nghiên cứu xây dựng phương pháp phân tích một số vi rút có nguy cơ cao trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ và đặc điểm sinh học phân tử

Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ .... Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua th

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

Phan Thị Thanh Hà

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

MỘT SỐ VI RÚT CÓ NGUY CƠ CAO TRONG NHUYỄN THỂ HAI MẢNH VỎ VÀ ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC PHÂN TỬ

Ngành: Công nghệ Sinh học

Mã số: 9420201

LUẬN ÁN TIẾN SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 TS Lê Quang Hòa

2 PGS TS Trương Tuyết Mai

Hà Nội - 2023

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của TS Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được các tác giả khác công bố

TM Tập thể hướng dẫn

TS Lê Quang Hòa

Tác giả của luận án

Phan Thị Thanh Hà

LỜI CẢM ƠN

Từ năm 2005 đến nay, trong những năm học Đại học, làm luận văn Thạc sĩ

và luận án Tiến sĩ tại Đại học Bách khoa Hà Nội thân yêu, tôi đã thu nhận được rất nhiều kiến thức quý báu về lý thuyết cũng như thực hành nghiên cứu thuộc lĩnh vực công nghệ Sinh học – công nghệ Thực phẩm Tôi vô cùng biết ơn các Thầy

Cô giáo, Ban Giám hiệu, các cán bộ tại Phòng thí nghiệm, Ban Đào tạo, Ban Tài chính – Kế hoạch …đã dạy dỗ, bảo ban giúp đỡ tôi về mọi mặt

Hoàn thành Luận án Tiến sĩ này, em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS

Lê Quang Hòa và PGS.TS Trương Tuyết Mai đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, dành nhiều thời gian trao đổi, định hướng trong quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu cũng như viết Luận án Xin chân thành cảm ơn các Thầy Cô, các cán bộ của Trung tâm nghiên cứu và phát triển Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học - Công nghệ thực phẩm, Ban Đào tạo đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực hiện và báo cáo đề tài Luận án

Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Viện Dinh dưỡng, lãnh đạo và các đồng nghiệp Khoa Vi sinh vật Thực phẩm và Sinh học phân tử đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi hoàn thành công việc chuyên môn được phân công

Lời cảm ơn sâu sắc xin gửi tới Gia đình, Bạn bè luôn chia sẻ khó khăn, động viên khích lệ tôi vượt qua mọi trở ngại để hoàn thành nhiệm vụ nghiên cứu

và học tập!

Hà Nội ngày tháng năm 2023

Nghiên cứu sinh

Phan Thị Thanh Hà

MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN I LỜI CẢM ƠN II MỤC LỤC III DANH MỤC CÁC HÌNH VI DANH MỤC CÁC BẢNG VI DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT X

MỞ ĐẦU 1

1 Tính cấp thiết của đề tài 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

4 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 3

5 Tính mới của đề tài 4

TỔNG QUAN 5

1. 1.1 Tình hình sản xuất, tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ và thách thức về an toàn thực phẩm 5

1.1.1 Tình hình sản xuất và tiêu thụ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 5

1.1.2 Tình hình nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 6

1.2 Đặc điểm sinh học các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 8

1.2.1 Norovirus 8

1.2.2 Hepatitis A virus 10

1.2.3 Hepatitis E virus 11

1.2.4 Astrovirus 12

1.3 Quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 13

1.3.1 Các phương pháp tách chiết RNA vi rút 13

1.3.2 Các phương pháp xác định vi rút 17

1.4 Các quy trình phát hiện và định lượng vi rút trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ dựa trên kỹ thuật Real-time RT-PCR 21

1.5 Ứng dụng công nghệ MGB và LNA nhằm tăng nhiệt độ nóng chảy của bộ mồi, mẫu dò trong phản ứng Real – time RT - PCR 25

1.5.1 Công nghệ MGB (Minor Groove Binders) 26

1.5.2 Công nghệ LNA (Locked Nucleic Acids) 27

1.6 Phương pháp xác định kiểu gen vi rút 28

1.6.1 Kỹ thuật Nested RT - PCR 28

1.6.2 Kỹ thuật giải trình tự Sanger 30

1.7 Tình hình nghiên cứu sự lưu hành các kiểu gen của NoV, HAV, HEV, HAstV trên thế giới và tại Việt Nam 32

1.7.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 32

1.7.2 Tình hình nghiên cứu tại Việt Nam 35

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 39

2. 2.1 Vật liệu nghiên cứu 39

2.1.1 Vật liệu kiểm soát 39

2.1.2 Mẫu nhuyễn thể hai mảnh vỏ 39

2.1.3 Oligonucleotide 39

2.1.4 Hóa chất 43

2.1.5 Thiết bị 43

2.2 Phương pháp nghiên cứu 44

2.2.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV và HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 44

2.2.2 Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 52

2.2.3 Xác định kiểu gen của các chủng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm phát hiện được trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 56

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 59

3. 3.1 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của HEV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 59

3.1.1 Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV 59

3.1.2 Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HEV bằng phiên mã in vitro 64

3.1.3 Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV với chu trình nhiêt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 67

3.1.4 Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HEV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này 72

3.1.5 Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 74

3.2 Xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA của

HAstV từ nhuyễn thể hai mảnh vỏ 84

3.2.1 Lựa chọn, hiệu chỉnh tổ hợp mồi, mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HAstV 84

3.2.2 Tách dòng và tổng hợp RNA mã hóa vùng gen đích của HAstV bằng phiên mã in vitro 88

3.2.3 Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV với chu trình nhiệt theo tiêu chuẩn ISO 15216-1:2013 89

3.2.4 Xây dựng chu trình nhiệt rút gọn cho phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện RNA của HAstV phục vụ xét nghiệm nhanh vi rút này 93

3.2.5 Đặc tính kỹ thuật của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HAstV trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ theo chu trình nhiệt rút gọn và chu trình nhiệt của ISO 15216-1:2013 94

3.3 Áp dụng quy trình đã xây dựng phát hiện vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ 100

3.3.1 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 100

3.3.2 Tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2022 107

3.3.3 So sánh tình trạng nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ năm 2016 và năm 2022 113

3.4 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên nhuyễn thể hai mảnh vỏ 117

3.4.1 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng NoV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 117

3.4.2 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HEV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 126

3.4.3 Phân tích đặc điểm sinh học phân tử của các chủng HAstV phát hiện trong nhuyễn thể hai mảnh vỏ 129

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 133

4 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA LUẬN ÁN 135

TÀI LIỆU THAM KHẢO 136

PHỤ LỤC 1 KẾT QUẢ BỔ TRỢ CỦA LUẬN ÁN 1

PHỤ LỤC 2 SẢN PHẨM CỦA LUẬN ÁN 13

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Xuất khẩu NTHMV Việt Nam 2020-2021 6

Hình 1.3 Cấu tạo khung đọc mở NoV 9

Hình 1.4 Cấu trúc virion Hepatitis A virus 10

Hình 1.5 Cấu trúc hệ gen Hepatitis A virus 10

Hình 1.6 Cấu trúc virion Hepatitis E virus 11

Hình 1.7 Cấu trúc hệ gen Hepatitis E virus 11

Hình 1.8 Cấu trúc virion HAstV 12

Hình 1.9 Cấu trúc hệ gen HAstV 12

Hình 1.10 Bộ 4 mồi chính của phản ứng LAMP 18

Hình 1.11 Nguyên tắc phản ứng Real-time PCR 19

Hình 1.12 Vị trí gắn của MGB trên mẫu dò và cấu trúc hóa học của MGB 26

Hình 1.13 Cấu trúc của nucleotide thông thường và của nucleotidd LNA (B) 27

Hình 1.14 Nguyên lý kỹ thuật Nested RT - PCR 28

Hình 1.15 Nguyên lý của kỹ thuật giải trình tự Sanger 30

Hình 2.1 Quy trình lựa chọn, hiệu chỉnh, thiết kế mồi và mẫu dò cho phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV và HAstV 44

Hình 2.2 Quy trình tách dòng trình tự gen đại diện của HEV và HAstV 45

Hình 2.3 Quy trình phiên mã in vitro tạo chứng dương RNA 47

Hình 2.4 Tối ưu phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV 48

Hình 2.5 Chu trình nhiệt của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện, định lượng HEV và HAstV 49

Hình 2.6 Tóm tắt quy trình phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV 52

Hình 2.7 Chu trình nhiệt phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo ISO 15216-1:2013 54

Hình 2.8 Chu trình nhiệt của phản ứng RT-PCR với mồi ngoài khuếch đại RNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 2.9 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Hình 3.1 Cấu trúc hệ gen chuẩn HEV của WHO (mã số AB630970) 59

Hình 3.2 Đặc điểm bộ mồi của Schlosser và của Jothikumar trên trình tự gen HEV chuẩn của WHO (mã số AB630970) 60 Hình 3.3 Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Schlosser và Jothikumar với các hệ gen HEV công bố trên GenBank 61 Hình 3.4 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV-A trên gel agarose 65 Hình 3.5 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.A sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 2,5% 65 Hình 3.6 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.A 66 Hình 3.7 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HEV.B trên gel agarose 66 Hình 3.8 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HEV.B sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 67 Hình 3.9 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HEV.B 67 Hình 3.10 Chu trình nhiệt rút gọn của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện HEV

từ NTHMV 74 Hình 3.11 Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HEV 78 Hình 3.12 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HEV trong NTHMV 82 Hình 3.14 Độ bao phủ của tổ hợp mồi, mẫu dò trong nghiên cứu của Cann và cộng sự 85 Hình 3.15 Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen đích HAstV trên gel agarose 88 Hình 3.16 Kết quả sàng lọc PCR khuẩn lạc E coli DH5α mang đoạn gen đích HAstV sau biến nạp vào vector pJET1.2 trên gel agarose 88 Hình 3.17 Kết quả giải trình tự một dòng plasmid pJET1.2 mang đoạn gen HAstV 89 Hình 3.18 Kết quả xác định giới hạn phát hiện với xác suất 95% (LOD95%) của phản ứng Real-time RT-PCR xác định HAstV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử dụng chu trình nhiệt theo ISO 96 Hình 3.19 Kết quả xác định khoảng định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng HAstV trong NTHMV sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; sử dụng quy trình ISO 98 Hình 3.20 Các đường chuẩn định lượng của phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện

và định lượng HAstV trong NTHMV Sử dụng chu trình nhiệt rút gọn; Sử dụng chu trình nhiệt theo ISO 98 Hình 3.21 Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2016 101 Hình 3.22 Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2016 105 Hình 3.23 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2016 106 Hình 3.24 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2016 106 Hình 3.25 Kết quả phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trên NTHMV năm 2022 108 Hình 3.26 Phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tính năm 2022 112 Hình 3.27 Tỉ lệ nhiễm tạp đồng thời nhiều loại vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV tại chợ và siêu thị năm 2022 112 Hình 3.28 Tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV theo thời điểm lấy mẫu năm 2022 113 Hình 3.29 So sánh tỉ lệ nhiễm vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV năm 2016 và năm 2022 114 Hình 3.30 So sánh sự phân bố nồng độ vi rút trong các mẫu dương tínhnăm 2016

và năm 2022 114 Hình 3.31 Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, dịch Covid-19) đến tình trạng nhiễm vi rút trong NTHMV bằng phần mềm SPSS 116 Hình 3.32 Kết quả đánh giá mối tương quan giữa các yếu tố (loại mẫu, địa điểm lấy mẫu, thời điểm lấy mẫu, năm lấy mẫu) đến mức nhiễm NoV GI và NoV GII trong NTHMV bằng phần mềm SPSS 116 Hình 3.33 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại vùng gen ORF1-ORF2 của NoV GI và NoV GII trên gel agarose 1,5% 118 Hình 3.34 Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GI phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự NoV GI tham chiếu từ GenBank Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự 120 Hình 3.35 Phân bố kiểu gen Norovirus GI của các mẫu phát hiện được trong nghiên cứu 121

Hình 3.36 Cây phát sinh loài của các mẫu NoV GII phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự NoV GII tham chiếu từ GenBank Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự 124 Hình 3.37 Phân bố kiểu gen Norovirus GII của các mẫu phát hiện được trong nghiên cứu 125 Hình 3.38 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose 1,5% 127 Hình 3.39 Cây phát sinh loài của các mẫu HEV phát hiện được trong nghiên cứu với các trình tự HEV tham chiếu từ GenBank Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự 128 Hình 3.40 Sản phẩm phản ứng Nested RT-PCR khuếch đại HEV trên gel agarose 1,5% 129 Hình 3.41 Cây phát sinh loài của bốn chủng HAstV phát hiện được trong 131 nghiên cứu với các trình tự HAstV tham chiếu từ GenBank Chiều dài nhánh (Branch length) thể hiện mối liên hệ về di truyền giữa các trình tự 131

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1 Tổng hợp các nghiên cứu tách chiết RNA vi rút từ NTHMV 16

Bảng 1.2 Nhận xét các phương pháp xác định vi rút gây bệnh thực phẩm 20

Bảng 1.3 Tổng hợp các bộ mồi và mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu phát hiện NoV, HAV, HEV và HAstV 22

Bảng 1.4 Chu trình nhiệt của các phản ứng Real-time RT-PCR phát hiện NoV, HAV, HEV, HAstV 23

Bảng 1.5 Tổng hợp một số nghiên cứu về vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm tại Việt Nam 36

Bảng 2.1 Trình tự mồi, mẫu dò sử dụng trong nghiên cứu xây dựng quy trình Real-time RT-PCR phát hiện và định lượng RNA vi rút từ NTHMV 40

Bảng 2.2 Tổng hợp các bộ mồi sử dụng trong phản ứng Nested RT-PCR xác định kiểu gen vi rút gây bệnh truyền qua thực phẩm trong NTHMV 41

Bảng 2.3 Thành phần phản ứng Real-time RT-PCR định lượng RNA vi rút sử dụng SuperScript™ III Platinum™ One-Step qRT-PCR Kit 49

Bảng 2.4 Thông tin các biến được phân tích bằng phần mềm SPSS 55

Bảng 2.5 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 56

Bảng 2.6 Thành phần phản ứng PCR với mồi trong để khuếch đại cDNA của NoV, HAV, HEV và HAstV trong NTHMV 57

Bảng 3.1 Đặc điểm kỹ thuật của tổ hợp mồi Schlosser và Jothikumar 60

Bảng 3.2 Đặc điểm kỹ thuật của các tổ hợp mồi sau khi hiệu chỉnh và ứng dụng công nghệ MGB, LNA 63

Bảng 3.3 Kết quả tối ưu nồng độ ion Mg2+ đối với hai tổ hợp mồi A và B 68

Bảng 3.4 Kết quả tối ưu nồng độ mồi đối với hai tổ hợp mồi A và B 70

Bảng 3.5 Kết quả tối ưu nồng độ mẫu dò đối với hai tổ hợp mồi A và B 71

Bảng 3.6 Thành phần tối ưu của phản ứng Realt-time RT-PCR phát hiện HEV 71

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát nhiệt độ gắn mồi của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 72

Bảng 3.8 Tối ưu hóa thời gian gắn mồi và kéo dài mạch của quy trình Real-time RT-PCR phát hiện HEV từ NTHMV theo chu trình nhiệt rút gọn 73