nhóm 6 thứ 4 ca 3 chủ đề 4

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN Hướng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN

Ngành học :CÔNG NGHỆ SINH HỌC Chuyên ngành :CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ THU NGÂN 21126113 NGUYỄN HOÀI AN 21126267 PHAN THANH BẠCH 21126282

VÕ HOÀNG MINH 21126408 TRẦN KHÔI NGUYÊN 21126432

TRẦN VĂN QUỐC 21126480 NGUYỄN THỊ THÙY 21126529 TRẦN CHÂU ANH 21126900

Niên khóa : 2021 – 2025

TP THỦ ĐỨC, 05/2024

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

CÔNG NGHỆ SẢN XUẤT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN

Hướng dẫn khoa học Sinh viên thực hiện

ThS VÕ THỊ THÚY HUỆ NGUYỄN THỊ THU NGÂN 21126113 NGUYỄN HOÀI AN 21126267 PHAN THANH BẠCH 21126282

TRẦN LÊ HÙNG 21126355 VÕ HOÀNG MINH 21126408 TRẦN KHÔI NGUYÊN 21126432 BÀNG ĐỨC QUÂN 21126476 TRẦN VĂN QUỐC 21126480 NGUYỄN THỊ THÙY 21126529 TRẦN CHÂU ANH 21126900

TP THỦ ĐỨC, 05/2024

MỤC LỤC

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT i

DANH SÁCH CÁC HÌNH ii

DANH SÁCH CÁC BẢNG iii

1 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học 1

1.1 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học 1

1.2 Nguồn gốc và phân loại 1

1.3 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn 1

1.4 Một số bệnh thường gặp 2

2 Giới thiệu về vi khuẩn Bacillus thuringiensis 4

2.1 Đặc điểm hình thái 4

2.2 Giới thiệu thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt 5

2.3 Cơ chế gây độc của Bt 6

3 Quy trình sản xuất chế phẩm sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn 8

3.1 Quy trình 8

4 Ứng dụng trong canh tác nông nghiệp 13

4.1 Ứng dụng trong canh tác nông nghiệp 13

4.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam và Quốc Tế 14

TÀI LIỆU THAM KHẢO 15

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 1.1 Helicoverpa đục thân trên bông, đậu bồ câu và cà chua 3

Hình 1.2 Sâu tơ (Plutella xylostella linaeus) là đối tượng gây hại chủ yếu trên cây rau họ hoa thập tự như su hào, bắp cải 3

Hình 2.1 Hình thái tế bào Bacillus thuringiensis quan sát dưới kính hiển vi có độ phóng đại 100X 4

Hình 2.2 Tinh thể độc tố Bt 5

Hình 3.1 Quy trình sản xuất thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt 8

Hình 3.2 Môi trường nuôi cấy T3 9

Hình 3.3 Chế phẩm sinh học từ Bacillus Thuringiensis 11

Hình 4.1 Chế phẩm sinh học từ Bacillus Thuringiensis 13

DANH SÁCH CÁC BẢNG

CHƯƠNG 1 THUỐC VẢO VỆ THỰC VẬT SINH HỌC 1.1 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học

Cùng với việc gia tăng sử dụng các hóa chất bảo vệ thực vật (BVTV) trong nông nghiệp, nguy cơ ô nhiễm môi trường, nguy cơ nhờn thuốc của dịch hại và sự ảnh hưởng tiêu cực tới sức khỏe con người cũng tăng theo Ngoài ra việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật có thể khiến cho lá bị hư hại, gây ra các triệu chứng như cháy lá hoặc đốm lá Những triệu chứng này có thể bị nhầm lẫn với những triệu chứng cháy lá và đốm lá do nhiều tác nhân gây bệnh là nấm và vi khuẩn gây ra Thuốc trừ cỏ có thể gây stress cho cây, làm chúng dễ mẫn cảm hơn với tác nhân gây bệnh Khi đó, các sản phẩm BVTV sinh học (biopesticides) được cho là giải pháp hiệu quả để thay thế dần và giảm thiểu việc sử dụng thuốc BVTV hóa học Là một nước nông nghiệp, Việt Nam càng cần phải quan tâm tới nghiên cứu và sử dụng thuốc BVTV sinh học

1.2 Nguồn gốc và phân loại

Thuốc bảo vệ thực vật sinh học có nguồn gốc từ vật liệu tự nhiên như động vật, thực vật, vi khuẩn và một số khoáng chất Được chia làm 3 loại chính dựa vào thành phần hoạt chất:

Thuốc bảo vệ thực vật vi sinh

Thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc thực vật Thuốc bảo vệ thực vật sinh hoá

Thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn

1.3 Thuốc bảo vệ thực vật sinh học có nguồn gốc từ vi khuẩn

Thuốc bảo vệ thực vật có nguồn gốc từ vi khuẩn là loại thuốc trừ sâu mà vi sinh vật hoạt động theo những cách khác nhau Vì chúng có thể kiểm soát sự phát triển của

vi khuẩn gây bệnh thực vật và nấm, nên có sử dụng làm thuốc trừ sâu Ưu điểm của việc sử dụng thuốc trừ sâu từ vi khuẩn :

• Thuốc trừ sâu sinh học vi khuẩn thường ít độc hơn thuốc trừ sâu vi khuẩn thuốc trừ sâu hóa học

• Thuốc trừ sâu sinh học vi khuẩn thường chỉ ảnh hưởng đến dịch hại mục tiêu và các sinh vật có quan hệ gần gũi

• Thuốc trừ sâu sinh học thường có hiệu quả với số lượng rất nhỏ và thường phân hủy nhanh chóng

Trong đó thuốc bảo vệ thực vật từ vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) trừ sâu đục thân, sâu tơ, sâu cuốn lá, sâu vẽ bùa, sâu tơ và sâu róm

Hình 1.1 Helicoverpa đục thân trên bông, đậu bồ câu và cà chua

Hình 1.2 Sâu tơ (Plutella xylostella linaeus) là đối tượng gây hại chủ yếu trên cây

rau họ hoa thập tự như su hào, bắp cải

CHƯƠNG 2 GIỚI THIỆU VỀ VI KHUẨN BACILLUS THURINGIENSIS

B thuringiensis là vi khuẩn sinh bào tử hiếu khí không bắt buộc, gram dương, dạng

que, hai đầu tù, kích thước 3 – 6 µm x 1,2 – 1,8µm, có tiêm mao mọc quanh tế bào Lông mọc xung quanh, hơi động hoặc không động Chúng thường tồn tại 1 cá thể hoặc 2 cá thể liền nhau Thể sinh dưỡng sinh sản theo kiểu phân chia ngang Trong thời kỳ sinh sản thường có 2, 4, 8…thể sinh dưỡng liền nhau thành chuỗi Lúc này vi khuẩn sinh trưỡng nhanh, trao đổi chất nhiều, dễ nuôi cấy trên môi trường

Khi nang bào tử phát triển đến một giai đoạn nào đó, chúng sẽ nứt ra, giải phóng bào tử và tinh thể độc Kích thước bào tử 1,6 - 2 µm Tinh thể protein được tạo thành trong giai đoạn tạo bào tử, kích thước 0,6 - 2µm, hình dạng rất đa dạng: hình tháp, hình ovan, hình lập phương, hình thoi, hình tròn hoặc có hình dạng không xác định

Hình 2.2 Tinh thể độc tố Bt

Bt là vi khuẩn gram dương, có khả năng tổng hợp protein gây tệ liệt ấu trùng của một số loài côn trùng gây hại, trong đó có sâu đục quả bông, các loài sâu đục thân ngô châu Á và Châu Âu Chúng đều là sâu hại thực vật phổ biến, có khả năng gây ra những sự tàn phá nghiêm trọng Bacillus thuringiensis có độc tính thuộc nhóm III, LD50 đường uống là >8.000 mg/kg Thuốc rất ít độc đối với môi trường và ký sinh có ích, không độc đối với cá và ong mật

2.2 Giới thiệu thuốc trừ sâu có nguồn gốc từ Bt

Chế phẩm Bt thực chất có nguồn gốc từ vi khuẩn, được sản xuất bằng phương pháp

lên men vi khuẩn Bacillus thuringiensis Sản phẩm lên men là độc tố ở dạng đạm

tinh thể và bào tử Độc tố này là những hợp chất cao phân tử không bền vững trong môi trường kiềm, môi trường acid mạnh và dưới tác động của một số loại men;

không tan trong nước và trong nhiều dung môi hữu cơ, nhưng tan trong dung dịch kiềm có độ pH từ 10 trở lên, tan trong dịch ruột của ấu trùng sâu bộ Lepidoptera Độ lớn của tinh thể độc tố từ 0,5-2 μm

Mỗi loài Bt chỉ có hiệu lực trên một số nhóm côn trùng nhất định vì vậy hiệu quả phụ thuộc vào việc Bt mang trên mình loại độc tố gì và loại gen nào Thành phần protein tinh thể của Bt không những quyết định hoạt lực diệt côn trùng mà còn liên quan đến sự tồn tại các lớp gen Cry Các protein 130kDa, diệt côn trùng cánh vẩy do gen cry1 mã hoá Gen Cry 3 mã hoá protein có trọng lượng phân tử thấp hơn (66-73kDa), diệt côn trùng cánh cứng Protein tinh thể diệt côn trùng hai cánh đa dạng nhất bao gồm các protein 130 kDa, 128kDa, 67kDa, 28kDa do gen cry 4, cry 10, cry 11 mã hoá Các protein này đều có hoạt lực diệt ruồi, muỗi, tuy nhiên mức độ gây độc khác nhau BT là một loại vi khuẩn sống, muốn hiệu quả thì côn trùng phải ăn được con vi khuẩn này vào đường ruột hoặc ăn phải độc tố mà chúng sản sinh ra

2.3 Cơ chế gây độc của Bt

Tác động của tinh thể độc Bacillus thuringiensis rất phức tạp tùy thuộc vào pH đường ruột, cơ thể côn trùng và tuổi sâu Cơ chế hoạt động của protein tinh thể của Bacillus

thuringiensis liên quan tới sự hòa tan tinh thể trong ruột giữa của côn trùng Khi sâu

ăn phải protein tinh thể của Bacillus thurigiensis, dưới tác động của men protease có

tính kiềm (pH > 10) trong ruột sâu, tinh thể độc tố bị hòa tan, và một nhân độc tố có khối lượng phân tử 60 – 65 kDa được hình thành và hoạt hóa Độc tố đã hoạt hóa bám vào các phân tử cảm thụ đặc biệt nằm trên màng vi thể của tế bào thành ruột sâu Sự gắn kết này ở ruột sâu làm thay đổi gradient điện hóa tạo thành các lỗ rò (kênh ion) Do đó phá hủy cân bằng áp suất thẩm thấu của màng tế bào, làm cho tế bào phồng lên, bị phân hủy dẫn đến sâu chết ( Nester E.W và ctv, 2002) Sâu sau khi ăn phải tinh thể độc của Bt thì sau 5 – 20 phút ruột sẽ bị tê liệt, pH trong máu và bạch huyết tăng lên từ 1 – 1,5 đơn vị, pH ruột giữa hạ xuống do chất kiềm của ruột

thấm vào máu, các tế bào biểu mô của ruột phá huỷ dẫn đến cơ thể bị phá huỷ trong

sau 1 giờ Đồng thời Bacillus thuringiensis cũng sản sinh ra các phân tử protein đặc

hiệu, gây ngộ độc cho đường tiêu hoá của ấu trùng, sâu hại Các protein này sẽ gây độc và làm thủng đường ruột hoặc làm bào mòn mỏng đường ruột của các ấu trùng, sâu non Chính vì vậy sau một thời gian khoảng từ 2-5 ngày sâu ngừng ăn và chết

Không chỉ tiêu diệt một cá thể, Bacillus thuringiensis còn lây lan cho các ấu trùng khác qua nước dãi, phân, xác chết của ấu trùng nhiễm Bacillus thuringiensis Do đó,

Bacillus thuringiensis có thể tạo ra sự lây nhiễm trên một diện tích lớn Khi ấu trùng,

sâu hại nhiễm Bacillus thuringiensis bị tiêu diệt tới 90% thậm chí đạt tới 99% (Theo

số liệu báo cáo của FAO và UNEP) Sâu nhỏ có thời gian ủ bệnh ngắn, nhanh chết hơn so với sâu tuổi lớn Khi sâu chết do Bt cơ thể sâu chuyển sang màu nâu dần dần màu đen, khô và quắc lại

CHƯƠNG 3 QUY TRÌNH SẢN XUẤT CHẾ PHẨM THUỐC BẢO VỆ THỰC VẬT CÓ NGUỒN GỐC TỪ VI KHUẨN

3.1 Quy trình

Sản phẩm Bt được sản xuất với dòng vi khuẩn Bacillus thuringiensis có nguồn gốc

từ phòng thí nghiệm vi sinh Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường có hiệu lực diệt côn trùng gây hại như sâu tơ, sâu khoang, sâu xanh được đánh giá cao nhất ở phòng thí nghiệm, nhà lưới, đồng ruộng

Hình 3.1 Quy trình sản xuất thuốc BVTV có nguồn gốc từ vi khuẩn Bt Bước 1: Chuẩn bị giống vi khuẩn cấp 1

Các ống giống của 4 dòng vi khuẩn Bt (BT9.1, BT10.2, TG6.2, TG5.1) không tạp

ống giống cấy chuyền khoảng 10-20 ống nghiệm giống cấp 1, mỗi lần sản xuất 50L chỉ sử dụng 1 ống cấp 1

+ Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phòng cấy vô trùng Bước 2: Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trường T3

Hình 3.2 Môi trường nuôi cấy T3

Chuẩn bị môi trường T3 lỏng (thành phần môi trường: tryptone 3 g, dịch chiết nấm

bình tam giác, được cấy vi khuẩn Bt vào, lắc trong thời gian 36 giờ, tiến hành đếm mật số vi khuẩn Bt và nhuộm, quan sát bào tử dưới kính hiển vi

+ Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phòng cấy vô trùng, máy lắc Bước 3: Tăng sinh khối vi khuẩn trên môi trường lỏng đã khảo sát

Chuẩn bị môi trường đã khảo sát từ nội dung trên là MT3 (glucose, pepton, khoáng), mỗi dòng vi khuẩn đã tăng sinh từ môi trường T3 cho vào môi trường lỏng với thành

và đã tối ưu hóa ở qui trình 50L, sau đó thu dịch lỏng vi khuẩn, đếm bào tử và quan sát tinh thể độc

+ Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phòng cấy vô trùng, máy lắc, nồi lên men Bước 4: Tăng sinh khối Bt trên môi trường bán rắn đã khảo sát

Chuẩn bị môi trường lỏng nuôi cấy vi khuẩn Bt trên môi trường MT3 (glucose,

khoảng 30 -40% so với bào tử vi khuẩn Môi trường bán rắn được khảo sát tối ưu nhất cho 4 dòng vi khuẩn là MT6 (cám bắp 30% và bột gạo 70%) Cấy giống vi khuẩn Bt từ môi trường lỏng sang môi trường bán rắn có pH 7-8 , độ ẩm 50% với tỷ

kiểm tra độ ẩm môi trường bán rắn đang ủ một lần và đảo trộn đều khối ủ Sau 60 giờ ủ vi khuẩn, thu nhận sinh khối bán rắn, đếm mật số khuẩn lạc, kiểm tra bào tử và tinh thể độc

+ Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phòng cấy vô trùng, phòng ủ Bước 5: Sấy sinh khối vi khuẩn và nghiền sinh khối vi khuẩn

Sinh khối vi khuẩn sau khi ủ 2,5 ngày được đổ ra khay, mỗi khay chứa khoảng 2 kg, bóp tơi sinh khối ra và đưa vào phòng kín, tối, đã được khử trùng bằng tia UV, nhiệt

24 giờ Sau khi sản phẩm khô với độ ẩm khoảng 15-20%, sinh khối vi khuẩn còn khoảng 40-50%

+ Điều kiện: tủ cấy, nồi hấp tiệt trùng, phòng cấy vô trùng, phòng sấy có lắp đèn UV, khay sạch, máy sấy với công suất 20kg/lần

Sản phẩm vi khuẩn sau khi sấy khô đưa vào mày nghiền có kích cỡ lưới nghiền là 0,5mm với công suất 20 kg/giờ Sau khi nghiền, tiến hành đếm mật số vi khuẩn, nhuộm, quan sát bào tử, tinh thể độc

+ Điều kiện: phòng sạch, máy nghiền Bước 6: Phối trộn phụ gia

Sản phẩm sau khi sấy sẽ tiến hành phối trộn với các chất phụ gia kháng UV như TiO2, bột talc, bột cao lanh theo tỷ lệ 40% vi khuẩn, 60% chất phụ gia Mỗi lần trộn trong vòng 10 phút tạo sản phẩm đồng đều với máy trộn 100 kg/lần

+ Điều kiện: phòng sạch, máy trộn Bước 7: Đóng gói chế phẩm

Bao bì thành phẩm được thiết kế và cung cấp bởi công ty, lượng thành phẩm 1kg/túi được định lượng bằng cân và hàn miệng túi bằng máy ép

+ Điều kiện: phòng sạch, máy ép miệng bao, máy đóng date, cân định lượng

Hình 3.3 Chế phẩm sinh học từ Bacillus Thuringiensis

Bước 9: Bảo quản sản phẩm

Sản phẩm sau khi đóng gói được cho vào thùng và để vào kho bảo quản ở nhiệt độ

trong nhà kho

CHƯƠNG 4 ỨNG DỤNG TRONG CANH TÁC NÔNG NGHIỆP 4.1 Ứng dụng trong canh tác nông nghiệp

Bt nước hiệu lực diệt sâu tơ khoảng 75-80%, sâu khoang và sâu xanh da láng khoảng 60-65% trong phòng thí nghiệm Ngoài đồng ruộng, hiệu lực tốt diệt sâu các loại khoảng 60-70% với 7 ngày khi phun

Hình 4.1 Chế phẩm sinh học từ Bacillus Thuringiensis

Dạng sản phẩm Bt bột màu trắng xám, hạt mịn và hòa tan trong nước khoảng 85%, độ thấm ướt 100% trong vòng 30 giây khi khuấy trộn và thể tích tạo bọt sau 30 giây khoảng 50 mL, tinh thể độc chiếm 24%, hiệu lực diệt sâu tơ khoảng 75-80%, sâu khoang và sâu xanh da láng khoảng 60-65% trong phòng thí nghiệm Ngoài đồng ruộng, hiệu lực diệt sâu các loại đạt 60-70% với 7 ngày khi phun

80-4.2 Các nghiên cứu tại Việt Nam và Quốc tế

Nghiên cứu tại Việt Nam:

Theo Viện Bảo vệ Thực vật, Bt có thể kiểm soát hiệu quả 80-90% sâu tơ trên bắp cải và bông cải xanh

Nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ cho thấy Bt có thể kiểm soát 70-80% sâu đục thân trên lúa

Nghiên cứu quốc tế:

Theo FAO, Bt có thể kiểm soát hiệu quả 50-90% hơn 600 loài sâu hại trên 200 loại cây trồng khác nhau

Một nghiên cứu tại Hoa Kỳ cho thấy Bt có thể kiểm soát 95% sâu bông cải xanh

TÀI LIỆU THAM KHẢO

2 hai lua va-bien-phap-phong-tru-n59.html

https://psc1.com/dich-hai -bien-phap-phong-tru/sau-duc-than-buom-hai-cham-3 pham-bt-bacillus-thuringiensis-dung-trong-kiem-soat-sau-hai-thuoc-bo-

https://congnghiepsinhhocvietnam.com.vn/tin-tuc/t838/quy-trinh-san-xuat-che-lepidoptera-tren-cay-rau.html

4 https://ctujsvn.ctu.edu.vn/index.php/ctujsvn/article/download/5238/4565/16319 5 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3035146/

6 Hofte H and H R Whitelog (1989) “Insecticidal crystal protein of Bacillus thuringiensis", Microbiol, Rev 53: 242 – 255

7 yeu-cua-nong-nghiep-ben-vung.aspx

https://vjst.vn/vn/tin-tuc/8118/thuoc-bao-ve-thuc-vat-sinh-hoc lua-chon-tat-8 https://vi.wikipedia.org/wiki/Bacillus_thuringiensis