ĐOÀN THỊ PHƯƠNG DUNG NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA PHƯƠNG PHÁP TIỀN XỬ LÝ NGUYÊN LIỆU ĐẾN HIỆU SUẤT TRÍCH LY POLYPHENOL, ACID CHLOROGENIC VÀ ACID ROSMARINIC TỪ LÁ KINH GIỚI ELSHOLTZIA CILLIAT
TỔNG QUAN
Tổng quan về cây kinh giới
Cây kinh giới còn có tên gọi khác là khương giới, giả tô, kinh giới rìa, bán biên tô, tiểu kinh giới, bài hương thảo Tên khoa học là Elsholzia cilliata
Cây kinh giới là một loại cây thân thảo, có mùi thơm, chứa nhiều tinh dầu, thuộc chi Elsholtzia, họ hoa môi Lamiaceae [13], là một họ thực vật có hoa chứa khoảng 236 chi và hơn 6.000 loài [1] Cây kinh giới được sử dụng như một loại gia vị có mùi hương, chúng được dùng làm phương thuốc trong y học dân gian như trà thảo mộc; sử dụng làm thực phẩm, gia vị, đồ uống; liệu pháp mùi hương và là nguồn sản xuất mật ong [14] Ưu điểm của cây kinh giới là rất dễ trồng vì chúng có yêu cầu thấp đối với môi trường trồng trọt, tốc độ tăng trưởng ngắn, thu hoạch vào mùa hè và mùa thu, ưa sáng và ưa ẩm, có thể hơi chịu nóng, thích nghi với đất phù sa và đất thịt Mùa hoa kinh giới từ tháng 7 đến tháng 10, mùa quả từ tháng 10 đến tháng 12 [15]
Cây kinh giới phân bố rộng rãi ở Đông Á, Châu Phi, Bắc Mỹ và Châu Âu, đặc biệt là ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Ấn Độ [14]
Theo thống kê, hiện nay tại Việt Nam có khoảng 07 loài kinh giới thuộc chi Elsholtzia, với tên gọi có chứa cụm từ kinh giới gồm Elsholtzia blanda, Elsholtzia commusis, Elsholtzia cilliata, Elsholtzia penduliflora, Elsholtzia rugulosa, Elsholtzia winitiana, Elsholtzia Pilosa:
Elsholtzia blanda: còn gọi là kinh giới rừng, kinh giới núi, Tả hoàng dồ (Hmông),
Dê sua tùa; phân bố ở Lai Châu, Lào Cai, Hà Giang Cây mọc tự nhiên ở vùng núi cao
− Chủng cho tinh dầu giàu linalol (>70%)
− Chủng cho tinh dầu giàu linalol (50%) và cineol (20%)
− Chủng cho tinh dầu giàu α-naginaten (53 - 65%)
− Chủng cho tinh dầu giàu α-naginaten (43%) và dehydro elsholtzia keton (14%)
− Chủng cho tinh dầu giàu dehydro elsholtzia keton (58%) và α-naginaten (12%) Trong đó chủng giàu linalol có ý nghĩa khai thác tinh dầu Ðây có thể là nguồn nguyên liệu cho tinh dầu giàu linalol có giá trị ở Việt Nam
Elsholtzia commusis: còn gọi là kinh giới bông, phân bố ở Lào Cai, Hà Giang Cây mọc tự nhiên ở các bãi hoang ven đường vùng núi, ở độ cao 1000 – 1600m
Hình 2.2: cây kinh giới Elsholtzia commusis
Elsholtzia cilliata: còn gọi là Khương giới, phân bố ở các tỉnh phía Bắc và TP Hồ
Chí Minh; cây cao 40-60 cm; thường sử dụng làm rau gia vị Thân vuông, có lông mịn Lá mọc đối chéo chữ thập, phiến lá hình trứng thuôn, đầu nhọn, mép lá có răng cưa Hoa nhỏ màu tím nhạt hoặc hồng tía, mọc thành bông ở đầu cành; lá bắc rộng màu lục, không cuống, dài hình ống Toàn cây có mùi thơm Bộ phận dùng, thu hái và chế biến: toàn cây trên mặt đất (Herba Elsholtziae) dùng tươi, phơi hoặc sấy khô; thu hái vào lúc cây đang ra hoa Thành phần hóa học: Cả cây chứa chủ yếu là tinh dầu (perillen 2,1-3,9%, elsholtzia keton 3,3-19,3%, dehydro-elsholtzia keton 66,1-72,4%…) Hợp chất flavonoid (apigenin, luteolin, dẫn chất methoxy
Hình 2.3: cây kinh giới Elsholtzia cilliata
Elsholtzia penduliflora: còn gọi là kinh giới hoa rủ, kinh giới rủ, cao 1-2m, mọc thành bụi nhỏ, thân vuông có lông mềm, phân nhánh nhiều Lá mọc đối, có cuống ngắn hình mác, gốc và đầu thuôn nhọn, dài 5-15cm, rộng 1-5cm Mặt trên phiến lá nhẵn, chỉ có lông ở gân, còn mặt dưới có lông mịn, màu nhạt hơn Mép khía răng của phiến lá không đều, đôi khi có viền màu tím nhạt Toàn cây có tinh dầu thơm, được mô tả là tương tự như hương của cây khuynh diệp, cây tràm…; chứa 0,4-0,6%, tinh dầu mùi thơm Bộ phận chứa tinh dầu chiếm tỷ lệ cao nhất là lá (0,4-0,6%), tiếp theo là hoa (0,28-0,47%), cành (0,16-0,25%) Hàm lượng tinh dầu cao nhất được ghi nhận vào khoảng tháng 8 đến tháng 9 Trong đó thành phần chủ yếu là cineol, chiếm 75-80% hoặc 56-60%, tùy phương pháp phân tích Bên cạnh đó, còn ghi nhận một số hoạt chất khác như: α-pinen và β-pinene; α-terpineol; α-phellandrene; Camphen, geranyl acetat, linalool, geraniol, β-caryophylen, β-℃imen, linalyl acetat…
Elsholtzia penduliflora được phát hiện ở vùng núi cao từ 1.450 - 1.600m ở Sìn Hồ
(Lai Châu), Bát Xát (Lào Cai), Sa Pa, Đồng Văn, Mường Lống-Kỳ Sơn (Nghệ An), Quản Ba (Hà Giang)…
Hình 2.4: cây kinh giới Elsholtzia penduliflora
Elsholtzia rugulosa: Kinh giới sần hay kinh giới nhám; kinh giới gân nổi, E rugulosa được biết đến tại Trung Quốc như là một loại trà thảo dược để chữa trị cảm lạnh và sốt cũng như là loại cây để cung cấp mật hoa cho ong mật Luteolin chiết từ Elsholtzia rugulosa đã được chứng minh là có tác dụng bảo vệ thần kinh trong một mô hình tế bào bệnh Alzheimer Nó chứa các flavonoit glycoside apigenin 4'- O-alpha-D-glucopyranoside và 5,7,3',4'-tetrahydroxy-5'-C-prenylflavone-7-O-beta- D-glucopyranoside, bên cạnh vài glycoside khác Nó có tác dụng chống lại vi khuẩn kháng methicillin là Staphylococcus aureus Apigenin và luteolin, các hợp chất có trong loài cây này, có thể giúp chống lại virus cúm H3N2
Hình 2.5: cây kinh giới Elsholtzia rugulosa
Elsholtzia winitiana: còn gọi là kinh giới đất, kinh giới dày Ở nước ta, cây mọc hoang trên các đồi và ở chân núi, nhất là trong các rừng thông, gặp nhiều ở Kontum và Lâm đồng (Đà lạt), ở độ cao trên 800m Người ta thu hái những cành lá trước khi cây có hoa hoặc đang có ít nụ hoa, phơi khô Cành lá có tinh dầu thơm như các loài kinh giới khác, hàm lượng tới 1% Có tác dụng như kinh giới, làm thuốc tiêu độc, cầm máu
Hình 2.6: cây kinh giới Elsholtzia winitiana
Elsholtzia Pilosa: còn gọi là kinh giới lông, phân bố ở Lào Cai (Sa Pa), là loài cỏ nhiều năm, mọc trong môi trường ẩm và sáng, ở độ cao trên 800m
Kinh giới thuộc loài cây thảo, cao 30 – 50 cm, thân vuông, mọc thẳng Hoa tự có lá bắc to, mọc thành bông ở đầu cành hoa nhỏ có màu tím nhạt Lá kinh giới mọc đối nhau, phiến lá thuôn, có cuống dài 2 – 3 cm, lá hình nang trứng, nhọn ở đầu, 2 bên mép lá có răng cưa Lá có màu xanh hoặc màu tía, sần sùi, mặt trên có nhiều lông bao phủ
Hình 2.8: Cấu tạo cây kinh giới
Thành phần dinh dưỡng trong 100g cây kinh giới [16]
Thành phần dinh dưỡng Đơn vị Hàm lượng
Gân lá Đỉnh lá Thân cây
Nghiên cứu của Pudziuvelyte và cộng sự, 2020, về E cilliata (Thunb.) Hyl chiết xuất từ các bộ phận khác nhau của thực vật: thành phần phenolic, hoạt tính chống oxy hóa và kháng viêm: sử dụng phương pháp phân tích HPLC trên chiết xuất ethanol từ thân, lá, hoa và toàn bộ cây kinh giới E cilliata, kết quả cho thấy: có 12 hợp chất phenolics đã được tìm thấy trong nguyên liệu, trong đó CGA, RA và rutin là những hợp chất chiếm ưu thế; lượng phenolic có trong dịch chiết từ lá là 89,55 ± 3,91 mg GAE/g chất khô cao hơn so với dịch chiết từ thân (61,25 ± 1,91 mg GAE/g chất khô) và dịch chiết từ hoa (77,39 ± 0,94 mg GAE/g chất khô) Lượng hoạt chất kháng oxy hóa theo DPPH; RA và CGA trong dịch chiết từ lỏ lần lượt là 319,78 ± 15,15 àmol TE/ g chất khô; 0,115 ± 0,011 mg/ g và 10,477 ± 0,391 (mg/g) [17]
Nghiên cứu của Liu và cộng sự, 2012, về đánh giá hoạt động chống oxy hóa của dịch chiết và các phần phân đoạn từ các bộ phận khác nhau của cây E cilliata: kết quả cho thấy hàm lượng phenolic ở lá là 30,64 ± 1,04 g/100g [18]
2.1.4 Tác dụng dược lý Để khảo sát và đánh giá tác dụng dược lý của cây kinh giới đối với sức khỏe con người, các nhà nghiên cứu đã sử dụng phần trên mặt đất của cây kinh giới đã được phơi sấy nhẹ đến khô hoặc dùng dạng thuốc sắc hoặc tán bột hoặc có thể dùng tươi [15]
Trong y học cổ truyền, theo Viện Y dược học dân tộc Việt Nam, cây kinh giới được sử dụng điều trị cho các trường hợp mắc cảm mạo, phong nhiệt, phong hàn, mụn nhọt, dị ứng; trị đau đầu, sốt, tiêu chảy, phù nề, đông máu, đau dạ dày, viêm họng, nhiễm trùng cổ họng [19] [20]
Trong y học hiện đại, tinh dầu kinh giới có hoạt tính chống ung thư đối với u nguyên bào thần kinh đệm ở người, ung thư vú và ung thư tuyến tụy [3]; chống vi khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, chống viêm, các hoạt động an thần, chống ung thư và chống khối u [1]
Tinh dầu kinh giới còn có tác dụng thay thế thuốc trừ sâu để chống lại côn trùng và ấu trùng gây hại cho lương thực (ngũ cốc, bột ngũ cốc)[20] và côn trùng làm hư hỏng nhiều thực phẩm như loài bọ cánh cứng Tribolium castaneum [21] năng gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào ung thư (tế bào ung thư biểu mô đáy phế nang ở người (A549) và tế bào ung thư vú MDA – MB) [22]
Tổng quan về chất chống oxy hóa
Chất chống oxy hóa là các hợp chất có khả năng làm chậm lại, ngăn cản hoặc đảo ngược quá trình oxy hóa các hợp chất có trong tế bào cơ thể sống
Chất chống oxy hóa bậc một: có thể trực tiếp phản ứng với các gốc tự do hoạt động để tạo ra những gốc tự do mới kém hoạt động hơn, từ đó có thể ngăn cản chuỗi phản ứng dây chuyền được khơi mào bởi các gốc tự do
Chất chống oxy hóa bậc hai: kìm hãm sự hình thành gốc tự do (hấp thụ các tia cực tím; tạo phức với các kim loại kích thích tạo gốc tự do như Cu, Fe; vô hoạt oxy đơn)
Có nhiều cách phân loại chất chống oxy hóa dựa trên nguồn gốc, cấu trúc của chúng, một trong những cách đó là dựa trên bản chất enzyme hoặc không enzyme của chất chống oxy hóa như sau:
Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme
Chất chống oxy hóa có bản chất enzyme hoạt động bằng cách chuyển đổi các sản phẩm trao đổi chất bị oxy hóa trong một quy trình gồm nhiều bước thành hydro peroxide và sau đó thành H2O bằng cách sử dụng các yếu tố như sắt, kẽm, đồng, mangan Các chất oxy hóa bản chất enzyme bao gồm Superoxide dismutases, Glutathion peroxidase (GSH-Px), Catalase, Acid lipoic peroxiredoxins [23]
Chất chống oxy hóa phi enzyme
Chất chống oxy hóa không có bản chất enzyme là những hợp chất do cơ thể sinh ra (có nguồn gốc nội sinh) như Coenzyme Q10, glutathion, methionine, Polymines, acid uric, bilibrubin, proteins huyết thanh hoặc các chất chống oxy hóa ngoại sinh có nhiều trong thực vật được cung cấp vào cơ thể thông qua khẩu phần ăn gồm có các nhóm vitamin C, vitamin E, carotenoids, flavonoids, polyphenol và khoáng chất Se, Mn, Cu,
Zn Các chất này có nhiều trong rau quả, chúng được coi là các chất chống oxy hóa tự
Tổng quan về polyphenol
TPC là một nhóm các hợp chất hóa học có mặt chủ yếu ở thực vật, trái cây, rau quả Đặc trưng của nhóm hợp chất này là sự hiện diện của vòng thơm benzen cùng với một hoặc một vài nhóm hydroxyl (-OH) gắn trên nhân thơm
Các hợp chất TPC có thể tồn tại trong tự nhiên dưới dạng aglycones tự do hoặc ở trạng thái ester hóa với glucose và các carbohydrate khác (dạng glycoside) Tuy nhiên, trong tự nhiên TPC chủ yếu tồn tại ở dạng glycoside do ở dạng aglycones tự do không bền, dễ bị phân hủy
Chất chiết xuất từ cây kinh giới là một nguồn TPC phong phú nhưng phần khối lượng của chúng phụ thuộc vào điều kiện trích ly, thời gian trích ly, độ phân cực dung môi và các chất khác [13] Đặc tính của TPC: không màu và có tính se khắt khứu giác Nó không cho mùi vị nhưng lại là chất chống oxy hóa cực mạnh
Tác dụng sinh học của các TPC được giải thích là do chúng có tác dụng khử các gốc tự do Các gốc tự do được sinh ra và tích lũy trong cơ thể, là nguyên nhân dẫn đến bệnh tật và làm tăng tốc độ quá trình lão hoá cơ thể con người
Có hơn 8.000 loại TPC đã được xác định trong các loại thực vật khác nhau, TPC có thể được phân loại thành các nhóm khác nhau theo chức năng của số lượng vòng phenol mà chúng chứa và trên cơ sở các yếu tố cấu trúc liên kết các vòng này với nhau, TPC có thể được phân loại thành ba nhóm chính: acid Phenolic, Flavonoids và Non-Flavonoids [24]
Hình 2.9: Cấu trúc hóa học của các loại TPC khác nhau
Acid phenolic là dẫn xuất của acid benzoic và acid cinnamic Chúng có nguồn gốc từ acid hydroxycinnamic (acid caffeic, acid ferulic, acid p-coumaric, ) và acid hydroxybenzoic (acid syringic, acid vanillic, acid gentisic, ), trong phân tử của chúng có một hoặc nhiều nhóm hydroxyl và nhóm acid cacboxylic được gắn trên một vòng benzen Acid phenolic được tìm thấy trong tất cả các nhóm thực phẩm và chúng có nhiều trong ngũ cốc, các loại đậu, hạt có dầu, trái cây, rau, đồ uống và thảo mộc
Hình 2.10: Cấu tạo phân tử của nhóm acid phenolic
Flavonoids là nhóm hợp chất phenol có cấu tạo khung theo kiểu C6-C3-C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen nối với nhau qua một mạch 3 carbon (dị vòng pyran) Flavonoids là một nhóm lớn của TPC Có nhiều cách để phân loại nhóm flavonoids là dựa trên sắc tố hoặc dựa trên vị trí của gốc aryl so với khung chroman
Non-flavonoids không có cấu tạo đặc trưng của acid phenolic hay flavonoids và gồm 2 nhóm nhỏ là Stilbenes và Lignans:
Stilbenes: có cấu trúc đặc trưng bởi sự hiện diện của nhân 1,2-diphenylethylene có thể được chia làm 2 loại là stilbene đơn phân và oligomeric Chúng có các đặc tính sinh học quan trọng, nhờ chất chống oxy hóa, chống viêm, chất chống ung thư và chất kháng khuẩn Chúng cũng có tác dụng bảo vệ gan, chống lại bệnh Alzheimer và ức chế sự gia tăng glucose và triglycerid trong huyết tương
Lignans: là những hợp chất có cấu trúc 2,3-dibenzylbutan liên kết với chất xơ được tìm thấy trong nhiều họ thực vật và thực phẩm thông thường, bao gồm ngũ cốc, quả hạch, hạt, rau và đồ uống như trà, cà phê hoặc rượu vang
TPC có tác dụng như chất chống oxy hóa, chúng có tác dụng bảo vệ tim mạch, giảm đau, chống ung thư, chống bệnh đái tháo đường, chống lão hóa, chống bệnh thần kinh, chống viêm, chống hen suyễn, hạ huyết áp, bảo vệ gan, giảm cholesterol, kháng nấm, kháng vi khuẩn, kháng virus [13] [25], [26], [27], [28]
Tổng quan về acid rosmarinic
RA là một este của acid caffeic và acid 3,4-dihydroxyphenyllactic Nó thường được tìm thấy ở các loài thuộc họ Bora ginaceae và phân họ Nepetoideae của Lamiaceae Tuy nhiên, nó cũng được tìm thấy ở các loài thuộc họ thực vật bậc cao khác và ở một số loài dương xỉ và rêu sừng
Hình 2.11: Cấu trúc của RA và một số dẫn xuất
▪ Chất rắn kết tinh, sôi ở 694,71℃; 760 mm Hg
▪ Độ hòa tan: Hòa tan trong Ethanol, Dimethyl sulfoxide hoặc dimethyl formamid
Trong nghiên cứu của Maike Petersena và cộng sự năm 2002 [29], thống kê một số các hoạt động sinh học đã được mô tả cho RA, đó là các hoạt động chính như chống oxy hóa, chống viêm, chống đột biến, kháng khuẩn và kháng vi-rút; hoạt động thứ hai được sử dụng trong điều trị nhiễm trùng Herpes simplex với chiết xuất chứa RA Các đặc tính chống viêm được cho là dựa trên sự ức chế lipoxygenase và cyclooxygenase và sự can thiệp của RA với liều lượng bổ sung RA được loại bỏ nhanh chóng khỏi tuần hoàn máu sau khi tiêm tĩnh mạch (thời gian từ 2 đến 9 phút) và cho thấy độc tính rất thấp với LD50 ở chuột là 561 mg/kg sau khi tiêm tĩnh mạch Các hợp chất phenolic như
RA có thể bảo vệ chống ung thư và góp phần vào hoạt động chống oxy hóa của thực vật được sử dụng trong ngành công nghiệp mỹ phẩm.
Tổng quan về acid chlorogenic
- Trọng lượng phân tử: 354, 30 g/mol [30]
- Tên khoa học theo hệ thống IUPAC:(1S,3R,4R,5R)-3-[(E)-3-(3,4- dihydroxyphenyl) prop-2-enoyl]oxy-1,4,5-trihydroxycyclohexane-1-carboxylic acid
Hình 2.12: Cấu trúc hóa học của CGA
Về mặt cấu trúc, CGA là este được hình thành giữa acid caffeic và 3-hydroxyl của axit L-quinic Các chất đồng phân của CGA bao gồm este caffeoyl tại các vị trí hydroxyl khác trên vòng acid quinic: acid 4-O-caffeoylquinic (acid crypt℃hlorogenic hoặc 4-CQA) và acid 5-O-caffeoylquinic (axit neochlorogen hoặc 5-CQA)
CGA là một acid phenolic hòa tan trong nước được thực vật tổng hợp trong quá trình hô hấp hiếu khí [31], có sẵn nhiều nhất trong thực phẩm như hạt cà phê xanh, trà, khoai tây, cà tím, đào, mận khô,
CGA là chất rắn, dạng bột màu trắng hoặc hơi ngã vàng, tan được trong nước và trong dung môi hữu cơ như ethanol, methanol, dimethyl sulfoxyd, dimethylformamid Đây là một chất khá bền vững, điều kiện bảo quản tốt nhất là 4℃
CGA là có nhiều hoạt tính sinh học quan trọng nên nó được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như y học, thực phẩm, chăm sóc sức khỏe và công nghiệp hóa chất như sau [30]:
Tác dụng chống oxy hóa: Hoạt động chống oxy hóa là một trong những hoạt động quan trọng của CGA vì chúng có thể loại bỏ ba loại oxy hóa khử như superoxide, hydro peroxide và các gốc hydroxyl (- OH, O - 2 và H2O2), khi nồng độ CGA cao tác dụng nhặt gốc tự do thể hiện rất rõ, tuy nhiên khi nồng độ thấp khả năng kháng oxy giảm đi và có thể thúc đẩy quá trình oxy hóa [30] CGA làm giảm tổn thương gan do rượu bằng cách làm giảm sự tích tụ các sản phẩm oxy hóa như superoxide, hydro peroxide và các gốc hydroxyl, bên cạnh đó nó còn giúp ức chế stress do oxy hóa [32]
Tác dụng chống viêm: CGA chống viêm bằng cách ức chế các phản ứng viêm và tăng cường hệ thống phòng thủ chống oxy hóa Một số nghiên cứu cho thấy tác dụng chống viêm của CGA như chống viêm mô tụy, phổi ở chuột bị viêm phổi [33]
Tác dụng kháng khuẩn và kháng virus: về kháng khuẩn, CGA có hoạt tính kháng khuẩn phổ rộng và có khả năng ức chế nhất định đối với Escherichia coli, Staphilococcus aureus, nấm men, Aspergillus niger và Bacillus subtilis CGA kháng nấm mạnh hơn kháng vi khuẩn, tác dụng kháng khuẩn của CGA bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ, tác dụng tăng khi nhiệt độ tăng, tuy nhiên nếu nhiệt độ vượt quá 60℃, tác dụng kìm khuẩn sẽ giảm [34]
Tác dụng hạ đường huyết và hạ lipid máu: CGA có thể duy trì nồng độ đường trong máu và ngăn chặn bệnh đái tháo đường ở một mức độ nhất định [35] Về tác dụng hạ lipid máu, CGA giúp điều chỉnh quá trình chuyển hóa cholesterol bằng cách ức chế hoạt động của hydroxylmethyl glutaric coenzyme A reductase [36] Ngoài ra, CGA cũng giúp ức chế lipase tuyến tụy nên nó được sử dụng để can thiệp bệnh béo phì và đái tháo đường [37]
Tác dụng chống bệnh tim mạch: CGA loại bỏ các gốc tự do và chống peroxy hóa lipid, làm tăng nồng độ các ion kali trong máu, giảm nồng độ triacylglycerol và cholesterol trong máu, bảo vệ các tế bào nội mô mạch máu và do đó có tác dụng bảo vệ hiệu quả đối với hệ thống tim mạch.[30]
Tác dụng chống đột biến và chống ung thư: CGA ức chế đột biến mạnh mẽ, ức chế đột biến do aflatoxin B và quá trình nitro hóa gây ra, đồng thời làm giảm hiệu quả sự đột biến của các tế bào hồng cầu trong tủy xương do bức xạ gây ra [38] Về tác dụng chống ung thư, CGA có tác dụng ức chế đáng kể đối với ung thư đại trực tràng, ung thư gan, ung thư phổi, ung thư ruột kết…nên chúng được xem là một chất hóa học bảo vệ ung thư hiệu quả [30] Đồng thời, CGA cũng giúp ngăn chặn chu kỳ phát triển của tế bào bằng cách gây ra quá trình chết theo chương trình và cũng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư [30]
Tác dụng điều hòa miễn dịch: CGA đóng vai trò điều hòa miễn dịch bằng cách ức chế sản xuất các cytokine chống viêm bằng đại thực bào, loại bỏ các tế bào khối u ác tính [39]
Quá trình tiền xử lý nguyên liệu
Sấy là một quá trình chuyển khối rất phức tạp Chúng có sự tham của pha rắn Quá trình này bao gồm cả quá trình khuếch tán bên trong và cả bên ngoài vật liệu rắn Đồng thời diễn ra quá trình truyền nhiệt Đây là một quá trình nối tiếp nhau, không tách rời Nói một cách khác, quá trình này sẽ chuyển lượng nước trong vật liệu từ pha lỏng sang pha hơi Cuối cùng tách pha hơi ra khỏi vật liệu ban đầu Động lực của quá trình này chính là sự chênh lệch độ ẩm Chênh lệch ở trong lòng và bên trên bề mặt vật liệu Quá trình khuếch tán chuyển pha sẽ được áp dụng trên bề mặt vật liệu Tiêu chuẩn là lớn hơn áp suất suất riêng của hơi nước trong môi trường không khí xung quanh
Lựa chọn thông số sấy [8]
- Nhiệt độ sấy lá thực vật dao động từ 40 đến 60℃
- Thời gian sấy lá thực vật từ 5 giờ đến 48 giờ Ưu điểm – Nhược điểm
Trong phương pháp sấy gồm có sấy tự nhiên và sấy nhân tạo, sấy tự nhiên tốn nhiều thời gian để làm giảm độ ẩm của nguyên liệu đồng thời làm mất đi hoạt chất cần nhiên, ngoài ra sấy đối lưu có thể điều chỉnh thời gian và nhiệt độ phù hợp với từng loia5 nguyên liệu khác nhau
Chần là một quá trình xử lý nguyên liệu ở nhiệt độ cao, sử dụng nước nóng hoặc hơi nước Khi sử dụng nước nóng để chần, nguyên liệu sẽ được nhúng vào trong nước nóng ở nhiệt độ và thời gian thích hợp với mục đích chính là ức chế các enzyme có trong nguyên liệu
Quá trình chần gồm ba giai đoạn: gia nhiệt nguyên liệu đến giá trị nhiệt độ chần, giữ nguyên liệu ở nhiệt độ chần trong một khoảng thời gian xác định và làm nguội nguyên liệu hoặc chuyển nhanh nguyên liệu sang công đoạn chế biến tiếp theo
Lựa chọn thông số chần [9]
- Nhiệt độ chần dao động từ 70 – 100℃
- Thời gian chần nguyên liệu lá thực vật: từ 0 đến 60 giây Ưu điểm
Giúp bất hoạt enzyme peroxidase, tiêu diệt vi sinh vật trên bề mặt nguyên liệu giúp kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu
Làm mềm cấu trúc tế bào nguyên liệu Ổn định các hoạt chất sinh học cần thu nhận sau quá trình trích ly
Nhiệt độ cao trong quá trình chần sẽ thúc đẩy một số phản ứng hóa học trong nguyên liệu xảy ra nhanh hơn Một số cấu tử từ nguyên liệu vào dung dịch chần làm tổn thất các chất có giá trị trong nguyên liệu cần thu nhận
Lạnh đông là quá trình bảo quản thực phẩm bằng cách giảm nhiệt độ của sản phẩm xuống thấp hơn nhiệt độ mà tại đó, nước có trong sản phẩm sẽ kết tinh Khi giảm nhiệt độ của sản phẩm từ -10℃ đến -20℃, những phản ứng ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm sẽ bị đình chỉ hoặc diễn ra ở cường độ rất thấp, hầu như tất cả vi sinh
Lựa chọn thông số lạnh đông [41]
- Nhiệt độ lạnh đông: người ta tính rằng cứ giảm 10℃ thì tốc độ phản ứng hoá sinh giảm xuống còn từ 1/2 đến 1/3 và đại bộ phận vi sinh vật đều ngừng hoạt động trong khoảng - 3℃ đến -10℃, các loại nấm mốc chịu đựng lạnh tốt hơn khoảng -15℃và độ ẩm ít nhất 15%, tuy nhiên cần hạ nhiệt độ xuống -18℃ thì nước trong thực phẩm mới có độ ẩm ở mức 14%, vì vậy nhiệt độ bảo quản tốt nhất từ -18℃ trở xuống mới làm cho hầu hết vi sinh vật và nấm mốc ngừng hoạt động hoàn toàn
- Thời gian lạnh đông: tùy theo từng loại nguyên liệu, tuy nhiên quá trình lạnh đông chậm (> 10 giờ) giúp nước trong tế bào chảy ra ngoài gian bào, bồi đắp làm tinh thể đá ở gian bào lớn dần lên mà không tạo ra tinh thể đá mới, do đó tinh thể đá to, có thể chèn ép làm rách màng tế bào, làm cấu tạo mô cơ bị biến dạng, ảnh hưởng nhiều đến chất lượng sản phẩm Ưu điểm
Giúp bất hoạt enzyme, ngưng các quá trình sinh hóa trong nguyên liệu, làm giảm thể tích nước trong nguyên liệu; giúp kéo dài thời gian bảo quản nguyên liệu; thay đổi cấu trúc nguyên liệu giúp chất tan khuếch tán vào dung môi nhiều hơn, giúp quá trình trích ly hiệu quả
Cần nhiều năng lượng và thời gian để tạo thành tinh thể đá trong nguyên liệu
2.6.4 Phương pháp tác động vi sóng
Vi sóng được tạo ra từ một bộ dao động điện từ và được khuếch đại nhờ Magnetron hoạt động như một đèn điện tử 3 cực Năng lượng (sóng viba) từ máy phát (magnetron) được truyền theo ống dẫn sóng đến quạt phát tán (phía trên nóc lò) để đưa sóng ra mọi phía Ở giữa lò các sóng phân tán đều đặn nhờ sự phản chiếu của sóng lên thành lò Hỗn hợp nước cất và lá kinh giới được đốt nóng bởi các phân tử nước Sự đốt nóng chia ra làm hai giai đoạn:
- Nước chứa trong hỗn hợp được hâm nóng bằng các sóng cực ngắn
- Thời gian tác động vi sóng: 30 giây đến 240 giây
- Công suất vi sóng: 100 đến 800W Ưu điểm
Tốn ít năng lượng, tiết kiệm thời gian xử lý nguyên liệu, gia nhiệt hỗn hợp nhanh và phân tán nhiệt đồng đều
Khi công suất vi sóng càng cao và thời gian tác động càng dài, nhiệt độ trong hỗn hợp nguyên liệu sẽ tăng theo và có thể làm biến đổi các hợp chất phenolic và hợp chất kháng oxy hóa chịu nhiệt kém dẫn đến giảm hàm lượng của chúng sau quá trình hỗ trợ vi sóng.
Quá trình trích ly
Trích ly là quá trình hòa tan chọn lọc một hay nhiều cấu tử có trong mẫu nguyên liệu bằng cách cho nguyên liệu tiếp xúc với dung môi Động lực của quá trình trích ly là sự chênh lệch nồng độ của cấu tử bên trong nguyên liệu và ở trong dung môi Đây là một quá trình truyền khối từ pha rắn sang pha lỏng thường xảy ra đối với ngành thực phẩm [40]
Chọn dung môi là một vấn đề rất quan trọng để thực hiện quá trình trích ly, được lựa chọn dựa vào những tiêu chí sau đây:
Dung môi có khả năng hòa tan chọn lọc, tức cấu tử cần thu nhận trong mẫu nguyên liệu có độ hòa tan cao trong dung môi Ngược lại, các cấu tử khác có trong mẫu nguyên liệu thì không hòa tan được trong dung môi hoặc có độ hòa tan kém
Dung môi phải trơ với các cấu tử có trong dịch trích
Dung môi không gây hiện tượng ăn mòn thiết bị, khó cháy và không độc đối với người sử dụng
Dung môi có giá thành thấp, dễ tìm; các nhà sản xuất có thể thu hồi dung môi sau quá trình trích ly để tái sử dụng Những dung môi phổ biến hiện nay trong công nghiệp thực phẩm bao gồm nước, một số loại dung môi hữu cơ và CO2 ở trạng thái siêu tới hạn
Nước là dung môi phổ biến nhất trong công nghiệp thực phẩm Nước được sử dụng để trích ly saccharose trong công nghệ sản xuất đường từ củ cải đường, trích ly các chất chiết từ trà và cà phê trong công nghệ sản xuất trà và cà phê hòa tan, trích ly các chất chiết từ thảo mộc trong công nghệ sản xuất thức uống không cồn
Các dung môi hữu cơ được sử dụng để trích ly chất béo từ thực vật trong công nghệ sản xuất dầu béo như hexane, heptane hoặc cyclohexane để tách chất béo từ đậu nành, dậu phộng, hạt bông, hạt hướng dương, hạt lanh Nhiệt độ sôi của ba dung môi nói trên lần lượt là 63,5-69,0℃; 90-99℃ và 71-85℃ Nhược điểm đáng lưu ý là cả ba dung môi trên là đều dễ gây cháy Bên cạnh đó, sử dụng carbon disulphide để trích ly chất béo từ oliu, acetone hoặc ethylether để tách chất béo từ gan cá và một số phụ phẩm trong ngành công nghiệp chế biến thịt, sử dụng ethanol để trích ly các chất mùi và chất màu từ nguyên liệu rau trái và thảo mộc trong sản xuất rượu mùi Riêng trichloroethylene (nhiệt độ sôi 86,5 ℃ ) là một dung môi không gây cháy nhưng rất độc, ít được sử dụng trong công nghiệp thực phẩm vì rất độc [44]
2.7.2 Các yếu tố ảnh hưởng khi trích ly bằng dung môi
Hàm mục tiêu của quá trình trích ly là hiệu suất thu hồỉ cấu tử cần chiết tách Đó là tỷ lệ giữa hàm lượng cấu tử trong dung dịch trích so với hàm lượng của nó trong nguyên liệu đem trích ly Giá trị hiệu suất thu hồi cấu tử càng cao thì việc thực hiện quá trình trích ly sẽ đạt hiệu quả kinh tê càng cao cần lưu ý là trong một số trường hợp, cấu tử cần thu nhận không phải là một chất mà là một hỗn hợp gồm nhiều hợp chất hóa học khác nhau có trong nguyên liệu đem trích ly Ví dụ như trong công nghệ sản xuất trà hòa tan, chúng ta cần thu nhận một hỗn hợp gồm nhiều thành phần khác nhau như đường, acid amin, TPC, vitamin, khoáng [44]
Kích thước của nguyên liệu
Kích thước nguyên liệu càng nhỏ thì điện tích bề mặt tiếp xúc giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Do đó, việc trích ly các cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ trở nên dễ dàng hơn Tuy nhiên, nếu kích thước của nguyên liệu quá nhỏ thì chi phí cho quá trình nghiền xé nguyên liệu sẽ gia tăng Ngoài ra, việc phân riêng pha lỏng và pha rắn khi kết thúc quá trình trích ly sẽ trở nên khó khăn hơn Bằng phương pháp thực
Với cùng một lượng nguyên liệu, nếu tăng lượng dung môi sử dụng thì hiệu suất trích ly sẽ tăng theo Đó là do sự chênh lệch nồng độ của cấu tử cần trích ly trong nguyên liệu và trong dung môi sẽ càng lớn Tuy nhiên, nếu lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích Khi đó, các nhà sản xuất phải thực hiện quá trình cô đặc hoặc xử lý dịch trích bằng phương pháp khác để tách bớt dung môi Như vậy, chúng ta cần xác định tỷ lệ phù hợp giữa khối lượng nguyên liệu và dung môi Ví dụ như trong công nghệ sản xuất thức uống từ thảo mộc, tỷ lệ khối lượng giữa nguyên liệu và dung môi (nước) thường dao động trong khoảng 1/6 -1/10 [44]
Khi tăng nhiệt độ trích ly, các cấu tử sẽ chuyển động nhanh hơn, do đó sự hòa tan và khuếch tán của cấu tử từ nguyên liệu vào dung môi sẽ được tăng cường Ngoài ra, khi nhiệt độ tăng, độ nhớt của dung môi sẽ giảm, dung môi dễ dàng xuyên qua lớp nguyên liệu và làm cho diện tích tiếp xúc bề mặt giữa nguyên liệu và dung môi sẽ càng lớn Tuy nhiên, việc tăng nhiệt độ trích ly sẽ làm tăng chi phí năng lượng cho quá trình, đồng thời có thể xảy ra một số phản ứng hóa học không mong muốn trong dịch trích và sự tổn thất các cấu tử hương sẽ gia tăng Do đó, cần chọn nhiệt độ trích ly tối uu tùy theo từng trường hợp cụ thể như trong công nghệ sản xuất, nhiệt độ trích ly saccharose từ củ cải đường, trong sản xuất đường thường dao động trong khoảng 55-85℃, đối với sản xuất trà hòa tan, quá trình trích ly được thực hiện ở 70-90℃ [44]
Khi tăng thời gian trích ly thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ gia tăng Tuy nhiên, nếu thời gian trích ly quá dài thì hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ không tăng thêm đáng kể Do đó, cần xác định thời gian tối ưu cho quá trình trích ly bằng phương pháp thực nghiệm [44]
Tốc độ của dòng dung môi chảy qua lớp nguyên liệu trong thiết bị trích ly
Nếu dòng dung môi được bơm với tốc độ cao vào thiết bị chứa nguyên liệu cần trích ly thì sẽ làm giầm đi kích thước lớp biên bao bọc xung quanh nguyên liệu chính là các cấu tử hòa tan Do đó, tốc độ trích ly các cấu tử từ nguyên liệu sẽ gia tăng Tùy thuộc vào hình dạng thiết bị, kích thước của lớp nguyên liệu trong thiết bị mà tốc độ dòng dung môi bơm vào thiết bị sẽ được lựa chọn sao cho thời gian trích ly là ngắn nhất và hiệu suất hồi chất chiết là cao nhất [44] Áp suất
Trong phương pháp trích ly bằng lưu chất siêu tới hạn, áp suất và nhiệt độ là hai yếu tố ảnh hưởng quyết định đến hiệu suất thu hồi chất chiết Thông thường, khi tăng áp suất và nhiệt độ thì quá trình trích ly diễn ra càng nhanh và hiệu suất trích ly sẽ tăng theo Tuy nhiên, việc tăng áp suất sẽ làm tăng chi phí vận hành và giá thành thiết bị cũng tăng cao.[44]
2.7.3 Một số biến đổi của nguyên liệu trong quá trình trích ly
Biến đổi hóa lý là nhóm biến đổi quan trọng nhất trong quá trình trích ly, là sự hòa tan của các cấu tử từ nguyên liệu (pha rắn) vào dung môi (pha lỏng) Cần lưu ý là tùy theo tính chọn lọc của dung môi mà thành phần và hàm lượng các cấu tử hòa tan thu được trong dịch trích sẽ thay đổi Thông thường, cùng với các cấu tử cần thu nhận, dịch trích còn chứa một số cấu tử hòa tan khác Các nhà sản xuất cần phải loại bỏ các tạp chất hòa tan và không tan ra khỏi dịch trích ở các công đoạn xử lý tiếp theo trong quy trình sản xuất Trong quá trình trích ly có thể xảy ra những biến đổi về pha khác như sự bay hơi, sự kết tủa
Sự khuếch tán là biến đổi vật lý quan trọng trong quá trình trích ly Các phân tử chất tan sẽ dịch chuyển từ tâm của nguyên liệu đến vùng bề mặt và dịch chuyển từ vùng bề mặt nguyên liệu vào dung môi Các phân tử dung môi sẽ khuếch tán từ vùng bên ngoài nguyên liệu vào bên trong cấu trúc các mao dẫn của nguyên liệu Sự khuếch tán sẽ giúp cho quá trình chiết rút các cấu tử cần trích ly từ nguyên liệu vào dung môi xảy ra nhanh và triệt để hơn Động lực của sự khuếch tán là do chênh lệch nồng độ.[44]
Trong quá trình trích ly, có thể xảy ra các phản ứng hóa học giữa các cấu tử trong nguyên liệu Tốc độ của các phản ứng hóa học sẽ gia tăng khi chúng ta thực hiện quá trình trích ly ở nhiệt độ cao làm cho dịch trích chứa nhiều tạp chất và gây khó khăn cho
Tình hình nghiên cứu
2.8.1 Nghiên cứu trên thế giới
Nghiên cứu của Chan và cộng sự, 2012, về nghiên cứu đặc tính chống oxy hóa của các loại thảo mộc với tác dụng tăng cường của phương pháp xử lý sấy khô: có 3 loài thảo mộc được thực hiện sấy khô bằng lò, sấy trong lò vi sóng và đông lạnh với các độ trưởng thành khác nhau của lá Kết quả cho thấy hàm lượng TPC, khả năng kháng oxy hóa của lá M Alba tăng lên đáng kể khi sấy bằng lò vi sóng so với lá tươi, trong khi đó khi đông khô lá E elatior giúp tăng lượng TPC lên 26%; tăng hợp chất chống oxy hóa lên 45% so với mẫu lá tươi và hàm lượng CGA thu được là 294 mg/100g cao hơn hẳn so với kim ngân hoa Nhật Bản
Nghiên cứu của Oh H và cộng sự, 2019, về phương pháp bảo quản phenolic trong lá Thunbergia laurifolia bằng các phương pháp sấy khô khác nhau: sử dụng các phương pháp sấy khô và chần khác nhau trên nguyên liệu để nghiên cứu tác dụng của chúng đối với việc bảo quản các hợp chất phenolic, hoạt tính chống oxy hóa và chất lượng của lá, kết quả sấy khô trong lò ở nhiệt độ 50 và 100℃(lần lượt là 51% và 65%), có sự phá hủy hàm lượng TPC và AC nhiều nhất trong khi phương pháp chần ở 100℃ làm giảm TPC thấp nhất [45]
Nghiên cứu của Tan và cộng sự, 2015, về nghiên cứu ảnh hưởng của sấy khô đến polyphenol oxidase và hoạt động kháng oxy hóa của lá dâu tằm Morus alba: các phương pháp tiền xử lý gồm chần kết hợp sấy khô ở 50℃ và 100℃; phơi nắng và sấy trong không khí xung quanh ở 24 ± 1℃, kết quả thu được lượng TPC cao nhất với mẫu lá chần kết hợp sấy khô ở 50℃ so với các mẫu lá tươi sấy không chần và lá chần kết hợp sấy ở 100℃ [46]
Nghiên cứu của Chan và cộng sự, 2016, về đánh giá các phương pháp tiền xử lý và chiết xuất khác nhau cho chiết xuất các hợp chất có hoạt tính sinh học từ lá
Orthosiphon stamineus thông qua phân tích cấu trúc vi mô: sử dụng nguyên liệu lá trà
Java ở Malaysia, được rửa sạch và sấy khô đối lưu cưỡng bức ở 45℃ qua đêm cho đến khi độ ẩm đạt dưới 15%; sau đó mẫu sẽ được nghiền và sàng rây để đạt nhiều kích thước hạt khác nhau 0,5mm; 250 – 500mm;100 – 250mm và được bảo quản ở 4℃ trước khi mang phân tích Các phương pháp tiền xử lý trích ly sử dụng trong nghiên cứu này gồm chiết xuất có hỗ trợ siêu âm, chiết xuất có hỗ trợ vi sóng và xử lý mẫu bằng axit và kiềm, dung môi sử dụng là ethanol 70% Nhóm tác giả đã sử dụng phương pháp phân tích kính hiển vi điện tử quét (SEM) của dịch chiết mẫu để kiểm tra sự biến đổi cấu trúc của các mẫu thực vật trước và sau mỗi phương pháp chiết làm ảnh hưởng đến hiệu suất trích ly Kết quả nghiên cứu cho thấy: hiệu suất của phương pháp chiết xuất về năng suất và thời gian chiết xuất phụ thuộc vào tác động đến cấu trúc vi mô của mẫu thực vật, đặc biệt là bộ ba tuyến vì nó là nơi chính để sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp của thực tỉ lệ thuận giữa hiệu suất khai thác và mức độ phá vỡ cấu trúc vi mô của thực vật [47]
Nghiên cứu của Yan Jiao và cộng sự, 2018, về ảnh hưởng của tiền xử lý đóng băng – rã đông đến năng suất chiết xuất và hoạt tính sinh học chống oxy hóa của Carotenoid ngô (Lutein và Zeaxanthin): sử dụng bột gluten ngô sàng để chọn hạt có kích thước 0,25mm; 5g bột gluten ngô trộn với 1 – 6ml nước cất và duy trì trong 12 giờ và các mẫu được đặt tương ứng ở các mức đóng băng khác nhau là 20, 40, 80 và 196℃ (đóng băng Nitơ lỏng) Sau đó, các mẫu được rã đông trong tủ ấm ở 20℃ trong 2 giờ; rồi tiếp tục đông khô để loại bỏ ẩm; cuối cùng các mẫu bột gluten ngô lần lượt trải qua 1,2,3,4 và 5 chu kỳ đóng băng – tan băng Hình thái của các mẫu bột gluten ngô đã xử lý và chưa xử lý được phân tích bằng kính hiển vi điện tử quét (SEM) ở điện áp gia tốc 15kV Kết quả nghiên cứu cho thấy cấu trúc vi mô của bột gluten ngô tiền xử lý đóng băng – rã đông có tổng hàm lượng caroten của chất chiết xuất từ bột gluten ngô cao hơn đáng kể so với chất chiết từ bột gluten ngô không được xử lý; cấu trúc vi mô của bột gluten ngô đã xử lý có hình cầu nhỏ gọn đã bị lão hóa, khoảng cách giữa các thành phần lớn hơn và hình thành cấu trúc xốp, các mẫu ít đậm đặc hơn, cấu trúc liên kết ngang của chúng bị phá hủy giúp cho việc giải phóng caroten và nâng cao hiệu suất chiết xuất [48]
Nghiên cứu của Santos và cộng sự, 2022, về tác động của phương pháp sấy trong tiền xử lý chiết các hợp chất có hoạt tính sinh học từ jambolana (Syzygium cumini (L.) Skeels: sử dụng nguyên liệu là cùi và vỏ quả jamolan (không sử dụng hạt) được thực hiện với hai phương pháp tiền xử lý: lò lưu thông không khí (AOC) - sấy tuần hoàn không khí sau đó sấy khô ở 55℃ trong 8 giờ không gián đoạn và Lyophilization (LYO)
- sấy khô bằng thiết bị đông khô trong 48 giờ Các mẫu được nghiền bằng máy nghiền dao Willey, sau đó bảo quản ở -18℃ trước khi mang đi phân tích Các mẫu này được mang đi phân tích cấu trúc vi mô bằng kính hiển vi điện tử quét SEM (hình ảnh được thực hiện theo gia số từ 50 đến 350 lần, ở điện áp 10kV) Kết quả nghiên cứu cho thấy cỏc hạt LYO cú đường kớnh 225àm, hỡnh dạng hơi trũn và độ xốp cao khi so sỏnh với các hạt xử lý AOC (kích thước lớn hơn và hình dạng không xác định) Ngoài ra, hiệu suất chiết từ các hạt LYO có nồng độ các hợp chất sinh học cao hơn so với các hạt AOC [49]
Hình 2.13: Cấu trúc vi mô của các mẫu jambolan dưới kính hiển vi điện tử quét a Sấy khô trong tủ sấy và b đông khô [49]
Nghiên cứu của Bamidele và cộng sự, 2017, về ảnh hưởng của thời gian chần đến hoạt tính phenolic tổng số, hoạt động chất chống oxy hóa và hàm lượng khoáng chất của rau lá xanh chọn lọc: sử dụng trên 6 loại rau lá xanh được tiêu thụ phổ biến ở Nigeria, chúng được chần ở cùng nhiệt độ là 90℃ với thời gian khác nhau làm giảm hàm lượng chất khô của rau, kết quả là thời gian chần 5 phút làm tăng đáng kể tổng phenolic (280,6
- 980,6 mg GAE/ 100g db) và hoạt tính kháng oxy hóa (25,1 - 95,1 mg TE/100g) tương đương trong tất cả các loại rau [50]
Nghiên cứu của Weiguang Yi và Hazel Y Wetzstein, 2011, về ảnh hưởng của điều kiện sấy khô và quá trình chiết xuất trên hoạt tính sinh hóa của các loài thảo mộc được lựa chọn: sử dụng ba loại thảo mộc dùng làm thực phẩm và dược liệu gồm có hương thảo (Rosmarinus officinalis), ngải cứu (Leonurus hearta) và bạc hà cay (Mentha piperita) Lá của 3 loại thảo mộc trên được làm khô bằng 3 phương pháp: làm khô dưới ánh nắng mặt trời, sấy khô trong lò ở 40℃ và sấy khô ở 70℃ và được chiết xuất bằng 80% metanol hoặc 80% ethanol Kết quả nghiên cứu cho thấy: cả điều kiện sấy khô và chiết xuất đều ảnh hưởng đáng kể đến hàm lượng TPP và TEAC trong ba loài thảo mộc Các loại thảo mộc sấy khô dưới ánh nắng mặt trời hoặc sấy ở 40℃ cho hàm lượng TPP và khả năng TEAC cao hơn đáng kể so với các mẫu tươi Việc sấy ở nhiệt độ 70℃ gây ra sự mất mát đáng kể chất chống oxy hóa Ngoài ra, khi chiết xuất bằng ethanol 80% thay đổi theo các phương pháp sấy khô khác nhau [51]
Nghiên cứu của Maja Dent và cộng sự, 2012, về ảnh hưởng của dung môi chiết xuất, nhiệt độ và thời gian đối với thành phần và tỷ lệ khối lượng của TPC trong chiết xuất cây xô thơm dại Dalmatian (Salvia officinalis L.): các dung dịch nước của ethanol hoặc acetone 30%, nhiệt độ chiết xuất là 60℃ và thời gian chiết xuất là 30 phút là hiệu quả nhất để chiết xuất TPC từ lá cây xô thơm khô Hàm lượng TPC tổng, RA và luteolin -3-glucuronide và một số TPC khác thu được đáng kể khi trích ly ở điều kiện trên [52]
2.8.2 Nghiên cứu tại Việt Nam
Nghiên cứu của Võ Văn Quốc Bảo và cộng sự, 2021, về ảnh hưởng của chế độ chần và lượng giấm bổ sung đến chất lượng của gừng dầm giấm: sử dụng nguyên liệu gừng xử lý thái mỏng và chần với sự thay đổi ở các nhiệt độ 70, 75, 80, 85 và 90℃ trong
2 phút, sau đó khảo sát tương tự thời gian chần với các mốc nhiệt độ khác nhau 0; 1; 1,5; 2; 2,5 và 3 phút; nồng độ giấm bổ sung vào dịch rót với các nồng độ 0,6; 0,7; 0,8; 0,9 và 1% Kết quả nghiên cứu cho thấy, sản phẩm gừng dầm giấm có chất lượng cao nhất khi được chần ở 85℃ trong vòng 15 phút, nồng độ giấm bổ sung là 0,9% sản phẩm gừng dầm giấm cũng ổn định chất dinh dưỡng và tăng giá trị cảm quan so với nguyên liệu ban đầu [9]
Nghiên cứu của Nguyễn Minh Phước, 2020, về ảnh hưởng cùa quá trình chần và sấy khô với sản xuất trà thảo mộc khô từ Bạc hà (Mentha piperita L.): sử dụng lá trà ở tỉnh Hậu Giang, Việt Nam, lá trà được thu hái và bảo quản ở 20℃ sau đó sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm Lá trà được chần ở nước nóng có 1,5% acid citric với điều kiện lần lượt như sau: 100℃ trong 5 giây; 95℃ trong 10 giây; 90℃ trong 15 giây; 85℃ trong 20 giây; điều kiện sấy cố định trong nghiên cứu này là 60℃ đến khi độ ẩm 9,5% Kết quả: [11]
Bảng 2.1: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian chần đến hàm lượng phenolic tổng số (mg/g), flavonoid (mg/g) và DPPH (mg/mL) trong trà thảo mộc
100℃, 5 giây 7,94 ± 0,03 ab 3,45 ± 0,01 ab 0,91 ± 0,01 ab 95℃, 10 giây 8,05 ± 0,02 a 3,78± 0,02 a 0,87 ± 0,00 a 90℃, 15 giây 7,83 ± 0,01 b 3,19 ± 0,03 b 0,98 ± 0,03 b 85℃, 20 giây 7,11 ± 0,00 c 2,64 ± 0,02 c 1,25 ± 0,00 c
Bảng 2.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng phenolic tổng số (mg/g), flavonoid (mg/g) và DPPH (mg/mL) trong trà thảo mộc Methapiperita L
Nghiên cứu của Trương Quốc Tất và cộng sự, 2021, về ảnh hưởng của nhiệt độ sấy đến hàm lượng hợp chất TPC, sắc tố carotenoids, chlorophyll và hoạt tính chống oxy hóa của cây rau càng cua (Peperomia pellucida L.) thu ở tỉnh Tiền Giang: sử dụng cây rau càng cua tươi được sấy ở các điều kiện lần lượt 50, 60, 70 và 80℃ đến khi đạt độ ẩm ≤ 10%, sau đó nghiền thành bột mịn và mang đi trích lý với ethanol 70%, kết quả cho thấy mẫu rau càng cua sấy ở nhiệt độ 70℃ giữ lại hàm lượng TPP, khả năng chống oxy hóa tốt hơn và giữ lại màu sắc khá tốt so với các mẫu còn lại; hàm lượng TPP là 12,88 (mg GAE/g chất khô); sắc tố carotenoids là 119,05 (mg/g chất khô), khả năng chống oxy hóa tốt với phần trăm gốc tự di DPPH bị khử là 69,54%.[8]
NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
Cây kinh giới (Elsholtzia cilliata) được mua tại Lâm Đồng từ tháng 09/2023 đến tháng 11/2023 Cây lá kinh giới được thu mua ngay sau khi thu hoạch từ 5 giờ sáng (đã cắt bỏ rễ), tại trang trại rau sạch ở Lâm Đồng (không sử dụng thuốc bảo vệ thực vật và thuốc tăng trưởng), thân cây cao khoảng 50cm, được bọc trong giấy kraf và xếp vào thùng xốp (EPS) đầy khoảng 2/3 thể tích thùng, thùng được đậy nắp và có đục lỗ, được vận chuyển trên xe có nhiệt độ khoảng 20 ℃ về TP.HCM và các thùng xốp EPS được được chuyển đến phòng thí nghiệm, bảo quản trong tủ mát 10 - 15 ℃ trong từng túi plastic EVA (co-polymer của polyethylene và vinylacetat) với khối lượng phù hợp cho thí nghiệm, được bảo quản trong điều kiện trên trong vòng 3 ngày.
Hóa chất, thiết bị
Stt Hóa chất Nguồn gốc
1 Ethanol 99,5%và các nồng độ khác Việt Nam
2 Thuốc thử Folin – Ciocalteu 10% Ấn Độ
3 Bột Sodium Carbonate (Na2CO3) Việt Nam
4 Dung dịch Acid gallic Trung Quốc
5 Bột 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) Mỹ
7 Bột Zicurium (IV) Trung Quốc
8 Dung dịch acid citric 10% Việt Nam
9 Dung dịch Trolox Việt Nam
- Máy quang phổ UV - Vis Lamda 35 (Thermo, Genesys 10UV, Mỹ)
- Cân sấy ẩm hồng ngoại (Ohaus MB45)
- Tủ sấy (Shel lab, SGO1, Mỹ)
- Cân 4 số lẻ (Shimadzu AUY 22)
- Cân 2 số lẻ (GS – Shinko)
- Máy xay sinh tố (Philip)
- Bếp điện (Delites model 853, Việt Nam)
- Lò vi sóng (LG, Hàn Quốc)
- Bể ổn nhiệt (Memmert, WNB22, Đức)
- Máy đo pH (Thermo, Orin 3 star, Mỹ)
Đánh giá chất lượng lá kinh giới
Mục tiêu nghiên cứu Đánh giá sơ bộ chất lượng nguyên liệu đầu vào để đưa ra các phương pháp xử lý nguyên liệu phù hợp nhằm thu nhận nhiều nhất các hoạt chất sinh học sau trích ly
Các chỉ tiêu phân tích
▪ Hàm ẩm (đối với phương pháp sấy)
▪ Hàm lượng AC theo DPPH
Phương pháp nghiên cứu
Các nội dung nghiên cứu chính của đề tài được trình bày bằng sơ đồ dưới đây:
Hình 3.2 Sơ đồ nghiên cứu
Khảo sát các thông số của quá trình trích ly
- Tỉ lệ nguyên liệu/ dung môi
- Hàm ẩm (đối với phương pháp sấy)
- Hàm lượng AC theo DPPH
Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình sấy đến hiệu suất trích ly:
Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình chần đến hiệu suất trích ly:
Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình lạnh đông ( -18℃) đến hiệu suất trích ly:
Khảo sát ảnh hưởng của thông số quá trình hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly:
- Thời gian tác động vi sóng
Phương pháp chần kết hợp lạnh đông và hỗ trợ vi sóng
Phương pháp chần kết hợp lạnh đông Phương pháp chần
3.4.2 Quy trình thực hiện các phương pháp tiền xử lý nguyên liệu
Hình 3.3: Quy trình thực hiện các phương pháp tiền xử lý nguyên liệu để trích ly TPC,
Nước, chất thải Rửa sạch
Mục đích: đảm bảo lựa chọn nguồn nguyên liệu ban đầu được đồng nhất
Phương pháp thực hiện : lá kinh giới từ cây kinh giới đã được bảo quản ở phòng thí nghiệm ở nhiệt độ 10 – 15℃, sẽ được lựa chọn thủ công với kích thước đồng đều với nhau, loại bỏ những lá hư hỏng, cho vào các túi nilon với khối lượng khoảng 10g
Mục đích: loại bỏ tạp chất và vi sinh vật trên bề mặt nguyên liệu
Phương pháp thực hiện: rửa lá kinh giới dưới vòi nước sạch ở nhiệt độ phòng sao cho các tạp chất bám trên bề mặt lá đều bị loại bỏ hoàn toàn, thực hiện nhẹ nhàng tránh làm tổn thương đến lá và để ráo
3.4.3.3 Xử lý nguyên liệu bằng phương pháp sấy
Mục đích: Làm giảm hàm ẩm trong lá kinh giới, giúp ổn định hàm lượng các hoạt chất cần thu nhận sau trích ly, ngăn cản sự trao đổi chất của tế bào, một số vi sinh vật và enzyme trong nguyên liệu sẽ bị vô hoạt bởi nhiệt
Phương pháp thực hiện: lá kinh giới sau khi được rửa sạch, để ráo nước sẽ được mang đi sấy đối lưu không khí với điều kiện nhiệt độ và thời gian thích hợp Trong phương pháp này, việc sử dụng không khí nóng để làm tác nhân sấy, mẫu nguyên liệu sẽ được tiếp xúc trực tiếp với không khí nóng trong buồng sấy, một phần ẩm trong nguyên liệu sẽ được bốc hơi và thoát ra bên ngoài
3.4.3.4 Xử lý nguyên liệu bằng phương pháp chần
Gồm giai đoạn chần và làm lạnh nhanh lá kinh giới:
Mục đích: giúp bất hoạt các loại enzyme PPO và enzyme POD, ngăn cản các quá trình sinh hóa diễn ra tiếp tục, tạo vết nứt trên vách tế bào nguyên liệu, bảo vệ hàm lượng các hoạt chất chần thu nhận sau trích ly
Phương pháp thực hiện: chuẩn bị nồi nước lọc có thể tích gấp 10 - 12 lần nguyên liệu, giữ lá kinh giới ở nhiệt độ chần trong một khoảng thời gian xác định và làm lạnh nhanh lá kinh giới bằng nước đá
Phương pháp thực hiện: lá kinh giới sau khi chần được vớt ra cho vào trong nước đá làm nguội nhanh
3.4.3.5 Xử lý nguyên liệu bằng phương pháp chần kết hợp lạnh đông
Nguyên liệu sau khi được xử lý chần ở mục 3.4.4.4 sẽ mang đi xử lý lạnh đông
Mục đích: giúp tạo kết tinh thành tinh thể đá bên trong tế bào lá, giúp tăng phá vỡ cấu trúc màng tế bào giúp quá trình khuếch tán các hoạt chất vào dung môi giúp tăng hiệu suất trích ly; ức chế hoạt động của vi sinh vật, bất hoạt enzyme
Phương pháp thực hiện: Lá kinh giới sau khi được xử lý bằng phương pháp chần với thông số phù hợp và làm lạnh nhanh được để ngay vào tủ lạnh đông có nhiệt độ cố định - 18℃ theo điều kiện thời gian lạnh đông phù hợp
3.4.3.6 Xử lý nguyên liệu bằng phương pháp chần kết hợp lạnh đông - hỗ trợ vi sóng
Nguyên liệu sau khi được xử lý chần ở mục 3.4.4.4 và lạnh đông ở mục 3.4.4.5, mang đi nghiền với nước cất và xử lý vi sóng
Mục đích: sử dụng bức xạ vi sóng gây ra sự phá vỡ liên kết hydro và sự di chuyển của các ion hòa tan dẫn đến sự phá vỡ mô thực vật giải phóng các hợp chất có trong nguyên liệu đi vào dung môi trích ly
Phương pháp thực hiện: Lá kinh giới sau khi được xử lý với phương pháp chần kết hợp lạnh đông được xay cùng nước cất theo định lượng đã có và được xử lý bằng lò vi sóng theo điều kiện thời gian tác động vi sóng và công suất vi sóng phù hợp
Mục đích: làm giảm kích thước nguyên liệu, tăng bề mặt tiếp xúc nguyên liệu với dung môi ethanol, giúp tăng hiệu suất trích ly
Phương pháp thực hiện: các mẫu lá kinh giới sau khi xử lý bằng phương pháp sấy, phương pháp chần và phương pháp chần kết hợp lạnh đông, được mang đi nghiền cùng với dung môi ethanol có nồng độ và thể tích phù hợp
Mục đích: chuẩn bị cho giai đoạn thu nhận dịch trích lá kinh giới
Phương pháp thực hiện: Các mẫu lá kinh giới sau khi được xử lý với bốn phương nhiệt độ trích ly, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, pH, nồng độ ethanol
Mục đích: thu nhận dịch trích lá kinh giới
Phương pháp thực hiện: các mẫu lá kinh giới sau trích ly được làm lạnh xuống từ 5 đến 10℃ khoảng 30 phút để ổn định các chất có hoạt tính sinh học Sau đó, dịch trích được lọc qua giấy lọc Whatman No.4 bằng thiết bị lọc chân không, thu nhận dịch lọc để chuẩn bị cho quá trình phân tích.
Nội dung nghiên cứu
3.4.1 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình sấy đến hiệu suất trích ly
Giúp xác định các thông số sấy đối lưu bằng không khí nóng để bất hoạt enzyme, hạn chế các phản ứng sinh hóa và ít ảnh hưởng đến hàm lượng TPC, AC, CGA và RA có trong lá kinh giới Quá trình khảo sát gồm hai yếu tố là nhiệt độ sấy và thời gian sấy
Cân khoảng 10g nguyên liệu lá kinh giới sấy khô cho mỗi lần thí nghiệm như quy trình được mô tả bằng hình 3.2 và bố trí thí nghiệm nêu tại bảng 3.1, nghiền nguyên liệu với dung môi ethanol 80%; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10 (w/v); tiến hành trích ly với nhiệt độ 70℃ trong thời gian 60 phút; pH 5,6 Sau đó tiến hành lọc; thu nhận dịch trích và tiến hành phân tích
Các yếu tố cần khảo sát cụ thể như sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của thông số nhiệt độ sấy ở các mốc nhiệt độ: 40℃; 45℃; 50℃; 55℃; 50℃
- Khảo sát ảnh hưởng của thông số thời gian sấy ở các mốc thời gian: 12 giờ; 18 giờ; 24 giờ; 30 giờ; 36 giờ
Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng củả quá trình sấy
3.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình chần đến hiệu suất trích ly
Xác định các thông số chần phù hợp giúp bất hoạt enzyme PPO và POD; ngăn chặn các quá trình sinh hóa của nguyên liệu, tạo vết nứt trên bề mặt nguyên liệu ảnh hưởng đến cấu trúc nguyên liệu làm tăng độ thẩm thấu của chất nguyên sinh, làm cho dịch bào thoát ra bên ngoài khi tiến hành quá trình trích ly và giúp tăng hiệu suất trích ly hàm lượng TPC, AC, CGA và RA Quá trình khảo sát gồm hai yếu tố là nhiệt độ chần và thời gian chần
Cân khoảng 10g lá kinh giới tươi cho mỗi lần thí nghiệm, sau khi thực hiện quá trình chần như quy trình được mô tả bằng hình 3.3 và bố trí thí nghiệm nêu tại bảng 3.2 dưới đây, sau đó nghiền với dung môi ethanol 80%; tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/10
Thí nghiệm Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Thời gian trích ly: 60 phút
- Hàm lượng AC theo DPPH
- Thời gian sấy: được chọn ở thí nghiệm 1
- Thời gian trích ly: 60 phút
- Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chần ở các mốc nhiệt độ: 70℃; 75℃; 80℃; 85℃ và 90℃
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian chần ở các mốc thời gian: 30 giây; 60 giây; 90 giây; 120 giây và 150 giây
Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình chần
3.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình lạnh đông đến hiệu suất trích ly
Giúp xác định thời gian lạnh đông tối ưu để bất hoạt enzyme và ngừng các quá trình sinh hóa của nguyên liệu, giúp kết tinh các phân tử nước trong nguyên liệu thành tinh thể đá tại điểm kết tinh từ đó làm rách và phá vỡ màng tế bào để dịch bào thoát ra và đi vào trong dung môi trích ly giúp gia tăng hiệu suất trích ly TPC, AC, CGA và RA
Thí nghiệm Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Thời gian trích ly: 60 phút
30 giây; 60 giây; 90 giây; 120 giây; 150 giây
- Hàm lượng AC theo DPPH
- Thời gian chần: được chọn ở thí nghiệm 1
- Thời gian trích ly: 60 phút
Cân khoảng 10g nguyên liệu lá kinh giới tươi, sau khi thực hiện quá trình chần như quy trình được mô tả bằng hình 3.3, nguyên liệu được tiến hành lạnh đông ở nhiệt độ cố định là -18℃ và bố trí thí nghiệm nêu tại bảng 3.3; sau khi kết thúc quá trình lạnh đông mang nguyên liệu đi xay với dung môi ethanol 80%; tỷ lệ NL/ DM là 1/10 (w/v); thực hiện trích ly với điều kiện nhiệt độ 70℃ trong thời gian 60 phút Sau đó tiến hành lọc; thu nhận dịch trích và tiến hành phân tích
Các yếu tố cần khảo sát cụ thể như sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lạnh đông ở các mốc thời gian: 12 giờ; 18 giờ,
Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình lạnh đông
3.4.4 Khảo sát ảnh hưởng của quá trình hỗ trợ vi sóng đến hiệu suất trích ly
Giúp xác định thời gian tác động vi sóng, công suất vi sóng lên thành phần nguyên liệu, giúp tăng hiệu suất trích ly hàm lượng TPC, AC, CGA và RA Quá trình khảo sát gồm thời gian tác động vi sóng và công suất vi sóng
Cân 10g nguyên liệu lá kinh giới tươi, sau khi thực hiện quá trình chần kết hợp lạnh đông, sẽ tiến hành xay nguyên liệu với nước cất (thể tích cố định) và mang đi xử lý với lò vi sóng Sau đó, hỗn hợp lá kinh giới - nước cất được bổ sung thêm dung môi ethanol 99,5% để đạt được nồng độ dung môi ethanol trích ly là 80%, sử dụng tỷ lệ
Thí nghiệm Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Thời gian trích ly: 60 phút
- Hàm lượng AC theo DPPH thời gian 60 phút Sau đó tiến hành lọc; thu nhận dịch trích và tiến hành phân tích
Các yếu tố cần khảo sát cụ thể như sau:
- Khảo sát ảnh hưởng của thời gian tác động vi sóng ở các mốc thời gian: 30 giây;
- Khảo sát ảnh hưởng của công suất hoạt động lò vi sóng ở các mốc: 0W; 350W; 500W; 650W
Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của quá trình hỗ trợ vi sóng
3.4.5 Khảo sát các quá trình trích ly hoạt chất của lá kinh giới sau xử lý bằng phương pháp chần
Mục đích nghiên cứu: xác định ảnh hưởng của các thông số trích ly gồm nhiệt độ trích ly, thời gian trích ly, tỷ lệ NL/DM, nồng độ ethanol, pH phù hợp đến hiệu suất trích ly TPC, CGA và RA
Thí nghiệm Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
- Thời gian trích ly: 60 phút
Thời gian tác động vi sóng: 30 giây; 60 giây;
- Hàm lượng AC theo DPPH
- Thời gian tác động vi sóng: được chọn ở thí nghiệm 1
- Thời gian trích ly: 60 phút
Tiến hành thí nghiệm: chọn nguyên liệu lá kinh giới đã được tiền xử lý bằng phương pháp chần với các thông số phù hợp ở bảng 3.2 để thực hiện tiếp tục việc khảo sát các thông số còn lại của quá trình trích ly
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát các thông số của quá trình trích ly Thí nghiệm Yếu tố cố định Yếu tố thay đổi Hàm mục tiêu
30 phút; 45 phút; 60 phút; 75 phút; 90 phút
- Hàm lượng AC theo DPPH
- Thời gian trích ly: được chọn ở thí nghiệm 1
- Thời gian trích ly: được chọn ở thí nghiệm 1
- Nhiệt độ trích ly: được chọn ở thí nghiệm 2
- Thời gian trích ly: được chọn ở thí nghiệm 1
- Nhiệt độ trích ly: được chọn ở thí nghiệm 2
- Tỷ lệ NL/DM: được chọn từ thí nghiệm 3
- Thời gian trích ly: được chọn
- Xác định thành phần nguyên liệu lá kinh giới
- Khảo sát hình thái tế bào lá cây kinh giới bằng phương pháp chụp SEM
- Phân tích hàm lượng TPC [58]
- Phân tích hàm lượng CGA[59]
- Phân tích hàm lượng RA [60]
- Phân tích hàm lượng hoạt chất kháng oxy hóa theo DPPH [61]
Nguyên tắc và phương pháp thực hiện: theo Phụ lục 1
3.6 Phương pháp xử lý số liệu
Dữ liệu sẽ được trình bày dưới dạng giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn (SD) Sử dụng phần mềm thống kê Minitab 16 để phân tích thống kê số liệu thí nghiệm và đánh giá sự khác biệt giữa các mẫu Phân tích thống kê được thực hiện bằng phân tích ANOVA một nhân tố và kiểm định Turkey (p ≤ 0,05) để so sánh sự khác biệt giữa các giá trị trung bình có ý nghĩa về mặt thống kê Tất cả các thí nghiệm sẽ được lặp lại 3 lần thí nghiệm 2
- Tỷ lệ NL/DM: được chọn ở thí nghiệm 3
- pH: được chọn ở thí nghiệm 4
