BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌCBÁO CÁO TIỂU LUẬNPHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PCR THỜI GIAN THỰCĐỂ PHÂN BIỆT ĐỘNG VẬT BỊ NHIỄM VỚI ĐỘNG
Trang 1BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO TIỂU LUẬN
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PCR THỜI GIAN THỰCĐỂ PHÂN BIỆT ĐỘNG VẬT BỊ NHIỄM VỚI ĐỘNG VẬTĐÃ ĐƯỢC TIÊM PHÒNG (DIVA) ĐỐI VỚI LOẠI HUYẾT
THANH 1 CỦA VIRUS BỆNH NGỰA CHÂU PHI
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Trang 2BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC
BÁO CÁO TIỂU LUẬN
PHÁT TRIỂN PHƯƠNG PHÁP PCR THỜI GIAN THỰCĐỂ PHÂN BIỆT ĐỘNG VẬT BỊ NHIỄM VỚI ĐỘNG VẬTĐÃ ĐƯỢC TIÊM PHÒNG (DIVA) ĐỐI VỚI LOẠI HUYẾT
THANH 1 CỦA VIRUS BỆNH NGỰA CHÂU PHI
TS HUỲNH VĂN BIẾT
TP Thủ Đức, 10/2023
TRẦN PHẠM THẢO NGUYÊN 21126131 VÕ LINH THƯ 21126525
TRẦN ĐÌNH THU UYÊN 21126574
Trang 31.2 Mục tiêu nghiên cứu 1
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
2.1 Tổng quan về virus bệnh ngựa châu Phi (AHSV) 2
2.2 Đặc điểm hình thái của AHSV 2
2.3 Bệnh ngựa châu Phi (AHS) 3
2.4 Tác động và kiểm soát virus bệnh ngựa châu Phi 4
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 5
3.1 Vật liệu 5
3.2 Phương pháp nghiên cứu 5
3.2.1 Phát hiện và phân loại huyết thanh của AHSV bằng rRT-PCR 5
3.2.2 Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR 6
3.2.2.1 Primer and Probe 6
3.2.2.2 rRT-PCR 7
3.2.2.3 Đường cong vận hành hiệu chuẩn và máy thu 8
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 9
4.1 Kết quả 9
4.2 Thảo luận 13
Trang 4DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AHS: African horse sickness
AHSV: African horse sickness virus AUC: Area under the ROC curve BTV: Bluetongue virus
DIVA: Differentiating infected from vaccinated animals ROC: Receiver operating curve
Trang 5DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1.Trình tự và vị trí của mồi và đầu dò được sử dụng 7
Bảng 4.1 Đánh giá AHSV-1 DIVA rRT-PCR sử dụng mẫu ngựa và vắc xin từ
Thái Lan 11
Trang 6DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc của virus bệnh ngựa châu Phi 3Hình 3.1 Sự liên kết trình tự nucleotide của gen VP5 đối với các chủng vắc
xin OBP AHSV và AHSV-1 của Thái Lan 6
Hình 4.1 Sự liên kết trình tự nucleotide của gen VP5 đối với vắc-xin OBP
AHSV-1, chủng AHSV –1 phân lập ở Thái Lan, chủng AHSV –1 phân lập từ các nghiên cứu trước đó 10
Trang 7CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Bệnh ngựa châu Phi (AHS) là một bệnh truyền qua vector gây tử vong ảnh hưởng đến tất cả các loài ngựa Căn bệnh này gây ra hậu quả kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi ngựa Tổ chức Thú y Thế giới (WOAH) liệt kê AHS là một căn bệnh phải khai báo, ảnh hưởng đến việc di chuyển ngựa đến và đi từ các khu vực bị ảnh hưởng AHS được biết là bệnh đặc hữu ở các khu vực rộng lớn ở châu Phi cận Sahara và đã lan sang Maroc, Trung Đông, Ấn Độ và Pakistan Gần đây hơn, các đợt bùng phát đã được báo cáo ở Bán đảo Iberia, Thái Lan và Malaysia Vào tháng 3 năm 2020, một đợt bùng phát AHS đã được báo cáo ở tỉnh Nakhon Ratchasima ở Thái Lan; 610 con ngựa bị ảnh hưởng và tỷ lệ tử vong trong trường hợp là ≈ 93% Hiện tại không có phương pháp điều trị cụ thể nào cho AHS ngoài việc nghỉ ngơi, điều trị hỗ trợ và chăm sóc Tiêm phòng cho ngựa có nguy cơ vẫn là cách hiệu quả nhất để phòng ngừa và kiểm soát bệnh.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
Để phân biệt ngựa bị nhiễm bệnh với ngựa đã được tiêm phòng, việc áp dụng chiến lược Phân biệt ngựa bị nhiễm bệnh với động vật được tiêm phòng (DIVA) trở nên quan trọng để phát hiện bệnh sớm, hạn chế sự di chuyển của ngựa có nguy cơ và cho phép chính quyền giải quyết tốt hơn mối đe dọa an toàn sinh học do virus gây ra trong đợt bùng phát Thử nghiệm này được thiết kế để tăng cường các chương trình giám sát AHS và quản lý ổ dịch bằng cách cho phép phát hiện nhanh chóng và chắc chắn những con ngựa bị nhiễm bệnh cũng như hiểu rõ hơn về bước đột phá của vắc xin nếu nó xảy ra.
Trang 8CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về virus bệnh ngựa châu Phi (AHSV)
Virus bệnh ngựa châu Phi (AHSV) là một loài virus thuộc chi Orbivirus,phân họ Sedoreovirinae trong họ Reoviridae AHSV lây truyền qua động vậtchân đốt, đặc biệt là muỗi vằn Culicoides Ý tưởng cho rằng AHSV có thể lâytruyền qua động vật chân đốt hút máu thuộc chi Culicoides lần đầu tiên được
đề xuất bởi Pitchford và Theiler vào năm 1903 Du Toit sau đó đã chứng minh
rằng loài Culicoides hoang dã đã bị nhiễm AHSV Các thử nghiệm thực địa vàtrong phòng thí nghiệm đã cho thấy Culicoides imicola và ở mức độ thấp hơnlà Culicoides bolitinos là vật truyền bệnh chính của AHSV, mặc dù vẫn tồn tại
một số bằng chứng về khả năng lây truyền AHSV bởi các vật truyền bệnh động vật chân đốt khác.
2.2 Đặc điểm hình thái của AHSV
AHSV có nhiều đặc tính với các orbivirus khác như virus lưỡi xanh (BTV) và virus gây bệnh não ngựa và là một loại virus không có vỏ bọc, hình khối hai mươi mặt và đường kính khoảng 80 nm Bộ gen của nó bao gồm 10 đoạn RNA sợi đôi (dsRNA) có kích thước khác nhau: 3 đoạn lớn (L1–L3), 3 đoạn trung bình (M4–M6) và 4 đoạn nhỏ (S7–S10) 10 đoạn RNA sợi đôi này mã hóa cho 7 protein cấu trúc của virus (VP1–7) và 5protein phi cấu trúc (NSP1, NSP2, NSP3/3A và NSP4).
Lõi được bao quanh bởi ba lớp vỏ bọc: lớp vỏ bên trong bao gồm các bộ điều chỉnh VP3, lớp vỏ trung gian bao gồm các bộ phận cắt VP7, và cuối cùng, lớp vỏ ngoài khuếch tán bao gồm các bộ phận cắt VP2 và VP5 Trong lõi, VP1 (polymerase của virus), VP4 (enzym đóng) và VP6 (helicase của virus) tạo nên phức hợp phiên mã vi rút và được gắn vào bề mặt bên trong của vỏ VP3 Các protein phi cấu trúc tham gia vào quá trình nhân lên của virus (NSP1), hình thành hình thái (NSP2) và thoát ra (NSP3/3A) khỏi tế bào bị nhiễm bệnh Chức năng của NSP4 vẫn chưa được giải quyết, nhưng nó có thể liên kết với dsDNA và được cho là có thể đóng vai trò tương tự với cùng loại protein được tìm thấy trong BTV trong việc điều chỉnh khả năng miễn dịch của vật chủ.
Trang 9Hình 2.1 Cấu trúc của virus bệnh ngựa châu Phi
(Susan J Dennis và ctv, 2019).
Cho đến nay, 9 chủng huyết thanh đã biết của AHSV (AHSV 1–9) đã được xác định bằng phương pháp trung hòa virus Tất cả chín loại huyết thanh AHS đã được ghi nhận ở miền đông và miền nam Châu Phi, còn các loại huyết thanh 4, 6 và 9 đã được phát hiện trong các đợt bùng phát ở Trung Đông, Châu Á và Châu Âu AHSV, giống như các orbivirus khác, không chỉ có thể bị đột biến mà còn có thể tái tổ hợp gen, điều này có ý nghĩa nghiêm trọng đối với hiệu quả của các loại vắc xin hiện tại Các chất tái phân loại khả thi đưa vào nguồn gen sự đa dạng không thể đoán trước mà theo thời gian có thể thoát ra và vượt qua khả năng miễn dịch thu được trước đó, khiến động vật có nguy cơ bị nhiễm trùng trong tương lai.
2.3 Bệnh ngựa châu Phi (AHS)
Bệnh ngựa châu Phi (AHS), do virus AHS gây ra, là một bệnh có khả năng lây nhiễm cao và thường gây tử vong do 9 chủng huyết thanh của virus gây bệnh ngựa châu Phi (AHSV) Căn bệnh này gây ra hậu quả kinh tế lớn cho ngành chăn nuôi ngựa Các dấu hiệu của bệnh xảy ra trong vòng 10 ngày kể từ
Trang 102.4 Tác động và kiểm soát virus bệnh ngựa châu Phi
Tác động kinh tế xã hội của AHSV chủ yếu rơi vào hai quần thể ngựa riêng biệt ở Châu Phi Tỷ lệ mắc bệnh và tử vong do AHS ở ngựa lao động có thể hạn chế sức kéo mà những loài động vật này mang lại ở các nước có thu nhập thấp, do đó ảnh hưởng đến an ninh lương thực, xóa đói giảm nghèo và bình đẳng giới.
Sự bùng phát của AHSV được kiểm soát bằng cách kiểm dịch ngựa di chuyển từ các vùng AHS lưu hành và dịch bệnh đến các khu vực không có vi rút, tiêm phòng và ổn định Tác động của việc kiểm dịch chủ yếu rơi vào các vùng lây truyền lưu hành có liên quan đến đua ngựa và chăn nuôi.Vắc xin sống giảm độc lực (LAV), mang lại khả năng bảo vệ rộng rãi chống lại tất cả 9 loại huyết thanh AHSV, được sản xuất bởi Onderstepoort Biologic Products (OBP; https://www.obpvaccines.co.za) và có sẵn trên thị trường Vắc xin được cung cấp dưới dạng 2 lọ đa giá: hóa trị ba, chứa AHSV-1, AHSV-3 và AHSV-4; và hóa trị bốn, chứa AHSV-2, AHSV-6, AHSV-7 và AHSV-8.
Trang 11CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Vật liệu
Các mẫu mô đồng nhất (bao gồm phổi, lá lách và tim) và các mẫu máu từ ngựa có dấu hiệu lâm sàng của AHS đã được nộp cho Viện Thú y Quốc gia, Thái Lan Các mẫu được thu thập từ các tỉnh phía tây (Prachuap Khiri Khan, Phetchaburi và Ratchaburi), đông bắc (Nakhon Ratchasima) và phía đông (Chon Buri) ở Thái Lan Tổng cộng có 3 mẫu mô đồng nhất và 4 mẫu máu từ lô mẫu ban đầu này đã được nhận tại CAVS để phân tích trong phòng thí nghiệm.
Các mẫu vắc xin AHSV-1 OBP được lấy từ Phòng thí nghiệm tham chiếu của Liên minh châu Âu về bệnh ngựa châu Phi và bệnh lưỡi xanh, Phòng thí nghiệm thú y trung ương (Thú y) ở Madrid, Tây Ban Nha.
Các mẫu từ các lô ban đầu sau đó được đưa vào để đánh giá xét nghiệm AHSV-1 DIVA Để xác nhận thêm các xét nghiệm DIVA được thiết kế trong nghiên cứu này, máu toàn phần được bảo quản trong EDTA và các chất đồng nhất mô được thu thập từ những con ngựa bị bệnh lâm sàng (n = 31) và những con ngựa đã được tiêm phòng (n = 12).
3.2 Phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Phát hiện và phân loại huyết thanh của AHSV bằng rRT-PCR
Thực hiện chiết xuất RNA bằng cách sử dụng bộ MagMax Pathogen RNA/DNA (ThermoFisher Scientific,https://www.thermofisher.com).
Quy trình thực hiện:
1 100 µL mẫu đồng nhất mô, máu toàn phần và vắc xin đã được chiết xuất axit nucleic theo khuyến nghị của nhà sản xuất.
Trang 123 Sử dụng thể tích 2,5 µL RNA chiết xuất trong cả hai rRT-PCR và sau đó sử dụng những RNA được xác nhận là AHSV-1 để xác nhận xét nghiệm AHSV-1 DIVA.
3.2.2 Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR3.2.2.1 Primer and Probe
Các đoạn gen có chiều dài đầy đủ của chủng AHSV-1 được thu bằng cách sử dụng phương pháp khuếch đại mồi đơn, sau đó là giải trình tự Oxford Nanopore (GenBank accession nos MT711958–67) So với trình tự của chủng AHSV-1 (1/Labstr/ZAF/1998/OBP-116) được sử dụng để sản xuất vắc xin LAV-OBP (GenBank Accession nos KT030330.1–9.1), một vùng gần đầu 3’ của gen VP5 có độ tương tự trình tự thấp hơn và do đó được khai thác để thiết kế mồi và đầu dò.
Protein VP5 không tham gia vào các xét nghiệm trung hòa qua trung gian kháng thể AHS, so với protein VP7 được sử dụng rộng rãi nhưng được bảo tồn nhiều hơn Sau đó, các đoạn mồi và đầu dò sẽ được thiết kế bằng Primer3web phiên bản 4.1.0 (https://primer3.ut.ee).
Hình 3.1 Sự liên kết trình tự nucleotide của gen VP5 đối với các chủng vắc
xin OBP AHSV và AHSV-1 của Thái Lan Màu vàng biểu thị các vùng liên kết
mồi (VP5-DIVA-F / R) và màu xanh lá cây vùng liên kết đầu dò (VP5-DIVA-P1).AHSV, vi rút gây bệnh ngựa châu Phi; DIVA, Phân biệt bị nhiễm bệnh với động vậtđược tiêm phòng; OBP, Sản phẩm sinh học Onderstepoort; VP, protein virus (YifanWang và ctv, 2022).
Trang 13Sử dụng 2 chương trình để đánh giá độ đặc hiệu ủ của mồi và đầu dò được thiết kế mới: Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast) và BLAST Global Alignment (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Primer-BLAST xác định liệu các primer có đặc hiệu với chủng AHSV-1 chứ không phải 2 chủng còn lại trong liều vắc xin hóa trị ba hay không, trong khi BLAST Global Alignment đã liên kết vắc xin AHSV và trình tự nucleotide loại hoang dã bằng các đầu dò bằng thuật toán Needleman-Wunsch để đảm bảo phân biệt chủng vắc xin và chủng dịch.
3.2.2.2 rRT-PCR
Hai rRT-PCR được thiết kế bằng cách sử dụng các đầu dò khác nhau để nhắm vào cùng một vùng gen VP5 của AHSV-1 Đầu dò VP5-DIVA-P1 đặc biệt nhắm vào chủng bùng phát, trong khi đầu dò VP5-DIVA-P2-vac nhắm mục tiêu vào chủng vắc xin LAV-OBP.
rRT-PCR được tiến hành trong hỗn hợp phản ứng 25-µL chứa 12,5 µL dung dịch đệm RT-PCR, 1 µL hỗn hợp enzyme RT-PCR, 0,5 µL mỗi primer thuận (VP5-DIVA-F: 3 ′-AGCGTCGGATGCAAAGAAATC-10 ′) và primer
Bảng 3.1.Trình tự và vị trí của mồi và đầu dò AHSV-1 DIVA được sử dụng
(Yifan Wang và ctv, 2022)
Trang 1495°C trong 5 phút và sau đó làm nguội trong nước đá trong 2 phút trước khi thêm vào đĩa PCR.
Chu kỳ nhiệt bao gồm bước sao chép ngược ban đầu ở 45°C trong 10 phút, biến tính ở 95°C trong 10 phút, sau đó là 40 chu kỳ biến tính ở 95°C trong 15 giây và ủ ở 53°C trong 45 giây Giá trị chu kỳ ngưỡng (Ct) < 40 cho thấy phát hiện AHSV dương tính.
3.2.2.3 Đường cong vận hành hiệu chuẩn và máy thu
Pha loãng nối tiếp gấp 10 lần DNA virus được chiết xuất từ máu lấy từ một con ngựa khỏe mạnh đã xác định phạm vi động và tuyến tính của xét nghiệm AHSV-1 DIVA.
Đối với chủng vắc xin, sử dụng các độ pha loãng nối tiếp 10 lần trong mỗi xét nghiệm AHSV-1 DIVA để kiểm tra độ đặc hiệu và thử nghiệm từng độ pha loãng trong 3 lần chạy riêng biệt cho tất cả các xét nghiệm.
Các đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ đồ thị các giá trị Ct theo logarit của số lượng DNA ban đầu và số đọc độ dốc rút ra từ đường xu hướng phù hợp nhất.
Sử dụng phân tích đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC) để ước tính và đánh giá trực quan về hiệu suất độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm PCR định lượng Diện tích dưới đường cong (AUC) cũng có thể được coi là chỉ báo chất lượng tích lũy cho xét nghiệm chẩn đoán Gói pROC trong phần mềm R (The R Project for Statistical Computing, https://www.r-project.org) được sử dụng để vẽ đường cong ROC và tính các giá trị AUC.
Trang 15CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả
Vào thời điểm bùng phát dịch bệnh vào năm 2020, chủng gây bệnh được xác định là AHSV-1 bằng cả phương pháp rRT-PCR nhắm vào gen VP7 và VP2, và các biện pháp ứng phó khẩn cấp đã được thực hiện Hai rRT-PCR mà chúng tôi thiết kế nhằm mục đích phân biệt giữa những con ngựa bị ảnh hưởng lâm sàng và những con ngựa đã được tiêm phòng để xác định và quản lý ổ dịch Phân tích mô phỏng cho thấy các đầu dò DIVA đặc hiệu cho chủng bùng phát AHSV-1 và chủng vắc xin mà không phải cho AHSV-3 hoặc AHSV-4 trong vắc-xin hóa trị ba Đầu dò VP5-DIVA-P1 được thiết kế để phát hiện đợt bùng phát chủng AHSV-1 không thể liên kết hoàn toàn với chủng vắc-xin
KT030334-AHSV1-OBP, trong khi đầu dò tương tự cho thấy mức độ liên kết cụ thể cao với trình tự AHSV-1 của Thái Lan Ngược lại, đầu dò VP5-DIVA-P2 được liên kết cụ thể với chủng vắc xin AHSV-1 nhưng không phù hợp với chủng AHSV-1 bùng phát Ngoài ra, các mồi và đầu dò DIVA thiết kế theo các trình tự AHSV-1 được chọn lấy từ GenBank, trong khi đầu dò DIVA-1 dành riêng cho chủng bùng phát ở Thái Lan và nó được thiết kế trong nghiên cứu này Đầu dò DIVA-2 cũng đặc hiệu rõ ràng cho gen VP5 được xác định từ những con ngựa được tiêm phòng được báo cáo ở nơi khác.
Trang 16Sử dụng các mẫu đã được gửi để thử nghiệm bao gồm ngựa và 2 mẫu vắc xin, thực hiện 2 AHSV-1 DIVA rRT-PCR riêng biệt để chứng minh tính đặc hiệu của mồi và đầu dò in vitro RNA AHSV-1 được phát hiện trong 7 mẫu ngựa khi sử dụng mồi với đầu dò VP5-DIVA-P1 nhưng không phải với mồi với đầu dò VP5-DIVA-P2-vac Ngược lại, RNA AHSV-1 chỉ được phát hiện trong các mẫu vắc xin AHSV-1 OBP khi sử dụng đầu dò VP5-DIVA-P2-vac Những dữ liệu này đã chứng minh độ chính xác (100%) cho cả hai phương pháp AHSV DIVA rRT-PCR trong số ít mẫu.
Hình 4.1 Sự liên kết trình tự nucleotide của gen VP5 đối với vắc-xin OBP
AHSV-1, chng AHSV –1 phân lập ở Thái Lan, chủng AHSV –1 phân lập từ các nghiên cứu trước đó.Màu vàng biểu thị vùng liên kết mồi thuận và ngược vàmàu xanh lá cây vùng liên kết đầu dò (VP5-DIVA-P1 hoặc P2) AHSV: virus gâybệnh ngựa châu Phi; DIVA: Phân biệt động vật bị nhiễm bệnh với động vật đượctiêm phòng; OBP: sản phẩm sinh học Onderstepoort; VP: protein virus (YifanWang và ctv, 2022)