) Viegas Pakistan Joumal of Biological Sciences, pp: - 22 El-Salam A.M.E Abd and El-Hawary F.M.A, 2011 Lethal and pathogenic effects of Beauveria bassiana and Lecanicillium lecanii on the adult and nymph of Aphis craccivora Koch Archives of Phytopathology and Plant Protection 44:57-66 23 Ekbom B.S and Ahman I 1980 The fungus Verticillium fusisporum as an insect pathogen Journal of Invertebrate Pathology 36: 136 - 138 24 FAO 2013 Production crops FAOSTAT 25 Feng, M G., Poprawski, T J and Khachatourians, G G 1994 Production, formulation and application of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana for insect control: Current status Biocontrol Sci Technol 4:3-34 26 Feng K.C., Liu B.L and Tzeng Y.M 2000 Verticillium lecanii spore production in solid state and liquid state fermentations Biopro and Biosys 23: 25 - 29 46 27 Feng, M G., Chen, B and Ying, S H 2004 Trials of Beauveria bassiana, Paecilomyces fumosoroseus and Imidacloprid for management of Tialeurodes vaporariorum on greenhouse grown lettuce Bio Sci Technol 14:531-544 28 Flint, M L 1998 Pests of the Garden and Small Farm: A Grower's Guide to Using Less Pesticide Oakland: Univ Calif Agric Nat 29 Flint M L., 2013 Pest note: Aphids Produced by UC Statewide, Integrated Pest Management Program, University of California, Davis 30 Gams W and Zare R 2001 A revision of Verticillium sect Prostrata III Generic classification 72: 329 - 337 31 Goettel M.S., Koike M., Kim J.J., Aiuchi D., Shinya R and Brodeur J 2008 Potential of Lecanicillium spp for management of insects, nematodes and plant diseases PatholJul 98: 256 - 61 32 Hall, R.A and H.D Burges, 1979 Control of glasshouse aphids with the fungus, Verticillium lecanii Annals of Applied Biology 93: 235-246 33 Hajek A E and Leger R J 1994 Interactions between fungal pathogens and insect host Ann Rev Entomol 39: 293 - 322 34 Humber Rhichard A., 2005 ARSEF Host by Fungus Insect Mycologis pp: 206 - 207 35 Johnson Paul 2003 Aphids and their control on orchids Insect Research Collection, South Dakota State University, Brookings 36 Jenkins, N E., Heviefo, G., Langewald, J., Cherry, A J and Lomer, C J 1998 Development of mass production technology for aerial conidia for use as mycopesticides Biocontrol News and Information 19:21-31 37 Jeong Jun Kim, Min Ho Lee, Cheol-Sil Yoon1, Hong-sun Kim, Jai-Ki Yoo, and Kyu-Chin Kim 2001 Control of cotton aphid and greenhouse whitefly with a fungal pathogen Invertebrate Pathology 27: 41-48 38 Kanagaratnam P., Hall R.A and Burges H.D 1982 Control of glasshouse whitefly, Trialeurodes vaporariorum, by an aphid strain of the fungus Verticillium lecanii Annals of Applied Biology 100: 213 -219 39 Khalil S K., Bartos, J and Landa, Z 2003 Effectiveness of Verticillium lecanii to reduce populations of aphid under glasshouse and field conditions Agr Ecosys Environ 12:151-156 40 LUBILOSA 2002 Section VII Mass production of fungal pathogenes for insect control – Insect pathology manual Technical Bulletins biologycal control of Locusts and Grasshoppers (LUBILOSA) 5-20 41 Milner R.J and Lutton G.G 1986 Dependence of Verticillium lecanii (Fungi: Hyphomycetes) on high humidities for infection and sporulation using Myzus persicae as host Environmental Entomology 15: 380 - 382 47 42 Milner, R.J 1997 Prospects for biopesticides for aphid control Entomophaga 42: 227- 239 43 Mehta Jitendra, Neha Kaushal, Priya Sen, Dev Ratan Sharma, Maninder Singh Dhillon and Banwari Lal Mathuriya 2012 Impact of carbon & nitrogen sources on the Verticillium lecanii and Metarhizium anisopliae- Entomopathogenic fungi European Journal of Experimental Biology (4):1278-1283 44 Neuenschwander P, 2001 Biological control of the cassava mealybug in Africa: a review Biological Control 21: 214 – 229 45 Park Heeyong and Kim Keun 2010 Selection of Lecanicillium Strains with High Virulence against Developmental Stages of Bemisia tabaci Mycobiology 38: 210 - 214 46 Saba Hasan, Anis Ahmad, Abhinav Purwar, Nausheen Khan, Rishi Kundan and Garima Gupta 2013 Production of extracellular enzymes in the entomopathogenic fungus Verticillium lecanii Amity Institute of Biotechnology, Amity University Uttar Pradesh, Lucknow Campus 226010, India 47 Samson, R A 1974 Paecilomyces and some allied Hyphomycetes Studies in Mycology, No 48 Smith C.F and Cermeli M.M 1979 An annotated list of Aphididae (Homoptera) of the Caribbean Islands and South and Central America North Carolina Agricultural Research Service Technical Bulletin, pp: - 131 49 Talwar Brahathi H 2005 Isolation and characterization of enomopathogenic fungi and their effectiveness Department of agriculture microbiology, university of agricultural sciences, Dharwad, pp: - 103 50 Van Hanh Vu, Suk I Hong and Keun Kim, 2008 Production of Aerial Conidia of Lecanicillium lecanii 41185 by Solid-State Fermentation for Use as a Mycoinsecticide Mycobiology 36(3) : 183-189 51 Vu, V H., Hong, S I and Kim, K 2007 Selection of entomopathogneic fungi for aphid control J Biosci Bioeng 104: 498-505 52 Wilding N 1981 The effect of systemic fungicides on the aphid pathogen Cephalosporium aphidicola Plant Pathology 21: 137-139 53 Zare R., Kouvelis, Typas and Bridge 1999 Presence of a 20 bp insertion/deletion in the ITS1 region of Verticillium lecanii Microbiology 28: 258 - 262 LỜI CẢM ƠN: Cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ Tp Hồ Chí Minh Chương trình Vườn ươm Khoa học trẻ Thành đồn Tp Hồ Chí Minh hỗ trợ kinh phí cho nghiên cứu 48 PHỤ LỤC Phụ lục Danh sách đề tài sinh viên có sử dụng vật mẫu kinh phí nghiên cứu Ngƣời thực Tên đề tài STT Điều tra trạng hiệu lực số Nguyễn loại thuốc sinh học rệp sáp bột hồng Hoàng Thái Phenacocus manihoti hại khoai mì tỉnh Tây Ninh Năm tốt nghiệp Đơn vị đào tạo 2015 Trường ĐH Nông Lâm TpHCM Phụ lục 2: Danh sách sinh viên đạt giải thƣởng NCKH có sử dụng vật mẫu kinh phí đề tài để thực STT Tên đề tài báo cáo Xếp giải Năm Giải III 2016 Giải thƣởng Nghiên cứu thiết lập quy trình nhân sinh khối nấm ký sinh côn trùng M anisopliae, B bassiana L lecanii tạo chế phẩm trừ sâu sinh học SV NCKH 2016 Bộ GDĐT tổ chức Phụ lục 3: Danh sách báo đăng tải tạp chí khoa học có sử dụng vật mẫu kinh phí đề tài STT Tên đề tài báo cáo Nghiên cứu thử nghiệm sản xuất chế phẩm từ nấm Lecanicillium lecanii phòng trừ rệp sáp bột hồng (Phenacoccus manihoti) gây hại sắn Tạp chí/Kỷ yếu Tác giả Năm Bảo vệ thực vật (đang gửi duyệt đăng) Trần Thị Vân 2017 Phụ lục 4: Bảng Số liệu thực đếm mật số bào tử thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian đến phát triển nấm L lecanii Mật số bào tử nấm L lecanii qua mức thời gian theo dõi (x109 bào tử/g) Nghiệm thức 10 ngày 12 ngày 14 ngày Lặp lại Lặp lại Lặp lại Trung Bình 0,04 0,14 2,10 5,63 2,32 0,08 0,15 2,01 6,29 3,03 0,09 0,11 1,96 6,62 3,45 0,070 0,133 2,023 6,180 2,933 49 Bảng Số liệu thực mật số bào tử thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng ẩm độ môi trường đến phát triển nấm L lecanii trình nhân ni Mật số bào tử nấm L lecanii mức ẩm độ theo dõi (x10 bào tử/g) LLL1 LLL2 LLL3 TB NT1 0,01 0,01 0,01 0,01 NGÀY NT2 0,02 0,02 0,02 0,02 NT3 0,08 0,09 0,08 0,08 NT4 0,09 0,09 0,09 0,09 NT1 0,58 0,56 0,56 0,57 NGÀY NT2 0,89 0,86 0,83 0,86 NT3 1,88 1,88 1,95 1,90 NT4 2,20 2,22 2,24 2,22 0,86 0,87 0,90 0,88 10 NGÀY NT1 NT2 1,10 1,16 1,13 1,13 NT3 2,02 2,01 2,03 2,02 NT4 3,48 3,44 3,52 3,48 2,00 1,97 2,04 2,00 12 NGÀY NT1 NT2 3,85 3,78 3,83 3,82 NT3 7,36 7,42 7,45 7,41 NT4 5,34 5,33 5,38 5,35 1,19 1,20 1,24 1,21 14 NGÀY NT1 NT2 1,83 1,90 1,86 1,86 NT3 2,20 2,24 2,18 2,21 NT4 2,18 2,23 2,20 2,20 Bảng Số liệu thực mật số bào tử thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ đến phát triển nấm L.lecanii q trình nhân ni Mật số bào tử nấm L lecanii qua mức nhiệt độ theo dõi (x10 bào tử/g) LL1 LL2 LL3 TB NT1 0,04 0,05 0,03 0,04 ngày NT2 0,07 0,06 0,09 0,073 NT3 0,08 0,07 0,09 0,08 NT4 0,07 0,07 0,07 0,07 NT5 0,02 0,01 0,03 0,02 NT1 1,25 1,19 1,22 1,22 ngày NT2 1,35 1,41 1,35 1,37 NT3 1,76 1,89 1,81 1,82 NT4 1,23 1,78 1,91 1,64 NT5 0,48 0,62 0,49 0,53 NT1 1,39 1,35 1,40 1,38 10 ngày NT2 2,01 1,75 1,76 1,84 NT3 3,00 2,79 2,88 2,89 NT4 2,47 2,37 2,72 2,52 50 NT5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 12 ngày 14 ngày 0,08 1,24 5,83 7,95 6,44 0,85 1,25 1,48 2,12 1,23 0,55 0,55 1,51 5,71 7,83 6,47 0,88 1,34 1,50 2,25 1,18 0,69 0,72 1,36 5,74 8,07 6,56 0,91 1,28 1,49 2,32 1,34 0,77 0,69 1,37 5,76 7,95 6,49 0,88 1,29 1,49 2,23 1,25 0,67 Bảng chuyển đổi số liệu số gây hại: arcsin (x)1/2 LLL NT TP 1 1 2 2 3 3 3 5 57,69 54,16 40,89 61,44 47,46 47,46 61,44 57,69 40,89 40,89 40,89 40,89 44,18 44,18 47,46 19/4/2015 3NSP 54,16 50,77 34,10 61,44 47,46 44,18 57,69 47,46 40,89 40,89 37,55 37,55 37,55 44,18 47,46 23/4/2015 5NSP 50,77 44,18 26,57 57,69 47,46 40,89 50,77 40,89 37,55 40,89 37,55 34,10 30,47 40,89 47,46 26/4/2015 7NSP 37,55 30,47 30,47 54,16 47,46 26,57 34,10 37,55 34,10 40,89 26,57 26,57 30,47 37,55 47,46 30/4/2015 14NSP 30,47 26,57 34,10 54,16 54,16 26,57 26,57 37,55 37,55 44,18 22,21 22,21 30,47 37,55 47,46 07/5/2015 21NSP 30,47 30,47 34,10 54,16 57,69 26,57 30,47 40,89 37,55 47,46 26,57 26,57 34,10 37,55 50,77 Bảng chuyển đổi số liệu hiệu lực phòng trừ rệp sáp bột hồng LLL NT 1 1 2 2 3 3 4 19/4/2015 23/4/2015 26/4/2015 30/4/2015 3NSP 5NSP 7NSP 14NSP 2,92 23,58 43,85 56,95 3,03 30,71 51,28 59,91 5,21 46,91 39,23 38,89 0,71 15,79 22,64 32,98 3,32 27,31 52,63 55,24 2,81 28,13 50,34 61,43 4,95 39,23 43,85 47,36 0,71 21,42 31,09 29,02 3,72 21,42 46,91 54,74 3,72 31,09 46,91 54,74 4,90 43,31 43,31 43,31 0,71 20,06 29,02 29,02 51 07/5/2015 21NSP 58,46 56,95 41,71 36,43 57,36 59,14 46,51 34,19 49,47 49,47 40,08 33,72 52