trích ly polyphenol từ cây ngũ trảo có hỗ trợ enzyme pectinase

Trang iii ANOVA Analysic of variance – Phân tích phương sai CSE Phương pháp trích ly cổ điển DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EAEC Axit Ascorbic equivalent FC Folin-Ciocalteu GEA Galli

Trang 1

BỘ CÔNG THƯƠNG

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & THỰC PHẨM

PHẠM NGUYỄN TRƯỜNG THỊNH VŨ THỊ KIỀU OANH

TRÍCH LY POLYPHENOL TỪ CÂY NGŨ TRẢO CÓ HỖ TRỢ ENZYME PECTINASE

Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã chuyên ngành: 7540101

hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

98Thursday, June 13, 20249:14:50 PM9:14:50 PM98Thursday, June 13, 20249:14:50 PM9:14:50 PM98Thursday, June 13, 20249:14:50 PM9:14:50 PM

hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

98hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhThursday, June 13, 2024

Trang 2

ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP TP.HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM VIỆN CN SINH HỌC & THỰC PHẨM Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

Bộ môn: Công nghệ thực phẩm

PHIẾU GIAO ĐỀ TÀI KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

1 Họ và tên sinh viên/ nhóm sinh viên được giao đề tài (sĩ số trong nhóm:2)

(1) Phạm Nguyễn Trường Thịnh MSSV: 17070271 lớp: DHTP13C (2) Vũ Thị Kiều Oanh MSSV: 17069421 lớp: DHTP13C Ngành: Công nghệ thực phẩm

4 Nội dung thực hiện:

- Khảo sát và xác định các yếu tố (tỉ lệ nguyên liệu: dung môi, thời gian, nhiệt độ, pH và nồng độ enzyme trích ly) ảnh hưởng đến trích ly polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa trong lá ngũ trảo Tối ưu hóa quá trình trích ly

- Phân tích các hợp chất sinh học từ dịch chiết lá ngũ trảo bằng phương pháp LC- MS

5 Kết quả dự kiến đạt được:

- Tìm được các yếu tố ảnh hưởng đến việc trích ly polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa - Xác định được điều kiện tối ưu để trích ly polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa - Xác định được một số hợp chất có hoạt tính sinh học từ dịch chiết

Ngày giao đề tài: 21/11/2020 Ngày nộp báo cáo: 23/05/2021 Họ tên GV hướng dẫn: Ths Nguyễn Thị Trang Chữ ký: ………

Ngày 23 tháng 05 năm 2021 Trưởng bộ môn Cán bộ hướng dẫn chính

(ký và ghi rõ họ tên) (ký và ghi rõ họ tên)

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 3

THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên sinh viên: Phạm Nguyễn Trường Thịnh MSSV: 17070271

Lớp : DHTP13C Khóa: 13

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: 7540101

Email : truongthinhn99@gmail.com

Tên đề tài : Trích ly polyphenol từ cây ngũ trảo có hỗ trợ enzyme pectinase

Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Trang

Trang 4

THÔNG TIN CHUNG

Họ và tên sinh viên: Vũ Thị Kiều Oanh MSSV: 17069421

Lớp : DHTP13C Khóa: 13

Chuyên ngành : Công nghệ thực phẩm Mã chuyên ngành: 7540101

Email : vuoanh301@gmail.com

Tên đề tài : Trích ly polyphenol từ cây ngũ trảo có hỗ trợ enzyme pectinase

Người hướng dẫn: Th.S Nguyễn Thị Trang

Trang 5

LỜI CẢM ƠN

Chúng em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến thầy cô trong trường Đại Học Công Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh nói chung và thầy cô trong Viện Công Nghệ Sinh Học và Thực Phẩm nói riêng Nhờ có sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình, thầy cô đã luôn tạo mọi điều kiện tốt nhất cho chúng em để chúng em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp đúng thời hạn đề ra Chúng em xin chân thành cảm ơn sự truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu của thầy cô để hỗ trợ chúng em hoàn thành khóa luận

Đặc biệt, chúng em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến cô Thạc sĩ – Nguyễn Thị Trang, người đã luôn sát cánh cùng chúng em trong quá trình chúng em thực hiện nghiên cứu Cô đã luôn giúp đỡ và hỗ trợ chúng em về mọi thứ để chúng em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp Cô luôn truyền đạt cho chúng em những kinh nghiệm, kiến thức rất bổ ích Một lần nữa chúng em xin chân thành gửi lời biết ơn đến cô

Và chúng em cũng gửi lời cảm ơn đến các thầy cô đã luôn hỗ trợ chúng em về máy móc, thiết bị, dụng cụ để có thể có đủ để hoàn thành tốt nhất khóa luận tốt nghiệp Sau cùng, xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè đã động viên, đóng góp ý kiến và giúp đỡ trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành khóa luận tốt nghiệp

Mặc dù chúng em đã cố gắng để hoàn thành tốt khóa luận nhưng không tránh khỏi những thiếu sót, rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến của thầy cô và các bạn

Chúng em xin chân thành cảm ơn! 982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 6

LỜI CAM ĐOAN

“Tôi xin cam đoan luận văn về đề tài “Trích ly polyphenol từ lá ngũ trảo (Vitex Negundo Linn) có hỗ trợ enzyme pectinase.” là công trình nghiên cứu của nhóm tôi trong thời gian qua Nội dung lý thuyết trong luận văn tôi có sử dụng một số tài liệu tham khảo như đã trình bày trong phần tài liệu tham khảo Mọi số liệu sử dụng phân tích trong luận văn và kết quả nghiên cứu là do chúng tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách khách quan, trung thực, có nguồn gốc rõ ràng và chưa được công bố dưới bất kỳ hình thức nào Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nếu có sự không trung thực trong thông tin sử dụng trong công trình nghiên cứu này.”

TP Hồ Chí Minh, ngày 23 tháng 5 năm 2021 Nhóm khóa luận 982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 7

TÓM TẮT ĐỀ TÀI

Ngũ trảo (Vitex Negundo Linn) chứa nhiều các hợp chất có hoạt tính sinh học quan trọng Trong lá có chứa flavonoid, axit phenolic, tinh dầu, iridoids, triterpenes, và lignans có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống oxy hóa, đặc tính bảo vệ gan, kháng khuẩn Ngoài ra, ngũ trảo có tác dụng đuổi muỗi, trừ ký sinh trùng, diệt giun, trung hòa nọc rắn, tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và kháng sinh Nghiên cứu tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến trích ly polyphenol và hoạt tính kháng oxi hóa với sự hỗ trợ của enzyme pectinase Hàm lượng polyphenol được xác định bằng phương pháp Folin – Ciocalteu, hoạt tính kháng oxy hóa được xác định bằng phương pháp DPPH Điều kiện trích ly bao gồm 5 yếu tố được khảo sát bằng thực nghiệm là tỉ lệ nguyên liệu: dung môi; thời gian; nhiệt độ; pH; nồng độ enzyme trích ly Tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol có hỗ trợ enzyme thu được các thông số tối ưu ở tỉ lệ nguyên liệu: dung môi 1:16g/ml; thời gian 59 phút; nhiệt độ 500C; pH 4,5; nồng độ enzyme trích ly 1,9% Hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa thu được lần lượt là 12,36 mgGAE/g DW và 42,53mol Trolox/g DW

Phân tích các hợp chất sinh học có trong dịch chiết từ lá ngũ trảo bằng phương pháp LC – MS thu được 24 hợp chất: 7-(α-D-glucopyranosyloxy)-2,3,4,5,6- pentahydroxyheptanoic acid; 6-O-α-D-galactopyranosyl-D-gluconic acid; Dihydroxybenzoic acid; Protocatechuic acid,… có hoạt tính sinh học cao như: kháng nấm, kháng khuẩn, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, chống ung thư,…

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 8

2 Mục tiêu của đề tài 2

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 2

1.1.4 Thành phần hợp chất có trong cây ngũ trảo 5

1.1.5 Công dụng của cây ngũ trảo 6

1.2 Tổng quan về polyphenol 7

1.2.1 Định nghĩa polyphenol 7

1.2.2 Phân loại polyphenol 8

1.2.3 Hoạt tính sinh học tự nhiên của Polyphenol 10

1.4 Tổng quan về enzyme pectinase 15

1.4.1 Phân loại enzyme pectinase 16982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 9

1.4.2 Cơ chế hoạt động của enzyme pectinase 17

1.4.3 Ứng dụng của enzyme pectinase 20

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 21

1.5.1 Trong nước: 21

1.5.2 Ngoài nước 22

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu 23

2.4 Sơ đồ nghiên cứu 26

2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi 27

2.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly 28

2.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 28

2.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH trích ly 28

2.4.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectinase trích ly 28

2.4.6 Tối ưu hóa quá trình trích ly hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa từ cây ngũ trảo 28

2.4.7 Phân tích các hợp chất sinh học có trong dịch chiết bằng phương pháp LC- MS 302.5 Phương pháp nghiên cứu 30

2.5.1 phương pháp trích ly 30

2.5.2 Xác đinh phenolic tổng theo phương pháp Folin- Ciocalteu 30

2.5.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa theo phương pháp DPPH 32

2.5.4 Phương pháp xử lý số liệu 34

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 35

3.1 Khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi trích ly 35

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian trích ly 37

3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 39982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 10

3.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH trích ly 41

3.5 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme trích ly 42

3.6 Tối ưu hóa quá trình trích ly hàm lượng polyphenol và hoạt tính kháng oxy hóa từ cây ngũ trảo 44

3.7 Phân tích các hợp chất sinh học có trong dịch chiết bằng phương pháp LC -MS 51

CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56

Trang 11

Trang i

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1 1 Cây ngũ trảo 4

Hình 1 2 Cấu trúc của các lớp polyphenol chính 8

Hình 1 3 Một số hoạt tính sinh học khác của polyphenol 13

Hình 1 4 Biểu diễn các phân tử sinh học được bao bọc giữa cấu trúc thành tế bào sơ cấp của nguyên liệu thực vật 15

Hình 1 5 Sơ đồ phân loại enzyme pectinase 16

Hình 1 6 Cơ chế hoạt động của Pectinesterase 17

Hình 1 7 Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase 17

Hình 1 8 Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase 18

Hình 1 9 Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase 18

Hình 1 10 Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase 18

Hình 1 11 Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin 19

Hình 2 1 Sơ đồ xử lý lá ngũ trảo………23

Hình 2 2 Lá ngũ trảo tươi……… 24

Hình 2 3 Lá ngũ trảo sau khi sấy ….……… 24

Hình 2 4 Lá ngũ trảo sau khi nghiền…… ………24

Hình 2 5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm trích ly polyphenol………26

Hình 2 6 Phản ứng trung hòa gốc DPPH của các chất chống oxy hóa……… 32

Hình 3 1 Ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu: dung môi đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa……… 36

Hình 3 2 Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa.38Hình 3 3 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa 40

Hình 3 4 Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa…… 42

Hình 3 5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa……… 43

Hình 3 6 Bề mặt đáp ứng TPC theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi và pH với các yếu tố cố định là thời gian 60 phút; nhiệt độ 500C, nồng độ enzyme 2% 48

Hình 3 7 Bề mặt đáp ứng (DPPH) theo tỉ lệ nguyên liệu: dung môi và thời gian với các thông số cố định: thời gian 60 phút; nhiệt độ 500C; pH 4,5……….50

Hình 3 8 Sắc ký đồ dịch chiết ethanol của lá ngũ trảo……… 52hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh98Thursday, June 13, 20249:14:52 PM9:14:52 PM98Thursday, June 13, 20249:14:52 PM9:14:52 PM98Thursday, June 13, 20249:14:52 PM9:14:52 PM

Trang 12

Trang ii

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của cây ngũ trảo 5

Bảng 2 1 Bảng danh mục các hóa chất sử dụng………25

Bảng 2 2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 25

Bảng 2 3 Danh mục các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 26

Bảng 2 4 Các yếu tố sử dụng trong RSM 29

Bảng 2 5 Xây dựng đường chuẩn Polyphenol bằng phương pháp Folin – Ciocalteu 31

Bảng 2 6 Xây dựng đường chuẩn của DPPH 33

Bảng 3 1 Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu: dung môi trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa……… 35

Bảng 3 2 Ảnh hưởng thời gian trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa 37

Bảng 3 3 Ảnh hưởng nhiệt độ trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa 39

Bảng 3 4 Ảnh hưởng pH trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa 41

Bảng 3 5 Ảnh hưởng nồng độ enzyme trích ly đến hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxi hóa 43

Bảng 3 6 Giá trị yếu tố sử dụng trong RSM 44

Bảng 3 7 Kế hoạch thực nghiệm theo RSM để tối ưu hóa hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa 45

Bảng 3 8 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình trích ly polyphenol với hàm mục tiêu là hàm lượng polyphenol 46

Bảng 3 9 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm (Hàm mục tiêu là hàm lượng polyphenol) 47

Bảng 3 10 Kết quả phân tích ANOVA tối ưu quá trình trích ly polyphenol với hàm mục tiêu là hoạt tính chống oxy hóa 49

Bảng 3 11 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm (Hàm mục tiêu là hoạt tính chống oxy hóa) 49

Bảng 3 12 Kết quả tối ưu hóa thực nghiệm 51

Bảng 3 13 Các hợp chất được tìm thấy trong dịch chiết của lá ngũ trảo 52hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 13

Trang iii ANOVA Analysic of variance – Phân tích phương sai

CSE Phương pháp trích ly cổ điển DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl EAEC Axit Ascorbic equivalent FC Folin-Ciocalteu

GEA Gallic acid equivalent

MbAE Chiết suất có hỗ trợ vi sinh vật MEA Trích ly hỗ trợ vi sóng

PG Polygalacturonase PGL Polygalacturonte lyase PMG Polymethygalacturonase PMGL Polymethylgalacturonate lyase SFE Chiết suất siêu tới hạn

SWE Chiết suất nước dưới tới hạn TE Trolox equivalent

UAE Trích ly hỗ trợ siêu âm

hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 14

Với thế mạnh nguồn dược liệu phong phú, dân tộc ta đã tích lũy nhiều kinh nghiệm chữa bệnh cũng như nhiều bài thuốc quý từ thực vật Theo từ điển cây thuốc Việt Nam, cây ngũ trảo (Vitex Negundo Linn.) hay còn gọi là hoàng kinh, chân chim thuộc họ cỏ roi ngựa (Verbenaceae), có nguồn gốc ở Madagascar, châu Phi, châu Á và Phillipines Hiện nay, ngũ trảo được trồng rộng rãi ở các nước nhiệt đới như Ấn Độ, Trung Quốc, Việt Nam, Lào, Campuchia, là vị thuốc chữa trị hiệu quả các loại bệnh thông thường như cảm sốt, nhức đầu, sổ mũi và nhiều bệnh khác Ngoài ra, ngũ trảo có tác dụng kháng sinh, kháng nấm và chống oxy hóa mạnh đối với một số loại vi khuẩn [9] Tất cả các bộ phận của cây đều được dân gian sử dụng làm thuốc từ lâu đời ở Trung Quốc và các nước châu Á khác Lá ngũ trảo có chứa flavonoid, axit phenolic, tinh dầu, iridoids, triterpenes, và lignans có tác dụng giảm đau, chống viêm, kháng histamine, chống oxy hóa, đặc tính bảo vệ gan, kháng khuẩn Ngoài ra, ngũ trảo hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 15

SVTH: Phạm Nguyễn Trường Thịnh

có tác dụng đuổi muỗi, trừ ký sinh trùng, diệt giun, trung hòa nọc rắn, tác dụng ức chế hệ thần kinh trung ương và kháng sinh [10]

Tuy vậy, những nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của các loài thuộc chi Vitex cụ thể là cây ngũ trảo ở Việt Nam còn rất hạn chế Do đó, để hiểu rõ hơn về yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng polyphenol tổng và khả năng chống oxi hóa của lá ngũ trảo với sự

hỗ trợ của enzyme Chúng em đề xuất đề tài nghiên cứu: “Trích ly polyphenol từ cây ngũ trảo (Vitex Negundo Linn) có hỗ trợ enzyme pectinase”

2 Mục tiêu của đề tài

− Xây dựng quy trình trích ly các hợp chất polyphenol từ lá ngũ trảo

− Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly polyphenol từ lá ngũ trảo có hỗ

trợ enzyme pectinase với 2 hàm mục tiêu chính là hàm lượng polyphenol và hoạt tính

− Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng hàm lượng polyphenol và hoạt tính

kháng oxy hóa từ cây ngũ trảo (Vitex Negundo Linn) có hỗ trợ enzyme pectinase”

− Xác định hàm lượng polyphenol tổng: bằng phương pháp UV-VIS với thuốc thử

Folin-Ciocalteu dựa theo TCVN 9745 -1-2003

− Xác định hoạt tính chống oxi hóa: bằng phương pháp Diphenylpicrylhydzaryl

Trang 16

4 Ý nghĩa của đề tài

4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu giúp tìm ra các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly polyphenol cũng như hoạt tính chống oxi hóa từ lá ngũ trảo, từ đó xây dựng nên quy trình trích ly polyphenol một cách tối ưu nhất

Kết quả thu được từ đề tài có thể được sử dụng làm nguồn tài liệu học tập cho các sinh viên khối ngành kỹ thuật khóa sau, đặc biệt là sinh viên ngành công nghệ thực phẩm Thúc đẩy sự học hỏi và nghiên cứu của sinh viên về các sản phẩm tự nhiên mang dược tính và các hoạt tính sinh học để làm giàu nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam

4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Kết quả nghiên cứu từ đề tài đã đưa ra những con số cụ thể về hàm lượng polyphenol tổng và khả năng chống oxy hóa của lá ngũ trảo, từ đó có thể áp dụng vào sản phẩm thực phẩm như một chất bảo quản thực phẩm giúp ức chế vi sinh vật, mở ra hướng đi mới cho ngành công nghiệp phụ gia an toàn cho sức khỏe người tiêu dùng Không chỉ vậy, nghiên cứu góp phần nâng cao giá trị của cây ngũ trảo ở nước ta, giúp cho mọi người biết thêm về công dụng của cây ngũ trảo từ đó mở rộng và nhân giống loài cây góp phần cải thiện đời sống người nông dân

Trang 17

1.1.2 Đặc điểm hình thái

Vitex negundo Linn (Verbenaceae) là một loại cây bụi thân gỗ, có mùi thơm, mọc thành cây gỗ nhỏ, sống lâu năm Khi phát triển, cây có thể cao 3 – 5 m, thân nhẵn hoặc có ít lông, thân cây hình trụ, cành non hình vuông, có khía, màu xám hoặc màu xám nâu [9]

Lá ngũ trảo có hình chân chim, mọc đối, kép, giống như 5 cái móng chim nên được gọi là ngũ trảo Mỗi lá dài khoảng 5 – 8 cm, rộng khoảng 3 – 4 cm, gốc lá tròn, đầu nhọn, mép ở đầu lá có răng cưa Mặt trên lá nhẵn nhụi màu xanh lục sẫm, mặt dưới phủ một lớp lông mịn màu trắng bạc [9]

Hoa mọc thành chùm nhỏ ngay ở đầu cành, màu tím nhạt hoặc màu tím lam, kích thước khá nhỏ, mặt ngoài hoa có phủ một lớp lông màu xám trắng hoặc xám nâu [11]

Quả khi còn non, mọng nước có màu xanh nhạt nhưng khi chín chuyển sang màu vàng đen hoặc đen, đỉnh quả thường lõm nhẹ, có đài bao bọc, bên trong chứa 4 hạt [9]

Trang 18

Ngũ trảo là loại cây ưa ẩm, ưa sáng, thường mọc trên đất ẩm ướt hoặc dọc theo các mạch nước trong đất hoang và rừng thưa hỗn hợp Cây sinh trưởng mạnh trong xuân hè, ra hoa quả nhiều nhất ở những cây được chiếu sáng nhiều

1.1.3 Nguồn gốc và sự phân bố

Chi Vitex L có khoảng 150 loài, phân bố rộng rãi khắp vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới như: châu Á, châu Phi, châu Mỹ Cây phân bố khá phổ biến ở vùng nhiệt đới Đông – Nam Á, từ Ấn Độ, Trung Quốc đến các nước Đông Dương, Malaysia, Philippin…

Ở Việt Nam, chi này có 15 loài, hầu hết là thân gỗ, thân bụi và một ít loài là cây thân thảo sống nhiều năm Ngũ trảo phân bố rộng rãi ở các tỉnh thuộc vùng núi thấp, trung du, đôi khi gặp ở đồng bằng của hai miền Bắc – Nam Cây thường mọc ở rừng thứ sinh, đồi cây bụi hay trong các lùm bụi trên các gò cao Ngũ trảo là cây ưa sáng, ra hoa quả nhiều hằng năm, tái sinh tự nhiên từ hạt và cây chồi sau khi bị chặt [9]

1.1.4 Thành phần hợp chất có trong cây ngũ trảo

Bảng 1 1 Thành phần hóa học của cây ngũ trảo

Viridiflorol; β-caryophyllene; sabinene; 4-terpineol;

gamma-terpinene; caryophyllene oxide; 1-oceten-3-ol; globulol [16] Betulinic acid [3β-hydroxylup-20-(29)-en-28-oic acid]; ursolic

acid [2β -hydroxyurs-12-en-28-oic acid]; n-hentriacontanol; sitosterol; p-hydroxybenzoic acid

β-[17]

Protocatechuic acid; oleanolic acid; flavonoids [18]Angusid; casticin; vitamin-C; nishindine; gluco-nonitol; p- [19] hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 19

hydroxybenzoic acid; sitosterol

3β -acetoxyolean-12-en-27-oic acid; 2α, 5,12-dien-28-oic acid; 2β,3α diacetoxyoleana-5,12-dien-28-oic acid; 2α, 3β-diacetoxy-18-hydroxyoleana- 5,12-dien-28-oic acid

3α-dihydroxyoleana-[20], [21]

Vitedoin-A; vitedoin-B; a phenylnaphthalene-type lignan

alkaloid, vitedoamine-A;five other lignan derivatives [22] 6-hydroxy-4-(4-hydroxy-3- methoxy-phenyl)-3-hydroxymethyl-

β-sitosterol; p-hydroxybenzoic acid; 5-oxyisophthalic acid; tritriacontane, n-hentriacontane; n-pentatriacontane; n-nonacosane

n-[19]

2β, 3α-diacetoxyoleana-5,12-dien-28-oic acid; dihydroxyoleana-5,12-dien-28-

2α,3α-oic acid; 2α,3β oic acid; vitexin and isovitexin

-diacetoxy-18-hydroxyoleana-5,12-dien-28-[24]

Negundin-A; negundin-B; (+)-diasyringaresinol;

(+)-lyoniresinol; vitrofolal-E and vitrofolal-F [25] Acetyl oleanolic acid; sitosterol; 3-formyl-4.5-dimethyl-8- oxo-

Tinh dầu từ hoa, lá tươi và quả khô

δ-guaiene; guaia-3,7-dienecaryophyllene epoxide; hexadecenoate; α-selinene; germacren-4-ol; caryophyllene epoxide; (E)-nerolidol; β-selinene; α-cedrene; germacrene D; hexadecanoic acid; p-cymene and valencene

ethyl-[27]

1.1.5 Công dụng của cây ngũ trảo

Tất cả các bộ phận của ngũ trảo bao gồm lá, hoa, cành, rễ và hạt đã được ứng dụng trong y học dân gian ở Trung Quốc và các nước châu Á khác Lá được sử dụng để chữa bệnh viêm khớp, chóng mặt [28], chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa và chống tăng đường huyết [29] Hạt có tác dụng giảm đau, chống viêm, chống ung thư, chống oxy hóa, an thần và ngăn ngừa các bệnh về gan [22], vết thương [30], đau nhức cơ thể [31], đau răng, hen suyễn [32], đau hghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihhhghieh euu eohg tae ke toah bah hahg va xae dihh ket pua kihh dochh tai eohg ty thhh theu hguyeh thi ho ehi mihh

982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM982413069:14:50 PM9:14:50 PM

Trang 20

mắt [33] và đau nửa đầu [34] Vỏ cây ngũ trảo dùng làm thuốc trị giun đũa và bệnh mắt; hoa được dùng để chữa bệnh tả và quả được dùng làm thuốc tẩy giun sán Toàn bộ cây được sử dụng để lợi tiểu, hạ sốt và sát trùng [35]–[37] Bên cạnh các tác dụng hoạt tính sinh học được đề cập ở trên, ngũ trảo còn có tác dụng chống HIV, diệt ấu trùng [38] và đuổi muỗi [39] Tinh dầu có trong lá có thể dùng làm dầu tắm, làm liền vết thương, vết loét [28] Tinh dầu trong hạt có khả năng diệt côn trùng đáng kể [22], [40] và kháng khuẩn [28]; [27]

Ở Việt Nam, có nhiều bài thuốc dân gian từ ngũ trảo như trị nhức mỏi gân cốt, trị sốt; quả, hạt sắc nước tác dụng điều hòa kinh nguyệt, giảm đau đầu, trị cảm mạo, sốt rét, đau dạ dày

1.2 Tổng quan về polyphenol

1.2.1 Định nghĩa polyphenol

Về mặt hóa học, polyphenol là chất chuyển hóa thứ cấp của thực vật có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl gắn với vòng benzen [41] Polyphenol được phân bố rộng rãi trong các loại thực phẩm có nguồn gốc thực vật và có hơn 10.000 hợp chất polyphenol [42] Trong đó, hơn 8.000 polyphenol khác nhau từ thực vật ăn được có trong chế độ ăn uống của con người [41] Chúng bao gồm nhiều loại hợp chất có cấu trúc đặc trưng của ít nhất một vòng thơm mang một hoặc nhiều nhóm hydroxyl Polyphenol được phân loại theo số lượng vòng phenol mà chúng chứa và theo các yếu tố cấu trúc liên kết các vòng này với nhau Các lớp chính của polyphenol là flavonoid, axit phenolic, stilbene và lignans [43]

Trang 21

1.2.2 Phân loại polyphenol

1.2.2.1 Flavonoid

Flavonoid là một nhóm hợp chất tự nhiên lớn thường gặp trong thực vật, còn gọi là những hợp chất màu phenol thực vật, tạo nên màu cho rất nhiều rau, quả, hoa,…phần lớn có màu vàng (do từ flavus nghĩa là màu vàng), một số sắc tố có màu xanh, tím, đỏ, không màu cũng được xếp vào nhóm này vì về mặt hóa học, chúng có cùng khung [44]

Về mặt hóa học, flavonoid là một chuỗi polyphenolic gồm có 15 nguyên tử cacbon và 2 vòng benzen, có cấu trúc cơ bản là 1,3-diphenylpropan, nghĩa là 2 vòng benzen Avà B nối nhau qua một dây có 3 cacbon, nên thường được gọi là C6-C3-C6 Vòng thơm bên trái gọi là vòng Hình 1 2 Cấu trúc của các lớp polyphenol chính: A: Flavonoids ; B: Phenolic acids ; C: Stibenes; D:

Trang 22

A, vòng thơm bên phải gọi là vòng B, vòng trung gian (có thể có) chứa nguyên tử oxy gọi là vòng pyran [43]

Flavonoid là chất chống oxi hóa để bảo vệ các tế bào, ngăn ngừa các nguy cơ xơ vữa động mạch, tai biến mạch máo, lão hóa, chống virus, chống ung thư, chống dị ứng, chống huyết khối và hoạt động giãn mạch,… [45]; [46] Hoạt tính chống oxi hóa của flavonoid mạnh hơn cả các chất khác như: vitamin C, E, selenium và kẽm Tác dụng chống độc của flavonoid làm giảm tổn thương gan, bảo vệ được chức năng gan Flavonoid có tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản) và một số tổ chức khác Nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavanon, flavonol có tác dụng thông tiểu rõ rệt Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon-glycoside của rễ cam thảo được ứng dụng để chữa đau dạ dày

1.2.2.2 Acid phenolic

Acid phenolic là các hợp chất polyphenolic thuộc loại non-flavonoid Chúng có thể được chia thành hai nhóm chính là acid benzoid và các dẫn xuất của acid cinnamic, dựa trên cấu trúc bộ khung carbon tương ứng là hydroxybenzoic acid (C1-C6) và hydroxycinamic (C3-C6) Hydroxybenzoic acid gồm có: gallic, p- hydroxybenzoic, protocatechuic, vanillic, xyringic acids Hydroxycinamic acids gồm có: acid caffeic, ferulic, p-coumaric, sinapic,… [47] Acid phenolic trong thực vật có chức năng rất đa dạng: hấp thụ dinh dưỡng, tổng hợp protein, quang hợp và các thành phần cấu trúc

Axit caffeic ngăn chặn có chọn lọc quá trình sinh tổng hợp leukotrienes, các thành phần liên quan đến các bệnh điều hòa miễn dịch, hen suyễn và phản ứng dị ứng [48]

Axit caffeic và một số este của nó có hoạt tính chống khối u, chống lại chất sinh ung thư ruột kết [48] và hoạt động như chất ức chế vi-rút suy giảm miễn dịch loại 1 ở người [49] Axit chlorogenic có thể ức chế quá trình peroxy hóa lipid trong gan chuột do carbon tetrachloride - chất gây ung thư gan mạnh [50]

Caffeic và axit ferulic có thể giải độc các chất chuyển hóa hydrocacbon thơm đa vòng gây ung thư [51]

Trang 23

(1,7-bis-(4-hydroxy-3-1.2.3 Hoạt tính sinh học tự nhiên của Polyphenol

1.2.3.1 Hoạt động chống oxi hóa

Trong số các hoạt tính sinh học đáng chú ý của các hợp chất phenolic, các hoạt động chống oxy hóa đã được nghiên cứu rộng rãi, bao gồm loại bỏ các gốc tự do, ức chế quá trình oxy hóa lipid, giảm sự hình thành hydroperoxide [57]

Các hợp chất phenolic có khả năng chống oxy hóa mạnh của thực vật là axit rosmarinic, ferulic, caffeic, chlorogenic, vanillic, p-hydroxybenzoic, axit p-coumaric, axit protocatechuic, [57]

Theo Leopoldini et al., (2011) quá trình kháng oxi hóa của hợp chất polyphenol có thể diễn ra theo 3 cơ chế chính [58]:

a Quá trình chuyển nguyên tử hydro (HAT)

Trang 24

Trong cơ chế chuyển nguyên tử HAT, chất kháng oxy hóa (ArOH) phản ứng trực tiếp với gốc tự do (R∗) tạo phân tử bền RH thông qua quá trình phân ly liên kết O–H Hoạt tính của ArOH do đó được quyết định bởi năng lượng phân ly liên kết O– H

b Quá trình chuyển các electron- proton (SET- PT)

R* + ArOH ➔ R¯ + ArOH +* ➔ RH +ArO*

Cơ chế chuyển electron – chuyển proton (SET-PT) gồm hai giai đoạn: tách electron cho ArOH+*, theo sau là quá trình trao đổi proton Trong trường hợp này, hợp chất có năng lượng ion hóa và năng lượng tách proton càng nhỏ, hoạt tính kháng oxy hóa càng mạnh

c Cơ chế mất proton – chuyển electron ( SPLET)

Đối với cơ chế mất proton – chuyển electron (SPLET), ái lực proton và enthalpy trao đổi electron của anion ArO– đóng vai trò quyết định Như vậy, hoạt tính kháng oxy hóa của một hợp chất có thể được đánh giá thông qua các tham số nhiệt động như năng lượng phân ly liên kết (BDE), năng lượng ion hóa (IP), năng lượng tách proton (PDE), ái lực proton (PA) và enthalpy trao đổi electron (ETE) [58]

1.2.3.3 Hoạt động chống ung thư

Ung thư là nguyên nhân chính gây tử vong trên toàn thế giới Polyphenol có thể đóng một vai trò quan trọng trong việc chống ung thư Nhiều polyphenol như proanthocyanidins, flavonoid, resveratrol, tannin, epigallocatechin-3-gallate, axit gallic và anthocyanin có tác dụng chống ung thư ở dạ dày, tá tràng, ruột kết, gan, phổi, tuyến vú hoặc da [59]

Proanthocyanidins có khả năng chống ung thư vú và ức chế di căn ung thư [60]

Anthocyanin giảm sự phát triển không mong muốn của mạch máu, dẫn đến giãn tĩnh mạch và hình thành khối u máu [61]

Resveratrol, epigallocatechin-3-gallate chống lại ung thư tuyến tiền liệt, gây chết các tế bào khối u [62]; [63]

Axit gallic, flavone có khả năng ngăn chặn hình thành ung thư ruột bằng cách ức chế AND [64]

Trang 25

Chiết xuất polyphenol từ bã anh đào chứa anthocyanins, hydroxycinnamic acids, flavonoids

có tác dụng kháng khuẩn chống lại 2 loại vi khuẩn: Salmonella, Escherichia coli [66]

Karioti et al., (2011) đã chứng minh dịch chiết từ lá Quercus có nhiều thành phần có hoạt tính sinh học như flavonoid, proanthocyanidins và axit phenolic và có khả năng kháng khuẩn với

8 loài vi khuẩn ở người: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella

typhimurium, Proteus mirabilis, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Micrococcus flavus, Staphylococcus aureus và 14 loài nấm: Altenaria alternata, Aspergillus flavus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus ochraceus, Aspergillus versicolor, Aureobasidium pullulans, Cladosporium cladosporioides, Fulvia fulvum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium trincintum, Penicillium funiculosum, Penicillium ochrochloron, Trichoderma viride [67]

Theo Jayaraman et al., (2010) axit protocatechuic, axit gallic, axit ellagic, rutin, berberine và

myricetin có khả năng chống nấm Pseudomonas aeruginosa [68].

Trang 26

1.3 Tổng quan về trích ly

Trích ly là quá trình một hợp chất (dạng hòa tan hay dạng chất rắn) chuyển từ pha này sang pha khác bằng cách cho hai pha tiếp xúc với nhau, mục tiêu là tách biệt và cô lập các hợp chất cụ thể từ một hỗn hợp của nhiều hợp chất hay tách chất mục tiêu ra khỏi tạp chất Hai pha đều ở trạng thái lỏng gọi là kỹ thuật trích ly pha lỏng-lỏng Việc trích ly cũng có thể được thực hiện giữa một pha lỏng và một pha rắn (kỹ thuật trích ly pha rắn-lỏng), hoặc giữa pha khí với pha lỏng (còn gọi là hấp thụ) [72]

1.3.1 Nguyên lý trích ly

Phương pháp trích ly bằng dung môi dựa trên việc cho dung môi tiếp xúc với mẫu, có nghĩa là cho hai pha lỏng – rắn tiếp xúc với nhau một phần hoặc toàn bộ Hợp chất cần trích ly sẽ hòa tan vào dung môi khi mà cấu trúc hóa học của nó tương tự với dung môi đó Khi hai pha tiếp xúc nhau, hợp chất trích ly sẽ chuyển từ pha rắn sang pha lỏng cho đến khi đạt sự cân bằng về nồng độ

Polyphenol Bảo vệ tim mạch

Bảo vệ thần kinh Bảo vệ phổi Bảo vệ thận Ngăn ngừa loãng xương

Kháng ung thư

Chống viêm Kháng khuẩn Chống lão hóa

Chống tia cực tím

Hình 1 3 Một số hoạt tính sinh học khác của polyphenol

Trang 27

1.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly

Theo Aida, (2011) tốc độ trích ly phụ thuộc vào một số yếu tố sau [73]:

Dung môi trích ly: bản chất dung môi ảnh hưởng rất nhiều đến các quá trình trích ly Mỗi

dung môi có một độ phân cực, độ nhớt và sức căng bề mặt khác nhau dẫn đến hiệu suất trích ly khác nhau

Nhiệt độ trích ly: tăng nhiệt độ có tác dụng tăng tốc độ khuếch tán và giảm độ nhớt, các phân

tử hòa tan chuyển động dễ dàng khi khuếch tán giữa các phân tử dung môi

Thời gian trích ly: khi thời gian tăng, lượng chất khuếch tán tăng nhưng thời gian phải có

giới hạn vì khi đã đạt mức độ trích ly cao nhất, nếu kéo dài thời gian sẽ không mang lại hiệu quả kinh tế

Kích thước của nguyên liệu: khi kích thước của nguyên liệu quá thô, dung môi sẽ khó thấm

ướt nguyên liệu dẫn đến hoạt chất khó được chiết hết Khi kích thước nguyên liệu càng nhỏ, thời gian để chất tan đi từ không bào ra bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi càng ngắn do “quãng đường” trích ly đã được thu hẹp, song song đó, diện tích bề mặt tiếp xúc của nguyên liệu cũng tăng lên, nhờ đó có thể rút ngắn thời gian và nâng cao hiệu quả trích ly

1.3.3 Các phương pháp trích ly

Các hợp chất có hoạt tính sinh học từ thực vật có thể được trích ly bằng các phương pháp cổ điển (CSE), phần lớn là dựa trên khả năng chiết xuất của các dung môi khác nhau kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, thời gian, điển hình phương pháp này là trích ly Soxhlet, trích ly lỏng có áp lực (PFE),…[74] Tuy nhiên, các phương pháp trích ly cổ điển có một loạt các nhược điểm như thời gian kéo dài, độ chọn lọc trích ly thấp, dung môi phải có độ tinh khiết cao Do đó, các phương pháp trích ly mới như trích ly có hỗ trợ siêu âm (UEA), trích ly có hỗ trợ vi sóng (MEA), trích ly chất lỏng có hỗ trợ ion, trích ly có hỗ trợ của enzyme (EAE),… đã khắc phục được các hạn chế trên và an toàn với môi trường do tuân thủ các tiêu chuẩn hiện hành của các cơ quan môi trường toàn cầu và cơ quan quản lý [75]

Trang 28

1.4 Tổng quan về enzyme pectinase

Pectinase là một nhóm các enzyme xúc tác sự phân hủy các polyme pectic có trong thành tế bào thực vật Chúng thuộc về họ polysaccharidase hủy phân pectin từ nhiều loại thực vật và còn được gọi là enzyme pectolytic hoặc pectic [77] Pectinase được sản xuất chủ yếu bởi nấm

mốc Aspergillus sp., Botrytis cinerea, Fusarium moniliforme, Rhizopus stolonifer,

Trichoderma sp., Neurospora crassa…

Hình 1 4 Biểu diễn các phân tử sinh học được bao bọc giữa cấu trúc thành tế bào sơ cấp

của nguyên liệu thực vật [76]

Trang 29

1.4.1 Phân loại enzyme pectinase

Các enzyme pectinase được phân loại dựa trên phương thức hoạt động chống lại bộ khung galacturonan của pectin Có hai nhóm enzyme pectic: các enzyme khử ester hóa xúc tác quá trình deester của pectin và các enzyme khử phân giải làm đứt các liên kết glycosidic - (1-4) giữa các gốc GalA bằng cách thủy phân (hydrolase) hoặc bằng cách transelimination (lyases) Một nhóm khác của enzyme pectic là protopectinase (PPase) chuyển đổi protopectin không hòa tan thành pectin hòa tan [78]

Ngoài ra, dựa trên độ pH tối ưu cho hoạt động của enzyme, các enzyme pectic cũng được phân thành hai loại là pectinase có tính axit và kiềm

Hình 1 5 Sơ đồ phân loại enzyme pectinase

Trang 30

1.4.2 Cơ chế hoạt động của enzyme pectinase

1.2.2.1 Pectinesterase (PE)

Pectinesterase còn được gọi là pectinmethylhydrolase, xúc tác khử ester của methoxyl nhóm pectin tạo thành axit pectic Enzyme hoạt động tốt nhất là trên một nhóm methyl ester của galacturonate đơn vị bên cạnh một đơn vị galacturonate không ester hóa [79]

1.2.2.2 Các enzyme khử mạch polymer

a Enzyme thủy phân liên kết glycoisde (Hydrolase)

Polymethylgalacturonases (PMG): xúc tác sự thủy phân liên kết α-1,4-glycosidic [79],

Hình 1 6 Cơ chế hoạt động của Pectinesterase (PE)

Hình 1 7 Cơ chế hoạt động của Endo-polymethylgalacturonase (Endo-PMG)

Trang 31

Polygalacturonase (PG): xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycosid của acid pectic, gồm 2

Hình 1 8 Cơ chế hoạt động của Exo-polymethylgalacturonase (Exo-PMG)

Hình 1 9 Cơ chế hoạt động của Endo-polygalacturonase (Endo-PG)

Hình 1 10 Cơ chế hoạt động của Exo-polygalacturonase (Exo-PG)

Trang 32

chuyển các proton đến các oxy glycosidic, để lại một liên kết đôi giữa C-4 và C-5 [80]

Các enzyme lyase phân cắt pectin bao gồm:

Polymethylgalacturonate lyase (PMGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid đặc hiệu

với pectin có mức độ ester hoá cao, có hai loại:

- Endo-PMGL (còn gọi là poly (methoxygalacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của pectin)

- Exo- PMGL (xúc tác phá vỡ từng nấc phân tử pectin)

Polygalacturonate lyase (PGL): xúc tác phá vỡ liên kết α-1-4-glycosid của acid pectic Có

2 loại:

- Endo- PGL (còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) lyase, xúc tác phân cắt ngẫu nhiên liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic) [79]

Hình 1 11 Cơ chế hoạt động của các enzyme lyase phân cắt pectin

Trang 33

- Exo- PGL (còn gọi là poly(1-4-α-D- galacturonide) exolyase, xúc tác phân cắt lần lượt liên kết α-1-4- glycosid của acid pectic từ đầu không khử) [79]

1.2.2.3 Protopectinase:

Enzyme Protopectinase xúc tác quá trình hòa tan protopectin tạo thành pectin hòa tan có mức độ polyme hóa cao [79][81]

1.4.3 Ứng dụng của enzyme pectinase

Trong công nghiệp thực phẩm: pectinase làm mềm mô thực vật, giảm độ nhớt nâng cao hiệu quả thu nhận dịch nước ép, làm tăng hiệu quả lọc rượu Việc bổ sung pectinase ở tỷ lệ 1.000 – 2.000 UI/ lít, trong thời gian 1 – 3 giờ sẽ nâng cao hiệu quả tinh lọc các loại nước ép táo [82][83]

Ứng dụng trong quá trình lên men trà và cà phê: trong quá trình lên men cà phê, người ta dùng các vi sinh vật phân giải pectin để loại bỏ lớp vỏ nhớt khỏi hạt cà phê (3/4 lớp vỏ nhớt này là pectin) Enzyme thương mại được phun vào hạt với liều lượng 2 - 10 g/tấn ở 15 – 200C Khi được xử lí với enzyme pectinase, giai đoạn lên men của quá trình chế biến cà phê được thúc đẩy và giảm từ 40 - 80 giờ còn khoảng 20 giờ Do việc xử lí cà phê với enzyme thương mại thì đắt và không kinh tế nên người ta dùng lớp vỏ nhầy của cà phê thải ra để nuôi vi khuẩn sinh enzyme pectinase Đối với trà, xử lí enzyme thúc đẩy quá trình lên men mặc dù liều lượng của enzyme phải được đều chỉnh cẩn thận để tránh tổn hại đến lá trà Việc thêm 6% enzyme pectinase cũng cải thiện tính tạo bọt của bột trà, rút ngắn quy trình sản xuất 14 giờ, tăng hàm lượng các chất hòa tan 30,15% [84]

Enzyme pectinase giúp rút ngắn thời gian bóc vỏ tiêu, hạn chế được mùi hôi và lượng nước thải ra môi trường [84]

Pectinase còn được sử dụng trong chế biến ca cao, nước táo, các loại nước giải khát khác, trích ly dược liệu [85] Pectinase acid chủ yếu thu nhận từ nấm mốc, ứng dụng nhiều trong trích ly và chế biến các loại trái cây, rượu và tạo ra các sản phẩm đơn bào Pectinase kiềm được thu nhận từ vi khuẩn, ứng dụng nhiều trong lên men trà, cà phê, công nghệ sản xuất sợi, trong công nghiệp giấy, xử lí nước thải có chứa pectin [79]

Trang 34

Ứng dụng trong công nghiệp sản xuất giấy: việc làm giấy là một quá trình lọc liên tục các huyền phù và những phần mịn của sợi, các chất độn vô cơ như đất sét, CaCO3 để tạo thành các phiến giấy Vì vậy quá trình lọc sẽ ngày càng bị hạn chế do việc thoát nước qua các phiến lọc sẽ ngày càng giảm Để giải quyết vấn đề này, người ta dùng các khung lọc có kích thước đủ lớn, tuy nhiên những lỗ này cũng làm cho những phần mịn và những chất độn đi qua Trong công nghiệp làm giấy hiện đại người ta thêm một số chất trợ giúp thẩm tích vào bột giấy để giữ những phần mịn và những chất độn trong các phiến giấy và làm tăng tốc độ thoát nước Ngày nay, công nghiệp giấy đã bắt đầu đùng enzyme pectinase để giải quyết những vấn đề trên trong quá trình sản xuất [86]

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Trong nước:

Mai et al., (2014), đã xác định hàm lượng polyphenols của 90 mẫu thảo dược hái tại Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, tỉnh An Giang bằng phương pháp đun hoàn lưu 100g mẫu khô với metanol sau đó đem đi cô quay Kết quả cho thấy, 7 mẫu (thân cây dâu tằm, lá cây cỏ sữa lá nhỏ, lá cây liễu, thân cây lăng vàng, vỏ cây cà dăm, thân dây huyết rồng hoa nhỏ và thân cây dây rơm) có tổng hàm lượng polyphenol lớn hơn 200 mg GAE g-1 DW, 22 mẫu (như thổ phục linh, kỳ hương….) có tổng hàm lượng polyphenol từ 100 đến 200 mg GAE g-1 DW; 35 mẫu thử (bình bát dây, ích mẫu, khổ qua,…) có tổng hàm lượng polyphenol từ 50 đến 100 mg GAE g-1 DW và 26 mẫu thử (cườm gạo, thiên tuế,… ) nhỏ hơn 50 mg GAE g-1 DW Trong đó, hàm lượng polyphenols của cây ngũ trảo (Vitex negundo Linn) là 60,3 mg GAEg-1 DW) [87]

Thư et al., (2020), đã xác định thành phần hóa học tinh dầu lá ngũ trảo bằng phương pháp sắc kí khí ghép khối phổ GC/MS có 20 hợp chất chính như sau: monoterpene, diterpene,

sesquiterpene, Eucalyptol, caryophyllene, naphthalene… và kháng được vi khuẩn Vibrio

vulnificus [88]

Bời (2011), đã tách chiết tinh dầu trong lá và hoa ngũ trảo (Thừa Thiên – Huế) bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước Kết quả thu được hàm lượng tinh dầu chiếm 0,22-0,49% mẫu tươi, lượng tinh dầu thu được cao nhất khi hoa nở rộ (tháng 6) [11]

Trang 35

1.5.2 Ngoài nước

Praveen Kumar et al., (2010), đã xác định các chất hóa học có trong lá ngũ trảo bằng phương

pháp sắc ký khí ghép khối phổ GC/MS có hợp chất sau: 4H-Pyran-4-one, 2,3-dihydro- dihydroxy-6-methyl, Phytol và Vitamin E Hàm lượng polyphenol tổng được thực hiện bằng phương pháp Folin Ciocalteu với hàm lượng phenol là 27,72 mgGAE/100g DW Hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá bằng phương pháp DPPH cho thấy lá của ngũ trảo chứa 23,21 mgTEAC/100g DW[2]

3,5-Movahhed Haghighi et al., (2019) đã xác định tinh dầu ngũ trảo lá ở giai đoạn trổ bông (0,43%) cao hơn so với trước giai đoạn trổ bông (0,25%) Các thành phần tinh dầu chính trong lá ở 2 giai đoạn này là α-pinen (25,4–30,2%), limonene (11,9–12,5%), α-terpinyl axetat (22,6–29,5%) và (E) –caryophyllene (7,6–11,6%) [89]

Kanimozhi, (2011), đã xác định chiết xuất lá ngũ trảo bằng dung môi ethanol có các chất như alkaloid, flavonoid và có khả chống viêm, phù nề do formaldehyde gây ra ở chuột [90] Tiwari & Tripathi, (2007), đã xác định trong ngũ trảo chứa nhiều hợp chất polyphenolic, terpenoit, ancaloit và iridoid glycosidic có khả năng chống oxi hóa, kháng khuẩn, chống viêm [91]

Jayakody et al., (2003), nghiên cứu khi uống của lá tươi của cây ngũ trảo có tác dụng chống viêm, giảm đau và kháng histamine được tuyên bố trong y học [92]

Mohankumar et al., (2017), đã xác định thành phần hóa học của tinh dầu từ ngũ trảo bằng phân tích GC-MS Kết quả có 6 hợp chất như sau: beta-Phellandrene, caryophyllene, 4-terpineol, β-(Z)-farnesene, epiglobulol, 5-(1-Isopropenyl-4,5- dimethylbicyclo[4.3.0]nonan-5-yl)-3-methyl-2- pentenol acetate Trong đó caryophyllene (21,58%) và epiglobulol (47,13%) có khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ [93]

Geetha et al., (2019), đã thu hồi tinh dầu ngũ trảo bằng thiết bị Clevenger Tinh dầu thu được

có khả năng kháng khuẩn với 4 loại vi khuẩn: Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa,

Staphylococcus aureus and Shigella dysenteriae [94]

Trang 36

CHƯƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Sấy 600C

Xay mịn

Sàng phân loại ≤0.5 mmLá ngũ trảo

Đóng gói

Bột lá ngũ trảoBao PE

Trang 37

Cách lựa chọn: nguyên liệu được sử dụng trong quá trình nghiên cứu là lá tươi, lá có màu

xanh, không héo, úa, chỉ lấy phần lá không lấy cuốn lá

Tiến hành sấy đến ở nhiệt độ 550C- 600C đến khi độ ẩm đạt <12%, xay nhỏ bằng máy nghiền, kích thước hạt nhỏ hơn 0.5mm và đóng gói chân không bằng túi PE với khối lượng 20g/gói và bảo quản ở nhiệt độ phòng

Trang 38

Novozymes-

Hoạt tính: ≥ 3.800 U/ml Dạng lỏng, màu nâu

5 Folin – Ciocalteu Merck - Đức ≥99.7 Lỏng 6 Sodium acetate trihydrate Trung Quốc ≥ 99 Rắn

2.3.2 Thiết bị

Bảng 2 2 Danh mục các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm

Trang 39

2.3.3 Dụng cụ

Bảng 2 3 Danh mục các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm

1 Becker 100ml, 250ml Đức 9 Giá ống nghiệm Trung Quốc

2

Bình định mức 10ml, 25ml, 50ml, 100ml, 250ml, 500ml

Trung Quốc 10 Microipet 100-

4 Bóp cao su Trung Quốc 12 Ống nhỏ giọt Trung Quốc 5 Cuvet thủy tinh Mỹ 13 Ống ly tâm Trung Quốc

6 Đầu típ 1ml Trung Quốc 14 Ống đong 100ml Trung Quốc

7 Đũa thủy tinh Trung Quốc 15 Pipet 1ml, 2ml,

8 Erlen 100ml, 250ml Trung Quốc 16 Phễu thủy tinh Trung Quốc

2.4 Sơ đồ nghiên cứu

Các thí nghiệm được bố trí theo sơ đồ bên dưới:

Trang 40

2.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của tỉ lệ nguyên liệu : dung môi

Hàm mục tiêu: xác định hàm lượng polyphenol và hoạt tính chống oxy hóa Yếu tố khảo sát: tỷ lệ nguyên liệu: dung môi: 1:9, 1:11, 1:13, 1:15, 1:17 [95]

Yếu tố cố định: khối lượng bột lá ngũ trảo: 1g; nồng độ enzyme pectinase 2 % [95]; thời gian

trợ bởi enzyme pectinase

Khảo sát tỉ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly: 1/9 đến 1/17

Khảo sát thời gian trích ly: 20; 40; 60; 80; 100 phút

Khảo sát nhiệt độ trích ly: 40; 45; 50; 55; 600C

Khảo sát pH trích ly: 3,5; 4; 4,5; 5; 5,5

Khảo sát nồng độ enzyme pectinase trích ly: 1% đến 3%

Tối ưu hóa quá trình trích ly polyphenol có hỗ trợ enzyme

pectinase

Phân tích các hợp chất sinh học có trong dịch chiết bằng phương

pháp LC-MS

Hình 2.5 Sơ đồ nghiên cứu trích ly Polyphenol từ lá ngũ trảo