bài tập thực hành sinh tin

Có thể có một tập hợp các mồi tiến và ngược với một chuỗi bổ sung choDNA mẫu - một điểm tổng hợp bắt đầu.Mục tiêu chính của mồi là tổng hợp DNA với đầu cuối tự do và điểm khởi đầu củapol

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH TIN HỌC

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

SINH TIN

PGS.TS NGUYỄN BẢO QUỐC NGUYỄN PHÚC HUY 21126073

NGÔ THANH THẢO 21126505 NGUYỄN QUỐC TRỌNG 21126557

TP Thủ Đức, 08/06/2024

MỤC LỤC

Trang

MỤC LỤC i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1

1.1 Thiết kế primer 1

1.2 Nguyên tắc thiết kế primer 1

1.3 Serratia marcescens 2

1.3.1 Serratia marcescens nguồn gốc và đặc điểm 2

1.3.2 Phân loại 2

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 4

2.1 Vật liệu 4

2.2 Phương pháp 4

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ 6

3.1 Cặp primer thứ nhất 6

3.2 Cặp primer thứ 2 6

3.3 Cặp primer thứ 3 7

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Trang

Hình 2.1 Trang web NCBI 4

Hình 2.2 Tìm cách trình từ hypothetical protein 4

Hình 2.3 Thiết kế primer trên Primer3plus 5

Hình 2.4 Kiểm tra qua in silico 5

Hình 3.1 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 509bp 6

Hình 3.2 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 538bp 7

Hình 3.3 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 570bp 7

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Thiết kế primer

Mồi là một đoạn trình tự ngắn đóng vai trò là điểm khởi đầu cho quá trình tổng hợp DNA Có thể có một tập hợp các mồi (tiến và ngược) với một chuỗi bổ sung cho DNA mẫu - một điểm tổng hợp bắt đầu

Mục tiêu chính của mồi là tổng hợp DNA với đầu cuối tự do và điểm khởi đầu của polymerase Một cặp mồi một ở sợi mẫu trong khi một ở sợi bổ sung liên kết ở hai đầu đối diện của chuỗi được thiết kế, tương tự, 3 'tương ứng với sợi mẫu cho quá trình kéo dài

Sơn lót phía trước chạy trong 3'-5' trong khi mồi ngược chạy trong 5'-3' Tuy nhiên, quá trình kéo dài dẫn đến hai chuỗi DNA ds mới

Chú ý: Sự hình thành các dimers xảy ra khi sợi mẫu nằm với sợi bổ sung là một điều kiện không thuận lợi

Mồi Forward và Reverse không tuân theo quy tắc bổ sung, thay vào đó mồi phía trước liên kết với một đầu của một mục tiêu ở 5 'P trong khi đầu kia của 5 'P chiếm mồi ngược

Mồi DNA được sử dụng rộng rãi nhất trong PCR, không giống như sao chép, do: Khái niệm về sự ổn định trong mồi DNA so với nhiều mồi RNA

Vì nó là chế độ trùng hợp đơn hướng, mồi RNA không thể được loại bỏ sau khi kết thúc phản ứng

Mồi DNA có thể được tổng hợp dễ dàng

Tuy nhiên, phần lớn sự khuếch đại được tạo ra từ DNA, chỉ nên sử dụng mồi nucleotide cụ thể

1.2 Nguyên tắc thiết kế primer

Độ dài của mồi: Nên nằm trong khoảng từ 15-30 base, độ dài tối ưu là khoảng từ 18-22 base Điều này phụ thuộc vào việc mồi cần đủ dài để gắn đặc hiệu và đủ ngắn để

có thể gắn dễ dàng vào khuôn tại nhiệt độ gắn mồi

Đầu 3’ và 5’ của mồi: Cần thiết kế sao cho đầu 3’ của mồi xuôi sẽ mở rộng về phía mồi ngược và đầu 3’ của mồi ngược sẽ mở rộng về phía mồi xuôi khi được gắn vào 2 mạch bổ sung Nếu ngược lại thì sản phẩm PCR sẽ không thể được tạo ra

Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Điểm nhiệt độ này được định nghĩa là điểm nhiệt

mà tại đó 50% sợi đôi ADN phân tách nhau và tạo sợi đơn Điểm nhiệt này rất quan trọng ở pha gắn mồi, Tm nên nằm trong khoảng 50-65oC Nhiệt độ nóng của mồi trên

65 độ dễ dẫn đến xu hướng mồi gắn không chính xác Nhiệt độ Tm của hai mồi không chênh lệch nhau quá 2oC, nhiệt độ chênh lệch quá 5oC có thể không thể tạo ra được sản phẩm

Nhiệt độ gắn mồi (Ta): Được tính dựa vào nhiệt động nóng chảy của mồi Nhiệt độ gắn mồi thấp có thể dẫn đến lượng sản phẩm PCR được tạo ra thấp, do không đủ số lượng phức hợp lai giữa mồi và khuôn Ngược lại, sản phẩm không đặc hiệu sẽ được tạo ra nhiều nếu nhiệt độ gắn mồi quá thấp

Mật độ GC: Ảnh hưởng đến Tm, do đó mật độ GC nên nằm trong khoảng 50 – 60%

Kẹp GC: Nên có ít nhất một G hoặc C ở đầu 3’ của mồi để giúp cho đầu 3’ của mồi liên kết mạnh hơn Tuy nhiên nên tránh việc trong 5 base đầu 3’ có nhiều hơn 3 G hoặc C do có thể gây liên kết đầu 3’ quá mạnh khiến mồi bắt cặp không đặc hiệu

1.3 Serratia marcescens

1.3.1 Serratia marcescens nguồn gốc và đặc điểm

Serratia marcescens là một loài hình que, Vi khuẩn gram âm trong họ

Yersiniaceae Nó là một vi khuẩn kỵ khí và là mầm bệnh cơ hội ở người

Serratia marcescens được tìm thấy trong nước ngọt và tù đọng hoặc nước mặn,

trong đất, và trong thực vật, côn trùng và động vật bao gồm cả loài người Nó đã biết khả năng gây bệnh cho đời sống phi thực vật thậm chí còn mạnh hơn thông qua tính kháng đa kháng sinh đặc trưng của nó

S marcescens có thể tồn tại trong môi trường sinh học và phi sinh học và đã tạo ra

vô số dịch bệnh trên toàn cầu Từ nguồn cung cấp nước bị ô nhiễm đến việc truyền một loại vi khuẩn duy nhất trong các khu chăm sóc quan trọng, khả năng nhân lên của

vi khuẩn này trong điều kiện xa lý tưởng và khả năng kháng điều trị có nghĩa là nhiễm

trùng Serratia có khả năng gây tử vong Từ đất đến cây trồng đến đĩa, hoặc từ nhân

viên y tế đến vết thương đến các mô liên kết của hệ thần kinh trung ương, vi khuẩn

Serratia di động cao được trang bị để tận dụng mọi cơ hội và xâm chiếm trong một

sinh vật sống

1.3.2 Phân loại

Domain: Bacteria

Phylum: Pseudomonadota

Class: Gammaproteobacteria

Order: Enterobacterales

Family: Yersiniaceae

Genus: Serratia

Species: S marcescens

CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

2.1 Vật liệu

Sử dụng NCBI để tìm và lấy cơ sở dữ liệu về các trình tự gene, protein…

Sử dụng công cụ BLAST của NCBI để phân tích tính tương đồng của các trình tự nucleptide/amino acid với cơ sở dữ liệu NCBI

Thiết kế mồi bằng phần mềm Primer3Plus

Thực hiện phản ứng PCR trên máy tính bằng phần mềm In silico PCR amplication

Kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng phần mềm Primer – BLAST của NCBI

2.2 Phương pháp

Bước 1: Truy cập NCBI (Nation Center for Biotechnology Information), chọn Genome và nhập tên đối tượng cần tìm, sau đó nhấn “Search”

Hình 2.1 Trang web NCBI.

Bước 2: Tìm kiếm tập trung các small protein (hypothetical protein) kích thước từ 80-200 aa

Hình 2.2 Tìm cách trình từ hypothetical protein.

Bước 3: Chọn 1 đoạn protein trong khoảng cho phép, BLAST để xác định xem có trình tự thuộc loài cần tìm hay không, copy trình tự FASTA từ các protein tương đồng

có trình tự nucleotide Tìm cặp primer đặc hiệu bằng phần mềm Primer3plus

Hình 2.3 Thiết kế primer trên Primer3plus.

Bước 4: Kiểm tra cặp primer bằng in silico PCR amplification

Hình 2.4 Kiểm tra qua in silico.

Bước 5: BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ

3.1 Cặp primer thứ nhất

L - CAGAAGTTCAAGCTGTTGGGC

R - GTCTCGCTGTACTCCCACTG

Khi kiểm tra in silico PCR Amplification với primer này thu được 1 band kết quả

Hình 3.1 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 509bp.

3.2 Cặp primer thứ 2

L - TCCTGGTACGCCTACCTGAT

R – ACTGCGACAGGATCATGGTT

Khi kiểm tra in silico PCR Amplification với primer này thu được 1 band kết quả

Hình 3.2 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 538bp.

3.3 Cặp primer thứ 3

L - GCGTCAAGCCGATCCAAATC

R – TGCCCTTTGCTTGTTCGGTA

Khi kiểm tra in silico PCR Amplification với primer này thu được 1 band kết quả

Hình 3.3 Kết quả trên insilico cho đoạn DNA 570bp.