CẤU TẠO VÀ NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG MÁY PCR VÀ
Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR
Thiết kế mồi cho phản ứng PCR: đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu của mồi, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược, khả năng tạo primer dimer,
Có rất nhiều loại PCR khác nhau tùy theo nhu cầu sử dụng mà lựa chọn phù hợp và tối ưu nhất.
Phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ gắn mồi; nồng độ các chất tham gia các chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt,… Tùy mỗi đối tượng mà mục tiêu hướng đến mà sẽ có sự thay đổi cho phù hợp.
Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy PCR
PCR là chữ viết tắt của cụm từ Polymerase Chain Reaction, được dịch ở một vài sách là Phản ứng chuỗi trùng hợp cũng có sách gọi là "phản ứng khuếch đại gen" PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm khuếch đại (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA mà không cần sử dụng các sinh vật sống như E.coli hay nấm men.
PCR được sử dụng trong các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều ứng dụng khác nhau như nhân bản ADN để giải trình tự, nghiên cứu quá trình phát sinh chủng loại dựa trên bằng chứng về ADN, hoặc phân tích chức năng của gen; chẩn đoán các bệnh di truyền; xác định các dấu vân tay ADN (sử dụng trong khoa học pháp y và xác định quan hệ huyết thống), phát hiện và chẩn đoán các bệnh truyền nhiễm.
Vào năm 1977, Frederick Sanger đã xác định được phương pháp giải trình tựDNA liên quan đến DNA polymerase, mồi và tiền chất nucleotide, nhờ đó ông đã được trao giải Nobel năm 1980 Do đó, đến năm 1980, tất cả các thành phần để khuếch đại PCR đã sẵn sàng Tuy nhiên, phải đến năm 1983, trong nỗ lực khắc phục một số vấn đề trong công trình nghiên cứu của mình, Mullis mới sử dụng phương pháp giải trình tự DNA của Sanger làm cơ sở để nghĩ ra một kỹ thuật mới Ông đã thêm mồi thứ hai vào chuỗi đối diện và nhận ra rằng việc sử dụng lặp lại DNA Polymerase sẽ kích hoạt phản ứng dây chuyền khuếch đại một đoạn DNA cụ thể, từ đó khám phá ra công nghệ PCR Kary Mullis đã đoạt giải Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 (với Michael Smith) cho thành tựu này.
Phương pháp PCR dựa trên chu kỳ nhiệt, bao gồm các chu kỳ tăng giảm nhiệt độ trong phản ứng biến tính ADN và tái bản ADN Đoạn mồi (là đoạn ADN ngắn) mang các trình tự bổ sung với trình tự ADN đích và ADN Polymerase là những thành phần quan trọng cho phép khuếch đại một cách chọn lọc và lặp lại Khi quá trình PCR diễn ra, ADN mới được tạo ra từ ADN khuôn ban đầu sẽ tiếp tục được sử dụng làm khuôn để tổng hợp phân tử ADN tiếp theo, tạo thành chuỗi phản ứng dây chuyền trong đó các mẫu DNA được khuếch đại theo cấp số nhân.
Hầu như tất cả các kỹ thuật PCR sử dụng một ADN Polymerase bền nhiệt, như Taq Polymerase (enzyme có nguồn gốc từ vi khuẩn Thermus Aquaticus) ADN Polymerase này có hoạt tính lắp ráp tổng hợp sợi ADN mới từ các đơn phân nucleotide bằng cách sử dụng khuôn ADN sợi đơn và các đoạn ADN Oligonucleotide (hay còn gọi là ADN mồi), đây cũng là các thành phần bắt buộc để bắt đầu quá trình tổng hợp DNA Phần lớn các phương pháp PCR sử dụng chu trình nhiệt, nghĩa là, tiến hành xen kẽ quá trình gia nhiệt và giảm nhiệt các mẫu PCR thông qua một chuỗi các giai đoạn nhiệt khác nhau được xác định.
1.2.2 Cấu tạo máy PCR cổ điển (máy luân nhiệt) 1.2.2.1 Cấu tạo
Gồm 3 bộ phận chính: bộ phận điều khiển, bộ phận luân nhiệt, nguồn điện.
Hình 1.1 Máy PCR cổ điển.
Bao gồm: màn hình, phím bấm, vi mạch điều khiển,
Vai trò: giúp người dùng thiết lập chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị.
Bao gồm: nắp nhiệt, Block nhiệt, bộ phận gia nhiệt, quạt tản nhiệt, cảm biến nhiệt,
Vai trò: giúp thay đổi nhiệt độ phản ứng liên tục theo chu trình nhiệt độ được thiết lập.
Công nghệ Gradient nhiệt độ:
+ Block nhiệt được cấu tạo từ 2 sò nóng lạnh trở lên Nhiệt độ trên Block được phân bố theo dải Gradient hoặc từng vùng riêng biệt.
+ Công nghệ Gradient nhiệt độ giúp thực hiện phản ứng PCR cùng lúc với nhiều nhiệt độ khác nhau nhờ đó tiết kiệm thời gian tối ưu hóa phản ứng PCR.
Cảm biến nhiệt: giúp đo nhiệt độ.
Quạt tản nhiệt: giúp làm giảm nhiệt độ nhanh hơn khi phản ứng chuyển sang giai đoạn có nhiệt độ phản ứng thấp hơn (ví dụ từ giai đoạn biến tính sang giai đoạn bắt cặp).
+ Bao gồm: điện trở, cảm biến nhiệt,
+ Vai trò: gia nhiệt cho phần nắp của tube PCR giúp ngăn cản quá trình bay hơi và ngưng tụ gây hao hụt thể tích phản ứng.
Bao gồm: biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot,
Vai trò: chuyển đổi dòng điện xoay chiều 220V thành dòng điện một chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị.
Một chu kỳ nhiệt của PCR sẽ gồm 3 giai đoạn nhiệt độ:
Biến tính: nhiệt độ sẽ được đưa lên 94 o C, các liên kết hydro sẽ bị phá vỡ khiếnDNA sợi đôi bị tách thành dạng sợi đơn.
Bắt cặp: nhiệt độ được hạ xuống 55 - 65 o C, các đoạn mồi sẽ bắt cặp bổ sung vào 2 đầu trình tự mục tiêu
Kéo dài: nhiệt độ được đưa lên 72 o C, Taq Polymerase sẽ sử dụng dNTPs để kéo dài đầu 3' của mồi và tạo ra mạch bổ sung.
1.2.3 Cấu tạo máy PCR hiện đại 1.2.3.1 Bộ phận điều khiển
+ Màn hình: đồ họa lớn để dễ đọc và theo dõi, cung cấp thông tin về trạng thái hiện tại của các tính năng và chức năng của máy.
+ Phím bấm: cho phép người dùng nhập các giao thức và cài đặt khác nhau cần thiết cho quy trình PCR.
+ Phần mềm cho phép thiết lập các thông số: vị trí trên Block nhiệt, đặt chu trình nhiệt, hiển thị và phân tích kết quả hoặc tương đương.
+ Đóng vai trò là bộ phận giao tiếp với người dùng, giúp thiết lập chương trình và điều khiển hoạt động của thiết bị.
Bao gồm: biến áp, cầu chì, tụ điện, điện trở, diot. Đóng vai trò chuyển đổi đòng điện xoay chiều 220V thành dòng diện một chiều với nhiều mức điện áp khác nhau để cung cấp cho các bộ phận khác nhau của thiết bị.
Bao gồm nắp nhiệt, Block nhiệt, bộ phận gia nhiệt, quạt tản nhiệt, cảm biến nhiệt,
… Đóng vai trò thay đổi nhiệt độ phản ứng liên tục theo chu trình nhiệt được thiết lập.
Khi hai dây dẫn khác loại nối với nhau và đặt ở hai nhiệt độ khác nhau (tức là có Gradient nhiệt) thì tạo ra một điện áp Sự chênh lệch nhiệt dẫn đến dòng nhiệt truyền, làm khuếch tán các hạt mang điện Dòng chảy giữa các hạt mang điện giữa các vùng nóng và lạnh lại tạo ra một điện áp khác nhau.
Năm 1834, Jean Charles Athanase Peltier phát hiện ra hiệu ứng ngược lại, rằng một dòng điện chạy qua mối nối nhau của hai dây dẫn khác loại nhau, thì tùy thuộc vào chiều dòng điện, làm cho nó hoạt động như một phần tử làm nóng hoặc làm mát.
Hiệu ứng được gọi là hiệu ứng Peltier và Bơm nhiệt Peltier hoạt động theo hiệu ứng này.
Cấu tạo và nguyên lý hoạt động máy Real-time PCR
Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vào DNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe này.
1.3.1.2 Mục đính của máy Real-time PCR Định tính trình tự đích trong mẫu: giống như PCR, Real-time PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm, ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP),
1.3.1.3 Nguyên lý hoạt động của máy Real-time PCR
Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR/ Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vàoDNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe này Việc khuếch đại này dựa trên sự khác nhau của nhiệt độ phản ứng và những biến đổi của các thành phần.
1.3.2 Thiết bị trong máy Real-time PCR
1.3.2.1 Cấu tạo của máy Real-time PCR
+ Phần nhiệt: dùng để luân nhiệt cho quá trình phản ứng PCR.
+ Phần quang: dùng để phát hiện tính hiệu huỳnh quang phát ra trong quá trình phản ứng.
Hình 1.3 Máy Real-time PCR Rotor Gene Q MDx.
1.3.2.2 Các loại tube sử dụng trong Real-time PCR 1.3.2.2.1 Tube đơn Ống sử dụng trong quá trình ly tâm, tách chiết, bảo quản mẫu… Có khóa nắp an toàn Làm từ nhựa nguyên sinh không có các hóa chất thôi ra từ nhựa gây ảnh hưởng kết quả thí nghiệm Chịu lực ly tâm lên đến 30.000 xg.
Các dải có thể tùy chỉnh dễ dàng chia thành các phần nhỏ hơn Các nắp được gắn theo góc ngăn không cho nắp và bản lề giao thoa với nhau, cho phép vận hành dễ dàng hơn trong giá đỡ định dạng SBS Để sử dụng trong y tế, dược phẩm và công nghiệp thực phẩm, và sinh học phân tử.
Mô hình 96 giếng là một loại ELISA PLATE, có vai trò quan trọng trong thử nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme (ELISA) Nó tham gia vào phản ứng miễn dịch học, chẳng hạn như: lớp phủ kháng thể hoặc kháng nguyên, khối đệm,
1.3.3 Định tính trình tự đích trong mẫu
Giống như PCR, Real-time PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm,… ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP),
Khi đem một mẫu chuẩn có hàm lượng DNA đã xác định đi pha loãng bậc 10 liên tiếp, sau đó đem tất cả các nồng độ pha loãng đi chạy Real-time PCR ta sẽ được các giá trị chu kỳ ngưỡng Ct khác nhau Đường biểu diễn mối liên hệ giữa Ct và hàm lượng DNA được gọi là đường chuẩn Real-time PCR.
1.3.5 Phương pháp phân tích đường cong nóng chảy
Hiệu chuẩn (Calibration) là hoạt động xác định, thiết lập mối quan hệ giữa giá trị đo của chuẩn đo lường, phương tiện đo với giá trị đo của đại lượng cần đo.
Hiệu chỉnh (Adjustment) là chỉnh sửa những sai sót của máy móc, thiết bị nhằm đạt một độ chính xác và độ tin cậy cần thiết của máy móc, thiết bị.
Bảo trì (Maintenance) là hoạt động chăm sóc kĩ thuật, điều chỉnh, sửa chữa hoặc thay thế một hoặc nhiều chi tiết hay cụm chi tiết nhằm duy trì hoặc khôi phục các thông số hoạt động, bảo đảm máy móc thiết bị hoạt động với tính năng đã xác định trước.
Kiểm định (Verification) là hoạt động kỹ thuật theo một quy trình nhất định nhằm đánh giá và xác nhận sự phù hợp của sản phẩm, hàng hoá với yêu cầu quy định trong quy chuẩn kỹ thuật tương ứng.
Cơ chế hoạt động của SYBR Green và Taqman
SYBR Green và Taqman là hai phương pháp được sử dụng để phát hiện hoặc theo dõi quá trình khuếch đại của PCR thời gian thực.
1.4.1 Cơ chế hoạt động của SYBR GREEN
Phương pháp SYBR Green được thực hiện bằng cách sử dụng thuốc nhuộm huỳnh quang gọi là SYBR Green và phát hiện sự khuếch đại bằng cách liên kết thuốc nhuộm với DNA sợi đôi được tạo ra.
Hình 1.7 Cơ chế hoạt động của SYBR GREEN.
Dùng SYBR GREEN I Dye, một dye bám đặc hiệu DNA mạch kép để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ.
Phát hiện tất cả các DNA mạch đôi, bao gồm cả sản phẩm không đặc hiệu.
Cho phép theo dõi sự khuếch đại của bất cứ trình tự mạch đôi nào Không cần thiết kế probe, giảm công sức cài đặt và giá thành Nhiều dye có thể bám vào một phân tử duy nhất, tăng độ nhạy cho phát hiện sản phẩm.
Có thể dương tính giả vì không phân biệt được sản phẩm không đặc hiệu.
1.4.2 Cơ chế hoạt động của Taqman
Phương pháp Taqman được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò được gắn nhãn kép và phát hiện sự khuếch đại bằng cách suy thoái đầu dò bởi Taq Polymerase và giải phóng Fluorophore.
Hình 1.8 Cơ chế hoạt động của TaqMan.
Dùng một probe đánh dấu huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ.
Chỉ phát hiện các sản phẩm được khuếch đại đặc hiệu.
+ Phân tích lộ trình/ biểu hiện/ đột biến/ protein, multiplexing.
Lai đặc hiệu giữa probe và đích là cần để sinh tín hiệu huỳnh quang, vì thế giảm tín hiệu nền và dương tính giả Đánh dấu các probe khác nhau bằng các dye báo cáo khác nhau nên khuếch đại được 2 (thậm chí 4) trình tự đích cùng lúc Xử lý sau PCR là không cần, tiết kiệm.
Mỗi probe phải thiết kế thêm cho mỗi trình tự đích nhất định.
XÂY DỰNG PHẢN ỨNG PCR
Xây dựng phản ứng PCR
2.1.1 Thành phần phản ứng PCR
PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đã xác định được một phần. Đó có thể là một gen đơn, hay một phần của gen Dể thực hiện một phản ứng PCR cần rất nhiều thành phần Những thành phần đó là:
- DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại.
- Cặp mồi(primer), để xác định điểm bắt đầu và kết thúc vùng cần khuếch đại
- DNA-polymerase enzym xúc tác cho việc nhân lên của DNA.
- Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA-polymerase để xây dựng DNA mới.
- Dung dịch đệm, cung cấp môi trường hóa học cho DNA
- Polymerase phản ứng PCR được thực hiện trong chu kỳ nhiệt Đây là máy đun nóng và làm nguội trong ống phản ứng ở nhiệt độ chính xác cho mỗi phản ứng.
2.1.2 Xây dựng phản ứng PCR
Tiền biến tính: bước biến tính ban đầu là 1 phút ở 95°C được khuyến nghị cho các mẫu không phức tạp như DNA plasmid hoặc cDNA Đối với các khuôn phức tạp hơn như DNA bộ gen của sinh vật nhân chuẩn, thời gian biến tính ban đầu dài hơn lên đến 3 phút là cần thiết để tạo điều kiện cho DNA tan chảy hoàn toàn.
Biến tính: đề xuất bước biến tính chu kỳ 15 giây ở 95°C, bước này cũng phù hợp với các mẫu giàu GC, tuy nhiên đối với các mẫu có hàm lượng GC thấp (40 - 45%), thời gian biến tính có thể giảm xuống còn 5 giây.
Nhiệt độ và thời gian bắt cặp: nhiệt độ bắt cặp tối ưu phụ thuộc vào trình tự mồi và thường là 2 - 5°C
Nhiệt độ và thời gian kéo dài: bước kéo dài phải được thực hiện ở 72°C Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của amplicon và độ phức tạp của mẫu.
Chương trình nhiệt của phản ứng PCR
Bước Nhiệt độ ( O C) Thời gian Số chu kỳ
Các bước tiến hành
Bước 1: hút 12,5l master mix cho vào ống tube.
Bước 2: thay đầu tip, hút thêm 0,5l primer cho vào tube.
Bước 3: thay đầu tip, hút 10l H2O cho vào tube.
Bước 4: thêm 1,5l đối chứng dương (chứa DNA con heo).
Bước 5: trộn đều hỗn hợp. b Đối chứng âm:
Bước 1: hút 12,5l master mix cho vào ống tube.
Bước 2: thay đầu tip, hút thêm 0,5l primer cho vào tube.
Bước 3: thay đầu tip, hút 11.5l H2O cho vào tube.
Bước 4: trộn đều hỗn hợp. c Mẫu:
Bước 1: hút 12,5l master mix cho vào ống tube.
Bước 2: thay đầu tip, hút thêm 0,5l primer cho vào tube.
Bước 3: thay đầu tip, hút 10l H2O cho vào tube.
Bước 4: thêm 1,5l mẫu (có thể có chứa DNA con heo).
Bước 5: trộn đều hỗn hợp.
Bước 6: Sau khi mix mãu xong, bỏ vào máy ly tâm mini.
Bước 7: bỏ tube vào máy PCR
ĐIỆN DI, PHÂN TÍCH KẾT QUẢ
Giới thiệu về điện di
Có thể thực hiện phân tách protein có độ phân giải cao, dựa trên sự chênh lệch điện tích bằng phương pháp điện di đĩa, điện di dịch chuyển (điện di đẳng hướng) và đặc biệt là tập trung đẳng điện (IEF) Sự phân tách kích thước thu được bằng điện di trên gel natri dodecyl sulfate-polyacrylamide (SDS-PAGE) Sự kết hợp của Gel IEF, tiếp theo là SDS-PAGE trong gel phiến chiều thứ hai, tức là điện di gel hai chiều, mang lại độ phân giải cao nhất lên tới vài nghìn điểm trên mỗi Gel Nhuộm protein mang lại các mẫu có độ phân giải cao có thể được quét và lưu trữ trong cơ sở dữ liệu toàn diện Trong 10 năm qua, sự phân tách điện di trong Gel và hình ảnh tiếp theo của axit nucleic (DNA, RNA) và thậm chí cả gen cũng như nucleotide đã được cải thiện nhiều, giúp lập bản đồ gen ở người và tất cả các sinh vật khác một cách hiệu quả Điều này đã dẫn đến nỗ lực phối hợp lớn nhất trong lịch sử khoa học, tức là lập bản đồ bộ gen của con người, điều này sẽ có tầm quan trọng chừng nào loài người còn tồn tại.
Trong những năm gần đây, điện di trong mao mạch đã thu hút nhiều sự quan tâm vì đối với nhiều chất, chẳng hạn như protein, axit nucleic, dược phẩm, chất chuyển hóa và peptide, nó mang lại độ phân giải cao trên thang phân tích với hơn 1 triệu đĩa lý thuyết Phương pháp điện di có tác động chưa từng có đối với khoa học đời sống, tạo cơ sở cho những tiến bộ độc đáo trong hóa sinh, sinh học phân tử, di truyền, công nghệ gen và y học.
Sản phẩm sau khi PCR được quan sát bằng kỹ thuật điện di DNA trên Gel Agarose Chất nhuộm DNA có trong Gel Agarose sẽ bám vào các sản phẩm PCR khi những phân tử này di chuyển trong Gel dưới tác dụng của điện trường Dưới ánh sáng cực tím (UV) chất nhuộm DNA sẽ phát quang và cho phép xác định được vị trí của sản phẩm PCR Khi so sánh với vị trí của các đoạn DNA chuẩn biết trước kích thước, kỹ thuật viên sẽ biết được kích thước của sản phẩm PCR và kết luận được trong mẫu DNA ban đầu có chứa DNA mục tiêu hay không
3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng khi điện di
Hiệu điện thế: hiệu điện thế càng lớn thì tốc độ điện di càng nhanh.
Nồng độ Gel: nồng độ Gel càng lớn thì tốc độ điện di càng chậm. Ảnh hưởng từ hoá chất: trước khi điện di cần kiểm tra hoá chất vì hoá chất hoạt động tốt thì mới ra băng phản ứng mới xảy ra thì mới đọc kết quả được. Ảnh hưởng từ thao tác: trong quá trình thao tác người làm cần làm đúng các bước từ đầu đến cuối vì chỉ cần sai ở bước nào đó hoặc nhầm lẫn giữ các bước thì kết quả cũng không đúng. Ảnh hưởng từ thiết bị: khi thiết bị không còn hoạt động tốt như việc điện thế lớn dẫn đến các đoạn DNA di chuyển nhanh nên khi kết quả được trả về là kết quả sai.
Quy trình thực hiện khái quát
Luôn nằm ở trạng thái trung gian rắn và lỏng Tốc độ hình thành gel phụ thuộc vào 3 yếu tố: nồng độ các monomer và các gốc tự do, nhiệt độ và độ tinh khiết của hóa chất sử dụng.
Agarose là một loại polysaccharide tự nhiên được chiết từ tảo biển Gel Agarose sử dụng trong điện di thường ở nồng độ 0.5 ~ 2%, tùy vào kích thước DNA cần phân tách.
Gel Agarose: gồm 2 loại TBE và TAE Được chiết xuất từ tảo biển, có các cầu nối hydrogen, kích thước lỗ Gel lớn, nên phù hợp cho các phân tử lớn và điện di dựa trên độ kích điện.
Gel Acrylamide: là sản phẩm tổng hợp, có thể tạo thành gel với nhiều kích thước lỗ khác nhau.
Gel Polyacrylamide (PAGE) kích thước lỗ gel được xác định theo nồng độ (nồng độ thông thường là 15%, theo gradient là 5 - 25%)
3.2.1.2 Dung dịch đệm khi điện di (Buffer)
Hệ đệm liên tục (Continuous Buffer System): thường được sử dụng khi điện di acid nucleic và protein.
Hệ đệm không liên tục ( Discontinuous Buffer System): ion khác nhau giữa Gel và buffer và cần độ phân giải cao.
TAE: Tris-acetate-EDTA phù hợp phân tách các đoạn lớn hơn 4kb.
(Điện di DNA trên Gel Agarose ở điện thế cao sẽ sinh ra nhiệt Dung dịch đệm có độ dẫn điện cao như TAE sẽ tạo ra nhiều nhiệt hơn so với dung dịch có độ dẫn điện thấp Khi điện di với điện thế cao hơn 175 volt nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy hình chữ S, không thể lấy được kết quả Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời gian dài có thể gây chảy miếng Gel Khi chạy điện di DNA trên agarose ở điện thế cao, tránh dùng các loại Agarose có điểm nóng chảy thấp).
TBE: Tris-acetate-EDTA phù hợp phân tách các đoạn lớn hơn 0.1 – 3kb (Chất Borate – một chất ức chế enzyme – có chứa trong Dung dịch điện di TAE đã khiến cho sản phẩm có được khả năng đệm rất tốt).
3.2.1.3 Các chất tẩy rửa và chất biến tính Được dùng để phá vỡ các tương tác protein - lipid, protein - protein Có nhiều loại chất tẩy rửa khác nhau.
SDS là một chất tẩy rửa mạnh được sử dụng để làm biến đổi các protein bản địa để mở ra các polypeptit cá nhân Khi một hỗn hợp protein được làm nóng đến 100°C với sự hiện diện của SDS, chất tẩy bao bọc xung quanh xương sống polypeptide.
Trong quá trình này, các giá trị nội tại của các polypeptide trở nên không đáng kể so với các chi phí âm tính do SDS đóng góp Do đó các polypeptide sau khi xử lý trở thành các cấu trúc giống như que có mật độ điện tích đồng nhất, đó là cùng một điện tích âm ròng trên một đơn vị chiều dài Các điện di electrophoretic của các protein này sẽ là một chức năng tuyến tính của logarithms của trọng lượng phân tử của họ.
LDS (Lithium Dodect Sulfate): được dùng thay cho SDS trong điện di SDS- PAGE.
Uréa: được sử dụng thường xuyên, dùng để phá vỡ cầu nối hydro, không được dùng chung với Gel Agarose vì Uréa bẻ gãy cầu nối hydro trong Gel Agarose.
Formamide: dùng để biến tính RNA và DNA, bẻ gãy cầu nối hydro.
Chuẩn bị Gel điện di có nồng độ Agarose 1,5%.
+ Tính lượng Agarose và thể tích dung dịch đệm cần thiết+ Trộn Agarose và dung dịch đệm, sau đó đem đun sôi sao cho lượng Agarose tan hết (có thể nung nóng 2-3 lần nếu Agarose chưa tan)
+ Để dung dịch nguội tự nhiên, đến khoảng 60℃ thì tiến hành đổ vào khuôn và thì tiến hành đổ vào khuôn và lược đã chuẩn bị sẳn (đổ chậm và nhẹ nhàng ở góc khay để tránh tình trạng tạo bọt khí) Đợi gel đông và tiến hành điện di Cho Gel vào bồn điện di.
Bước 1: hỳt 10àl hỗn hợp GelRed và Loadingdye rồi cho lờn giấy bạc hoặc Parafilm.
Bước 2: hỳt 5àl mẫu và mix đều với hỗn hợp đó hỳt trước đú.
Hình 3.3 Quy trình bước 2 Mix mẫu.
Bước 3: hỳt toàn bộ 15àl hỗn hợp, tiến hành bơm vào giếng.
Mix GelRed và Ladder để tạo thang DNA chuẩn phục vụ cho quan sát kết quả.
Thiết lập máy với cường độ dòng điện và thời gian thích hợp (110V - 30 phút).
Có thể giữ máy trong điều kiện tối để tránh làm mất màu GelRed.
Sau khi quá trình điện di hoàn tất, mang tấm Gel đi chụp hình và quan sát.
3.2.4 Phân tích kết quả điện di
Hình 3.5 Kết quả thực hành điện di A Có DNA con heo; B Không có DNA con heo.
Với các đối chứng dương (+) là DNA con heo và L là thang chuẩn Các mẫu A là có băng sáng với kích thước bằng kích thước đối chứng dương chứng tỏ là mẫu là DNA con heo Các mẫu B là không có DNA con heo (Nếu có xuất hiện protein heo là do thao tác sai).
THIẾT KẾ PRIMERS
Các bước thao tác thiết kế primer
4.1.1 Mục đích và nguyên tắc của việc thiết kế primer Đoạn mồi (Primer) là một thành phần bắt buộc có và đóng vai trò quan trọng trong phản ứng PCR Primer là những đoạn oligonucleotide ngắn có chiều dài từ 18 - 25 nu Nó có trình tự bổ sung với mạch khuôn DNA làm trình tự nhận biết bám vào của enzyme Taq Polymerase Đoạn mồi được thiết kế dựa vào hai vùng trình tự đã biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại Trong phản ứng PCR bao giờ cũng cần có cặp mồi (mồi xuôi và mồi ngược), có rất nhiều các tiêu chuẩn nghiêm ngặt đặt ra khi thiết kế một cặp mồi như:
+ Độ dài đoạn mồi từ 18 – 25 Nucleotide.
+ Tỉ lệ G và C (%G+C) dao động trong khoảng từ 40% → 60%.
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi Tm: Tm= 2 o C(A+T) + 4 o C(G+C).
+ Nhiệt độ bắt cặp: Ta=Tm – 4 o C.
+ TmF và TmR không chênh lệch quá 5 o C.
+ Số lần lặp lại của một nucleotide không quá 4 lần.
Bước 1: truy cập vào trang web NCBI.
Bước 2: chọn vùng tìm kiếm là genome và nhập tên đối tượng cần thiết kế primer vào.
Bước 3: chọn vào Refseq -> mục FASTA -> tải bộ gene về.
Bước 4: sau khi đã có trình tự của virus ta vào BioEdit và nhấn File Open File trình tự đã lưu.
Bước 5: đối với mồi F thì ta copy một đoạn mã gen và kiểm tra các điều kiện trên trang công cụ Tm Calculator.
Bước 6: đối với tạo mồi R ta tiến hành như mồi F nhưng sau khi kiểm tra trên công cụ Tm Calculator thì phải reverse - complement để có trình tự bổ sung đảo ngược chuẩn.
Bước 7: thực hiện kiểm tra primer đã thiết kế với primer blast, ta thu được kết quả trình tự mục tiêu chuẩn đối với primer đã thiết kế dành cho virus mục tiêu.
4.1.3 Thực hành tại lớp a) Primer xuôi (F) 5’ TTAGGCATCTGCCTAATCTTG 3’
%GC= 52 Chạy PCR trên máy tính ( PCR in silico) b)
Bài tập về nhà
Thiết kế một cặp primer khuếch đạu một đoạn DNA (Gene CYTOCHROME B) dài 200 – 1000 bp đặc hiệu cho con bò CATTLE (yêu cầu: đảm bảo không bắt cặp trên DNA heo).
4.2.2 Quy trình thực hiện a Thiết kế prime xuôi:
Bước 1: tải gen CYTOCHROME B của heo và bò từ ngân hàng gen.
Bước 2: sau khi đã tải xuống thì mở trình tự gen trong phần mềm Bioedit.
Bước 3: vào mục Edit chọn Copy Sequence(s) để copy trình tự gen của heo và dán vào trình tự gen của bò.
Bước 4: chọn 21 nu (từ 215-235) để làm primer xuôi.
Hình 4.3 Quy trình bước 3. b Thiết kế primer ngược:
Bước 1: chọn một đoạn nu có độ dài 21 nu cách primer ngược khoảng 500 nu (708-728).
Bước 2: copy trình tự nu vừa chọn vào Reverse Complement để được trình tự bổ sung.
Bước 3: sau khi có 2 đoạn primer thì chạy thử PCR trên web Primer Blast.
Bước 4: nếu kết quả đặc hiệu cho con bò CATTLE không bắt cặp trên gen của DNA con heo thì thành công.
GIẢI TRÌNH TỰ VÀ XỬ LÝ TRÌNH TỰ
Giới thiệu về giải trình tự và xử lý
Là phương pháp sinh học hiện đang được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực y học, giải trình tự của gen là kỹ thuật xác định trình tự của DNA của cá thể bằng cách giải trình tự của các nucleotide Phương pháp này được áp dụng trên một đoạn hoặc cả bộ gen.
Nguyên lý của quá trình giải trình tự gen được dựa trên cấu trúc của DNA bao gồm 4 loại nucleotide chính là Adenine, Cytosine, Guanine và Thymine Các loại thông thường sẽ được liên kết với nhau theo một trật tự nhất định Việc tìm ra trật tự liên kết của chúng được thông qua bởi quá trình giải trình tự của gen.
Các phương pháp giải trình tự và xử lý
(Giải trình tự Maxam–Gilbert là phương pháp giải trình tự hóa học DNA Nó từng phổ biến nhưng đã bị thay thế bởi phương pháp giải trình tự Sanger và giải trình tự thế hệ tiếp theo vì tốc độ chậm, hiệu suất thấp và sử dụng các hóa chất nguy hiểm.
Tuy nhiên, nó vẫn có những công dụng thích hợp Ví dụ, nó có thể phát hiện các sửa đổi DNA như quá trình methyl hóa và acetyl hóa và có thể được sử dụng với dấu vết DNA để suy ra các trình tự liên kết với protein.)
Giải trình tự Maxam–Gilbert còn được gọi là giải trình tự hóa học vì các phản ứng hóa học, chứ không phải khuếch đại DNA và RNA, là cơ sở của phương pháp này.
Giao thức bắt đầu với việc ghi nhãn ở đầu 5 'của sợi với dấu hiệu phốt pho 32, sau đó xảy ra sự biến đổi hóa học của bazơ nitơ và nó được tách ra Cuối cùng, sự chia tách vùng basic xảy ra. Đầu tiên, chuỗi được sắp xếp theo trình tự được rút ngắn thành các phân đoạn nhỏ hơn Bước này được thực hiện với các enzyme cắt giới hạn, dẫn đến các cực trị xuất sắc.
Tiếp theo, phản ứng được thực hiện với một phosphatase kiềm, với mục đích là loại bỏ nhóm phốt phát Do đó, một polynucleotide kinase có thể được sử dụng để thực hiện ghi nhãn.
Chuỗi bị biến tính (hai sợi mở) Sau đó tiến hành áp dụng các hóa chất Các phản ứng phân cắt này được thực hiện một cách có kiểm soát và loại liên kết nào bị phá vỡ bởi mỗi hóa chất được áp dụng. Đọc kết quả: Đọc kết quả liên quan đến việc phân tách theo kích thước của chuỗi thu được trong hệ thống điện di Các hệ thống bao gồm polyacrylamide cho phép thu được độ phân giải rất phù hợp để đọc gel Kết quả trình tự đọc qua máy tính sẽ là các pit (đỉnh) tương ứng với các nucleotide.
Tốc độ chậm: đầu tiên, nó rất tốn thời gian Và đó là giả sử mọi thứ diễn ra tốt đẹp trong lần thử đầu tiên Rất nhiều bước trong phương pháp này có thể gây ra vấn đề Ví dụ về các bước có thể có vấn đề bao gồm:
2 Các phản ứng phân cắt.
5 Phát triển phim X-quang để hiển thị kết quả.
Ngoài ra, bạn không thể dễ dàng song song hóa phương pháp này Vì vậy, bạn chỉ có thể xác nhận khoảng 200–300 base DNA mỗi vài ngày!
Sử dụng hóa chất nguy hiểm: Làm việc với các đồng vị phóng xạ và hóa chất độc hại không bao giờ là lý tưởng Trình tự Maxam–Gilbert sử dụng cả hai. Đặc biệt, 32 P là một đồng vị khó chịu Đó là chất phát beta năng lượng cao với thời gian bán hủy ngắn Hoặc trong tiếng Anh, nó có thể truyền rất nhiều năng lượng vào mô của bạn và tác động một cách nhanh chóng.
Hoạt động mol của nó là 338,61 TBq/mmol (3386100000000000 phân rã mỗi giây trên milimole) và thời gian bán hủy của nó là khoảng 14 ngày.
Dấu chân DNA: dấu chân DNA cho phép xác định các trình tự DNA liên quan đến tương tác protein-DNA và trình tự Maxam-Gilbert có thể được sử dụng để thực hiện bước giải trình tự Sau khi dán nhãn các phần DNA liên kết với protein giả định, chúng được ủ với protein được đề cập và phân tách theo giao thức Maxam–Gilbert.
Protein sẽ bảo vệ DNA mà nó liên kết khỏi sự phân cắt trong khi các đoạn không liên kết sẽ bị cắt nhỏ.
DNA sau đó được tách ra khỏi protein và chạy trên gel cùng với các đoạn đối chứng được cắt ra So sánh kiểu mẫu của các đoạn DNA có và không có protein gắn, bạn có thể tìm ra trình tự DNA mà protein liên kết.
Xác định các sửa đổi DNA: DNA có thể được sửa đổi, điều này có thể có ý nghĩa quan trọng trong một số bối cảnh nhất định Sửa đổi ví dụ bao gồm methyl hóa và acetyl hóa.
Một lần nữa khai thác các bước phân tách, bạn có thể phân tách các đoạn DNA tại các vị trí mà bạn nghi ngờ bị sửa đổi, sắp xếp chúng và so sánh chúng với một loạt các đoạn kiểm soát Điều này cho phép bạn biết liệu.
Phân tích cấu trúc DNA: tương tự như vậy, cấu trúc DNA liên quan đến các chuỗi ngắn nhất định của các cặp bazơ mà bạn có thể sử dụng trình tự Maxam–Gilbert để thu được thông tin trình tự chi tiết đến mức bạn có thể bắt đầu đưa ra các suy luận về cấu trúc về DNA.
5.2.1.2 Phương pháp Sanger và Sanger cải tiến
Nguyên lý của giải trình tự bằng Sanger: phương pháp này thực hiện dựa trên kỹ thuật phổ biến là “chain termination- kết thúc chuỗi” bằng việc sử dụng các deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH đóng vai trò cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3’-OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn các dNTP vào mạch đơn của DNA để kéo dài mạch ở vị trí 3’- OH và dừng lại nếu gắn các ddNTP vào chuỗi.
Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành các đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng Dựa vào sự sai khác về độ dài các đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác định trình tự trong gene.
Bài tập về nhà
Bước 1: chọn vùng trình tự giống nhau từ 66 đến 450
Bước 2: dựa vào vùng sóng ổn định ở dưới ta chọn từ 1 đến 65 trình tự ở dưới.
Vị trí K là điểm bắt đầu của trình tự ở trên nên được thay thành T còn vị trí 2 gạch chính là GC ở trình tự trên
Bước 3: tiếp tục lấy vị trí 451 tới hết ta lấy trình tự ở trên vì có sóng ổn định.
Tại 2 vị trí MM ta so sánh với sóng ở trên ta dò được CC.
Primer 1: GGAGAGGTGAGTGGAATTCCGA Primer 2: ACCCAACATCTAGGTAAAAACC Với trình tự primer 2 ta tìm được primer xuôi và trình tự primer cần được đổi chiều.
TTACCCAACATCTAGGTAAAAACCTAAACTTGATGGCAACTAGAGGC AGGGGTTGCGCTCCGGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAG CTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTAAAGGTCTCCGAAAAGAAAATAC CATCTCTGATATCGTCCTATACATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGT TGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATT CCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGC GTTAGCTGCGCCACTGAATGGTAAACCACCCAACAGCTAGCACTCATCGTT TACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCG CGCCTCAGCGTCAGTATCAGGCCAGTGAGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCC TCCGAATATCTACGAATTTCACCTCTACACTCGGAATTCCACTCACCTCTCC CAA
Bỏ đi đoạn primer ta sẻ tìm ra được đoạn DNA cần tìmTAAACTTGATGGCAACTAGAGGCAGGGGTTGCGCTCCGGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTGTAAAGGTCTCCGAAAAGAAAATACCATCTCTGATATCGTCCTATACATGTCAAGGGCTGGTAAGGTTCTGCGCGTTGCATCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTTAATCTTGCGACCGT
ACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTGAATGGTAAAC CACCCAACAGCTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTA ATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCGCCTCAGCGTCAGTATCAGGCCAGT GAGCCGCCTTCGCCACCGGTGTTCCTCCGAATATCTACGAATTTCACCTCT ACAC
Trình tự có độ bao phủ 100% và độ tương đồng 100% với trình tự có mã truy cập là MG92086.1 của loài Tomato mottle mosaic virus được công bố bởiChe,H.Y.,Luo,D.Q và Cao,X.R trong bài báo First Report of Tomato Mottle MosaicVirus in Tomato Crops in China trên tạp chí Plant Dis Năm 2018.
CẤU TẠO VÀ NGUYÊN LÝ HOẠT ĐỘNG HỆ THỐNG VI THAO TÁC
Hệ thống vi thao tác
Máy vi thao tác là thiết bị nhằm chuyển đổi chuyển động lớn của tay người thành chuyển động tinh của một dụng cụ nhỏ được giữ trên cán của nó Mục đích thiết bị này để giúp các nhà khoa học di chuyển những dụng cụ vô cùng nhỏ được sử dụng trong các thử nghiệm được thực hiện dưới kính hiển vi Được ứng dụng chủ yếu trong thụ tinh nhân tạo Cấu tạo gồm 2 bộ phận chính: kính hiển vi soi ngược và bộ vi thao tác.
Hình 6.1 Hệ thống vi thao tác Với kính hiển vi soi ngược ở giữa và bộ vi thao tác ở hai bên.
6.1.2 Kính hi n vi soi ngển vi soi ngược ượcc
Kính hiển vi soi ngược là loại kính hiển vi có vật kính nằm bên dưới nơi để mẫu và đèn nằm trên nơi để mẫu, mục đích là để tạo không gian rộng cho việc thao tác trực tiếp với mẫu.
Hình 6.2 Kính hiển vi soi ngược.
6.1.3 B vi thao tácộ vi thao tác 6.1.3.1 B ph n ch nh thôộ vi thao tác ận chỉnh thô ỉnh thô
Dùng để đưa kim đến vùng có mẫu cần thao tác chứ hầu như không thể đến chính xác vị trí mẫu Bộ điều khiển thô thủ công được sử dụng kết hợp với bộ vi điều khiển thủy lực để chuyển vi kim vào trường nhìn của kính hiển vi Cấu tạo bao gồm một tay cầm hoặc các núm chỉnh thô giúp di chuyển theo 3 hướng của trục XYZ.
Hình 6.3 Bộ phận chỉnh thô.
6.1.3.2 B ph n ch nh tinhộ vi thao tác ận chỉnh thô ỉnh thô
Dùng để điều chỉnh kim thao tác đến chính xác vị trí mẫu cần thao tác Bộ phận này có cần điều khiển thủy lực bằng dầu cho phép di chuyển ba chiều với một đòn bẩy duy nhất
Hình 6.4 Bộ phận chỉnh tinh.
Kim vi tiêm dùng để thao tác với mẫu, có đầu nhọn, đường kính khoảng từ 0,75 - 4àM, được gắn trờn kớnh hiển vi soi ngược, dựng để bơm hoặc hỳt mẫu.
Kim phun khí nén: được thiết kế dành riêng cho thao tác giữ noãn, có đầu bằng và có thể được gắn vào cần điều khiển, cho phép giữ và nhả noãn một dễ dàng và an toàn.
Hình 6.5 Kim phun khí nén.
6.1.4 Máy kéo kim 6.1.4.1 C u t oấu tạo ạo
Máy kèo kim gồm có: bộ phận điều khiển (công tắc nguồn, các nút vặn điều chỉnh nhiệt độ, lực kéo), lò xo điện trở, quả tạ, thân máy, đế máy.
