nghiên cứu tách chiết cao atiso có hỗ trợ enzyme và thẩm định phương pháp phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic từ lá cây atiso

CYNARIN VÀ ACID CHLOROGENIC TỪ LÁ CÂY ACTISO Chuyên ngành: HO PH N T CH Mã chuyên ngành: 8440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ THÀNH PHỐ HỒ CH MINH, NĂM 2021 luan van tot nghiep, luan van thac si, l

Trang 1

CYNARIN VÀ ACID CHLOROGENIC TỪ LÁ CÂY ACTISO

Chuyên ngành: HO PH N T CH Mã chuyên ngành: 8440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ

THÀNH PHỐ HỒ CH MINH, NĂM 2021

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hopluan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop luan van tot nghiep, luan van thac si, luan van cao hoc, luan van tong hop

Trang 2

Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Công nghiệp TP Hồ Chí Minh Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Quốc Thắng

Luận v n thạc s được ảo vệ tại Hội đồng chấm ảo vệ Luận v n thạc s Trường Đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ngày 10 tháng 09 n m 2021

Thành phần Hội đồng đánh giá luận v n thạc s gồm:

1 PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuấn… - Chủ tịch Hội đồng 2 PGS.TS Ngô V n Tứ……… - Phản iện 1

3 TS Trần Thị Thanh Thuý… - Phản iện 2 4 PGS.TS Nguyễn V n Cường - Ủy viên

(Ghi rõ họ, tên, học hàm, học vị của Hội đồng chấm bảo vệ luận văn thạc sĩ)

Trang 3

NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ

Họ tên học viên: Võ Thị Kim Hoa MSHV: 18104831 Ngày, tháng, n m sinh: 31/05/1980 Nơi sinh: TP.HCM

Chuyên ngành: Hoá Phân Tích Mã chuyên ngành: 8440118

2 Nội dung

 Thẩm định quy trình phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic;  Khảo sát các phương pháp trích ly cynarin, acid chlorogenic từ lá actiso;  Khảo sát ảnh hưởng của điều kiện trích ly ằng enzyme pectinase:

+ Khảo sát từng yếu tố: Nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ thủy phân;

+ Khảo sát đồng thời a yếu tố trên ằng quy hoạch thực nghiệm tâm xoay ậc hai với mô hình Box-Wilson, xử lý số liệu ằng phần mềm Design Expert 11.0;

 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích.

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Trang 4

II NGÀY GIAO NHIỆM VỤ : 10.07.2020 III NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ : 30.06.2021

IV NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC : TS Nguyễn Quốc Thắng

Tp Hồ Chí Minh, ngày 20 tháng 09 năm 2021

Trang 5

Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến TS Nguyễn Quốc Thắng đã tận tình hướng dẫn em hoàn thành luận v n

Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn đến tập thể các anh chị và ạn è ở Công ty BV Pharma đã tạo giúp đỡ, hỗ trợ và điều kiện thuận lợi để tôi hoàn thành luận v n

Tác giả

Võ Thị Kim Hoa

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 6

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ

Đề tài tập trung vào hai nội dung:

1 Phân tích đồng thời cynarin và chlorogenic acid trên thiết ị HPLC, cột pack GISS C18 ở 30 °C, đầu dò Photodiode Array đặt ở ước sóng 325 nm đối với cynarin và 321 nm đối với chlorogenic acid Pha động là hỗn hợp MeOH và 5% AcOH ở tỉ lệ 10:90; v/v, tốc độ dòng 1.5 mL/phút Tổng thời gian phân tích 1 mẫu 25 phút Phương trình tuyến tính, hệ số tương quan của cynarin trong khoảng nồng độ từ 31,5 đến 73,5 mg/L, y = 16736x + 31934, r2 = 0,9998 và của chlorogenic acid trong nồng độ từ 39,0 đến 91,0 mg/L là y = 19094x + 43864, r2 = 0,9996 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng lần lượt là 0,64 mg/L, 1,93 mg/L đối với cynarin và 0,30 mg/L, 0,90 mg/L đối với chlorogenic acid Hiệu suất thu hồi từ 96,15% đến 100,73% đối với cynarin và từ 98.53% đến 103,14% đối với chlorogenic acid

Shim-2 Cynarin và chlorogenic acid được trích ly từ lá cây Cynara scolymus L Bằng

phương pháp hỗ trợ ởi enzyme pectinase Ảnh hưởng độc lập của nồng độ enzyme, pH, nhiệt độ đến quá trình trích ly được khảo sát để chọn khoảng điều kiện thích hợp để enzyme phát huy tác dụng Sau đó sử dụng mô hình Box và Wilson trên phần mềm Design Expert 11.0 để thiết kế thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng đồng thời các yếu tố này, sử dụng để thiết kế Trong khi đó, sử dụng mẫu đối chứng không sử dụng enzyme để trích ly Hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích được khảo sát ằng cách sử dụng 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl và ằng phản ứng khử sắt.

123docz.net - File bi loi xin lienhe: lethikim34079@hotmail.com

Trang 7

ABSTRACT

1 In this research, the first, the method simultaneous determination of cynarin and chlorogenic acid were used HPLC, Shim-pack GISS C18 column, at a temperature of 30 °C, with Photodiode Array Detector set at 325 nm for cynarin and 321 nm for chlorogenic acid The mobile phase a mixture of MeOH and 5% AcOH solution in a ratio 10:90; v/v, set at a flow rate of 1.5 mL/min Total chromatographic analysis time per sample was approximately 25 min The linear range were collected from 31.5 to 73.5 mg/L for cynarin with linear regression 16736x + 31934, correlation coefficient r2 = 0.9998 and from 39.0 to 91.0 mg/L for chlorogenic acid with linear regression 19094x + 43864, correlation coefficient r2 = 0.9996 The limit of detection (LOD) and limit of quantification (LOQ) were 0.64 mg/L and 1.93 mg/L for cynarin and 0.30 mg/L and 0.90 mg/L chlorogenic acid, respectively The recovery was from 96.15% to 100.73% for cynarin and from 98.53% to 103.14% for chlorogenic acid

2 The second, cynarin and chlorogenic acid were extracted from Cynara scolymus L by enzyme-assisted method, which was Enzyme pectinase The effect of three

independent variables in terms of enzyme concentration, pH, temperature was investigated to find a range of suitable conditions, which can help enzyme pectinase to activate well Then, the Box and Wilson design was applied to survey the simultaneous effect of these factors, using Design Expert 11.0 software for the experimental design and regression analysis of the experimental cynarin and chlorogenic obtained in the extract At the same time, the control sample was extracted similarly in that process, but enzyme pectinase was not added in sample The antioxidant activity of the extract were investigated by 2,2- diphenyl-1-picrylhydrazyl radical scavenging capacity assay and potassium ferricyanide reducing power

Trang 8

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của ản thân tôi Các kết quả nghiên cứu và các kết luận trong luận v n là trung thực, không sao chép từ ất kỳ một nguồn nào và dưới ất kỳ hình thức nào Việc tham khảo các nguồn tài liệu (nếu có) đã được thực hiện trích dẫn và ghi nguồn tài liệu tham khảo đúng quy định

Tác giả

Võ Thị Kim Hoa

Trang 9

2 Mục tiêu nghiên cứu 1

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 1

3.1 Đối tượng nghiên cứu 1

3.2 Phạm vi nghiên cứu 2

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu 2

4.1 Thẩm định phương pháp phân tích đồng thời hàm lượng cynarin và acid chlorogenic từ cao actiso ằng thiết ị HPLC 2

4.2 Khảo sát điều kiện trích ly cao chứa cynarin và acid chlorogenic từ cây actiso 2

4.3 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích 2

5 Ý ngh a thực tiễn của đề tài 2

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 3

1.1 Cây actiso 3

1.1.1 Danh pháp và phân loại khoa học 3

1.1.2 Mô tả thực vật 3

1.1.3 Khu vực phân ố, kỹ thuật trồng và thu hoạch 4

1.1.4 Thành phần hóa học trong actiso 6

1.1.5 Công dụng của cây actiso 7

1.2 Hoạt chất cynarin và acid chlorogenic 8

1.2.1 Tính chất và công dụng của cynarin 8

1.2.2 Tính chất và công dụng của acid chlorogenic 10

1.2.3 Phương pháp phân tích cynarin và acid chlorogenic 12

1.2.4 Ứng dụng của cynarin và acid chlorogenic 13

1.3 Các phương pháp trích ly 19

Trang 10

1.3.1 Phương pháp ngấm kiệt 19

1.3.2 Phương pháp chiết Soxhlet 20

1.3.3 Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng (microwave-assisted extraction) 21

1.3.4 Phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm (ultrasound-assisted extraction) 22

1.3.5 Phương pháp trích ly ằng lưu chất siêu tới hạn (supercritical fluid extraction) 23

1.3.6 Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme (enzyme-assisted extraction) 25

1.4 Sơ lược về tình hình nghiên cứu 29

1.4.1 Một số nghiên cứu trên thế giới 29

1.4.2 Một số nghiên cứu trong nước 31

2.2.1 Khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích 38

2.2.2 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 38

2.2.3 Độ chụm 38

2.2.4 Hiệu suất thu hồi 39

2.2.5Quy trình phân tích cynarin và acid chlorogenic từ cao chiết 39

2.3 Khảo sát kỹ thuật chiết cynarin và acid chlorogenic từ cao actiso 40

2.3.1 Kỹ thuật chiết ằng dung môi 41

2.3.2 Kỹ thuật chiết hiện đại 41

2.4 Khảo sát điều kiện trích ly cynarin và acid chlorogenic từ actiso ằng enzyme 422.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố 43

2.4.2 Ảnh hưởng đồng thời các yếu tố 44

2.5 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích 45

2.5.1 Khảo sát khả n ng loại gốc tự do ằng phương pháp DPPH 45

2.5.2 Khảo sát n ng lực khử 46

Trang 11

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 49

3.1 Xác nhận phương pháp phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic 49

3.1.1 Kết quả khảo sát tính đặc hiệu của phương pháp phân tích 49

3.1.2 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của phương pháp phân tích 50

3.1.3 Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính của phương pháp phân tích 51

3.1.4 Kết quả khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng 52

3.1.5 Kết quả khảo sát độ chụm của phương pháp 53

3.1.6 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của phương pháp 53

3.1.6 Kết quả phân tích hàm lượng cynarin và acid chlorogenic từ ột lá actiso 54

3.2 Kết quả khảo sát kỹ thuật trích ly cynarin và acid chlorogenic từ actiso 55

3.2.1 Kết quả khảo sát kỹ thuật trích ly ằng dung môi 55

3.2.2 Kết quả khảo sát kỹ thuật trích ly có hỗ trợ siêu âm và chiết có hỗ trợ enzyme… …….56

3.3 Kết quả khảo sát điều kiện trích ly cynarin và acid chlorogenic từ actiso ằng enzyme pectidase 58

3.3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến khả n ng trích ly cynarin và acid chlorogenic 58

3.3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố 61

3.4 Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao chiết từ lá actiso có hỗ trợ enzyme pectidase 76

3.4.1 Khả n ng loại gốc tự do ằng phương pháp DPPH 76

3.4.2 Kết quả khảo sát n ng lực khử 77

KẾT LUẬN…… 78

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA HỌC VIÊN 80

DANH MỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO 92

PHỤ LỤC……… 97

LÝ LỊCH TR CH NGANG CỦA HỌC VIÊN 98

Trang 12

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1 Lá và hoa actiso 3

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cynarin 9

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử acid chlorogenic 11

Hình 1.4 Vi khuẩn Escherichia coli 16

Hình 1.5 Vi khuẩn Bacillus cereus 17

Hình 1.6 Vi khuẩn Pseudomonas aeroginosa 18

Hình 1.7 Bình trích ngấm kiệt 20

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống trích Soxhlet 21

Hình 1.9 Sơ đồ hệ thống trích ly hồi lưu có hỗ trợ vi sóng 22

Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly có hỗ trợ siêu âm 22

Hình 1.11 Sơ đồ hệ thống trích ly ằng cac on dioxid siêu tới hạn 24

Hình 1.12 Sơ đồ nguyên tắc phá vỡ cấu trúc cơ chất dưới tác dụng của enzyme 27

Hình 2.1 Lá actiso (a dạng đã sấy khô, ( dạng ột kích thước khoảng 300 μm 33

Hình 2.2 Các thiết ị sử dụng 35

Hình 2.3 (a Chất chuẩn cynarin và acid chlorogenic và ( các enzyme sử dụng 37

Hình 2.4 Sơ đồ thực nghiệm nghiên cứu trích ly cynarin và acid chlorogenic từ actiso… 40

Hình 2.5 Sơ đồ thực nghiệm nghiên cứu trích ly cynarin và acid chlorogenic từ actiso ằng eznyme 42

Hình 3.3 Phương trình đường chuẩn của cynarin và acid chlorogenic 52

Hình 3.4 So sánh các kỹ thuật trích ly hỗ trợ siêu âm và hỗ trợ enzyme 57

Hình 3.5 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme pectidase 59Hình 3.6 Ảnh hưởng của pH đến khả n ng trích ly cynarin và acid chlorogenic của

Trang 13

Hình 3.7 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả n ng trích ly cynarin và acid chlorogenic

của enzyme pectidase 60

Hình 3.8 Hàm lượng cynarin từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 65

Hình 3.9 Sự tác động của a yếu tố khảo sát 65

Hình 3.10 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và pH đến hàm lượng cynarin 66

Hình 3.11 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nhiệt độ thuỷ phân đến hàm lượng cynarin 67

Hình 3.12 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ thuỷ phân đến hàm lượng cynarin 68

Hình 3.13 Hàm lượng acid chlorogenic từ số liệu thực nghiệm và dự đoán 71

Hình 3.14 Sự tác động của a yếu tố khảo sát đến quy trình trích ly acid chlorogenic 72

Hình 3.15 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và pH đến hàm lượng acid chlorogenic… 73

Hình 3.16 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme và nhiệt độ thuỷ phân đến hàm lượng acid chlorogenic 73

Hình 3.17 Ảnh hưởng của pH và nhiệt độ thuỷ phân đến hàm lượng acid chlorogenic 74

Hình 3.18 Khả n ng ắt gốc tự do của acid ascor ic và cao trích thu được từ lá actiso có hỗ trợ enzyme pectidase 76

Hình 3.19 N ng lực khử của acid ascor ic và cao trích thu được từ lá actiso có hỗ trợ enzyme pectidase 77

Trang 14

DANH MỤC BẢNG BIỂU

Bảng 2.1 Các thiết ị sử dụng trong đề tài nghiên cứu 34

Bảng 2.2 Các dụng cụ sử dụng trong đề tài nghiên cứu 36

Bảng 2.3 Các hoá chất sử dụng trong đề tài nghiên cứu 36

Bảng 2.4 Thiết kế thí nghiệm ảnh hưởng từng yếu tố 43

Bảng 2.5 Thiết kế thí nghiệm theo mô hình Box-Wilson 44

Bảng 3.1 Kết quả khảo sát tính tương thích hệ thống của cynarin và acid chlorogenic trong các dung dịch 51

Bảng 3.2 Kết quả khảo sát độ chụm và độ đúng của phương pháp phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic trong các dung dịch chuẩn 53

Bảng 3.3 Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi và độ lệch chuẩn tương đối của phương pháp phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic trong các mẫu cao trích actiso……… 54

Bảng 3.4 Kết quả phân tích hàm lượng cynarin và acid chlorogenic từ ột actiso…56 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát hiệu suất trích ly cynarin và acid chlorogenic từ ột actiso ằng các dung môi khác nhau 55

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát khả n ng trích ly cynarin và acid chlorogenic từ ột actiso ằng các kỹ thuật trích ly hiện đại 56

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát theo nồng độ enzyme pectidase 59

Bảng 3.8 Kết quả ảnh hưởng của pH đến khả n ng trích ly cynarin và acid chlorogenic của enzyme pectidase 59

Bảng 3.9 Khoảng iến thiên phù hợp thí nghiệm 61

Bảng 3.10 Các mức thí nghiệm được triển khai 61

Bảng 3.11 Kết quả thí nghiệm trích ly cynarin theo mô hình Box-Wilson 62

Bảng 3.12 Kết quả phân tích ANOVA đối với quy trình chiết cynarin 63

Bảng 3.13 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 64

Bảng 3.14 Kết quả thí nghiệm trích ly acid chlorogenic theo mô hình Wilson………… 69

Box-Bảng 3.15 Kết quả phân tích ANOVA đối với quy trình chiết acid chlorogenic……… 69

Bảng 3.16 Kết quả phân tích sự phù hợp của mô hình với thực nghiệm 71

Bảng 3.17 Điều kiện trích ly cynarin và acid chlorogenic phù hợp 75

Trang 15

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

STT Từ viết tắt

Từ đầy đủ

10 PAD Photo Diode Array Detector chuỗi (dãy) diốt quang

tử ngoại khả kiến

Trang 16

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Từ xưa, trong dân gian đã iết sử dụng các loại dược liệu như actiso, actiso đỏ,… để điều trị ệnh Tuy nhiên, khi đó chưa có các nghiên cứu sâu hơn nhằm đưa ra cơ sở khoa học giải thích lý do khả n ng trị ệnh của actiso, actiso đỏ Vì vậy, nhiều công trình nghiên cứu các hoạt chất từ cây actiso lần lượt ra đời trên thế giới Ở Việt Nam, với điều kiện khí hậu, đất đai phù hợp, actiso được trồng khá nhiều ở các vùng SaPa, Hà Giang, Sơn La, Tam Đảo và đặc iệt được trồng nhiều nhất tại Đà Lạt tạo điều kiện nghiên cứu và phát triển loại dược liệu này Những nghiên cứu về khả n ng chiết tách các hoạt chất có ứng dụng sinh học từ actiso lần lượt được triển khai Tuy nhiên, những công ố về phương pháp trích ly hoạt chất, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của actiso được trồng tại Việt Nam vẫn chưa phổ iến, nhất là kỹ thuật trích ly ằng enzyme Xuất phát từ những lý do trên, chúng tôi chọn

đề tài “Nghiên cứu tách, chiết cao actiso có hỗ trợ enzyme và thẩm định phương pháp phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic từ lá cây actiso”

2 Mục tiêu nghiên cứu

 Thẩm định quy trình phân tích đồng thời cynarin và acid chlorogenic từ lá cây actiso

 Nghiên cứu kỹ thuật chiết cao actiso nhằm đạt hiệu quả cao trong trích ly cynarin và acid chlorogenic

 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3.1 Đối tượng nghiên cứu

 Lá cây actiso  Cao actiso

 Hoạt chất cynarin và acid chlorogenic

Trang 17

3.2 Phạm vi nghiên cứu

 Trích ly cao chứa cynarin và acid chlorogenic từ cây actiso và thử nghiệm hoạt tính kháng oxi hoá của cao trích

4 Cách tiếp cận và phương pháp nghiên cứu

4.1 Thẩm định phương pháp phân tích đồng thời hàm lượng cynarin và acid chlorogenic từ cao actiso ng thiết ị HPLC

 Tính đặc hiệu

 Tính tương thích hệ thống

 Giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng  Hiệu suất thu hồi

 Độ lặp lại, độ tái lập trung gian

4.2 Khảo sát điều kiện trích ly cao chứa cynarin và acid chlorogenic từ cây actiso

 Khảo sát điều kiện trích ly cao trích chứa cynarin và acid chlorogenic ằng các phương pháp cổ điển và hiện đại

 Khảo sát điều kiện trích ly cao chứa cynarin và acid chlorogenic có hỗ trợ enzyme: Khảo sát ảnh hưởng của từng yếu tố như pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hiệu quả trích ly (hàm lượng cynarin và acid chlorogenic cao nhất từ cây actiso Khảo sát ảnh hưởng đồng thời của các yếu tố: Sau khi tìm khoảng iến thiên phù hợp, tiến hành khảo sát ảnh hưởng đồng thời của 3 yếu tố (pH, nhiệt độ và thời gian thủy phân) ằng quy hoạch thực nghiệm theo phương pháp ề mặt đáp ứng với mô hình Box – Wilson

4.3 Thử nghiệm hoạt tính háng o i hoá của cao tr ch 5 Ý nghĩa thực tiễn của đề tài

Kết quả của đề tài làm cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo về trích ly cynarin và acid chlorogenic từ cây actiso trong công nghiệp và ứng dụng của cao trích

Trang 18

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 Cây actiso

1.1.1 Danh pháp và phân loại khoa học

 Tên khoa học: Cynara scolymus L.; tên gọi khác: Artichaut (Pháp , artichoke

(Anh)  Giới: Plantae  Bộ: Asterales  Họ: Asteraceae  Chi: Cynara

Trang 19

đính trên một đế hoa đường kính 6 – 15 cm, ở gốc đế hoa được ao ởi nhiều lá ắc, có chóp nhọn Quả actiso nhẵn óng có các tơ trắng dài và dính nhau ở gốc, hạt không có nội nhũ [1-3]

1.1.3 Khu vực phân bố, kỹ thuật trồng và thu hoạch

1.1.3.1 hu v c ph n b

Actiso có nguồn gốc từ miền Nam châu u, do người Cổ La Mã và Cổ Hy Lạp trồng để lấy hoa làm rau n Vào giữa thế kỷ 15, actiso được trồng để làm dược liệu đầu tiên ở Naples Sau đó, actiso được Catherine de Medici đem đến trồng Pháp vào thế kỷ 16 Sau đó, người Hà Lan mang actiso đến Anh Actiso được trồng ở bang Louisiana và California, Mỹ vào thế kỷ 19 ởi người Pháp và Tây Ban Nha khi đến nhập cư Ngày nay, actiso được trồng chủ yếu ở Tây Ban Nha, Ý, Pháp, Mỹ và các nước châu Mỹ Latinh Tại Việt Nam, actiso được người Pháp đưa về để trồng Hiện nay, dược liệu này được trồng nhiều ở Đà Lạt, Sapa và Tam Đảo [1, 3]

1.1.3.2 thuật trồng

Nhân giống:

 Cách thứ nhất: Khi thu hoạch actiso, người ta giữ lại phần gốc có nẩy chồi đẻ cây con để làm giống, phần thân này được lưu giữ nơi thoáng mát Với mỗi thân cây, tùy vào số mầm mà người ta có thể cắt thành 2 đến 4 mầm con để trồng Khi chuẩn ị đất xong thì đem phần thân có nẩy mầm cây con để trồng  Cách thứ hai là gieo hạt: Hạt giống được ngâm và ủ để hạt nứt nanh, sau đó

gieo vào các vỉ xốp hoặc trên giá thể sạch để tránh việc lây lan nguồn nấm ệnh từ giá thể, thường xuyên tưới nước để giữ ẩm cho cây Cây con được giữ ở nơi mát và ẩm Khi cây con đủ tiêu chuẩn, người ta chọn cây sạch ệnh và đem trồng ngoài đồng ruộng

 Actiso thích hợp với loại đất thịt, đất giàu chất hữu cơ, có thể giữ ẩm và tạo luống nhằm thoát nước tốt, pH khoảng 6 - 6,5, mật độ trồng khoảng 10000 -12000 cây/ha

Trang 20

Bón phân:

Do actiso có thời gian sinh trưởng kéo dài, nên để cây cho ông to và nhiều ông thì đất trồng phải được ón phân cân đối và đầy đủ Khi làm đất, phải xác định pH của đất để tính toán lượng vôi cần sử dụng (thường lượng dùng khoảng 1000-1500 kg/ha), ngoài ra, cần bón lót thêm phân chuồng (lượng dùng từ 40-80 m3/ha) và phân lân (2000 kg/ha) trước khi trồng Trong quá trình sinh trưởng phát triển của cây, cần ón thúc thêm khoảng 5 đến 6 lần để cây phát triển tốt trong suốt cả vụ canh tác Ngoài ra, ổ sung các loại phân trung lượng, vi lượng qua lá Để cây có dược tính cao, người ta phải ngưng ón phân 45 ngày trước khi thu hoạch toàn ộ thân, rễ

Các loại sâu, ệnh hại actiso và iện pháp phòng trừ:

 Bọ phấn: Để hạn chế ọ phấn, người ta phải cày, phơi đất kỹ vài ngày trước

khi canh tác Ngoài ra, thường xuyên vệ sinh vườn trồng, tỉa lá, tỉa cành nhằm tạo độ thông thoáng để hạn chế nơi cư trú của sâu ọ Khi phát hiện khu vực có ọ phấn với mật số cao, gây hại nặng, cần cắt ỏ lá và mang đi tiêu hủy, đặt ẫy dính để ắt diệt ọ phấn Phun thêm thuốc ảo vệ thực vật có hoạt

chất: Dinotefuran, Thiamethoxam, Citrus oil, Oxymatrine

 Rầy mềm: Để hạn chế rầy mềm, tiến hành cày và phơi đất thật kỹ trước khi trồng Thường xuyên vệ sinh vườn trồng, cắt tỉa để tạo độ thông thoáng nhằm hạn chế nơi cư trú của rầy Trường hợp ị rầy mềm tấn công, nên cắt ỏ và thu dọn những cây ị hại và mang đi tiêu hủy nhằm giảm độ rầy gây hại Phun thêm thuốc ảo vệ thực vật có hoạt chất: Alpha-cypermethrin, Abamectin, Thiamethoxam, Abamectin, Azadirachtin, Abamectin, Etofenprox để phòng trừ

 Bệnh đốm lá: Do nấm Ramularia cynarae gây ra, Bệnh phát triển và lây lan

nhanh vào mùa mưa, do độ ẩm trong không khí cao Để hạn chế ệnh, nên chọn vùng đất thông thoáng, cao ráo, thoát nước tốt để canh tác Thường xuyên thu dọn, mang tiêu hủy những cây ệnh Lưu ý chế độ ón phân sao cho đầy đủ và cân đối nhằm tạo sức đề kháng cho cây

Trang 21

 Bệnh héo rũ: Bệnh do nấm Verticillium dahliae gây ra, cắt tỉa những lá già, lá

ị ệnh và mang đi tiêu hủy Không được gây vết thương cho cây đẻ hạn chế nấm dễ xâm nhiễm vào vết thương và gây hại

Thu hoạch:

Actiso được trồng vào khoảng tháng 4, 5, thu hoạch khoảng tháng 2, 3 Lá được thu hoạch lúc cây sắp ra hoa vào n m thứ nhất của thời kỳ sinh trưởng hoặc vào cuối mùa hoa Do hàm lượng hoạt chất trong lá giảm khi cây trổ hoa, vì vậy, người ta thường thu hoạch lá trước khi cây ra hoa Phần lá sau khi thu hái sẽ được đem phơi hoặc sấy khô, sau đó ảo quản ở nơi thoáng mát Hoa actiso được thu hoạch khi chưa nở, thường từ tháng 12 n m trước đến tháng 2 n m sau Người ta thường dùng hoa actiso để làm rau n và làm thuốc

1.1.4 Thành phần hóa học trong actiso

 Các acid hữu cơ: Gồm các acid nhóm phenol như cynarin (acid 1-3 dicafeyl quinic và các sản phẩm thủy phân của nó (acid cafeic, acid chlorogenic, acid neochlorogenic), acid succinic, acid alcol [1, 3]

 Nhóm hợp chất flavonoid (dẫn chất của luteolin , ao gồm: Scolymozid (luteolin-7-rutinozid-3’- glucozid), cynarozid (luteolin -7-D glucpyranozid), [1]

 Thành phần khác: Cynaopicrin (thuộc nhóm guaianolid) Các enzyme:

Oxidase, oxigenase, catalase, peroxidase và nhiều chất vô cơ chứa K, Na, Ca, Mg [1]

Phân ố hoạt chất trong actiso khác nhau Lá chứa nhiều hoạt chất nhất: 1,23% polyphenol, acid chlorogenic 4%, hợp chất flavonoid (đặc iệt là rutin) Thân và rễ cây chứa ít hoạt chất hơn lá (thân 0,75%, rễ 0,54% Hoạt chất polyphenol tập trung ở lá actiso, có nhiều nhất ở phiến lá (7,2% rồi đến hoa (3,48% , đến cụm hoa, rễ, cuống lá [4] Lá non chứa nhiều hoạt chất (0,84% hơn lá mọc thành hình hoa thị ở mặt đất (0,38%) Hoa actiso chứa cacbon hydrat (16%), inulin protein (3,6% , chất vô cơ (1,8%), dầu éo (0,1% , P (0,10%), Fe (2,3 mg/100g), Ca (0,12%), caroten

Trang 22

(60 unit/100 g tính ra Vitamin A) Thân và lá còn chứa muối hữu cơ của các kim loại K, Ca, Mg, Na Hàm lượng Kali rất cao Hoa actiso n rất tốt cho sức khỏe, thành phần của hoa chứa khoảng 9,3% cac ohydrat, 1,5% chất xơ, rất ít chất éo và protein N ng lượng cung cấp chỉ khoảng 40 đến 50 kcal nhưng rất giàu vitamin và chất khoáng như K, P, Ca, Na, S và Mg Rễ gần như không có dẫn chất của acid caffeic, ao gồm cả acid clorogenic và sesquiterpen lacton

1.1.5 ông d ng c a cây actiso

 Ng n ngừa ệnh ung thư: Các chất chống oxy hóa có khả n ng làm giảm nguy cơ ung thư vú, ung thư tuyến tiền liệt và ệnh ạch cầu Actiso có hàm lượng quercetin, polyphenol, flavonoid và rutin cao nên có khả n ng chống oxy hoá cao

 Cải thiện hoạt động của hệ tim mạch: Ngoài khả n ng chống ung thư, actiso cũng được xem là một thực phẩm ổ sung tốt cho hoạt động của tim Một số thành phần trong lá của actiso có khả n ng làm giảm cholesterol xấu (LDL - lipoprotein cholesterol tỷ trọng thấp và t ng cholesterol tốt (HDL - lipoprotein cholesterol tỷ trọng cao hoặc acid béo omega - 3) nhằm cải thiện hoạt động của hệ tim mạch

 Kiểm soát huyết áp: Actiso giàu kali giúp trung hòa natri dư thừa, có tác dụng làm giảm huyết áp Bệnh nhân ị tiểu đường cũng được khuyến khích n actiso để làm giảm các iến chứng liên quan đến cao huyết áp và tiểu đường  Cải thiện sức khỏe gan: Actiso được sử dụng làm dược liệu ổ gan, do trong

actiso có chứa hai chất chống oxy hóa là cynarin và silymarin có tác dụng làm giảm các độc tố trong gan và tạo điều kiện để gan loại ỏ chúng khỏi cơ thể  T ng cường chuyển động ruột: Actiso có nhiều chất xơ và chất dinh dưỡng

tốt cho việc cải thiện sức khỏe và chức n ng của ộ máy tiêu hóa Việc thêm chất xơ trong thức n có tác dụng làm giảm hiện tượng táo bón Ngoài ra, chất xơ giúp làm giảm nguy cơ ung thư dạ dày và ruột

Trang 23

 Đối với chứng đau đầu, uồn nôn: Actiso có thể làm hạn chế tắc nghẽn mạch máu, giúp loại ỏ độc tố trong máu nhanh chóng Sau khi uống rượu bia, nhai actiso sẽ giúp cơ thể cảm thấy thoái mái, đỡ đau đầu vào sáng hôm sau

 T ng mật độ khoáng xương: Actiso rất giàu vitamin và khoáng chất như photpho, magie và mangan, đây là những khoáng chất có tác dụng t ng cường sức khỏe và mật độ xương, từ đó làm giảm nguy cơ loãng xương

 T ng cường trao đổi chất: Mangan và magie là hai nguyên tố cần thiết trong quá trình trao đổi chất của cơ thể và các nguyên tố này hiện diện đáng kể trong actiso Magie là nguyên tố quan trọng trong quá trình tổng hợp protein, cũng như tạo điều kiện thuận lợi cho việc hấp thụ canxi của cơ thể, làm cho xương chắc và khoẻ Mangan ảnh hưởng đến khả n ng trao đổi cholesterol, cacbohydrat và acid amin của cơ thể

 Cải thiện chức n ng não: Actiso có tác dụng làm giãn mạch máu, từ đó cho phép nhiều oxy đến não hơn Ngoài ra, photpho là một khoáng chất có trong actiso và cũng hiện diện trong các tế ào não Thiếu photpho có thể làm suy giảm khả n ng nhận thức [1, 2].

1.2 Hoạt chất cynarin và acid chlorogenic

1.2.1 Tính ch t và công d ng c a cynarin

Trong lá cây actiso có glucosid, là phức hợp của các nguyên tố như canxi, magie, kali, natri Đây là một chất kết tinh được gọi là cynarin, có công thức C25H24O12.H2O là đi ester giữa hai phân tử acid caffeic và một phân tử acid quinic Tên IUPAC (1R,3R,4S,5R)-1,3-Bis[[(E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy]-4,5-dihydroxycyclohexane -1-carboxylic acid Cynarin còn được gọi là acid 1,5-dicaffeoylquinic,cinarin, cinarine

 Khối lượng phân tử: 516,4 g mol Nhiệt độ sôi 225 – 227 o

Trang 24

 Cynarin là một acid yếu, có màu vàng trong dung dịch kiềm và không ền Cynarin tham gia phản ứng khử ạc nitrat trong dung dịch amoniac [5] và fleric flericyanid Cynarin phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocalteau tạo hợp chất màu xanh, thuốc thử này phản ứng tạo màu với dẫn chất o-

dihydroxyphenol [6]

Hình 1.2 Cấu trúc phân tử cynarin

 Cynarin là một trong những thành phần thực phẩm chức n ng có hoạt tính sinh học, tác dụng tiềm tàng đối với ệnh sỏi đường mật, ảo vệ gan, chống HIV, chống tiểu đường, chống ung thư và hoạt động điều hoà miễn dịch [7] Cynarin có hoạt tính chống oxy hóa [8] và gây ra hiệu ứng ức chế miễn dịch [9]

 Các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng cynarin có thể có khả n ng đóng vai trò tác nhân hóa trị ằng cách đảo ngược kháng đa thuốc qua trung gian P-glycoprotein [10]; nhưng nó cũng có thể gây ra tương tác thuốc ằng cách ức chế các chất vận chuyển anion hữu cơ [11]

 Cynarin cùng với nguồn dưỡng chất dồi dào từ hoa, quả và lá actiso, có tác dụng hạ cholesterol và urê trong máu, tạo mật, t ng tiết mật, lợi tiểu, thường được làm thuốc thông mật, thông tiểu tiện, chống xơ vữa động mạch, chữa các chứng ệnh về tim mạch và thận Bên cạnh đó, cynarin còn có vai trò

Trang 25

quan trọng ảo vệ gan khỏi các chứng ệnh như suy giảm chức n ng gan, suy gan mãn tính, viêm gan [12, 13]

 Theo nghiên cứu của Ning Xia và cộng sự (2014 , cynarin có vai trò ức chế hiệu ứng sinh nitơ oxid (NO trong các tế ào cơ trơn mạch máu Tuy nhiên, tiềm n ng điều trị của cynarin cần được kiểm chứng trong các nghiên cứu tương lai [14]

 Các nghiên cứu trên động vật cho thấy chiết xuất từ actiso làm t ng hàm lượg superoxide effutase, catalase, glutathione khử và glutathione oxi hoá trong gan, đồng thời làm giảm nồng độ malondialdehyd trong gan và huyết tương của nhóm động vật mắc ệnh một cách đáng kể so với nhóm so sánh [15]  Một tác dụng khác của hoạt chất cynarin là được sử dụng trong ẩm thực như

một chất tạo vị Nếu nếm thử cynarin sẽ thấy có vị đắng nhẹ, nhưng khi kết hợp với n hay uống một món khác, thì vị của món n, thức uống kia sẽ trở nên ngọt hơn Thậm chí nếu trước đó nếm cynarin thì khi uống nước lọc cũng sẽ có cảm giác ngọt như pha thêm đường Chính vì đặc tính này, cynarin được sử dụng để tạo vị ngọt cho món n khi không muốn sử dụng đường hay mật ong Cynarin còn được sử dụng rộng rãi trong thực đơn dành cho người n kiêng hoặc người ị tiểu đường

1.2.2 Tính ch t và công d ng c a acid chlorogenic

Acid chlorogenic là ester của acid caffeic và nhóm OH thứ a của acid L-quinic, có công thức phân tử C16H18O9 [16] Tên IUPAC: acid (1S,3R,4R,5R)-3-[[(2E)-3-(3,4-dihydroxyphenyl)prop-2-enoyl]oxy]-1,4,5-trihydroxycyclohexanecarboxylic Tên gọi khác 3-(3,4-Dihydroxycinnamoyl)quinate, acid 3-Caffeoylquinic, acid 3-O-Caffeoylquinic, Chlorogenate, acid 3-trans-Caffeoylquinic

Khối lượng phân tử 354,31 g/mol Nhiệt độ sôi 205-209 o

C

Acid chlorogenic có thể được tìm thấy trong actiso, tre Phyllostachys edulis [17], chồi của cây thạch thảo (Calluna Vulgaris) [18] Ngoài ra acid chlorogenic còn có trong thịt của cà tím [19], đào [20], mận khô [21] và hạt cà phê, … [22]

Trang 26

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử acid chlorogenic

Acid chlorogenic được sử dụng như một chất ổ sung trong chế độ n uống hoặc trong cà phê, acid chlorogenic làm giảm nhẹ huyết áp [23, 24] Ngoài ra, hoạt chất này đã được nghiên cứu cho thấy có tác dụng chống viêm [25] Acid chlorogenic đã được nghiên cứu như một chất có khả n ng chống dị ứng đường hô hấp [26]

Acid chlorogenic có tính kháng ung thư, có khả n ng kháng oxi hóa, chống ệnh béo phì và chống lại ệnh co giật Một nghiên cứu mới đây cho thấy acid chlorogenic thể hiện tác dụng có lợi đối với Hội chứng chuyển hóa (Meta olic syndrome Hội chứng chuyển hoá là tổng hợp của các yếu tố sinh lý, lâm sàng, hóa sinh và hội chứng này làm t ng khả n ng mắc các ệnh về tim mạch và ệnh tiểu đường type 2 Các triệu chứng của hội chứng này ao gồm những rối loạn chuyển hóa lipid trong máu (ch ng hạn làm t ng hàm lượng cholesterol tổng trong máu, t ng hàm lượng triglycerid, hàm lượng LDL-cholesterol, làm giảm hàm lượng HDL-cholesterol), gây ra tình trạng huyết áp cao, làm t ng lượng đường trong máu, dễ gây viêm, gây nên tình trạng gan nhiễm mỡ và trạng thái ngưng thở khi ngủ Hội chứng này được xem như là hội chứng mang tính chất toàn cầu vì số lượng người mắc ngày càng t ng trong tất cả nhóm người, kể cả thanh niên và trẻ em [27]

Thử nghiệm cũng cho thấy acid chlorogenic có khả n ng kháng lại một loạt các sinh vật, ao gồm: Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc, vi rut và amip Những đặc tính kháng khuẩn này có thể được sử dụng trong ngành công nghiệp thực phẩm để ảo quản các sản phẩm chế iến từ thực phẩm [27]

Trang 27

1.2.3 Phương pháp phân tích cynarin và acid chlorogenic

Lá actiso được sấy khô và nghiền thành ột; thêm dịch chiết là hỗn hợp methanol nước (80:20; v:v), để trong a ngày thỉnh thoảng lắc nhẹ Dịch lọc được cho ay hơi trong chân không, ở 40 oC còn khoảng 200 mL Dịch chiết được lắc với n – butanol sau đó được đông khô Cynarin và acid chlorogenic được phân tích trên HPLC với các điều kiện như sau: Sử dụng cột C18, pha động gồm nước:methanol: acid acetic tỉ lệ 78,5: 20: 2,5; v/v Tốc độ pha động 1,3 ml/phút Đầu dò được cài đặt ở ước sóng hấp thu 316 nm Thời gian lưu của cynarin và acid chlorogenic trên sắc ký đồ lần lượt là 4,783 và 5,467 phút [28]

Một nghiên cứu khác phân tích acid chlorogenic như sau: Lá actiso được sấy khô, nghiền thành ột Thêm hỗn hợp methanol:nước với tỉ lệ 70:30; v/v, sau đó siêu âm trong thời gian 30 phút Phần dịch chiết được lọc qua màng lọc 0,45 m và được phân tích trên HPLC, cột C 18 Pha động 0,2% acid photphoric trong nước (A : acetonitril (B), sử dụng chế độ gradient nồng độ qua hai ước Ban đầu, tỉ lệ A : B là 94: 6; v/v, đến phút thứ 15, tỉ lệ A: B thay đổi thành 82:18; v v Tốc độ dòng pha động là 0,5 mL phút Nhiệt độ cột được duy trì ở 40 °C Acid chlorogenic được phát hiện ằng dầu dò DAD ở ước sóng 330 nm [29]

Ngoài ra, theo nghiên cứu của Kulza M và cộng sự, cynarin được chiết từ lá actiso ằng ethyl acetat theo kỹ thuật chiết lỏng – lỏng sau đó được tách ằng HPLC-DAD, sử dụng cột C18, pha động 0,05% acid trifluoroacetic trong nước và methanol Đầu dò đặt ở ước sóng 330 nm Khoảng tuyến tính 1,5625 - 50,0 mg/L Giới hạn phát hiện của cynarin 0,75 µg/L và giới hạn định lượng là 2,25 µg/L Hiệu suất thu hồi là 67% [30]

Nghiên cứu của Mulinacci N và cộng sự phân tích cynarin theo phương pháp HPLC-DAD và HPLC-MS: Lá actiso được sấy khô và nghiền thành ột Cynarin trong ột được chiết ằng MeOH/H2O 1: 1; v v Dịch chiết được lọc rồi phân tích trực tiếp ằng HPLC-DAD và HPLC MS Pha động đặt ở chế độ gradient nồng độ với hai dung môi: (A H2O (chỉnh pH = 2,4 ằng HCOOH và (B : CH3CN Tỉ lệ

Trang 28

92% A và 8% B, sau đó chuyển thành 30% A và 70% B trong 50 phút Tốc độ dòng 0,4 ml/phút Đối với HPLC-DAD, bước sóng đầu dò đặt ở 326 nm Đối với HPLC, phổ MS dương: Nhiệt độ mao quản 220 oC, điện áp mao quản 3,0 V, điện áp nguồn 4,2 kV điện áp ống kính 30 V và n ng lượng va chạm 35% Phổ MS âm với nhiệt độ mao quản 350 oC và điện áp mao quản 3500 V Điện thế các mảnh khối phổ trong khoảng 80 – 180 V [31]

1.2.4 Ứng d ng c a cynarin và acid chlorogenic

Hiện nay, có khá nhiều nghiên cứu về tác dụng của cynarin và acid chlorogenic được trích ly hoặc phân lập từ cây actiso Có thể kể đến những ứng dụng như khả n ng kháng tiểu đường và kháng oxi hoá

1.2.4.1 Hoạt tính kh ng o i ho của cynarin và acid chlorogenic

a S tạo thành g c t do và khả năng ảnh h ng đ i với cơ thể sinh vật

Trong cơ thể sống luôn xảy ra các phản ứng oxy hóa – khử, những phản ứng này gắn liền với quá trình trao đổi chất, trao đổi n ng lượng của tế ào Các phản ứng oxy hóa – khử thường sinh ra các dạng oxy hoạt động ao gồm gốc superoxide (O2), hydro peroxid (H2O2), và gốc hydroxyl (HO) Ngoài ra, các gốc tự do còn sinh ra ởi các nguyên nhân ên ngoài như tia UV, chất kích thích sinh trưởng, chất ảo quản thực phẩm, chất thải công nghiệp… Các ion kim loại chuyển tiếp (Cu2+, Fe2+ … xúc tác cho phản ứng tạo gốc hydroxyl từ superoxide và hydro peroxide thông qua phản ứng Fenton:

Trang 29

 Phản ứng với protein: Các gốc tự do tấn công các acid amin là thành phần chính của protein Khi protein ị oxi hoá sẽ ảnh hưởng đến sự thay đổi của cơ chế dẫn truyền tín hiệu, hoạt động của enzyme gây nên sự lão hóa [32]

 Tác động đến vật liệu di truyền: Các gốc tự do tấn công acid nucleic (RNA và DNA , do đó ảnh hưởng đến chức n ng sao chép của các tế ào, gây ra sự iến dạng trong chức n ng di truyền Đây là ước đầu tiên trong sự phát triển của ung thư [32]

 Phá hủy lysosome: Lysosome là một ào quan của các tế ào nhân thực Lysosome chứa các enzyme thủy phân các đại phân tử Khi lysosome ị phá hủy, các enzyme được giải phóng làm cho tế ào ị phá hủy Khi đó dẫn đến một số ệnh lý như ệnh Tay-Sachs, hay rối loạn chuyển hóa thể tiêu ào [33]

b hả năng kh ng o i ho của cynarin và acid chlorogenic

Các nghiên cứu in vitro và in vivo của Gebhardt đã chứng minh khả n ng chống oxy hóa, chống lại tổn thương tế ào gan gây ra do nhiều loại độc tố gan của chiết xuất từ cây actiso [34]

Nghiên cứu của Lattanzio và cộng sự cho thấy chiết xuất từ actiso và một số thành phần phenol tinh khiết của dịch chiết có khả n ng kiểm soát nguy hại của gốc oxy hóa (RCOO• hoặc OH•) đối với các phân tử sinh học (protein, lipid và DNA [35] Một nghiên cứu khác cho thấy các nhóm hydroxyl trên vòng thơm của các hợp chất phenolic có khả n ng chống oxy hóa Khi số lượng các nhóm hydroxyl càng nhiều thì khả n ng chống oxy hóa cao hơn Ngoài ra, nhóm hydroxyl thứ hai nếu ở vị trí orto hoặc para càng làm t ng khả n ng chống oxy hóa Cynarin có cả hai đặc điểm này nên cynarin có khả n ng chống oxy hóa cao hơn so với các hợp chất khác như như acid chlorogenic, acid 1-caffeoylquinic, cynaroside, luteolin rutinoside, apigenin rutinoside trong actiso [36]

Nghiên cứu của Jun và cộng sự đã chỉ ra rằng cynarin có hoạt tính chống oxy hóa mạnh đối với các gốc tự do như: DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) và ABTS

Trang 30

[acid 2,2'-azino-bis (3- thylbenzothiazoline-6-sulfonic)] Cynarin cũng ức chế quá trình oxy hóa acid linoleic, loại ỏ các gốc tự do hydroxyl và anion superoxid [37] Một nghiên cứu khác trên các tế ào 3T3, cynarin với nồng độ 51 µM ức chế oxy hóa 75% ion Fe 2+ và thí nghiệm khác cho thấy cynarin 45 µM ức chế 72% oxy hóa stress gây ra ởi AAPH [2,20-azobis (2-amidinopropane) dehydrochloride ] [38] Theo nghiên cứu trong phòng thí nghiệm của Erfan, các hợp chất chiết xuất từ actiso thể hiện tác dụng chống oxy hoá qua thí nghiệm hình thành methemoglobin từ natri nitrit Cả cynarin và acid chlorogenic đều cho thấy tác dụng chống oxy hóa tốt so với nhóm đối chứng, nhưng cynarin có khả n ng kháng oxi hoá tốt hơn acid chlorogenic Kết quả này có thể được giải thích như sau: Trong cấu trúc cynarin có hai phân tử acid caffeic, mỗi phân tử có hai nhóm hydroxyl, hai phân tử acid caffeic này gắn với hợp chất acid quinin, nên có thể làm ổn định điện tích dương ằng cách chuyển dịch cộng hưởng điện tử, trong khi trong acid chlorogenic chỉ có một phân tử acid caffeic nên khả n ng chuyển dịch cộng hưởng kém hơn [39]

1.2.4.2 Hoạt tính kh ng khuẩn của cynarin và acid chlorogenic a h i niệm v vi khuẩn

Vi khuẩn hay vi trùng, là một nhóm vi sinh vật thuộc nhóm nhân sơ đơn ào Vi khuẩn có cấu trúc tế ào đơn giản, thường không có nhân, bộ khung tế ào và các bào quan như ty thể và lục lạp, kích thước vi khuẩn rất nhỏ, thường chỉ vào khoảng 0,5 - 5,0 μm Vi khuẩn có thể xuất hiện ở khắp mọi nơi như đất, nước, kể cả trong chất thải phóng xạ, trong suối nước nóng Chúng có thể tồn tại ở dạng ký sinh hoặc cộng sinh với các loài sinh vật khác Vi khuẩn có thể sống trong mọi loại hình khí hậu khác nhau

Tuỳ theo loài mà vi khuẩn có thể có ích hoặc có thể có hại cho môi trường sống và gây hại cho động vật, kể cả đối với con người Vi khuẩn có hại là tác nhân gây ra các ệnh như sốt thương hàn, uốn ván, tả, lao, giang mai, Ở thực vật, vi khuẩn gây mụn lá, héo cây, Tuy nhiên, một số loài vi khuẩn có lợi sống trong nốt rễ các cây họ đậu có khả n ng cố định đạm ằng các enzyme của chính mình và iến nitơ

Trang 31

thành amoniac hoặc các hợp chất của nitơ Nhiều loại vi khuẩn có lợi sống cộng sinh trong cơ thể người và các sinh vật khác, giúp ng n cản sự phát triển của các vi sinh vật có hại Một số loài vi khuẩn khác có khả n ng phân giải các hợp chất hữu cơ, giúp làm sạch môi trường Một số vi khuẩn được sử dụng cùng với nấm men để chế iến các thực phẩm lên men như phô-mai, nước tương, dưa chua, dưa cải, rượu, giấm và sữa chua

Trong luận v n này a loại vi khuẩn được nghiên cứu ao gồm: Escherichia coli, Bacillus cereus, Pseudomonas aeroginosa

 Escherichia coli

Hình 1.4 Vi khuẩn Escherichia coli

Escherichia coli (viết tắt: E coli) hay còn gọi trực khuẩn lị, nó là một loài vi

khuẩn Gram âm, thuộc giới Bacteria, ngành Proteo acteria, lớp

Gammaroteo acteria, ộ Entero acteriales, họ Entero acteriaceae, chi Escherichia, loài E.coli Kích thước trung bình từ 2–3 µm x 0,5 µm Loài này có thể phát triển ở nhiệt độ từ 5 – 40 °C, nhiệt độ thích hợp nhất là khoảng 37 °C E.coli phân

ố nhiều nơi trong môi trường sống ở trên Trái Đất Loài này có mặt mọi nơi như trong thực phẩm, trong nguồn nước, sống kí sinh trong ruột già của người và đa số

Trang 32

các loài thú [40] Phần lớn các chủng E coli là vô hại mặc dù sống kí sinh, nhưng một số dòng E coli có thể gây ngộ độc thức n, gây ra các ệnh đường ruột như tiêu

chảy, nhiễm khuẩn huyết, nhiễm khuẩn đường tiểu [41] Trong một số trường hợp nhất định, loài này giúp vật chủ sản xuất vitamin K [42], và chống lại sự xâm lấn của các mầm ệnh khác, tạo nên một mối quan hệ cộng sinh [43]

 Bacillus cereus

Bacillus cereus là vi khuẩn Gram dương, có dạng hình que, có khả n ng sinh ào tử,

thuộc loại vi khuẩn hiếu khí Thuộc giới Bacteria, ngành Firmicutes, lớp Bacilli, ộ

Bacillales, họ Bacillaceae, chi Bacillus, loài B cereus Kích thước B cereus trong

khoảng từ 0,5–1,5 x 2–4 µm Vi khuẩn tồn tại ở nhiệt độ 5–50 oC, tối ưu ở nhiệt độ 35–40 oC, pH 4,5–9,3, sống thích hợp trong khoảng pH 7–7,2 Một số chủng vi

khuẩn B cereus có lợi cho hệ vi sinh vật sống trong đường ruột của động vật, trong khi một số chủng lại có khả n ng gây ra ngộ độc thực phẩm Một nghiên cứu gần

đây cho thấy vi khuẩn này sản xuất ra một loại chất độc gây uồn nôn và ói mửa ở người Tùy thuộc vào độc tố phát tán do vi khuẩn, ệnh nhân có thể xuất hiện các triệu chứng như tiêu chảy hoặc nôn mửa

Hình 1.5 Vi khuẩn Bacillus cereus  Pseudomonas aeroginosa

Pseudomonas aeruginosa còn được gọi là Trực khuẩn mủ xanh, là một vi khuẩn có

hại, gây ệnh cho con người và động vật Thuộc giới Bacteria, ngành

Trang 33

Proteobacteria, lớp Gamma Proteobacteria, ộ Pseudomonadales, họ

Pseudomonadaceae, chi Pseudomonas, loài Pseudomonas aeruginosa Vi khuẩn này

có thể phát triển ở nhiệt độ 30–37 oC, pH 7,0–7,2 Nó có thể tồn tại trong đất, nước, trong hệ vi sinh vật trên da và ngay cả trong các môi trường nhân tạo Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường không khí ình thường và chúng còn có thể sống trong môi trường có ít khí oxy

Hình 1.6 Vi khuẩn Pseudomonas aeroginosa

Vi khuẩn lây nhiễm vào cơ thể của người ị suy giảm hệ miễn dịch và làm phá hủy các mô Triệu chứng chung của ệnh này là gây ra viêm nhiễm và nhiễm trùng đường huyết Nguy hiểm hơn, vi khuẩn này có khả n ng gây ra hậu quả chết người nếu chúng xâm nhập vào các cơ quan thiết yếu của cơ thể như phổi, đường tiết niệu, và thận [44]

b hả năng kh ng khuẩn của cynarin và acid chlorogenic

Các loại khuẩn Staphylococcus aureus, Bacillus cereus, E coli, Pseudomonas aeruginosa và nấm Candida albicans đã được sử dụng trong nghiên cứu kháng sinh

in vitro ằng phương pháp khuếch tán đ a Kết quả cho thấy các hoạt chất cynarin và acid chlorogenic có khả n ng kháng nấm và khuẩn khác nhau đối với các vi sinh vật đang được nghiên cứu Cynarin ở nồng độ (12,5 và 25 mg mL không có hoạt

tính kháng sinh đối với toàn ộ vi sinh vật được thử nghiệm ngoại trừ P

Trang 34

aeruginosa Cynarin có hoạt tính kháng nấm, nhưng nó hoàn toàn không có khả n ng chống lại khuẩn S aureus Acid chlorogenic nồng độ 12,5 mg mL không có khả n ng kháng khuẩn B cereus và P aeroginosa, trong khi ở nồng độ 25, 50, 100,

200 mg/mL có khả n ng chống lại tất cả các vi khuẩn nghiên cứu Về khả n ng

kháng nấm, acid chorogenic không có hoạt tính kháng C albicans ở ất kỳ nồng độ

thí nghiệm Nhìn chung, cynarin có khả n ng kháng khuẩn và nấm nhưng không

kháng S aureus Ngược lại, acid chorogenic có khả n ng kháng S aureus nhưng không có tác dụng kháng nấm Cả hai đều cho thấy tác dụng kháng khuẩn E coli

[39]

Về khả n ng kháng khuẩn và kháng nấm, nghiên cứu cho thấy acid chlorogenic (và các hợp chất liên quan gắn vào bên ngoài màng tế ào, phá hủy màng, làm giảm tiềm n ng nội ào, mất các đại phân tử tế ào chất, dẫn đến chết tế ào [45]

1.3 Các phương pháp tr ch ly

Trích ly hoạt chất sinh học từ các loại dược liệu thiên nhiên là ước đầu tiên trong nghiên cứu cũng như trong ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm và thực phẩm Hiện nay, có rất nhiều phương pháp trích ly khác nhau từ cổ điển đến hiện đại Đó là các phương pháp ngâm trích ly ằng dung môi hữu cơ không sử dụng nhiệt (ngấm kiệt hoặc sử dụng nhiệt (trích ly Soxhlet , trích ly ằng nước nóng, siêu âm, vi sóng, enzyme, chất lỏng siêu tới hạn,… Mỗi phương pháp có ưu điểm và nhược điểm nhất định

1.3.1 Phương pháp ng m kiệt

ị, dược liệu được ngâm vào dung môi ở trong ình ngấm kiệt có vòi ở phía dưới đáy ình Sau một khoảng thời gian phù hợp, tuỳ thuộc vào từng loại dược liệu, người ta mở vòi xả để thu được từ từ dịch chiết ở phía dưới ình chiết, đồng thời, cho dung môi chảy rất chậm và liên tục qua lớp dược liệu nằm yên (không được khuấy trộn để ổ sung thêm dung môi vào phía trên lớp dược liệu Lớp dung môi trong ình chiết phải đảm ảo ngập cách ề mặt lớp dược liệu khoảng 3 đến 4 cm

Trang 35

Phương pháp ngấm kiệt được phân loại thành phương pháp ngấm kiệt đơn giản và phương pháp ngấm kiệt phân đoạn Trong phương pháp ngấm kiệt đơn giản, người ta sử dụng dung môi mới để chiết đến hết hoạt chất có trong dược liệu và ở phương pháp ngấm kiệt phân đoạn, người ta sử dụng dịch chiết nồng độ loãng để chiết mẻ dược liệu mới nhằm tận dụng dung môi chiết

 Ưu điểm: Dược liệu được chiết đến kiệt, tiết kiệm được dung môi

 Nhược điểm: N ng suất chiết thấp, tiến hành thủ công, cách thực hiện phức tạp hơn so với phương pháp ngâm - ngấm kiệt đơn giản

Hình 1.7 Bình trích ngấm kiệt

1.3.2 Phương pháp chiết Soxhlet

Soxhlet là phương pháp trích nóng liên tục Dược liệu chứa trong túi xi-phong và đặt trực tiếp trong ống chứa mẫu Dung môi được đun hồi lưu từ ình cầu phía dưới Hơi dung môi ngưng tụ xuống ống chứa mẫu nhờ hệ thống nước làm mát, tích tụ trong ng n trích để hoà tan chất trong dược liệu Khi lượng dung môi tích tụ vượt qua mức, sẽ tràn qua ống xi phông xuống ình cầu mang theo chất hòa tan Từ đó, dịch trích thu được ở dưới ình cầu, quá trình cứ lặp lại cho đến khi dược liệu được trích kiệt Hình 1.8 mô tả sơ đồ hoạt động của thiết ị trích Soxhlet

Trang 36

 Ưu điểm: Chiết liên tục, tự động và trích kiệt hoạt chất

 Nhược điểm: Thời gian trích ly dài, chất hòa tan tiếp xúc với nhiệt liên tục nên không thích hợp để trích ly các hợp chất kém bền nhiệt, trích ở quy mô nhỏ

Hình 1.8 Sơ đồ hệ thống trích Soxhlet

1.3.3 Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng (microwave-assisted extraction)

Vi sóng là sóng điện từ được lan truyền với vận tốc ánh sáng Hầu hết các lò vi sóng gia dụng sử dụng tần số 2450 MHz và ước sóng tương ứng là λ = 12,24 cm Sự đun nóng ằng vi sóng là quá trình làm t ng nhiệt độ vật chất một cách đặc iệt Nhiệt được gia t ng do ma sát ngay từ bên trong vật chất gây ra bởi tương tác giữa các các phân tử và điện trường xoay chiều có tần số rất cao Sự đun nóng ởi vi sóng rất chọn lọc, trực tiếp và nhanh nhóng đối với các hợp chất có độ phân cực cao Nước là dung môi phân cực mạnh nên nước thường được dùng nhiều trong phương pháp chiết hỗ trợ vi sóng Phương pháp trích ly có hỗ trợ vi sóng thường được kết hợp với trích ly hồi lưu như thể hiện trên hình 1.9

Trang 37

Hình 1.9 Sơ đồ hệ thống trích ly hồi lưu có hỗ trợ vi sóng

 Ưu điểm: Sản phẩm trích ly chất lượng tốt, thiết bị trích ly dễ sử dụng, an toàn, sử dụng dung môi thân thiện môi trường và thời gian trích ly ngắn  Nhược điểm: Không áp dụng trích ly các phân tử không phân cực, khó áp

dụng cho quy mô công nghiệp vì đầu tư cho thiết bị tạo vi sóng là không nhỏ để có đủ công suất

1.3.4 Phương pháp trích ly có hỗ trợ siêu âm (ultrasound-assisted extraction)

Hình 1.10 Sơ đồ hệ thống trích ly có hỗ trợ siêu âm

Siêu âm là sóng cơ học được hình thành do sự lan truyền dao động của các phần tử trong không gian Những sóng siêu âm này có tần số sóng âm lớn hơn giới hạn ngưỡng nghe của con người (tần số sóng âm mà con người nghe được trong khoảng

Trang 38

16-20 kHz) Bản chất của sóng siêu âm là sóng dọc, ngh a là các phần tử có phương dao động cùng với phương truyền sóng trong trường siêu âm

Sóng siêu âm sử dụng trong trích ly hoạt chất từ dược liệu có a tác động sau:

 Rung: Khi sóng siêu âm tác động lên các mô gây ra chuyển động giống như được rung hoặc như lắc nhẹ

 Nhiệt: Sóng siêu âm tác động lên các phân tử trong môi trường, làm cho chúng chuyển động nhanh hơn, từ đó sinh ra nhiệt

 Sự tạo và vỡ ọt: Trong trường siêu âm, dưới tác dụng của sóng siêu âm tạo ra một n ng lượng rất lớn gây nên hiện tượng vật lý là tạo ọt và vỡ ọt của dung môi chiết suất Như vậy sóng siêu âm làm cho các phân tử dung môi tại các hốc ề mặt dược liệu ị sủi ọt, các hạt bọt li ti này nhanh chóng ị vỡ tạo ra sóng xung kích rất mạnh tác động vào dược liệu để đẩy chất cần chiết ra khỏi ề mặt dược liệu, hoà tan vào dung môi nhằm t ng hiệu quả trích ly  Ưu điểm: Trích ly hoạt chất thiên nhiên bằng phương pháp siêu âm cho sản

phẩm có chất lượng tốt hơn, giúp hoạt chất khuếch tán vào dung môi tốt hơn, giảm thời gian trích ly

 Nhược điểm: Chi phí đầu tư thiết bị khá tốn kém, siêu âm gây tiếng ồn, và sóng siêu âm gây ảnh hưởng đến sức khỏe người nghiên cứu

1.3.5 Phương pháp trích ly bằng lưu ch t siêu tới hạn (supercritical fluid extraction)

Trong phương pháp này, người ta sử dụng cacbon dioxid siêu tới hạn thay thế các dung môi truyền thống để tách chiết hoạt chất từ các sản phẩm thiên nhiên Khi một chất khí được nén đến áp suất đủ lớn, chúng sẽ hoá lỏng Tuy nhiên, trong trường hợp đặc iệt, ở một điều kiện áp suất phù hợp, nếu người ta t ng nhiệt độ thì chất lỏng không chuyển sang trạng thái khí mà chuyển sang một trạng thái đặc iệt gọi là trạng thái siêu tới hạn Ở trạng thái siêu tới hạn, không có sự phân iệt rõ ràng giữa trạng thái lỏng và khí Trạng thái siêu tới hạn của khí cac on dioxid là ở nhiệt độ 304,1 K và áp suất 72,8 atm Do đó, sử dụng cac on dioxid ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết sẽ có nhiều lợi thế, nhất là nhiệt độ chiết thấp và khả n ng ay

Trang 39

hơi của cac on dioxid làm cho sản phẩm chiết tinh khiết hơn Đối với việc trích ly các hợp chất tự nhiên như tinh dầu, chất thơm, chất màu, là những chất kém ền đối với các tác nhân vật lý như nhiệt độ, ánh sáng và đòi hỏi tinh chế sạch trong quá trình sản xuất, thì sử dụng cac on dioxid ở trạng thái siêu tới hạn làm dung môi chiết là một lựa chọn tối ưu

Hình 1.11 Sơ đồ hệ thống trích ly ằng cac on dioxid siêu tới hạn

Mẫu dược liệu được đặt vào bình chứa mẫu ở nhiệt độ phòng Cho dòngkhí cacbon dioxid vào để đuổi hết không khí ra khỏi bình chứa Điều chỉnh nhiệt độ mong muốn và chỉnh áp suất đến khoảng 300 bar Lúc này, dòng cacbon dioxidtrở thành dòng lỏng siêu tới hạn, dòng này tiếp xúc với dược liệu trong bình chứa, hoà tan các chất cần chiết Sau đó, dịch trích được đưa đến ình tách sản phẩm Tiến hành thay đổi nhiệt độ và áp suất để hoá khí cac on dioxid, thu được sản phẩm Dòng khí cacbon dioxid ay ra được nén lạnh để đưa về dạng lỏng, tiếp tục đưa đến ình mẫu để thực hiện quá trình trích ly

 Ưu điểm: Cacbon dioxid có giá thành thấp, không độc hại, an toàn cháy nổ, độ nhớt thấp, khả n ng khuếch tán cao Đặc biệt, sử dụng cacbon dioxid dễ dàng thu hồi dung môi sau khi trích ly Mặt khác, cacbon dioxid là hợp chất không phân cực nên chỉ có thể hòa tan các chất không hoặc kém phân cực Vì vậy, để có thể hòa tan các chất phân cực, phương pháp này còn có thể kết hợp

Trang 40

giữa cacbon dioxid và các chất phân cực để t ng khả n ng phân cực của lưu chất siêu tới hạn

 Nhược điểm: Hạn chế của phương pháp CO2 siêu tới hạn là chi phí đầu tư thiết bị đắt tiền, chỉ thực hiện ở quy mô phòng thí nghiệm

1.3.6 Phương pháp trích ly có hỗ trợ enzyme (enzyme-assisted extraction)

1.3.6.1 h i niệm v en yme

 Trong cơ thể của sinh vật, nhờ có sự hiện diện của các chất xúc tác sinh học được gọi chung là enzyme nên các phản ứng hóa học diễn ra với hiệu suất rất cao, mặc dù các phản ứng này được thực hiện ở điều kiện ình thường về nhiệt độ, áp suất, pH Enzyme hay còn gọi là men là những chất xúc tác sinh học do tế ào sống sản xuất, có thành phần cơ ản là protein Enzyme có khả n ng tiếp xúc và tạo phức với cơ chất nhờ sự phù hợp cấu hình không gian và sự phù hợp của các nhóm chức làm giảm n ng lượng hoạt hóa đầu vào của phản ứng Vì enzyme đóng vai trò xúc tác nên được ảo toàn sau phản ứng

Các phản ứng sinh hóa xảy ra trong cơ thể có 6 loại và các enzyme xúc tác cho các phản ứng này được đặt tên tương ứng:

 Nhóm enzyme chịu trách nhiệm xúc tác cho phản ứng oxy hoá - khử: Những enzyme này xác tác cho các phản ứng oxy hóa và khử Khi một chất nền đang ị oxy hóa, các enzyme này đóng vai trò là chất cho hydro và được gọi là dehydrogenase hoặc reductase Khi nguyên tử oxy là chất nhận, các enzyme này được gọi là oxyase

 Nhóm enzyme vận chuyển: Các enzyme nhóm này chịu trách nhiệm chuyển các nhóm chức từ phân tử này sang phân tử khác Ví dụ: alanine aminotransferase chịu trách nhiệm chuyển nhóm alpha amino giữa alanine và aspartate, v.v Một số chất chuyển cũng chuyển các nhóm photphat giữa ATP và các hợp chất khác

 Nhóm enzyme chịu trách nhiệm xúc tác cho phản ứng thuỷ phân: Những enzyme này xúc tác cho các phản ứng thủy phân Một số enzyme thuỷ phân