Thiết bị và kt cnsh nhóm 3 thứ 4 ca 2

Huỳnh Văn Biết Phát triển phương pháp qPCR để phân biệt động vật bị nhiễm với động vật đã được tiêm phòng DIVA đối với loại huyết thanh 1 của virus bệnh ngựa châu Phi... Vật liệuMẫu ngựa

BÁO CÁO

THIẾT BỊ VÀ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCMKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

GVHD: TS Huỳnh Văn Biết

Phát triển phương pháp qPCR để phân biệt động vật bị nhiễm với động vật đã được tiêm phòng

(DIVA) đối với loại huyết thanh 1 của virus bệnh ngựa châu Phi

MỞ ĐẦU 01

3

ngựa Căn bệnh này gây ra hậu quả kinh tế lớn cho ngành chăn

nuôi ngựa Hình 1.1 Truyền virus gây bệnh ngựa châu Phi qua vectơ côn trùng Nguồn: By Demircimehmed - Own work, CC BY-SA 4.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=40655084

• Vào tháng 3 năm 2020, một đợt

bùng phát AHS đã được báo cáo ở tỉnh Nakhon Ratchasima ở Thái Lan.

• Khoảng 610 con ngựa bị ảnh

hưởng và tỷ lệ tử vong trong

1.1 Đặt vấn đề

Hiện tại không có phương pháp điều trị cụ thể nào cho AHS ngoài việc nghỉ ngơi,

Hình 1.4 Ngựa nhiễm bệnh bị sưng trên

hốc mắt https://www.msdvetmanual.com/

Hình 1.5 Một lượng lớn chất lỏng sủi bọt, serofibrinous

thường được nhìn thấy đến từ lỗ mũi

https://www.westsidefacts.com/2022/11/horse-sickness-african-horse-sickness.html

1.1 Đặt vấn đề

7

1.2 Mục tiêu

Để phân biệt ngựa bị nhiễm bệnh với ngựa đã

Hạn chế sự di chuyển của ngựa có nguy cơ và cho phép chính quyền giải quyết tốt hơn mối đe dọa an toàn sinh học do dịch bệnh gây ra

Phát hiện nhanh chóng và chắc chắn những con ngựa bị nhiễm bệnh cũng như hiểu rõ hơn về bước đột phá của vắc xin nếu nó xảy ra.

TỔNG QUAN

9

2.1 Tổng quan về virus bệnh ngựa châu Phi

Virus bệnh ngựa châu Phi (AHSV) là một loài virus thuộc chi Orbivirus, phân họ Sedoreovirinae trong họ Reoviridae AHSV lây truyền qua động vật chân đốt, đặc biệt là muỗi vằn Culicoides.

Hình 2.1 Cấu trúc kính hiển vi điện tử 3D của vi rút gây bệnh ngựa châu

Phi

Nguồn: http://www.pdbe.org/emsearch/african%20horse%20sickness

2.2 Đặc điểm hình thái của AHSV

• Là một loại virus không có vỏ bọc, hình khối hai mươi mặt và đường kính khoảng 80 nm

• Bộ gen của nó bao gồm 10 đoạn RNA sợi đôi (dsRNA) có kích thước khác nhau.

• 10 đoạn RNA sợi đôi này mã hóa cho 7 protein cấu trúc của virus (VP1–7) và 5 protein phi cấu trúc • Cho đến nay, 9 chủng huyết thanh

đã biết của AHSV (AHSV 1–9) đã được xác định bằng phương pháp trung hòa virus.

Hình 2.2 Cấu trúc vi rút gây bệnh ngựa châu Phi

Nguồn: https://doi.org/10.3390/v1109084411

2.3 Tổng quan về vắc xin sống giảm động lực (LAV)

• Vắc xin sống giảm độc lực (LAV), mang lại khả năng bảo vệ rộng rãi chống lại tất cả 9 loại huyết thanh AHSV, được sản xuất bởi

Onderstepoort Biologic Products có sẵn trên thị trường.

• Vắc xin được cung cấp dưới dạng 2 lọ đa giá: hóa trị ba, chứa AHSV-1, AHSV-3 và AHSV-4; và hóa trị bốn, chứa 2,

AHSV-6, AHSV-7 và AHSV-8 Hình 2.3 Vắc xin phòng bệnh ngựa châu

Phi dành cho ngựa, la và lừa của OBP.Nguồn: https://www.obpvaccines.co.za

PHƯƠNG PHÁP 03

13

3.1 Vật liệu

Mẫu ngựa và mẫu vắc xin:

Các mẫu mô đồng nhất (bao gồm phổi, lá lách và tim) và các mẫu máu từ ngựa có dấu hiệu lâm sàng của AHS đã được nộp cho Viện Thú y Quốc gia, Thái Lan.

Các mẫu vắc xin AHSV-1 OBP được lấy từ Phòng thí nghiệm tham chiếu của Liên minh châu Âu về bệnh ngựa châu Phi.

Các mẫu từ các lô ban đầu sau đó được đưa vào để đánh giá xét nghiệm

3.2 Phương pháp nghiên cứu

Phát hiện và xác định kiểu huyết thanh của AHSV bằng rRT-PCR

Phát hiện và xác định kiểu huyết thanh của AHSV bằng rRT-PCR

Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR

14

Thực hiện chiết xuất RNA bằng cách sử dụng bộ MagMax Pathogen RNA/DNA

3.2.1 Phát hiện và phân loại huyết thanh của AHSV bằng

3.2.2 Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR

3.2.2.1 Primer and Probe

• Các đoạn gen có chiều dài đầy đủ của chủng AHSV-1 được thu bằng cách sử dụng phương pháp khuếch đại mồi đơn, sau đó là giải trình tự Oxford Nanopore • So với trình tự của chủng AHSV-1 được sử dụng để sản xuất vắc xin LAV-OBP,

một vùng gần đầu 3’ của gen VP5 có độ tương tự trình tự thấp hơn 🡪 được khai thác để thiết kế mồi và đầu dò Sau đó, các mồi và đầu dò sẽ được thiết kế bằng Primer3web phiên bản 4.1.0

• Sử dụng 2 chương trình để đánh giá độ đặc hiệu ủ của mồi và đầu dò được thiết kế mới: Primer-BLAST và BLAST Global Alignment.

3.2.2.2 rRT-PCR

Hai rRT-PCR được thiết kế bằng cách sử dụng các đầu dò khác nhau để nhắm vào cùng một vùng gen VP5 của AHSV-1

Đầu dò VP5-DIVA-P1 đặc biệt nhắm vào chủng bùng phát, trong khi đầu dò VP5-DIVA-P2-vac nhắm mục tiêu vào chủng vắc xin LAV-OBP

3.2.2 Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR

17

3.2.2 Phát triển AHSV-1 DIVA rRT-PCR

3.2.2.3 Đường cong vận hành hiệu chuẩn và máy thu

Sử dụng phân tích đường cong đặc tính hoạt động của máy thu (ROC) để ước tính và đánh giá trực quan về hiệu suất độ nhạy và độ đặc hiệu của các xét nghiệm PCR định lượng

Các đường cong hiệu chuẩn tiêu chuẩn được tạo ra bằng cách vẽ đồ thị các giá trị Ct theo logarit của số lượng DNA ban đầu và số đọc độ dốc rút ra từ đường xu hướng phù hợp nhất.

KẾT QUẢ

19

4.1 Kết quả

Phân tích mô phỏng cho thấy các đầu dò DIVA đặc hiệu cho chủng bùng phát AHSV-1 và chủng vắc xin Đầu dò VP5-DIVA-P1 được thiết kế để phát hiện đợt bùng phát chủng AHSV-1 không thể liên kết hoàn toàn với chủng vắc xin KT030334-AHSV1-OBP, trong khi đầu dò tương tự cho thấy mức độ liên kết cụ thể cao với trình tự AHSV-1 của Thái Lan Ngược lại, đầu dò VP5-DIVA-P2 được liên kết cụ thể với chủng vắc xin AHSV-1 nhưng không phù hợp với chủng AHSV-1 bùng phát.

4.1 Kết quả

Sử dụng các mẫu đã được gửi để thử nghiệm bao gồm ngựa và 2 mẫu vắc xin, thực hiện 2 AHSV-1 DIVA rRT-PCR riêng biệt để chứng minh tính đặc hiệu của mồi và đầu dò in vitro.

Chứng minh rằng các cặp mồi được thiết kế thực sự đủ đặc hiệu và nhạy cảm để phân biệt giữa vắc xin và chủng AHSV-1 hoang dã:

• Thu thập thêm mẫu máu và mô từ cả động vật được tiêm phòng trước và sau tiêm chủng từ ngựa trong khu vực bùng phát ở Thái Lan

• Sử dụng các mẫu này, quan sát thấy rằng ngựa bị nhiễm AHSV (tức là bị ảnh hưởng lâm sàng) và ngựa được tiêm phòng có thể được phân biệt bằng cách sử dụng các xét nghiệm VP5-DIVA-P1 và VP5-DIVA-P2-vac được thiết kế trong nghiên cứu này với độ chính xác 100%.

21

4.2 Thảo luận

Sau đợt bùng phát ở Thái Lan trong đó AHSV-1 là tác nhân gây bệnh, những nỗ lực quản lý dịch bệnh và bảo vệ động vật đã tập trung vào kiểu huyết thanh này Xét nghiệm AHSV-1 DIVA được mô tả trong nghiên cứu này chỉ áp dụng cho OBP LAV hiện đang được sử dụng trong chiến dịch tiêm chủng ở Thái Lan.

nguy cơ, hữu ích cho việc giám sát và kiểm soát ổ

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1 Wang, Y., Ong, J., Ng, O., Songkasupa, T., Koh, E Y., Wong, J Yap, H (2022) Development of Differentiating Infected from Vaccinated Animals

(DIVA) Real-Time PCR for African Horse Sickness Virus Serotype 1 Emerging Infectious Diseases, 28(12), 2446-2454.

2 Castillo-Olivares, J African horse sickness in Thailand: Challenges ofcontrolling an outbreak by vaccination Equine Vet J 2021; 53: 9–143 Meiswinkel, R., & Paweska, J T (2003) Evidence for a new fieldCulicoides vector of African horse sickness in South Africa Preventiveveterinary medicine, 60(3), 243–253

CẢM ƠN THẦY

VÀ CÁC BẠN ĐÃ LẮNG NGHE!

26