Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy PCR và Realtime PCR

Các vấn đề cần lưu ý thực hiện với kỹ thuật PCR

Thiết kế mồi cho phản ứng PCR: đáp ứng các yêu cầu về độ đặc hiệu của mồi, nhiệt độ gắn mồi của mồi xuôi và mồi ngược, khả năng tạo primer dimer,. Có rất nhiều loại PCR khác nhau tùy theo nhu cầu sử dụng mà lựa chọn phù hợp và tối ưu nhất. Phản ứng PCR phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: nhiệt độ gắn mồi; nồng độ các chất tham gia các chất tham gia phản ứng, chu kỳ nhiệt,… Tùy mỗi đối tượng mà mục tiêu hướng đến mà sẽ có sự thay đổi cho phù hợp.

Cấu tạo và nguyên lý hoạt động của máy PCR 1 Giới thiệu về PCR

• Cấu tạo máy PCR cổ điển (máy luân nhiệt) 1. Cấu tạo
• Cấu tạo máy PCR hiện đại 1. Bộ phận điều khiển

Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vào DNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe này. Nguyên lý cơ bản của kỹ thuật PCR/ Real-time PCR là dựa vào sự khuếch đại đặc hiệu của enzyme Taq Polymerase trên cơ sở sự bắt cặp chính xác của primer vào DNA trong mẫu và các dNTP tự do và sự phát quang của các probe huỳnh quang và tự đó bộ phận ghi nhận tín hiệu sẽ ghi nhận được tín hiệu phát ra từ các probe này. Giống như PCR, Real-time PCR cũng có thể được sử dụng để thực hiện định tính các tác nhân gây bệnh như vi khuẩn, virus, nấm,… ngoài ra việc tối ưu trình tự mẫu dò có thể giúp phát hiện cả các đột biến điểm hay các đoạn DNA có đa hình trình tự đơn (SNP),.

Cơ chế hoạt động của SYBR Green và Taqman

• Cơ chế hoạt động của SYBR GREEN
• Cơ chế hoạt động của Taqman

Hiệu chuẩn (Calibration) là hoạt động xác định, thiết lập mối quan hệ giữa giá trị đo của chuẩn đo lường, phương tiện đo với giá trị đo của đại lượng cần đo. Hiệu chỉnh (Adjustment) là chỉnh sửa những sai sót của máy móc, thiết bị nhằm đạt một độ chính xác và độ tin cậy cần thiết của máy móc, thiết bị. Bảo trì (Maintenance) là hoạt động chăm sóc kĩ thuật, điều chỉnh, sửa chữa hoặc thay thế một hoặc nhiều chi tiết hay cụm chi tiết nhằm duy trì hoặc khôi phục các thông số hoạt động, bảo đảm máy móc thiết bị hoạt động với tính năng đã xác định trước.

Kiểm định (Verification) là hoạt động kỹ thuật theo một quy trình nhất định nhằm đánh giá và xác nhận sự phù hợp của sản phẩm, hàng hoá với yêu cầu quy định trong quy chuẩn kỹ thuật tương ứng. Dùng SYBR GREEN I Dye, một dye bám đặc hiệu DNA mạch kép để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ. Nhiều dye có thể bám vào một phân tử duy nhất, tăng độ nhạy cho phát hiện sản phẩm.

Phương pháp Taqman được thực hiện bằng cách sử dụng các đầu dò được gắn nhãn kép và phát hiện sự khuếch đại bằng cách suy thoái đầu dò bởi Taq Polymerase và giải phóng Fluorophore. Dùng một probe đánh dấu huỳnh quang để phát hiện sản phẩm PCR đặc hiệu khi nó tích lũy dần qua các chu kỳ. Lai đặc hiệu giữa probe và đích là cần để sinh tín hiệu huỳnh quang, vì thế giảm tín hiệu nền và dương tính giả.

Đánh dấu các probe khác nhau bằng các dye báo cáo khác nhau nên khuếch đại được 2 (thậm chí 4) trình tự đích cùng lúc.

Giới thiệu về điện di 1. Định nghĩa

Nồng độ Gel: nồng độ Gel càng lớn thì tốc độ điện di càng chậm. Ảnh hưởng từ hoá chất: trước khi điện di cần kiểm tra hoá chất vì hoá chất hoạt động tốt thì mới ra băng phản ứng mới xảy ra thì mới đọc kết quả được. Ảnh hưởng từ thao tác: trong quá trình thao tác người làm cần làm đúng các bước từ đầu đến cuối vì chỉ cần sai ở bước nào đó hoặc nhầm lẫn giữ các bước thì kết quả cũng không đúng.

Ảnh hưởng từ thiết bị: khi thiết bị không còn hoạt động tốt như việc điện thế lớn dẫn đến các đoạn DNA di chuyển nhanh nên khi kết quả được trả về là kết quả sai.

Quy trình thực hiện khái quát 1 Thành phần khi điện di trên gel

(Điện di DNA trên Gel Agarose ở điện thế cao sẽ sinh ra nhiệt. Dung dịch đệm có độ dẫn điện cao như TAE sẽ tạo ra nhiều nhiệt hơn so với dung dịch có độ dẫn điện thấp. Khi điện di với điện thế cao hơn 175 volt nên cẩn thận vì nhiệt lượng hình thành có thể gây ra hiện tượng đường chạy hình chữ S, không thể lấy được kết quả. Ngoài ra, chạy điện di với điện thế cao trong thời gian dài có thể gây chảy miếng Gel. Khi chạy điện di DNA trên agarose ở điện thế cao, tránh dùng các loại Agarose có điểm nóng chảy thấp). (Chất Borate – một chất ức chế enzyme – có chứa trong Dung dịch điện di TAE đã khiến cho sản phẩm có được khả năng đệm rất tốt). SDS là một chất tẩy rửa mạnh được sử dụng để làm biến đổi các protein bản địa để mở ra các polypeptit cá nhân.

Khi một hỗn hợp protein được làm nóng đến 100°C với sự hiện diện của SDS, chất tẩy bao bọc xung quanh xương sống polypeptide. Trong quá trình này, các giá trị nội tại của các polypeptide trở nên không đáng kể so với các chi phí âm tính do SDS đóng góp. Do đó các polypeptide sau khi xử lý trở thành các cấu trúc giống như que có mật độ điện tích đồng nhất, đó là cùng một điện tích âm ròng trên một đơn vị chiều dài.

Các điện di electrophoretic của các protein này sẽ là một chức năng tuyến tính của logarithms của trọng lượng phân tử của họ. Uréa: được sử dụng thường xuyên, dùng để phá vỡ cầu nối hydro, không được dùng chung với Gel Agarose vì Uréa bẻ gãy cầu nối hydro trong Gel Agarose. + Trộn Agarose và dung dịch đệm, sau đó đem đun sôi sao cho lượng Agarose tan hết (có thể nung nóng 2-3 lần nếu Agarose chưa tan).

+ Để dung dịch nguội tự nhiên, đến khoảng 60℃ thì tiến hành đổ vào khuôn và thì tiến hành đổ vào khuôn và lược đã chuẩn bị sẳn (đổ chậm và nhẹ nhàng ở góc khay để tránh tình trạng tạo bọt khí).

Các bước thao tác thiết kế primer

Bước 7: thực hiện kiểm tra primer đã thiết kế với primer blast, ta thu được kết quả trình tự mục tiêu chuẩn đối với primer đã thiết kế dành cho virus mục tiêu. Thực hành tại lớp a). Thiết kế một cặp primer khuếch đạu một đoạn DNA (Gene CYTOCHROME B) dài 200 – 1000 bp đặc hiệu cho con bò CATTLE (yêu cầu: đảm bảo không bắt cặp trên DNA heo). Bước 2: sau khi đã tải xuống thì mở trình tự gen trong phần mềm Bioedit.

Bước 3: vào mục Edit chọn Copy Sequence(s) để copy trình tự gen của heo và dán vào trình tự gen của bò. Bước 2: copy trình tự nu vừa chọn vào Reverse Complement để được trình tự bổ sung. Bước 4: nếu kết quả đặc hiệu cho con bò CATTLE không bắt cặp trên gen của DNA con heo thì thành công.

Hệ thống vi thao tác 1. Gi i thi u t ng quanới thiệu tổng quanệu tổng quanổng quan

• B vi thao tác ộ vi thao tác
• Máy kéo kim 1. C u t o ấu tạo ạo
• Máy rèn kim 1. C u t oấu tạoạo

Kính hiển vi soi ngược là loại kính hiển vi có vật kính nằm bên dưới nơi để mẫu và đèn nằm trên nơi để mẫu, mục đích là để tạo không gian rộng cho việc thao tác trực tiếp với mẫu. Dùng để đưa kim đến vùng có mẫu cần thao tác chứ hầu như không thể đến chính xác vị trí mẫu. Bộ điều khiển thô thủ công được sử dụng kết hợp với bộ vi điều khiển thủy lực để chuyển vi kim vào trường nhìn của kính hiển vi.

Cấu tạo bao gồm một tay cầm hoặc các núm chỉnh thô giúp di chuyển theo 3 hướng của trục XYZ. Dùng để điều chỉnh kim thao tác đến chính xác vị trí mẫu cần thao tác. Bộ phận này có cần điều khiển thủy lực bằng dầu cho phép di chuyển ba chiều với một đòn bẩy duy nhất.

Kim vi tiêm dùng để thao tác với mẫu, có đầu nhọn, đường kính khoảng từ 0,75 - 4àM, được gắn trờn kớnh hiển vi soi ngược, dựng để bơm hoặc hỳt mẫu. Kim phun khí nén: được thiết kế dành riêng cho thao tác giữ noãn, có đầu bằng và có thể được gắn vào cần điều khiển, cho phép giữ và nhả noãn một dễ dàng và an toàn. Máy kèo kim gồm có: bộ phận điều khiển (công tắc nguồn, các nút vặn điều chỉnh nhiệt độ, lực kéo), lò xo điện trở, quả tạ, thân máy, đế máy.