Đánh giá khả năng tăng cường tích lũy tinh bột ở cây thuốc lá chuyển gen agps và agpl mã hóa enzyme agpase ở cây sắn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Văn Đoài ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC (Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm) Hà Nội - 2016 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT Nguyễn Văn Đoài ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 01 14 NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC TS Phạm Bích Ngọc Hà Nội - 2016 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan Luận văn hoàn toàn đƣợc hoàn thành trình nghiên cứu khoa học thân dƣới hƣớng dẫn TS Phạm Bích Ngọc với cán phịng Cơng nghệ Tế bào Thực Vật, viện Công nghệ Sinh học Các số liệu, kết đƣợc trình bày luận văn trung thực Phần văn trích dẫn đƣợc ghi rõ nguồn tham khảo Tôi xin chịu trách nhiệm lời cam đoan trƣớc hội đồng khoa học Hà nội, tháng 12 năm 2016 Học viên ii LỜI CẢM ƠN Luận văn hồn thành dựa vào kinh phí đề tài: ““Khai thác phân lập nguồn gen có sẵn tập đoàn giống sắn Việt Nam nhằm phát triển giống sắn có khả chống chịu bệnh suất cao công nghệ gen” Tôi xin chân thành cảm ơn tới TS Phạm Bích Ngọc hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi q trình học tập, làm việc hồn thành luận văn Tôi xin gửi lời cảm ơn đến cán phịng Cơng nghệ Tế bào Thực vật – Viện Công nghệ Sinh học, em Lý Khánh Linh giúp đỡ tơi suốt q trình làm việc Cuối cùng, tơi gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè bên tôi, ủng hộ giúp đỡ để tơi hồn thành tốt cơng việc hoàn thành luận văn Hà Nội, tháng 12 năm 2016 Học viên iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC .III DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT VI DANH MỤC CÁC BẢNG VII DANH MỤC CÁC HÌNH VIII MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tinh bột .3 1.1.1 Tinh bột thực vật 1.1.2 Cơ chế dự trữ tinh bột thực vật 1.1.3 Dự trữ tinh bột 1.2 Enzyme AGPase 1.2.1 Enzyme AGPase thực vật 1.2.2 AGPase sắn 10 1.3 Nghiên cứu ứng dụng cơng nghệ sinh học nhằm cải biến q trình trao đổi tinh bột 11 1.3.1 Tăng khả tích lũy tinh bột 11 1.3.2 Tăng khả phân hủy tinh bột 12 1.3.3 Thay đổi thành phần tinh bột .12 1.4 Công nghệ chuyển gen nhờ Agrobacterium tumefaciens 13 1.5 Biểu nhiều gene khung đọc mở với 2a peptide 15 iv CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 17 2.1 Vật liệu .17 2.1.1 Vật liệu 17 2.1.2 Hóa chất .17 2.2 Phƣơng pháp .18 2.2.1 Một số phƣơng pháp sinh học phân tử 18 2.2.2 Phân lập gen AGPS AGPL từ sắn .21 2.2.3 Thiết kế vector chuyển gen pBI-35S-AGPSL .23 2.2.4 Phƣơng pháp chuyển gen vào thuốc thông qua A tumefaciens 25 2.2.5 Kiểm tra dòng thuốc chuyển gen phƣơng pháp PCR .27 2.2.6 Phân tích dịng chuyển gen Western blot 28 2.2.7 Kiểm tra khả tích lũy tinh bột thuốc chuyển gen .28 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 Kết tách dòng gen AGPS AGPL 31 3.1.1 Nhân đoạn gen AGPS AGPL RT-PCR 31 3.1.2 Tách dòng gen AGPS AGPL 32 3.1.3 Kết giải trình tự với mồi M13F M13R 33 3.2 Kết thiết kế vector chuyển gen 36 3.2.1 Tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI 37 3.2.2 Nối XbaI-AGPS-SmaI SmaI-P2a-AGPL-Cmyc-SacI với pBI121 39 3.2.3 Biến nạp pBI-35S-AGPSL vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens 42 3.3 Kết chuyển gen AGPSL vào thuốc 42 3.3.1 Tạo thuốc chuyển gen AGPSL 42 3.3.2 Kiểm tra chuyển gen phản ứng PCR 44 v 3.3.3 Phân tích biểu gen AGPSL Western blot 46 3.4 Kết định lƣợng tinh bột tích lũy 48 3.4.1 Kiểm tra tinh bột Iodine 48 3.4.2 Định lƣợng tinh bột Anthrone 50 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .58 Kết luận 58 Kiến nghị 58 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 59 Sách báo 59 Website 62 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ .63 Bài báo .63 Trình tự gen .63 PHỤ LỤC 68 vi DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu 35S 3-PGA A tumefaciens ADP ADPG AGPase AGPL AGPS AGPSL ATP cDNA CDS cmyc DBE DNA EDTA GUS isoform kb kDa LB NPTII OD P2a PCR Pi RNA SBE T-DNA Tris WT Viết đầy đủ Cauliflower mosaic virus 35S promoter 3-Phosphoglyceric acid Agrobacterium tumefaciens Adenosine diphosphate Adenosine diphophate glucose ADP-glucose pyrophosphorylase AGPase large subunit (Tiểu phần lớn AGPase) AGPase small subunit (Tiểu phần nhỏ AGPase) AGPS-P2a-AGPL-cmyc Adenosine triphosphate Complementary DNA (Sợi DNA bổ sung) Coding DNA sequence Myc (human c-Myc oncogene) epitope tag Debranching enzyme (Enzyme khử nhánh mạng tinh bột) Deoxyribonucleic Ethylenediaminetetraacetic acid β-Glucuronidase gene đồng phân (enzyme) Kilo base (1000 bazơ) Kilodalton (1000 dalton) Lysogeny broth (Môi trƣờng nuôi cấy Lysogeny) Neomycin phosphotransferase II gene mật độ quang 2a peptide Polymerase Chain Reaction Inorganic phosphate (Photphate vô (HPO42-)) Ribonucleic Starch branching enzyme (Enzyme phân nhánh mạch tinh bột) Transfer DNA 2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Wild type (Kiểu dại) vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Danh sách mồi PCR sử dụng 17 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt PCR với GoTaq® Green Master Mix 2X .18 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng nối hai nhiều đoạn DNA với T4 ligase 19 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng cắt DNA với Enzyme giới hạn 20 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân dòng đoạn AGPS AGPL 22 Bảng 2.6 Thành phần chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR tổng hợp SmaI-P2aAGPL-Cmyc-SacI 24 Bảng 2.7 Tóm tắt quy trình chuyển gen phân tích chuyển gen .26 Bảng 3.1 Kết so sánh trình tự gen AGPS AGPL phân lập với trình tự tham chiếu 34 Bảng 3.2 Kết định lƣợng tinh bột sau 2h chiếu sáng 53 Bảng 3.3 Kết định lƣợng tinh bột sau 14h chiếu sáng 56 viii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Q trình chuyển hóa saccharide tổng hợp tinh bột thực vật (theo Akula Nookaraju) [1] Hình 1.2 Các phản ứng quan trọng trình tổng hợp tinh bột [48] Hình 1.3 Cấu trúc enzyme AGPase khoai tây [20] Hình 1.4 Con đƣờng tổng hợp tinh bột lục lạp chế điều hòa AGPase [37] Hình 1.5 Sơ đồ vector chuyển gen Li cộng (2010) [26] 12 Hình 1.6 Sơ đồ mô tả nguyên tắc hoạt động P2a [47] 15 Hình 2.1 Sơ đồ đoạn gen P2a:AGPL:cmyc vị trí mồi PCR 23 Hình 2.2 Sơ đồ ghép nối pBI121 với AGPS P2a-AGPL-Cmyc 25 Hình 3.1 Kết RT-PCR nhân đoạn AGPS AGPL từ RNA tổng số tách sắn 32 Hình 3.2 Kết tách dòng gen AGPS AGPL .33 Hình 3.3 Kết giải trình tự gen AGPS AGPL 34 Hình 3.4 Trình tự polypeptide AGPS AGPL phân lập 35 Hình 3.5 Một số phƣơng án biểu hai gen vector 37 Hình 3.6 Kết tổng hợp đoạn XbaI-AGPS-SmaI SmaI-P2a-AGPL-CmycSacI 38 Hình 3.7 Ảnh điện di sản phẩm cắt vector pBI121 với XbaI SacI (A) sơ đồ vector pBI121 (B) .39 Hình 3.8 Kết PCR kiểm tra khuẩn lạc biếp nạp pBI-35S-AGPSL .40 Hình 3.9 Kết kiểm tra vector A tumefaciens mang vector pBI-35SAGPSL 41 Hình 3.10 Một số hình ảnh chuyển gen AGPSL vào thuốc 43 59 DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO SÁCH VÀ BÀI BÁO Akula Nookaraju, Chandrama P Upadhyaya, Shashank K Pandey, Ko Eun Young, Se Jin Hong, Suk Keun Park,Se Won Park (2010), "Molecular approaches for enhancing sweetness in fruits and vegetables", Scientia Horticulturae, 127(1) pp 1-15 Atkins, J F., Wills, N M., Loughran, G., Wu, C.-Y., Parsawar, K., Ryan, M D., … Nelson, C (2007), "A case for “StopGo”: reprogramming translation to augment codon meaning of GGN by promoting unconventional termination (Stop) after addition of glycine and then allowing continued translation (Go)", Rna 13 pp 803810 Bachmann M., Matile P.,Keller F (1994), "Metabolism of the raffinose family oligosaccharides in leaves of Ajuga reptans L Cold acclimation, translocation, and sink to source transition: discovery of chain elongation enzyme", Plant Physiol, 105 pp 1335-1345 Bradford M M (1976), "A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding", Anal Biochem, 72 pp 248-254 Burén S., Ortega-Villasante C., Ưtvưs K., Samuelsson G., Bakó L.,Villarejo A (2012), "Use of the Foot-and-Mouth Disease Virus 2A Peptide Co-Expression System to Study Intracellular Protein Trafficking in Arabidopsis", PLoS ONE, 7(12) pp 51973 Carciofi Massimiliano, Blennow Andreas, Nielsen Morten M., Holm Preben B.,Hebelstrup Kim H (2012), "Barley callus: a model system for bioengineering of starch in cereals", Plant Methods, 8(1) pp 36 Chatterton N J.,Silvius J E (1980), "Photosynthate partitioning into leaf starch as affected by daily photosynthetic period duration in species", Physiol Plant., 49 pp 141-144 Chen S., Yao H., Han J., Liu C., Song J., Shi L., Zhu Y., Ma X., Gao T., Pang X., Luo K., Li Y., Li X., Jia X., Lin Y.,Leon C (2010), "Validation of the ITS2 region as a novel DNA barcode for identifying medicinal plant species", PLoS One, 5(1) pp 8613 Cheng Li,Robert G Gilbert (2016), "Progress in controlling starch structure by modifying starch-branching enzymes", Planta 243(13) 10 Cline J., Braman J C.,Hogrefe H.H (1996), "PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases", Nucl Acid Res., 24 pp 3546-51 11 Deblaere R., Bytebier B., De Greve H., Deboeck F, Schell J, Van Montagu M,Leemans J (1985 ), "Efficient octopine Ti plasmid-derived vectors for Agrobacterium-mediated gene transfer to plants", Nucleic Acids Res, 13(13) pp 47774788 12 Doan DNP, Rudi H.,Olsen O-A (1999), "The Allosterically Unregulated Isoform of ADP-Glucose Pyrophosphorylase from Barley Endosperm Is the Most Likely Source of ADP-Glucose Incorporated into Endosperm Starch", Plant Physiology, 121(3) 60 pp.:965-975 13 Fondy B R., Geiger D R.,Servaites J C (1989), "Photosynthesis, carbohydrate metabolism and export in Beta vulgaris L and Phaseolus vulgaris L during square and sinusoidal light regimes", Plant Physiol, 89 pp 396-402 14 Gamez-Arjona F M., Li J., Raynaud S., Baroja-Fernandez E., Munoz F J., Ovecka M., Ragel P., Bahaji A., Pozueta-Romero J.,Merida A (2011), "Enhancing the expression of starch synthase class IV results in increased levels of both transitory and long-term storage starch", Plant Biotechnol J, 9(9) pp 1049-1060 15 Garry A Luke, Claire Roulston, Jens Tilsner,Martin D Ryan (2015), Growing Uses of 2A in Plant Biotechnology, Biotechnology, Associate Prof Deniz Ekinci (Ed.): InTech 16 Gelvin S B (2003), "Agrobacterium-mediated plant transformation: the biology behind the "gene-jockeying" tool", Microbiol Mol Biol Rev, 67(1) pp 16-37, table of contents 17 Gibon Y., Bläsing O E., Palacios Rojas N., Pankovic D., Hendriks J H M., Fisahn J., Höhne M., GüntherM.,Stitt M (2004), "Adjustment of diurnal starch turnover to short days: depletion of sugar during the night leads to a temporary inhibition of carbonhydrate utilization, accumulation of sugars and post-translational activation of ADP-glucose pyrophosphorylase in the following light period", Plant J, 39 pp 847862 18 Ha SH, Liang YS, Jung H, Ahn MJ, Suh SC, Kweon SJ, Kim DH, Kim YM,Kim JK (2010 ), "Application of two bicistronic systems involving 2A and IRES sequences to the biosynthesis of carotenoids in rice endosperm", Plant Biotechnol J, 8(8) pp 928938 19 Tichafa R I Munyikwa, Martin FregeneLuc Suurs, Evert Jacobsen, Richard G F Visser (2001), " Isolation and characterisation of cDNAs encoding the large and small subunits of ADP-glucose pyrophosphorylase from cassava (Manihot esculenta Crantz)", Euphytica 120 p 71 20 Jin X, Ballicora MA, Preiss J,Geiger JH (2005 ), "Crystal structure of potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase", EMBO J, 24(4) pp 694-704 21 Kleczkowski L A., Villand P., Luthi E., Olsen O-A.,Preiss J (1993), " Insensitivity of barley endosperm ADP-glucose pyrophosphorylase to 3-phosphoglycerate and orthophosphate regulation", Plant Physiol, 101 pp 179-186 22 Koller H R Upmeyer D J (1973), "Diurnal trends in net photosynthetic rate and carbohydrate levels of soybean leaves", Plant Physiol, 51 pp 871-874 23 Krishnamurthy K.,Giroux M J (2001), "Expression of wheat puroindoline genes in transgenic rice enhances grain softness", Nat Biotechnol, 19 pp 162- 166 24 Laemmli U K (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature Biotechnology, 227(5259) pp 680-685 25 Lee D S., Lee K H., Jung S., Jo E J., Han K H.,Bae H.J (2012), "Synergistic effects of 2A-mediated polyproteins on the production of lignocellulose degradation enzymes in tobacco plants", Journal of Experimental Botany, 63(13) pp 4797-4810 26 Li N., Zhang S., Zhao Y., Li B.,Zhang J (2011 ), "Over-expression of AGPase genes enhances seed weight and starch content in transgenic maize", Planta, 233(2) pp 241- 61 250 27 Lin T P., Caspar T., Somerville C.,Preiss J (1988), "Isolation and characterization of a starchless mutant of Arabidopsis thaliana L Henyh lacking ADP-glucose pyrophosphorylase activity", Plant Physiol, 86 pp 1131-1135 28 Matzke A J.,Matzke M A (1998), "Position effects and epigenetic silencing of plant transgenes", Curr Opin Plant Biol, 1(2) pp 142-148 29 Nakata P A., Greene T.W., Anderson J.M., Smith-White B.J., Okita T.W.,Preiss J (1991), "Comparison of the primary sequences of two potato tuber ADP-glucose pyrophosphorylase subunits", Plant Mol Biol 17 pp 1089-1093 30 Paine J A., Shipton C A., Chaggar S., Howells R.M., Kennedy M.J., Vernon G., Wright S Y., Hinchliffe E., Adams J L., Silverstone A l.,Drake R (2005), "Improving The Nutritional Value Of Golden Rice Through Increased Pro-Vitamin A Content", Nature Biotechnology 23(4) pp 482-487 31 Pandey M K., Rani N S., Madhav M S., Sundaram R M., Varaprasad G S., Sivaranjani A K., Bohra A., Kumar G R.,Kumar A (2012 ), "Different isoforms of starch-synthesizing enzymes controlling amylose and amylopectin content in rice (Oryza sativa L.)", Biotechnol Adv, 30(6) pp 1697-1706 32 Pollock C J.,Cairns A J (1991), "Fructan metabolism in grasses and cereals", Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol., 42 pp 77-101 33 Po-Yen Chen, Chen-Kuen Wang, Shaw-Ching Soong,Kin-Ying To (2003), "Complete sequence of the binary vector pBI121 and its application in cloning T-DNA insertion from transgenic plants", Molecular Breeding 11(4) 34 Rees T Zeeman S C (1999), "Changes in carbohydrate metabolism and assimilate partitioning in starch-excess mutants of Arabidopsis", Plant Cell Environ, 22(1) pp 445-1453 35 Regierer Babette, Fernie Alisdair R., Springer Franziska, Perez-Melis Alicia, Leisse Andrea, Koehl Karin, Willmitzer Lothar, Geigenberger Peter,Kossmann Jens (2002), "Starch content and yield increase as a result of altering adenylate pools in transgenic plants", Nat Biotech, 20(12) pp 1256-1260 36 Ryan M.D., King A.M.,Thomas G.P (1991), "Cleavage of foot-and-mouth disease virus polyprotein is mediated by residues located within a 19 amino acid sequence", The Journal of General Virology, 72(11) pp 2727-2732 37 Samuel C Zeeman, Steven M Smith,Alison M Smith (2007), "The diurnal metabolism of leaf starch", Biochemical Journal, 401 (1) pp 13-28 38 Sawada H., Ieki H.,Matsuda I (1995), "PCR detection of Ti and Ri plasmids from phytopathogenic Agrobacterium strains", Applied and Environmental Microbiology, 61(2) pp 828-831 39 Slater M (1998), "Pfu DNA Polymerase: A high fidelity enzyme for nucleic acid amplification", Promega Notes, 68 pp 7-10 40 Steven M Smith, Zeeman C., Alison M Smith (2007), "The diurnal metabolism of leaf starch", Samuel Biochemical Journal 401 (1) pp 13-28 41 Stitt M., Gerhardt R., Kürzel B.,Heldt H W (1983), "A role for fructose 2,6bisphosphate in the regulation of sucrose synthesis in spinach leaves", Plant Physiol, 62 72 pp 1139-1141 42 Suzuki K., Yamashita I.,Tanaka N (2002), "Tobacco plants were transformed by Agrobacterium rhizogenes infection during their evolution", Plant J, 32(5) pp 775-87 43 White T J., Bruns T., Lee S.,Taylor J (1990), PCR Protocols: a guide to methods and applications New York: Academic Press 44 Yemm E W.,Willis A J (1954), "The estimation of carbohydrates in plant extracts by anthrone", Biochemical Journal, 57(3) pp 508-514 45 Zeeman S C., Kossmann J.,Smith A M (2010), "Starch: its metabolism, evolution, and biotechnological modification in plants", Annu Rev Plant Biol, 61 pp 209-34 46 Zeeman S C., Ap Rees T (1999), Changes in carbohydrate metabolism and assimilate export in starch-excess mutants of Arabidopsis, Plant Cell & Environment 22(11) pp 1445–1453 WEBSITE 47 http://viralzone.expasy.org/all_by_protein/914.html Truy cập ngày 1/10/2016 48 http://www.andrewgray.com/essays/starch.htm Truy cập ngày 1/10/2016 49 http://www.nuffieldfoundation.org/practical-biology/testing-leaves-starch-technique Truy cập ngày 1/10/2016 50 http://www.starch.dk/isi/stat/rawmaterial.asp Truy cập ngày 1/10/2016 51 https://phytozome.jgi.doe.gov (Department of Energy's Joint Genome Institute) Truy cập ngày 1/10/2016 52 https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#!info?alias=Org_Mesculenta Truy cập ngày 1/10/2016 63 DANH MỤC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ BÀI BÁO Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 1-7, 2016 ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG TĂNG CƯỜNG TÍCH LŨY TINH BỘT Ở CÂY THUỐC LÁ CHUYỂN GEN AGPS VÀ AGPL MÃ HÓA ENZYME AGPASE Ở CÂY SẮN Nguyễn Văn Đoài1, Nguyễn Minh Hồng2, Lê Thu Ngọc1 , Nguyễn Thị Thơm1, Nguyễn Đình Trọng1, Vũ Huyền Trang1, Nguyễn Thị Thuý Hường1, Phạm Thị Vân1, Phạm Bích Ngọc1 Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam Đại học Hồng Đức, Thanh Hố TĨM TẮT Enzyme AGPase enzyme xúc tác cho bƣớc q trình tổng hợp tinh bột Nó có vai trò quan trọng đƣợc chứng minh enzyme điều hòa, điều chỉnh tốc độ phản ứng tồn chu trình sinh tổng hợp glycogen vi khuẩn tinh bột thực vật Ở thực vật bậc cao, AGPase đƣợc xác định enzyme dị lập thể, đƣợc cấu tạo hai tiểu phần lớn (AGPL) hai tiểu phần nhỏ (AGPS) hai gen tƣơng tứng mã hóa Trong nghiên cứu này, chúng tơi phân lập hai gen mã hóa cho tiểu phần lớn tiểu phần nhỏ AGPase từ giống sắn KM140 Hai gen đƣợc nối với trình tự P2a đƣợc biểu đồng thời khung đọc mở dƣới điều khiển promoter CaMV 35S Cấu trúc đƣợc chèn vào vector pBI121 đƣợc biến nạp vào thuốc phƣơng pháp chuyển gen thông qua A tumefaciens Cây chuyển gen đƣợc kiểm tra phƣơng pháp PCR, Western blot định lƣợng hàm lƣợng tinh bột phƣơng pháp anthrone Kết quả, hàm lƣợng tinh bột tích lũy chuyển gen cao đối chứng từ 13-116% điều kiện nuôi dƣỡng Nghiên cứu tạo thêm hƣớng tiếp cận việc tạo trồng biến đổi gen tăng cƣờng khả tích lũy tinh bột Từ khóa: AGPase, AGPS, AGPL, chuyển gen, P2a, tinh bột, thuốc lá, sắn TRÌNH TỰ GEN LOCUS KU243124 1578 bp mRNA linear PLN 18-MAY-2016 DEFINITION Manihot esculenta isolate Km140 ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit mRNA, complete cds ACCESSION KU243124 VERSION KU243124.1 KEYWORDS SOURCE Manihot esculenta (cassava) ORGANISM Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot REFERENCE (bases to 1578) AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T and Ngoc,P.B TITLE Cloning and Sequence Analysis of some starch biosynthesis gene in 64 Vietnam Cassava JOURNAL REFERENCE Unpublished (bases to 1578) AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T and Ngoc,P.B TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-DEC-2015) Plant Cell of Biology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 100000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES source Location/Qualifiers 1578 /organism="Manihot esculenta" /mol_type="mRNA" /isolate="Km140" /db_xref="taxon:3983" CDS 13 1575 /note="glucose-1-phosphate denylyltransferase small subunit" /codon_start=1 /product="ADP-glucose pyrophosphorylase small subunit" /protein_id="ANE10471.1" /translation="MAAIGVPRVPSSSTSSSSQSNSSNLNRRTPVQSLSLSSSSISGD KIYSKVFSARRGNAYNEKTPRIVSPKAVSDSRNSQTCLDPDASRSVLGIILGGGAGTR LYPLTKKRAKPAVPLGANYRLIDIPVSNCLNSNISKIYVLTQFNSASLNRHLSRAYAS NMGGYKNEGFVEVLAAQQSPENPNWFQGTADAVRQYLWLFEEHNVLEFLILAGDHLYR MDYERFIQAHRETDADITVAALPMDEKRATAFGLMKIDEEGRIIEFAEKPKGEQLKAM KVDTTILGLDDERAKELPFIASMGIYVVSKNVMLDLLRDKFPGANDLGSEVIPGATSI GMRVQAYLYDGYWEDIGTIGAFYNANLGITKKPVPDFSFYDRSSPIYTQPRYLPPSKM LDADVTDSVIGEGCVIKNCKIHHSVVGLRSCISEGAIIEDTLLMGADYYETDADRRFL AAKGSVPIGIGKNSHIKRAIIDKNARIGVDVKIINGDNVQEAARETDGYFIKSGIVTV IKDALIPSGTVI" ORIGIN ctaatggcga gtatggcggc catcggagtt ccgagagtac cgtcttcttc gacttcatct 61 tcttcacagt ccaattcgtc gaatctcaat cggagaacgc ctgtgcaaag cctttcgctc 121 tcctcgtcta gcatctccgg tgataagatt tactccaagg ttttttctgc tcgccgagga 181 aatgcttata atgagaagac tccacggatc gtttctccta aggccgtttc tgattccagg 241 aattcgcaaa cttgtcttga ccctgacgct agtcgaagtg tcttgggaat tattcttgga 301 ggcggtgctg ggacccgcct ttacccactt acaaagaaga gggcaaaacc tgctgttcct 361 ttaggagcaa attacagact gattgatatt cctgtgagca actgcttgaa cagtaatata 421 tcaaagattt acgttcttac acaattcaat tctgcatctc ttaatcgtca cctttcacgg 481 gcatatgcaa gcaacatggg tggctacaag aatgaaggtt ttgttgaagt tcttgcagcc 541 cagcagagcc cagagaatcc aaattggttc cagggcacag ctgatgctgt cagacagtac 601 ttgtggttgt ttgaagagca caatgttctg gaattcttga ttcttgctgg ggatcattta 661 taccgcatgg attatgaaag gtttattcaa gcacacagag aaactgatgc agatataaca 65 721 gtagctgctc taccaatgga tgaaaaacgt gcaacagcct ttggtctgat gaaaattgat 781 gaagaagggc gcataattga atttgctgag aagccaaaag gggagcaatt gaaagctatg 841 aaggttgata ctacaattct aggtcttgat gatgagagag caaaagagtt gccttttatt 901 gctagtatgg ggatatatgt cgtcagcaaa aatgtgatgt tagatcttct aagagataag 961 tttcctggag ccaatgatct tggaagtgaa gttattcctg gtgctacttc cattgggatg 1021 agagtgcaag cttacttata tgatggctac tgggaagata ttggaacaat tggggcattt 1081 tacaatgcca atctgggtat aactaaaaag ccagtgccag atttcagctt ctatgatcgt 1141 tcatctccaa tttatactca gcctcgatat ttgcctccat ccaagatgct tgatgctgat 1201 gttactgaca gtgttattgg tgaggggtgt gttattaaga actgtaagat tcaccactct 1261 gtggttgggc ttcgatcctg catatcagaa ggtgcaatca tagaggatac attactaatg 1321 ggagcagatt actatgagac tgatgctgac aggaggtttc tggcagccaa gggtagtgtt 1381 ccaattggta ttggcaagaa ttctcatatt aagagagcca ttattgacaa aaatgctcgc 1441 attggggtcg atgtgaagat cattaatggt gataatgtgc aagaagcagc gagggaaact 1501 gatggatatt tcataaagag tggaattgtt accgtaatca aggacgcgtt gattcccagc 1561 ggaaccgtga tctagatg // LOCUS DEFINITION KU243122 1618 bp mRNA linear PLN 18-MAY-2016 Manihot esculenta isolate Km140 AGPase large subunit protein mRNA, complete cds ACCESSION KU243122 VERSION KU243122.1 KEYWORDS SOURCE Manihot esculenta (cassava) ORGANISM Manihot esculenta Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; Gunneridae; Pentapetalae; rosids; fabids; Malpighiales; Euphorbiaceae; Crotonoideae; Manihoteae; Manihot REFERENCE (bases to 1618) AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T and Ngoc,P.B TITLE Cloning and Sequence Analysis of some starch biosynthesis gene in Vietnam Cassava JOURNAL REFERENCE Unpublished (bases to 1618) AUTHORS Doai,N.V., Ngoc,L.T and Ngoc,P.B TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-DEC-2015) Plant Cell of Biology, Institute of Biotechnology, 18 Hoang Quoc Viet, Hanoi 100000, Vietnam COMMENT ##Assembly-Data-START## Sequencing Technology :: Sanger dideoxy sequencing ##Assembly-Data-END## FEATURES source Location/Qualifiers 1618 /organism="Manihot esculenta" 66 /mol_type="mRNA" /isolate="Km140" /db_xref="taxon:3983" CDS 1587 /note="ADP-glucose pyrophosphorylase large subunit" /codon_start=1 /product="AGPase large subunit protein" /protein_id="ANE10469.1" /translation="MDSCCVALKANAHVAKTSKGDFMYGDKEFWGERIRGSLNNSIWS NQMTRSLRAERNAIKVKPGVAHAVLTSNNPKESMTLQPPRFERRKVDPTNVAAIILGG GAGTQLFPLTRRAATPAVPVGGCYKLIDIPMSNCINSGINKIFVLTQFNSASLNRHLA RTYFGNGINFGDGFVEVLAATQTPGEAGMQWFQGTADAVRQFIWVFEDAKNRNVENIL ILSGDHLYRMDYLDFLQHHVDSNADITISCAPVSESRASDCGLVKIDNRGRIVNFAEK PTGAELKSMQADTTHLGLSLQDALKTPYIASMGVYVFRTEILLKLLRWRYPTSNDFGS EVIPAAVMEHNVQGYIFRDYWEDIGTIKTFYEANLALTDEPPKFEFYDPKTPFYTSPR FLPPTKMDKCRIVDAIISHGCFLRECTIQHSVVGERSRLDYGVELKDTVMLGADNYQT EAEIASLLAEGKVPIGVGRNSKIKNCIIDKNAKVGKNVIITNKDGVQEADRPEKGFYI RSGITIIAEKATIEDSTVI" ORIGIN ggaatggatt cttgctgtgt ggccctgaaa gccaatgccc atgtggcaaa aactagcaaa 61 ggtgatttca tgtatggaga taaagagttt tggggtgaaa ggatcagagg gagtctcaac 121 aatagtattt ggtccaatca gatgacaaga agcttaagag ctgagaggaa tgccatcaag 181 gtcaagcctg gtgttgctca tgctgtttta acatcaaaca atcccaagga gtctatgacc 241 ttacaaccac caagatttga gagacgaaaa gtggacccaa caaatgtagc agcgatcata 301 ttgggaggag gtgcagggac tcagctgttt cctcttacca gaagggcagc aacaccagct 361 gtgccagtgg gaggatgcta taaactaata gacattccaa tgagcaactg catcaacagt 421 ggcataaaca aaatatttgt actgacccaa ttcaactctg cttcccttaa tcggcacctt 481 gcacgcacat actttggaaa tggtattaac tttggagacg gttttgtgga ggtcctagca 541 gcaactcaaa cgcctggaga agcaggaatg cagtggttcc aaggaactgc agatgctgtg 601 aggcaattta tttgggtttt tgaggatgcc aagaacagaa atgttgagaa tatattgatc 661 ttgtccggag atcatcttta ccgaatggat tatctggatt ttttgcagca tcatgttgac 721 agtaatgctg atatcacgat ttcatgtgct ccagtcagtg agagccgcgc atcagattgt 781 ggtttggtga agatagacaa caggggacga attgtcaatt ttgctgaaaa accaactggt 841 gctgagctga aatcaatgca agctgatacc actcatctag gattatctct gcaagatgcc 901 ctcaaaaccc cttatatcgc atcaatggga gtctatgtat ttaggactga gattctgctg 961 aagcttctac ggtggagata ccctacatca aatgactttg gatctgaagt catccccgct 1021 gctgttatgg agcacaatgt tcaaggatat atttttagag actactggga agatatagga 1081 acaataaaga cattttatga agcaaacttg gctctcactg atgagcctcc aaagtttgaa 1141 ttttatgacc caaagacacc cttctacaca tctcctcgat ttctaccacc aaccaaaatg 1201 gataagtgcc ggattgtaga tgcgataatt tcccatgggt gcttcttgcg agaatgtact 1261 atacaacact ctgtggttgg tgaacgctca cgtttagatt atggtgtaga gctaaaggac 1321 actgtgatgt tgggagctga caactaccaa actgaagctg aaatcgcatc tcttttggca 1381 gagggcaaag tccctattgg tgttggaaga aactcaaaga tcaagaactg cataattgac 1441 aagaatgcga aagtaggaaa aaatgtgatc atcacaaaca aagatggtgt gcaagaagca 1501 gataggccag aaaaaggatt ttacattcgt tctggaatca caattatagc agagaaggcg 67 1561 acaatagaag atagcacagt aatataaatg gatccagagc atgttcaagg actggttg // 68 PHỤ LỤC So sánh trình tự AGPL phân lập với trình tự tham chiếu AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | ATGGATTCTTGCTGTGTGGCCCTGAAAGCCAATGCCCATGTGGCAAAAACTAGCAAAGGTGATTTCATGT M D S C C V A L K A N A H V A K T S K G D F M M D S C C V A L K A N A H V A K T S K G D F M 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | ATGGAGATAAAGAGTTTTGGGGTGAAAGGATCAGAGGGAGTCTCAACAATAGTATTTGGTCCAATCAGAT Y G D K E F W G E R I R G S L N N S I W S N Q M Y G D K E F W G E R I R G S L N N S I W S N Q M 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | GACAAGAAGCTTAAGAGCTGAGAGGAATGCCATCAAGGTCAAGCCTGGTGTTGCTCATGCTGTTTTAACA T R S L R A E R N A I K V K P G V A H A V L T T R S L R A E R N A I K V K P G V A H A V L T 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | TCAAACAATCCCAAGGAGTCTATGACCTTACAACCACCAAGATTTGAGAGACGAAAAGTGGACCCAACAA S N N P K E S M T L Q P P R F E R R K V D P T S N N P K E S M T L Q P P R F E R R K V D P T 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | ATGTAGCAGCAATCATATTGGGAGGAGGTGCAGGGACTCAGCTGTTTCCTCTTACCAGAAGGGCAGCAAC N V A A I I L G G G A G T Q L F P L T R R A A T G N V A A I I L G G G A G T Q L F P L T R R A A T 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | ACCAGCTGTGCCAGTGGGAGGATGCTATAAACTAATAGACATTCCAATGAGCAACTGCATCAACAGTGGC P A V P V G G C Y K L I D I P M S N C I N S G P A V P V G G C Y K L I D I P M S N C I N S G 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | ATAAACAAAATATTTGTACTGACCCAATTCAACTCTGCTTCCCTTAATCGGCACCTTGCACGCACATACT I N K I F V L T Q F N S A S L N R H L A R T Y I N K I F V L T Q F N S A S L N R H L A R T Y 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | TTGGAAATGGTATTAACTTTGGAGACGGTTTTGTGGAGGTCCTAGCAGCAACTCAAACGCCTGGAGAAGC F G N G I N F G D G F V E V L A A T Q T P G E A F G N G I N F G D G F V E V L A A T Q T P G E A 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | AGGAATGCAGTGGTTCCAAGGAACTGCAGATGCTGTGAGGCAATTTATTTGGGTTTTTGAGGATGCCAAG G M Q W F Q G T A D A V R Q F I W V F E D A K 69 AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 G M Q W F Q G T A D A V R Q F I W V F E D A K 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | AACAGAAATGTTGAGAATATATTGATCTTGTCCGGAGATCATCTTTACCGAATGGATTATCTGGATTTTT N R N V E N I L I L S G D H L Y R M D Y L D F G N R N V E N I L I L S G D H L C R M D Y L D F 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | TGCAGCATCATGTTGACAGTAATGCTGATATCACGATTTCATGTGCTCCAGTCAGTGAGAGCCGCGCATC L Q H H V D S N A D I T I S C A P V S E S R A S L Q H H V D S N A D I T I S C A P V S E S R A S 780 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | AGATTATGGTTTGGTGAAGATAGACAACAGGGGACGAATTGTCAATTTTGCTGAAAAACCAACTGGTGCT D Y G L V K I D N R G R I V N F A E K P T G A .G D C G L V K I D N R G R I V N F A E K P T G A 850 860 870 880 890 900 910 | | | | | | | | | | | | | | GAGCTGAAATCAATGCAAGCTGATACCACTCATCTAGGATTATCTCTGCAAGATGCCCTCAAAACCCCTT E L K S M Q A D T T H L G L S L Q D A L K T P E L K S M Q A D T T H L G L S L Q D A L K T P 920 930 940 950 960 970 980 | | | | | | | | | | | | | | ATATCGCATCAATGGGAGTCTATGTATTTAGGACTGAGATTCTGCTGAAGCTTCTACGGTGGAGATACCC Y I A S M G V Y V F R T E I L L K L L R W R Y P Y I A S M G V Y V F R T E I L L K L L R W R Y P 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 | | | | | | | | | | | | | | TACATCAAATGACTTTGGATCTGAAGTCATCCCCGCTGCTGTTATGGAGCACAATGTTCAAGGATATATT T S N D F G S E V I P A A V M E H N V Q G Y I T S N D F G S E V I P A A V M E H N V Q G Y I 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 | | | | | | | | | | | | | | TTTAGAGACTACTGGGAAGATATAGGAACAATAAAGACATTTTATGAAGCAAACTTGGCTCTCACTGATG F R D Y W E D I G T I K T F Y E A N L A L T D F R D Y W E D I G T I K T F Y E A N L A L T D 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 | | | | | | | | | | | | | | AGCCTCCAAAGTTTGAATTTTATGACCCAAAGACACCCTTCTACACATCTCCTCGATTTCTACCACCAAC E P P K F E F Y D P K T P F Y T S P R F L P P T E P P K F E F Y D P K T P F Y T S P R F L P P T 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | | | CAAAATGGATAAGTGCCGGATTGTAGATGCGATAATTTCCCATGGGTGCTTCTTGCGAGAATGTACTATA K M D K C R I V D A I I S H G C F L R E C T I K M D K C R I V D A I I S H G C F L R E C T I 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 70 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 AL CDS AL140 | | | | | | | | | | | | | | CAACACTCTGTGGTTGGTGAACGCTCACGTTTAGATTATGGTGTAGAGCTAAAGGACACTGTGATGTTGG Q H S V V G E R S R L D Y G V E L K D T V M L Q H S V V G E R S R L D Y G V E L K D T V M L 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | GAGCTGACAACTACCAAACTGAAGCTGAAATCGCATCTCTTTTGGCAGAGGGCAAAGTCCCTATTGGTGT G A D N Y Q T E A E I A S L L A E G K V P I G V G A D N Y Q T E A E I A S L L A E G K V P I G V 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 | | | | | | | | | | | | | | TGGAAGAAACTCAAAGATCAAGAACTGCATAATTGACAAGAATGCGAAAGTAGGAAAAAATGTGATCATC G R N S K I K N C I I D K N A K V G K N V I I .a G R N S K I K N C I I D K N A K V G K N V I I 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 | | | | | | | | | | | | | | ACAAACAAAGATGGTGTGCAAGAAGCAGATAGGCCAGAAAAAGGATTTTACATTCGTTCTGGAATCACAA T N K D G V Q E A D R P E K G F Y I R S G I T T N K D G V Q E A D R P E K G F Y I R S G I T 1550 1560 1570 1580 | | | | | | | | TTATAGCAGAGAAGGCGACAATAGAAGATGGCACAGTAATATAA I I A E K A T I E D G T V I * I I A E K A T I E D G T V I * So sánh trình tự AGPS phân lập với trình tự tham chiếu AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 10 20 30 40 50 60 70 | | | | | | | | | | | | | | ATGGCGAGTATGGCGGCCATCGGAGTTCCGAGAGTACCGTCTTCTTCGACTTCATCTTCTTCACAGTCCA M A S M A A I G V P R V P S S S T S S S S Q S M A S M A A I G V P R V P S S S T S S S S Q S 80 90 100 110 120 130 140 | | | | | | | | | | | | | | ATTCGTCGAATCTCAATCGGAGAACGCCTGTGCAAAGCCTTTCGTTCTCCTCGTCTAGCATCTCCGGTGA N S S N L N R R T P V Q S L S F S S S S I S G D C N S S N L N R R T P V Q S L S L S S S S I S G D 150 160 170 180 190 200 210 | | | | | | | | | | | | | | TAAGATTTACTCCAAGGTTTTTTCTGCTCGCCGAGGAAATGCTTATAATGAGAAGACTCCACGGATCGTT K I Y S K V F S A R R G N A Y N E K T P R I V K I Y S K V F S A R R G N A Y N E K T P R I V 220 230 240 250 260 270 280 | | | | | | | | | | | | | | TCTCCTAAGGCCGTTTCTGATTCCAGGAATTCGCAAACTTGTCTTGACCCTGACGCTAGTCGAAGTGTCT S P K A V S D S R N S Q T C L D P D A S R S V S P K A V S D S R N S Q T C L D P D A S R S V 290 300 310 320 330 340 350 | | | | | | | | | | | | | | 71 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 TGGGAATTATTCTTGGAGGCGGTGCTGGGACCCGCCTTTACCCACTTACAAAGAAGAGGGCAAAACCTGC L G I I L G G G A G T R L Y P L T K K R A K P A L G I I L G G G A G T R L Y P L T K K R A K P A 360 370 380 390 400 410 420 | | | | | | | | | | | | | | TGTTCCTTTAGGAGCAAATTACAGACTGATTGATATTCCTGTGAGCAACTGCTTGAACAGTAATATATCA V P L G A N Y R L I D I P V S N C L N S N I S V P L G A N Y R L I D I P V S N C L N S N I S 430 440 450 460 470 480 490 | | | | | | | | | | | | | | AAGATTTACGTTCTTACACAATTCAATTCTGCATCTCTTAATCGTCACCTTTCACGGGCATATGCAAGCA K I Y V L T Q F N S A S L N R H L S R A Y A S K I Y V L T Q F N S A S L N R H L S R A Y A S 500 510 520 530 540 550 560 | | | | | | | | | | | | | | ACATGGGTGGCTACAAGAATGAAGGTTTTGTTGAAGTTCTTGCAGCCCAGCAGAGCCCAGAGAATCCAAA N M G G Y K N E G F V E V L A A Q Q S P E N P N N M G G Y K N E G F V E V L A A Q Q S P E N P N 570 580 590 600 610 620 630 | | | | | | | | | | | | | | TTGGTTCCAGGGCACAGCTGATGCTGTCAGACAGTACTTGTGGTTATTTGAAGAGCACAATGTTCTGGAA W F Q G T A D A V R Q Y L W L F E E H N V L E .G W F Q G T A D A V R Q Y L W L F E E H N V L E 640 650 660 670 680 690 700 | | | | | | | | | | | | | | TTCTTGATTCTTGCTGGGGATCATTTATACCGCATGGATTATGAAAGGTTTATTCAAGCACACAGAGAAA F L I L A G D H L Y R M D Y E R F I Q A H R E F L I L A G D H L Y R M D Y E R F I Q A H R E 710 720 730 740 750 760 770 | | | | | | | | | | | | | | CTGATGCAGATATAACAGTAGCTGCTCTACCAATGGATGAAAAACGTGCAACAGCCTTTGGTCTGATGAA T D A D I T V A A L P M D E K R A T A F G L M K T D A D I T V A A L P M D E K R A T A F G L M K 780 790 800 810 820 830 840 | | | | | | | | | | | | | | AATTGATGAAGAAGGGCGCATAATTGAATTTGCTGAGAAGCCAAAAGGGGAGCAATTGAAAGCTATGAAG I D E E G R I I E F A E K P K G E Q L K A M K I D E E G R I I E F A E K P K G E Q L K A M K 850 860 870 880 890 900 910 | | | | | | | | | | | | | | GTTGATACTACAATTCTAGGTCTTGATGATGAGAGAGCAAAAGAGTTGCCTTTTATTGCTAGTATGGGGA V D T T I L G L D D E R A K E L P F I A S M G V D T T I L G L D D E R A K E L P F I A S M G 920 930 940 950 960 970 980 | | | | | | | | | | | | | | TATATGTCGTCAGCAAAAATGTGATGTTAGATCTTCTAAGAGATAAGTTTCCTGGAGCCAATGATTTTGG I Y V V S K N V M L D L L R D K F P G A N D F G C I Y V V S K N V M L D L L R D K F P G A N D L G 72 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 AGPSCDS AGPS140 990 1000 1010 1020 1030 1040 1050 | | | | | | | | | | | | | | AAGTGAAGTTATTCCTGGTGCTACTTCCATTGGGATGAGAGTGCAAGCTTACTTATATGATGGCTACTGG S E V I P G A T S I G M R V Q A Y L Y D G Y W S E V I P G A T S I G M R V Q A Y L Y D G Y W 1060 1070 1080 1090 1100 1110 1120 | | | | | | | | | | | | | | GAAGATATTGGAACAATTGAGGCATTTTACAATGCCAATCTGGGTATAACTAAAAAGCCAGTGCCAGATT E D I G T I E A F Y N A N L G I T K K P V P D G E D I G T I G A F Y N A N L G I T K K P V P D 1130 1140 1150 1160 1170 1180 1190 | | | | | | | | | | | | | | TCAGCTTCTATGATCGTTCATCTCCAATTTATACTCAGCCTCGATATTTGCCTCCATCCAAGATGCTTGA F S F Y D R S S P I Y T Q P R Y L P P S K M L D F S F Y D R S S P I Y T Q P R Y L P P S K M L D 1200 1210 1220 1230 1240 1250 1260 | | | | | | | | | | | | | | TGCTGATGTTACTGACAGTGTTATTGGTGAGGGGTGTGTTATTAAGAACTGTAAGATTCACCACTCTGTG A D V T D S V I G E G C V I K N C K I H H S V A D V T D S V I G E G C V I K N C K I H H S V 1270 1280 1290 1300 1310 1320 1330 | | | | | | | | | | | | | | GTTGGGCTTCGATCCTGCATATCAGAAGGTGCAATCATAGAGGATACATTACTAATGGGAGCAGATTACT V G L R S C I S E G A I I E D T L L M G A D Y V G L R S C I S E G A I I E D T L L M G A D Y 1340 1350 1360 1370 1380 1390 1400 | | | | | | | | | | | | | | ATGAGACTGATGCTGACAGGAGGTTTCTGGCAGCCAAGGGTAGTGTTCCAATTGGTATTGGCAAGAATTC Y E T D A D R R F L A A K G S V P I G I G K N S Y E T D A D R R F L A A K G S V P I G I G K N S 1410 1420 1430 1440 1450 1460 1470 | | | | | | | | | | | | | | TCATATTAAGAGAGCCATTATTGACAAAAATGCTCGCATTGGGGACGATGTGAAGATCATTAATGGTGAT H I K R A I I D K N A R I G D D V K I I N G D T H I K R A I I D K N A R I G V D V K I I N G D 1480 1490 1500 1510 1520 1530 1540 | | | | | | | | | | | | | | AATGTGCAAGAAGCAGCGAGGGAAACTGATGGATATTTCATAAAGAGTGGAATTGTTACCGTAATCAAGG N V Q E A A R E T D G Y F I K S G I V T V I K N V Q E A A R E T D G Y F I K S G I V T V I K 1550 1560 1570 | | | | | | ACGCGTTGATTCCCAGCGGAACCGTGATCTAG D A L I P S G T V I * D A L I P S G T V I * 73 Kiểm định kết định lượng tinh bột sau 2h chiếu sáng t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances WT Chuyển gen Mean 0.807185 1.400622148 Variance 0.017515 0.259532857 Observations 11 Hypothesized Mean Difference df 13 t Stat -3.60508 P(T trung bình hai mẫu khác Kiểm định kết định lượng tinh bột sau 14h chiếu sáng t-Test: Two-Sample Assuming Unequal Variances Mean Variance Observations Hypothesized Mean Difference df t Stat P(T