Thiết bị và kĩ thuật nhóm 4 thứ 4 ca 2

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC Phát hiện đột biến gen KRAS trong ung thư đại... Giới thiệu sơ về gen KRAS 1Đây là một loại đột biến gen khiến cho việ

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINHKHOA KHOA HỌC SINH HỌC

Phát hiện đột biến gen KRAS trong ung thư đại

Mai Nguyễn Thục DiễmNguyễn Thị Thu Ngân

Phương pháp nghiên cứuKết quả và thảo luận

2

Giới thiệu chung

I

Giới thiệu sơ về gen KRAS 1

Đây là một loại đột biến gen

khiến cho việc truyền thông tin bị gián đoạn làm cho các tế

bào phân chia mất kiểm soát

dẫn đến hình thành các khối u trong cơ thể

4

 Gen KRAS nằm trên NST số 12

 Có chức năng cung cấp hướng dẫn để tạo ra protein K-RAS tham gia

vào quá trình đường truyền tín hiệu chuyển tiếp các tín hiệu từ bên ngoài tế bào đến nhân tế bào  Tín hiệu được chuyển tiếp sẽ

hướng dẫn tế bào phát triển, phân

chia và thực hiện các chức năng

biệt hóa của nó.

Giới thiệu phương pháp COLD-PCR.2

 PCR đồng khuếch đại ở nhiệt độ biến tính thấp hơn

(COLD-PCR) là một cải tiến mới của phương pháp PCR thông thường

 Nhằm khuếch đại có chọn lọc các alen thiểu số từ hỗn

hợp các trình tự kiểu tự nhiên (wildtype) và kiểu đột

biến (mutant) bất kể loại đột biến hoặc vị trí đột biến

7

Giới thiệu phương pháp

AIIVÀ ĐẶT VẤN TỔNG QUAN ĐỀ

9

Tổng quan

Theo Trung tâm y học hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai, ung thư đại trực tràng là một trong

những loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao nhất Tỷ

lệ mắc chuẩn theo tuổi là 10,1/100.000 dân

 Phương pháp điều trị bao gồm phẫu thuật, xạ trị, hóa trị và trong đó có các kháng thể đơn dòng kháng thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô (EGFR).

1

2 Đặt vấn đề

Rối loạn các thụ thể tyrosine kinase, trong đó có thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu mô

(EGFR: epidermal growth factor receptor)

11

 Hoạt tính tyrosine kinase của EGFR đóng

vai trò quan trọng trong điều khiển sự tăng

sinh và sống còn của tế bào.

 Protein EGFR thường biểu hiện quá mức

trên bề mặt tế bào

 Ức chế hoạt tính tyrosine kinase của EGFR

là một chiến lược điều trị thích hợp.

 Khi đột biến xảy ra sẽ suất đột biến tại condon

12 và 13 của gen KRAS

ở bệnh nhân bằng kỹ thuật COLD-PCR kết hợp giải trình tự DNA phép khuếch đại ưu thế dòng alen mang gen đột biến ngay cả khi chỉ có

<1% tế bào mang đột

biến trong mẫu khảo sát

13

3 Đối tượng nghiên cứu

Tiến hành khảo sát đột biến gen KRAS cho những bệnh nhân UTDTT, bệnh nhân được chuẩn đoán xác định UTDTT bằng tiêu chuẩn giải phẫu bệnh tại bộ môn giải phẫu bệnh – đại học Y dược

Thành phố Hồ Chí Minh

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

Phương pháp

Tách chiết genomic DNA

Bệnh phẩm: mô vùi nến, hoặc vùng mô ung thư (bệnh phẩm phẫu thuật)

Đánh dấu vùng mô ung thư và vùng mô lành xung quanh, rồi được cạo vào tube 1,5μL bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).L bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).

DNA genomic được lý trích bằng bộ kit ReliaPrep FFPE gDNA Miniprep System.

1

Khuếch đại exon 2 của gen KRAS bằng kỹ thuật COLD-PCR

Cặp mồi được thiết kế bằng phần mềm Oligo 4.1 dựa trên trình tự chuẩn của gen KRAS:

+ Primer R 5’ CTGTATCAAAGAATGGTCCTGCAC 3’

Mỗi tube PCR có tổng thể tích 50μL bằng lưỡi dao chuyên biệt (2-4 tiêu bản).L, các thành phần gồm PCR buffer, primer F, primer R, Taq Polymerase, 50-100ng genomic DNA

17

Giai đoạn thực hiện theo chu kì luân nhiệt:

 Giai đoạn biến tính ban đầu 98oC – 3phút, theo sau 10 chu kỳ gồm, biến tính ở 98oC trong 10 giây, gắn mồi ở 60oC trong 15 giây, tổng hợp chuỗi DNA ở 72oC trong 40 giây.

 Tiếp theo, phản ứng tổng hợp chuỗi DNA được thực hiện với 40 chu kỳ gồm 5 bước:

+ Biến tính ở 98oC trong 10 giây

+ Tái bắt cặp các sản phẩm PCR ở 70oC trong 2 phút

+Phân tách các sản phẩm PCR ở 80oC trong 10 giây+ Gắn mồi ở 60oC trong 15 giây

+ Tổng hợp chuỗi DNA ở 72oC trong 40 giây.

Phản ứng kết thúc ở giai đoạn kéo dài sản phẩm ở 72oC trong 5 phút Tinh sạch sản phẩm PCR.

Sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch agarose 1.5% có thuốc nhuộm ethidium bromide và quan sát dưới màn soi gel Prỉngraph.

19

Thực hiện giải trình tự chuỗi DNA.

Sản phẩm PCR đã được tinh sạch sẽ được thực hiện phản ứng Cycle sequencing, theo 2 chiều xuôi và ngược Sản phẩm sau đó được kết tủa bằng ethanol, biến tính ở 95oC trong 2 phút trước khi làm lạnh đột ngột Trình tự DNA được đọc bằng máy ABI 3130 Genetic Analyzer Kết quả được phân tích bằng phần mềm SeqScape.

KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

21

Kết quả1

thành ung thư cũng như sự đề kháng với điều trị

codon 12 và Gly13Asp của codon 13

Xác định những bệnh nhân phù hợp cho chỉ định kháng

thể đơn dòng,cơ sở quan trọng cho việc thiết kế các

Thảo luận2

Đột biến gen KRAS thường gặp trong UTDTT ở bệnh nhân Việt Nam Phát hiện đột biến gen KRAS

bằng kỹ thuật COLD PCR kết hợp giải trình tự chuỗi DNA nên được thực hiện cho bệnh nhận muốn được

điều trị bằng kháng thể đơn dòng cetuximab.

CREDITS: This presentation template was created by

Slidesgo, including icons by Flaticon, infographics &

images by Freepik and content by Eliana Delacour

Please keep this slide for attribution

Cảm ơn thầy và các bạn đã

lắng nghe

25