Tiểu luận thiết bị nhóm 4 thứ 4 ca 2

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA KHOA HỌC SINH HỌC TIỂU LUẬN MÔN HỌC PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD-

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

TIỂU LUẬN MÔN HỌC

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHOA KHOA HỌC SINH HỌC

BÁO CÁO THỰC HÀNH

PHÁT HIỆN ĐỘT BIẾN GEN KRAS TRONG UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG BẰNG KỸ THUẬT COLD-PCR VÀ GIẢI TRÌNH TỰ DNA

NGUYỄN THỊ THU NGÂN MAI NGUYỄN THỤC DIỄM

Mục lục

CHƯƠNG 1 GIỚI THỆU CHUNG 1

1.1 Giới thiệu về gen KRAS 1

1.2 Giới thiệu về phương pháp COLD-PCR 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ 3

2.1 Tổng quan 3

2.2 Đặt vấn đề 3

2.3 Đối tượng nghiên cứu 4

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 5

3.1 Phương pháp phát hiện gen đột biến bằng COLD-PCR 5

3.2 Phương pháp giải trình tự DNA 6

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 7

4.1 Kết quả 7

4.2 Thảo luận 8

TÀI LIỆU THAM KHẢO 9

CHƯƠNG 1 GIỚI THỆU CHUNG

1.1 Giới thiệu về gen KRAS

Đây là một loại đột biến gen khiến cho

việc truyền thông tin bị gián đoạn làm cho

các tế bào phân chia mất kiểm soát dẫn đến

hình thành các khối u trong cơ thể Các loại

ung thu do loại gen này gây lên như ung thư

phổi, ung thư mật, bệnh bạch cầu, ung thư

đại trực tràng,…

Gen KRAS nằm trên NST số 12, có

chức năng cung cấp hướng dẫn để tạo ra

protein K-RAS tham gia vào quá trình đường

truyền tín hiệu RAS/MAPK Những protein sau khi được tạo ra sẽ chuyển tiếp các tín hiệu từ bên ngoài tế bào đến nhân tế bào Những tín hiệu được chuyển tiếp sẽ hướng dẫn

tế bào phát triển, phân chia và thực hiện các chức năng biệt hóa của nó

Chức năng chính của gen KRAS là khả năng chuyển đổi các phân tử GTP thành GDP Các protein K-Ras sẽ hoạt động như một công tắc có thể được bật hoặc tắt bởi các phân tử GTP và GDP Để tín hiệu được truyền đi thì các protein K-ras (GTPase – đóng vai trò vô cùng quan trọng trong quá trình phân chia, biệt hóa tế bào và trong quá trình

tự hủy tế bào) trong quá trình phân phải được liên kết vào các phân tử GTP

1.2 Giới thiệu về phương pháp COLD-PCR

PCR thông thường sẽ khuếch đại cả các alen chính (wildtype) và alen phụ (đột biến) với hiệu quả như nhau, ngăn chặn khả năng dễ dàng phát hiện sự hiện diện của đột biến

PCR đồng khuếch đại ở nhiệt độ biến tính thấp hơn (COLD-PCR) là một cải tiến mới của phương pháp PCR thông thường nhằm khuếch đại có chọn lọc các alen thiểu

số từ hỗn hợp các trình tự kiểu tự nhiên (wildtype) và kiểu đột biến (mutant) bất kể loại đột biến hoặc vị trí đột biến

Phương pháp này dựa trên quan sát rằng có một nhiệt độ biến tính tới hạn (Tc) cho mỗi trình tự DNA, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của nó (Tm) Hiệu suất khuếch đại PCR đối với trình tự DNA giảm đột ngột nếu nhiệt độ biến tính được đặt dưới mức Tc

2

của nó

Giải thích hình ảnh:

Bên trái- PCR tiêu chuẩn: tỷ lệ giữa trình tự tự nhiên và trình tự đột biến là 10:1,

ở Tc – nhiệt độ biến tính tiêu chuẩn (tính dự theo trình tự nu), quá trình PCR diễn ra bình thường Kết quả, tỷ lệ sau khuếch đại của phương pháp PCR tiêu chuẩn không đổi (10:1), khả năng phát hiện được đột biến gen KRAS thấp

Hình bên phải – PCR Lạnh: ban đầu, tỷ lệ giữa trình tự tự nhiên và đột biến là 10:1, Tc của COLD-PCR thấp hơn PCR tiêu chuẩn(co-amplification at lower

denaturation temperature PCR), tạo ưu thế cho đoạn trình tự đột biến (mong muốn) được

khuếch đại một cách chọn lọc => Kết quả, tỷ lệ thay đổi 1:1 do trình tự đoạn gen tự nhiên ngưng khuếch đại => Cải thiện khả năng phát hiện các đột biến gen KRAS chưa biết sớm hơn phương pháp PCR tiêu chuẩn gấp 10-100 lần

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN VÀ ĐẶT VẤN ĐỀ

2.1 Tổng quan

Theo Trung tâm y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai, Ung thư đại trực tràng (UTĐTT) là một trong những loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất Tại Việt Nam, tỷ lệ mắc chuẩn theo tuổi là 10,1/100.000 dân, đứng thứ sáu trong các bệnh ung thư, các phương pháp điều trị Ung thư đại trực tràng bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa trị

và trong đó có các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng tăng trưởng biểu mô(EGFR)

2.2 Đặt vấn đề

Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu

mô (EGFR: epidermal growth factor receptor), thường gặp trong ung thư ở người, trở thành những đích nhắm phân tử hiệu quả trong điều trị Hoạt tính tyrosine kinase của EGFR đóng vai trò quan trọng trong điều khiển sự tăng sinh và sống còn của tế bào Trong utdtt, protein EGFR thường biểu hiện quá mức trên bề mặt tế bào, được coi là nguồn gốc khởi phát các tín hiệu tăng sinh tế bào quá độ trong khối u Ức chế hoạt tính tyrosine kinase của EGFR là một chiến lược điều trị thích hợp

Gen KRAS mã hóa cho một guanosine triphosphate GTPase vốn có hai trạng thái hoạt động (bất hoạt có gắn GDP và hoạt động có gắn GTP) KRAS có vai trò quan trọng trong việc khởi phát và tiến triển của một số ung thư như carcinom tuyến của đại tràng, phổi và tụy Khi đột biến sảy ra sẽ làm mất hoat tính ATPase và giữ phân tử Protein ở trạng thái gắn ATP liên tục, đẫn đến là các phân tử truyền tin hạ nguồn luôn hoạt động

để duy trì tín hiệu tăng sinh tế bào

Tại Việt Nam, kháng thể đơn dòng đã được chỉ định cho Ung thư đại trực tràng giai đoạn tiến xa Nghiên cứu này được tiến hành nhằm xác định tần suất đột biến tại condon 12 và 13 của gen KRAS ở bệnh nhân Ung thư đại trực tràng bằng kỹ thuật COLD-PCR (co-amplification at lower denaturation temperature) kết hợp giải trình tự DNA, giúp quyết định lựa chọn kháng thể đơn dòng cho bệnh nhân một cách phù hợp

Kỹ thuật COLD PCR cho phép khuếch đại ưu thế dòng alen mang gen đột biến ngay cả khi chỉ có <1% tế bào mang đột biến trong mẫu khảo sát Trong kỹ thuật này, sau khoảng

10 chu kỳ luân nhiệt đầu tiên với kỹ thuật PCR chuẩn, người ta sử dụng nhiệt độ biến tính khoảng 80℃ - 90℃, đủ cho các mạch đôi dị hợp tử có mang đột biến trong sản

4

phẩm PCR duỗi ra để được ưu tiên khuếch đại

2.3 Đối tượng nghiên cứu

Tiến hành khảo sát đột biến gen KRAS cho những bệnh nhân UTDTT từ tháng 1/2011 đến tháng 5/2013, bệnh nhân được chuẩn đoán xác định UTDTT bằng tiêu chuẩn giải phẫu bệnh tại bộ môn giải phẫu bệnh – đại học Y dược Thành phố Hồ Chí Minh

CHƯƠNG 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

(Quy trình chẩn đoán đột biến gen được thực hiện tại Trung tâm Y Sinh học Phân

tử, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh.)

• Tách chiết genomic DNA

- Bệnh phẩm: mô vùi nến, hoặc vùng mô ung thư (bệnh phẩm phẫu thuật)

- Đánh dấu vùng mô ung thư và vùng mô lành xung quanh, rồi được cạo vào tube 1,5μL bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản)

- DNA genomic được lý trích bằng bộ kit ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System

• Khuếch đại exon 2 của gen KRAS bằng kỹ thuật COLD-PCR

- Cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen KRAS mang accession number NG_007524:

Primer F 5’ AGGCCTGCTGAAAATGACTGATA 3’

Primer R 5’ CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC 3’

- Mỗi tube PCR có tổng thể tích 50μL, gác thành phần gồm PCR buffer, primer F, primer R, Taq Polymerase, 50-100ng genomic DNA

• Giai đoạn thực hiện theo chu kì luân nhiệt:

- Giai đoạn biến tính ban đầu 98℃ – 3phút, theo sau 10 chu kỳ gồm, biến tính ở 98℃ trong 10 giây, gắn mồi ở 60℃ trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72℃ trong 40 giây

- Tiếp theo, phản ứng tổng hợp chuỗi DNA được thực hiện với 40 chu kỳ gồm 5 bước: biến tính ở 98℃ trong 10 giây, tái bắt cặp các sản phẩm PCR ở 70℃ trong 2 phút, phân tách các sản phẩm PCR ở 80℃ trong 10 giây, gắn mồi ở 60℃ trong 15 giây và tổng hợp chuỗi DNA ở 72℃ trong 40 giây

- Phản ứng kết thúc ở giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72℃ trong 5 phút Tinh sạch sản phẩm PCR

• Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1.5% có thuốc nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Prỉngraph

Lưu ý: trong mỗi đợt thực nghiệm luôn có một tube chứng âm, genomic DNA được thay bằng nước cất đã dùng để pha mastermix

6

Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng Cycle sequencing với BigDye Terminator Version 3.1 từ Applied Biosystems, theo 2 chiều xuôi và ngược Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, hoà tan trong Hi-Di formamide, biến tính

ở 95℃ trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI

3130 Genetic Analyzer, với POP-7 polymer và capillary 50cm (Applied Biosystems, Mỹ) Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 Kết quả

KRAS đột biến đóng vai trò

quan trọng cả trong hình thành ung

thư cũng như sự đề kháng với điều trị

Đột biến KRAS thường tập trung tại

codon 12 và 13, có 14 kiểu đột biến

khác nhau được ghi nhận trên thế giới

Thường gặp nhất là các đột biến

Gly12Asp (tại vị trí nucleotid 35 exon

2, G bị biến đổi thành A, làm cho axit

amin glycin tại codon 12 bị biến thành

Asparatate) và Gly12Val của codon 12 và Gly13Asp (tại vị trí nucleotid 38 exon 2, G

bị biến đổi thành A, làm cho axit amin G tại codon 13 bị biến thành A) của codon 13 Kết quả nghiên cứu giúp ích cho việc xác định những bệnh nhân phù hợp cho chỉ định kháng thể đơn dòng, đồng thời cũng là cơ sở quan trọng cho việc thiết kế các bộ KIT chẩn đoán bằng ASO-PCR để phát hiện những đột biến gặp trên bệnh nhân Việt Nam

Trong tổng số trường hợp đã khảo sát, phát hiện số bệnh nhân mang gen đột biến KRAS chiếm tỷ lệ 35,8% Đặt biệt, phát hiện có 4 bệnh nhân mang đột biến ở cả hai codon 12 và 13 Bệnh nhân trẻ tuổi (dưới 40 tuổi) cũng ít gặp đột biến gen KRAS hơn

so với nhóm bệnh nhân lớn tuổi

Hình 2 Phân phối các đột biến gen KRAS

8

4.2 Thảo luận

Đột biến gen KRAS thường gặp trong UTDTT ở bệnh nhân Việt Nam Phát hiện đột biến gen KRAS bằng kỹ thuật COLD PCR kết hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện cho bệnh nhận muốn được điều trị bằng kháng thể đơn dòng cetuximab

TÀI LIỆU THAM KHẢO

- https://chekco.com/gen-kras/

- https://doan.edu.vn/do-an/phat-hien-dot-bien-gen-kras-trong-ung-thu-dai-truc-trang-bang-ky-thuat-coldpcr-va-giai-trinh-tu-dna-52861/

- Zuo Z, Jabbar KJ COLD-PCR: Applications and Advantages Methods Mol Biol 2016;1392:17-25 doi: 10.1007/978-1-4939-3360-0_2 PMID: 26843042

- Li, J., Wang, L., Mamon, H et al Replacing PCR with COLD-PCR enriches variant DNA sequences and redefines the sensitivity of genetic testing Nat

Med 14, 579–584 (2008) https://doi.org/10.1038/nm1708

Diagnostics, 11:2, 159-169, DOI: 10.1586/erm.10.115