Định lượng đồng thời rutin, acid chlorogenic và acid caffeic trong dược liệu hy thiêm (siegesbeckia orientalis l ) bằng phương pháp hplc

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI RUTIN, ACID CHLOROGENIC VÀ ACID CAFFEIC TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM (Siegesbeckia orientalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH DƯỢC HỌC Hà Nội – 2023 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC Người thực hiện: NGUYỄN THỊ HỒNG NHUNG ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI RUTIN, ACID CHLOROGENIC VÀ ACID CAFFEIC TRONG DƯỢC LIỆU HY THIÊM (Siegesbeckia orientalis L.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP HPLC KHĨA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC (NGÀNH DƯỢC HỌC) Khóa: QH.2018.Y Người hướng dẫn: TS TRẦN THỊ VÂN ANH ThS NGUYỄN VĂN KHANH Hà Nội – 2023 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành khóa luận, tơi nhận nhiều giúp đỡ quý báu vật chất lẫn tinh thần, kinh nghiệm kiến thức chuyên môn thầy cô, bạn bè gia đình Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ kính trọng lịng biết ơn sâu sắc tới TS Trần Thị Vân Anh – Giảng viên Trường Cao đẳng Y Dược Phú Thọ ThS Nguyễn Văn Khanh tận tình hướng dẫn, bảo tơi q trình thực đề tài Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo Bộ môn Bào chế Công nghệ dược phẩm Trường Đại học Y Dược – Đại học Quốc Gia Hà Nội hết lòng quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho thực nghiên cứu hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới Ban chủ nhiệm khoa, tồn thể thầy giáo Trường Đại học Y Dược - Đại học Quốc gia Hà Nội cho kiến thức quý báu q trình học tập trường Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới gia đình, bạn bè bên cạnh động viên, ủng hộ tạo điều kiện giúp đỡ suốt q trình học tập, nghiên cứu hồn thành khóa luận Sau cùng, tơi xin kính chúc thầy mạnh khỏe, hạnh phúc thành công công việc sống Hà Nội, ngày 20 tháng 05 năm 2023 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng Nhung DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT Chữ/ Ký hiệu Viết đầy đủ AMPK Adenosine Monophosphate (AMP) – activated Protein Kinase AOAC Association of Official Analytical Chemists Hiệp hội nhà Hóa phân tích CA Acid caffeic CGA Acid chlorogenic G6Pase Glucose-6-phosphatase GLUT4 Glucose transporter type Chất vận chuyển glucose loại HMGB1 High mobility group box Protein nhóm có tính di động cao HPLC High Performance Liquid Chromatography Sắc ký lỏng hiệu cao ICH International Conference on Harmonization Hội nghị quốc tế hài hịa hóa thủ tục đăng ký Dược phẩm sử dụng cho người MeCN Acetonitrile MeOH Methanol DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cây hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) Hình 1.2 Cấu trúc diterpenoid thuộc nhóm ent-pimaran glycosid chúng phân lập từ hy thiêm Hình 1.3 Cấu trúc hóa học chất phân lập từ hy thiêm Việt Nam Hình 1.4 Cấu trúc hóa học acid chlorogenic .7 Hình 1.5 Cấu trúc hóa học rutin Hình 1.6 Cấu trúc hóa học acid caffeic .12 Hình 3.1 Hình ảnh quét phổ dung dịch chuẩn chất 26 Hình 3.2 Sắc ký đồ dung dịch chuẩn hệ pha động 27 Hình 3.3 Sắc ký đồ HPLC hỗn hợp chất chuẩn (A), mẫu thử (B), mẫu trắng (C) 29 Hình 3.4 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CGA diện tích pic 31 Hình 3.5 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CA diện tích pic 31 Hình 3.6 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ rutin diện tích pic 31 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Một số phương pháp xác định CGA, CA rutin 16 Bảng 2.1 Danh sách mẫu dược liệu hy thiêm thu thập 18 Bảng 2.2 Thông tin mẫu xử lý (đợt 1) 20 Bảng 2.3 Thông tin mẫu xử lý (đợt 2) 21 Bảng 2.4 Chương trình dung môi rửa giải .21 Bảng 3.1 Chương trình dung mơi rửa giải gradient 28 Bảng 3.2 Kết đánh giá tính thích hợp hệ thống 29 Bảng 3.3 Kết phương trình tuyến tính, LOD, LOQ 30 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ lặp lại .32 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ xác trung gian 33 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phương pháp (n=3) 34 Bảng 3.7 Kết định lượng CGA, CA rutin mẫu dược liệu hy thiêm (n=3) 35 MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU HY THIÊM 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố 1.1.3 Bộ phận dùng 1.1.4 Thành phần hóa học 1.1.5 Công dụng 1.1.6 Tác dụng sinh học hy thiêm 1.2 TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT PHÂN TÍCH TRONG HY THIÊM 1.2.1 Acid Chlorogenic .7 1.2.2 Rutin 1.2.3 Acid caffeic 11 1.3 TỔNG QUAN VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HĨA HỌC CỦA HY THIÊM .13 1.3.1 Các phương pháp phân tích thành phần hóa học dược liệu .13 1.3.2 Phân tích thành phần hóa học chất nghiên cứu hy thiêm 16 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Đối tượng nghiên cứu 18 2.2 Nguyên vật liệu, thiết bị 18 2.2.1 Chất chuẩn 18 2.2.2 Dung mơi, hóa chất 19 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ .19 2.3 Phương pháp nghiên cứu .19 2.3.1 Phương pháp xử lý mẫu 19 2.3.2 Phương pháp phân tích .21 2.3.3 Phân tích mẫu thực tế .25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ 26 3.1 Khảo sát điều kiện phân tích quy trình xử lý mẫu .26 3.1.1 Lựa chọn điều kiện sắc ký 26 3.1.2 Kết khảo sát xử lý mẫu: .28 3.2 Thẩm định phương pháp định lượng 29 3.2.1 Tính thích hợp hệ thống .29 3.2.2 Độ đặc hiệu phương pháp 29 3.2.3 Khoảng tuyến tính, giới hạn phát (LOD), giới hạn định lượng (LOQ) 30 3.2.4 Độ lặp lại 32 3.2.5 Độ xác trung gian 33 3.2.6 Độ 33 3.3 Phân tích mẫu thực tế 34 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 36 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO MỞ ĐẦU Cùng với tiến cách mạng khoa học – kỹ thuật, người dần có xu hướng “trở với thiên nhiên”, Y học cổ truyền ngày quan tâm, nghiên cứu phát triển Trong đó, việc tập trung tìm kiếm, phân lập hoạt chất chữa bệnh từ loài dược liệu tự nhiên mang lại giá trị to lớn có ý nghĩa vơ thiết thực cho cơng chăm sóc sức khỏe người Cây hy thiêm có tên khoa học Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ Cúc (Asteraceae) [1], vị thuốc quý sử dụng rộng rãi Y học truyền thống Việt Nam Trung Quốc với nhiều công dụng điều trị phong thấp, nhức xương, yếu chân, bán thân bất toại, gân cốt nhức lạnh, lưng gối tê dại, khớp sưng nóng đỏ đau nhức, đau lưng, mỏi gối, mụn nhọt lở ngứa, kinh nguyệt không [2] Bên cạnh đó, số nghiên cứu tác dụng sinh học dịch chiết hy thiêm cho thấy chúng có nhiều hoạt tính ý nghĩa chống viêm, chống dị ứng, chống nhiễm khuẩn, chống oxy hóa [3-6] Về thành phần hóa học, nhiều cơng trình nghiên cứu cơng bố hy thiêm chứa nhóm chất sesquiterpenoid, diterpenoid, steroid phenolic,…[4-7] Acid hydroxycinnamic (acid chlorogenic acid caffeic), rutin có nhiều hoạt tính sinh học khả chống oxy hóa mạnh khả thu hồi gốc tự chúng Tuy nhiên, theo chuyên luận Hy thiêm Dược điển Việt Nam V khơng có tiêu định lượng chất Từ thực tiễn trên, để góp phần làm sở khoa học xây dựng tiêu chuẩn nguyên liệu đầu vào cho sản phẩm thuốc thực phẩm bảo vệ sức khỏe chứa hy thiêm cách xác, đơn giản tiết kiệm thời gian, tiến hành đề tài “Định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic rutin dược liệu hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) phương pháp HPLC” với mục tiêu: Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic rutin dược liệu hy thiêm phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Ứng dụng phương pháp để phân tích số mẫu dược liệu hy thiêm thu hái vùng khác Việt Nam CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN DƯỢC LIỆU HY THIÊM 1.1.1 Vị trí phân loại Cây hy thiêm có tên khoa học Siegesbeckia orientalis L., thuộc họ Cúc (Asteraceae), hay gọi Cỏ đĩ, Cứt lợn, Hy kiểm thảo, Hy tiên, Niêm hổ thái, Chư cao, Hổ cao, Chó đẻ hoa vàng, Nụ áo rìa, [2] Vị trí phân loại Siegesbeckia orientalis L giới thực vật: Giới: Thực vật (Plants) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ Cúc (Asterales) Họ Cúc (Asteraceae) Chi Siegesbeckia [1] 1.1.2 Đặc điểm thực vật phân bố Hy thiêm loài cỏ sống hàng năm, cao chừng 30 - 40cm đến 1m, có nhiều cành, có lơng tuyến Lá mọc đối, cuống ngắn hình ba cạnh hay thn hình trám, đầu nhọn, phía cuống thót lại, mép có cưa, mặt có lơng, dài - 10cm, rộng - 6cm Cụm hoa hình đầu, màu vàng, cuống có lơng tuyến dính Có loại bắc khơng nhau: bắc ngồi hình thìa dài -10mm, mọc tỏa thành hình sao, có lơng dính; bắc dài 5mm, hợp thành tổng bao tất mang lông tuyến dính Quả bế đen hình trứng, - cạnh dài 3mm, rộng 1mm Mùa hoa: tháng - đến tháng - 9, mùa quả: tháng - 10 Chi Siegesbeckia L có loại Việt Nam hy thiêm hy thiêm núi Hy thiêm phân bố nhiều vùng có khí hậu cận nhiệt đới nhiệt đới Trung Quốc, Ấn Độ, Nhật Bản, Australia, Ở Việt Nam, phân bố chủ yếu vùng núi trung du phía Bắc Hà Giang, Lai Châu, Sơn La, Lào Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, , đến tỉnh miền trung Thanh Hóa, Nghệ An tỉnh Tây Nguyên Cây ưa sáng ưa ẩm, thường mọc tập trung đất ẩm bãi sông, ruộng hoang, ruộng trồng ngô ven đường Độ cao 1500m Hàng năm, S (mAU.s) Acid clorogenic 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 200 y = 15.805x - 0.7734 R² = 0.9998 20 40 60 80 100 120 C (µg/ml) Hình 3.4 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CGA diện tích pic S (mAU.s) Acid caffeic 800 700 600 500 400 300 200 100 y = 7.299x - 1.0865 R² = 0.9997 50 100 150 C (µg/ml) Hình 3.5 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ CA diện tích pic Hình 3.6 Đường chuẩn biểu diễn mối quan hệ nồng độ rutin diện tích pic 31 Nhận xét: Kết thực nghiệm cho thấy, phương trình hồi quy tuyến tính bậc chất khoảng nồng độ khảo sát có mối tương quan chặt Spic nồng độ, với R2 chất phân tích nằm khoảng 0,99 – 1, chứng tỏ đường chuẩn xây dựng có độ tuyến tính cao, đảm bảo để thực phép phân tích định lượng CGA, CA rutin hy thiêm Kết LOD acid chlorogenic, acid caffeic rutin tương ứng là: - 0,036; 0,076 0,15 µg/mL Kết LOQ acid chlorogenic, acid caffeic rutin tương ứng là: - 0,12; 0,25 0,5 µg/mL 3.2.4 Độ lặp lại Xác định hàm lượng chất mẫu dược liệu thử HT-PT.01 với lần thực với xử lý mẫu điều kiện lựa chọn Kết thu trình bày Bảng 3.4 Bảng 3.4 Kết đánh giá độ lặp lại Acid chlorogenic STT Acid caffeic Rutin Spic Hàm lượng Spic Hàm lượng Spic Hàm lượng (mAU.s) (mg/g) (mAU.s) (mg/g) (mAU.s) (mg/g) 235,4 0,821 57,1 0.082 64,1 0,491 236,8 0,826 58,4 0,084 63,7 0,488 231,6 0,808 57,8 0,083 64,8 0,496 238,6 0,832 58,4 0,084 64,4 0,493 237,4 0,828 56,5 0,083 63,5 0,486 232,8 0,812 59,0 0,083 65,9 0,504 Trung bình(%) 0,821 0,083 0,493 RSD(%) 1,15 0,91 1,31 32 Kết Bảng 3.4 cho thấy phương pháp sắc ký lựa chọn cho độ lặp lại ổn định cao, với RSD chất phân tích dược liệu hy thiêm < 2,0% nằm khoảng cho phép theo quy định AOAC 3.2.5 Độ xác trung gian Thực quy trình định lượng với hai kiểm nghiệm viên khác nhau, người chuẩn bị 06 mẫu thử riêng biệt hai ngày làm việc khác Kết trình bày Bảng 3.5 Bảng 3.5 Kết khảo sát độ xác trung gian Acid chlorogenic STT Spic Hàm lượng (mAu.s) (mg/g) Acid caffeic Spic (mAu.s) Rutin Hàm lượng Spic (mg/g) (mAu.s) Hàm lượng (mg/g) 233,1 0,813 56,5 0,081 66,3 0,507 237,7 0,829 58,4 0,084 64,4 0,493 238,3 0,831 57,1 0,082 65,1 0,498 232,5 0,811 59,0 0,083 64,1 0,491 235,1 0,820 57,8 0,083 64,7 0,495 233,7 0,815 57,1 0,082 63,6 0,487 Trung bình 0,820 mg; n=6; RSD=1,03% 0,083 mg; n=6; RSD= 1,78% 0,495 mg; n=6; RSD= 1,39% KNV (n=12) RSD= 1,04% RSD=1,70% RSD=1,31% Kết RSD chất < 2,0% hàm lượng chúng ngày khác kiểm nghiệm viên không khác có ý nghĩa thống kê (p>0,05) Kết phân tích cho thấy phương pháp đạt yêu cầu độ xác theo hướng dẫn ICH 3.2.6 Độ Độ phương pháp đánh giá thông qua hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi xác định phương pháp thêm chuẩn với mức (các mức thêm lượng chất tăng dần gấp đôi so với lượng thêm trước) Tại mức nồng độ thực mẫu độc lập đem phân tích theo điều kiện chọn, kết trình bày Bảng 3.6 33 Bảng 3.6 Kết đánh giá độ phương pháp (n=3) Hàm lượng Hợp chất thêm vào (µg/mL) CGA CA Rutin Hàm lượng tìm thấy (µg/mL) Độ thu hồi (%) RSD (%) 16,42 ‒ ‒ 24,29 ± 0,12 100,0 – 102,6 1,47 16 32,03 ± 0,17 101,3 – 103,3 1,01 32 48,46 ± 0,43 98,7 – 101,4 1,33 1,64 ‒ ‒ 0,8 2,46 ± 0,01 101,3 – 103,8 1,40 1,6 3,23 ± 0,02 98,1 – 100,6 1,26 3,2 4,74 ± 0,01 96,6 – 97,2 0,37 9,82 ‒ ‒ 14,79 ± 0,07 98,4 – 101,0 1,46 10 19,80 ± 0,17 98,3 – 101,6 1,67 15 24,71 ± 0,24 97,7 – 100,9 1,62 Nhận xét: Kết cho thấy hiệu suất thu hồi trung bình acid chlorogenic từ 98,7 % đến 103,3 %, rutin từ 97,7 % đến 101,6 %, acid caffeic từ 96,6% đến 103,8 % Như vậy, phương pháp có độ đạt yêu cầu theo AOAC hiệu suất thu hồi 3.3 Phân tích mẫu thực tế Kết thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp đáng tin cậy cho việc định lượng đồng thời acid chlorogenic, rutin acid caffeic hy thiêm Áp dụng phương pháp định lượng xây dựng để xác định hàm lượng acid chlorogenic, rutin acid caffeic mẫu hy thiêm thu mua địa bàn tỉnh Phú Thọ số tỉnh khác Kết phân tích trình bày Bảng 3.7 34 Bảng 3.7.Kết định lượng CGA, CA rutin mẫu dược liệu hy thiêm (n=3) Hàm lượng (TB±SD, mg/g) Mẫu Acid chlorogenic Acid caffeic Rutin HT-PT.01 0,82 ± 0,01 0,08 ± 0,01 0,49 ± 0,02 HT-PT.02 0,38 ± 0,04 0,06 ± 0,01 0,27 ± 0,05 HT-PT.03 0,71 ± 0,06 0,11 ± 0,03 0,50 ± 0,07 HT-PT.04 0,09 ± 0,03 0,05 ± 0,00 0,07 ± 0,04 HT-HB 0,25 ± 0,03 0,02 ± 0,02 0,40 ± 0,06 HT-SL 0,52 ± 0,01 0,21 ± 0,03 0,32 ± 0,04 HT-TH 0,38 ± 0,06 0,11 ± 0,03 0,52 ± 0,02 HT-YB 0,34 ± 0,05 0,06 ± 0,01 0,12 ± 0,03 Nhận xét: Kết thu cho thấy hàm lượng chất dược liệu hy thiêm thu hái Việt Nam sau: + Acid chlorogenic nằm khoảng từ 0,09 - 0,82% Trong mẫu thu hái Tân Sơn, tỉnh Phú Thọ cho hàm lượng CGA cao (0,82%), mẫu cho hàm lượng CGA Hạ Hòa, tỉnh Phú Thọ thấp (0,09%) + Acid caffeic nằm khoảng từ 0,02 - 0,21% Trong mẫu thu hái Sơn La cho hàm lượng cao (0,21%), mẫu cho hàm lượng acid caffeic Hịa Bình thấp (0,02%) + Rutin nằm khoảng từ 0,07 - 0,52% Trong mẫu thu hái Thanh Hóa cho hàm lượng cao (0,52%), mẫu cho hàm lượng rutin Hạ Hòa, tỉnh Phú Thọ thấp (0,07%) 35 CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN Hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) loại dược liệu có vị đắng, tính hàn, quy vào kinh can, thận Theo y học cổ truyền, vị thuốc có cơng trừ phong thấp, nhiệt, giải độc dùng để chữa đau lưng, gối, xương khớp; chân tay tê buốt, mụn nhọt [2] Đối với y học đại, cao chiết chất phân lập từ hy thiêm sỏ hữu nhiều tác dụng dụng sinh học có ý nghĩa như: chống viêm, chống oxy hóa, ức chế miễn dịch, chống dị ứng, dòng tế bào u hắc sắc tố, kháng khuẩn, Bên cạnh đó, tác dụng chống viêm, giảm đau, chống oxy hóa hy thiêm chứa hàm lượng cao chất phenolic (acid caffeic, acid chlorogenic, ) flavonoid (rutin, quercetin, ) [6] Chính vậy, tập trung nghiên cứu chất acid chlorogenic, acid caffeic rutin hy thiêm để mang tới kết có triển vọng hoạt động chăm sóc sức khỏe người Hiện nay, cơng trình nghiên cứu xác định hàm lượng phenolic, có acid chlorogenic, acid caffeic, rutin hy thiêm không nhiều Năm 2017, S K Pradhan cs xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời chlorogenic, acid caffeic hy thiêm phương pháp HPTLC thu hái Bắc Ấn Độ Kết định lượng thấy hàm lượng chất dao động lớn acid chlorogenic (0,0045  1,191 mg/g khô, acid caffeic (không phát  0,328mg/g) Tuy nhiên, hàm lượng acid chlorogenic cao acid caffeic [49] Nghiên cứu thấy hàm lượng chất dao động lớn thấp so với nghiên cứu S K Pradhan cs [49] Phân đoạn D101 có hoạt tính cao chiết EtOH 50% hy thiêm xác định hàm lượng chất rutin, acid isochlorogenic A, acid isochlorogenic C darutoside HPLC-PDA, hệ dung môi ACN- acid phosphoric 0,2% rửa giải theo chế độ gradient Kết hàm lượng chất phân đoạn D101 0,24 ± 0,02; 0,47 ± 0,05; 0,59 ± 0,06 3,38 ± 0,30% [59] Nghiên cứu tập trung vào phân tích đánh giá đồng thời hàm lượng CGA, CA, rutin mẫu dược liệu hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) điều kiện phịng thí nghiệm Phương pháp HPLC phương pháp sử dụng phổ biến phân tích, kiểm nghiệm thuốc, dược liệu với nhiều ưu điểm như: vừa có khả định tính, định lượng, vừa tốn mẫu mà kết lại có độ xác chọn lọc cao Trong đề tài này, tiến hành định lượng CGA, CA rutin mẫu dược liệu hy thiêm, thu hái tỉnh thành khác Việt Nam theo phương 36 pháp HPLC xây dựng thẩm định Kết cho thấy hàm lượng chất mẫu nghiên cứu có khác nhiều, cụ thể: hàm lượng acid chlorogenic dao động từ 0,09 - 0,82% cao huyện Tân Sơn, tỉnh Phú Thọ; hàm lượng CA dao động từ 0,02 - 0,21%, cao tỉnh Sơn La cuối hàm lượng rutin nằm khoảng 0,07 - 0,52%, cao tỉnh Thanh Hóa Từ kết cho thấy, hy thiêm Việt Nam trồng vùng khác nhau, thời điểm thu hái khác hàm lượng chất có chênh lệch rõ rệt vùng Đặc biệt, hàm lượng chất phân tích đạt hàm lượng cao khu vực có khí hậu nhiệt đới gió mùa Theo tra cứu chúng tơi, chưa có cơng trình cơng bố xây dựng thẩm định phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic, rutin hy thiêm Việc chất có hoạt tính sinh học lựa chọn xây dựng phương pháp định lượng cần thiết, góp phần tiêu chuẩn hóa, đánh giá chất lượng dược liệu hy thiêm Kết nghiên cứu rằng, phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic, rutin hy thiêm đạt yêu cầu theo hướng dẫn ICH, AOAC Mặt khác, thời gian chiết xuất thời gian lưu ngắn, tiết kiệm công lao động, hóa chất, dung mơi, dễ dàng triển khai áp dụng vào thực tiễn 37 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT  Kết luận Qua trình nghiên cứu, tiến hành thí nghiệm, xử lý đánh giá kết quả, đề tài hoàn thành mục tiêu đặt ra, cụ thể sau: Đã xây dựng thẩm định thành công phương pháp định lượng đồng thời acid chlorogenic, acid caffeic rutin dược liệu hy thiêm (Siegesbeckia orientalis L.) phương pháp HPLC Nghiên cứu coi cơng trình nghiên cứu phương pháp phân tích định lượng đồng thời hoạt chất hy thiêm Đã ứng dụng phương pháp định lượng đồng thời CGA, CA rutin phương pháp HPLC xây dựng để phân tích mẫu dược liệu hy thiêm thu hái tỉnh Việt Nam Kết cho thấy hàm lượng CGA dao động từ 0,09 0,82%; hàm lượng CA nằm khoảng 0,02 - 0,21% lượng rutin dao động từ 0,07 - 0,52% (tính theo khối lượng dược liệu khơ tuyệt đối) Nghiên cứu góp phần cung cấp sở số liệu thực nghiệm cho cơng trình nghiên cứu kiểm tra, đánh giá chất lượng dược liệu hy thiêm Việt Nam  Kiến nghị Áp dụng phương pháp xây dựng để tiến hành định lượng acid chlorogenic, acid caffeic, rutin nhiều mẫu dược liệu hy thiêm vùng khác nhau, thu hái thời điểm khác Tiếp tục khảo sát thử nghiệm điều kiện sắc ký khác để tối ưu hóa phương pháp định lượng acid chlorogenic, acid caffeic rutin dược liệu hy thiêm 38 TÀI LIỆU THAM KHẢO Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Thực vật chí Việt Nam Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội; 2007 Đỗ Tất Lợi Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học, Hà Nội; 2001 X Gao, Z Rong, G Long, et al ent-Pimarane Diterpenoids from Siegesbeckia glabrescens with Anti-inflammatory Activity Bioorganic Chemistry 2020;99 doi:10.1016/j.bioorg.2020.103854 J M T Chu, W Xiong, K G Linghu, et al Siegesbeckia orientalis L Extract Attenuates Postoperative Cognitive Dysfunction, Systemic Inflammation, and Neuroinflammation Experimental Neurobiology 2018; 27(6):564-573 doi:10.5607/en.2018.27.6.564 Q Wang, Y Liang, K Li, et al Herba Siegesbeckiae: A review on Its Traditional Uses, Chemical Constituents, Pharmacological Activities and Clinical Studies Journal of Ethnopharmacology 2021; 275:114-117 doi:10.1016/j.jep.2021.114117 N T Duong, P T Thuong, I H Hwang, et al Anti-Hyperuricemic, Antiinflammatory and Analgesic Effects of Siegesbeckia orientalis L Resulting from the Fraction with High Phenolic Content BMC Complementary and Alternative Medicine 2017; 17(1):191.doi: 10.1186/s12906-017-1698-z Y Li, J Zhang, G Tian, H Shang, H Tang Kirenol, Darutoside and Hesperidin Contribute to the Anti-inflammatory and Analgesic Activities of Siegesbeckia pubescens Makino by Inhibiting COX-2 Expression and Inflammatory Cell Infiltration Journal of Ethnopharmacology 2021; 268 doi:10.1016/j.jep.2020.113547 Đỗ Bích Huy Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam Tập Nhà xuất Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội; 2011 Ying Xiang, Hua Zhang, Cheng-Qi Fan, Jian-Min Yue Novel Diterpenoids and Diterpenoid Glycosides from Siegesbeckia orientalis Chem Pharm Bull 2004; 67(9):1517-1521.doi: 10.1021/np0400407 10 Fei Wang, Xue-Lian Cheng, Ya-Ju Li, Song Shi, Ji-Kai Liu ent-Pimarane Diterpenoids from Siegesbeckia orientalis and Structure Revision of a Related Compound J Nat Prod 2009; 72(11): 2005–2008.doi: 10.1021/np900449r 11 Nam NH A Cytotoxic principle from Siegesbeckia orientalis growing in Vietnam J Chemistry 2000; 38 (4): 84-86 12 Lê Thị Kiều Nhi Nghiên cứu hoá học số hoạt chất có tác dụng chống Oxy hố chống nhiễm khuẩn từ hy thiêm (Siegesbeckia Orientalis L.) Bòn Bọt (Glochidion eriocarpum Champ) Việt Nam Luận án tiến sĩ, Đại học Quốc gia Hà Nội.2001 13 Phan Minh Giang, Phan Tong Son, Hideaki Otsuka ent-Pimarane-type diterpenoids from Siegesbeckia orientalis L Chemical & pharmaceutical bulletin 2005; 53(2): 232 – 234.doi: 10.1248/cpb.53.232 14 M.A.H Mollik, M.R Faruque, M Badruddaza, A Chowdhury, M.S Rahman Medicinal plants from Sundarbans used for the prevention of cardiovascular diseases: A pragmatic randomized ethnobotanical survey in Khulna division of Bangladesh European Journal of doi:10.1248/cpb.53.232 Integrative Medicine 2009; 1(4):231-232 15 FA Hamill, Apio, NK Mubiru, et al Traditional herbal drugs of Southern Uganda, II: literature analysis and antimicrobial assays Journal of Ethnopharmacology 2003; 84(1):57-78.doi: 10.1016/s0378-8741(02)00289-1 16 Jian-ping Wang, Ya-ming Zhou, Yu-jie Ye, et al Topical anti-inflammatory and analgesic activity of kirenol isolated from Siegesbeckia orientalis Journal of Ethnopharmacology 2011; 137(3):1089-1094.doi: 10.1016/j.jep.2011.07.016 17 Ming Hao Yin, Dae Gill Kang, Deok Ho Choi, Tae Oh Kwon, Ho Sub Lee Screening of vasorelaxant activity of some medicinal plants used in Oriental medicines Journal of Ethnopharmacology 2005; 99(1):113-117 doi:10.1016/j.jep.2005.02.013 18 Chae Hee Hong, Sun Kyung Hur, O-Jin Oh, et al Evaluation of natural products on inhibition of inducible cyclooxygenase (COX-2) and nitric oxide synthase (iNOS) in cultured mouse macrophage cells Journal of Ethnopharmacology 2002; 83(1-2):153-159.doi: 10.1016/s0378-8741(02)00205-2 19 Jeng-De Su, Toshihiko Osawa, Mitsuo Namiki Screening for Antioxidative Activity of Crude Drugs Agricultural and Biological Chemistry 1986; 50(1):199203.doi: 10.1080/00021369.1986.10867357 20 Dae Gill Kang, Chi keun Yun, Ho Sub Lee Screening and comparison of antioxidant activity of solvent extracts of herbal medicines used in Korea Journal of Ethnopharmacology 2003; 87(2-3):231-236.doi: 10.1016/s0378-8741(03)00142-9 21 Nancy J Ganson, Susan J Kelly, Edna Scarlett, John S Sundy, Michael S Hershfield Control of hyperuricemia in subjects with refractory gout, and induction of antibody against poly(ethylene glycol) (PEG), in a phase I trial of subcutaneous PEGylated urate oxidase Arthritis research & therapy 2006; 8(1):R12.doi: 10.1186/ar1861 22 W J Hwang, E J Park, C H Jang, et al Inhibitory effect of immunoglobulin E production by jin-deuk-chal (Siegesbeckia orientalis) Immunopharmacology and Immunotoxicology 2001; 23(4):555-563.doi: 10.1081/iph-100108601 23 Nguyễn Văn Đồng, Hoàng Trạch, Nguyễn Thích Bình Tác dụng hy thiêm tới chuyển hóa lipid đơng máu Tạp chí dược học 1994: 17 -18 24 Compound summary for CID 1794427: Chlorogenic acid.PubChem compound Database September 16,2004 April 29,2023 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/1794427 25 Nguyễn Thị Mai, Nguyễn Thị Kiều Anh Xây dựng thẩm định phương pháp định lượng acid chlorogenic viên nang mềm Bổ gan sắc ký lỏng hiệu cao, Tạp chí Dược học 2018; 58(4):35-39 26 Naveed M, Hejazi V, Abbas M, Kamboh AA, Khan GJ Chlorogenic acid (CGA): A pharmacological review and call for further research Biomedicine & Pharmacotherapy 2018; 97:67-74.doi: 10.1016/j.biopha.2017.10.064 27 Tajik N, Tajik M, Mack I, Enck P The potential effects of chlorogenic acid, the main phenolic components in coffee, on health: A comprehensive review of the literature European Journal of Nutrition 2017; 56(7):2215-2244 doi:10.1007/s00394-017-1379-1 28 Zhang LY, Cosma G, Gardner H, Vallyathan V, Castranova V Effect of chlorogenic acid on hydroxyl radical Molecular and Cellular Biochemistry 2003; 247(1-2):205-210.doi: 10.1023/a:1024103428348 29 Tsuchiya T, Suzuki O, Igarashi K Protective effects of chlorogenic acid on paraquat-induced oxidative stress in rats Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 1996; 60(5):765-768.doi: 10.1271/bbb.60.765 30 Ong KW, Hsu A, Tan BKH Anti-diabetic and anti-lipidemic effects of chlorogenic acid are mediated by ampk activation Biochemical Pharmacology 2013; 85(9):1341-1351.doi: 10.1016/j.bcp.2013.02.008 31 Tousch D, Lajoix AD, Hosy E, Azay MJ, Ferrare K Chicoric acid, a new compound able to enhance insulin release and glucose uptake Biochemical and Biophysical Research Communications doi:10.1016/j.bbrc.2008.09.088 2008; 377(1):131-135 32 Watanabe T, Arai Y, Mitsui Y, et al The blood pressure-lowering effect and safety of chlorogenic acid from green coffee bean extract in essential hypertension Clinical and Experimental doi:10.1080/10641960600798655 Hypertension 2006; 28(5):439-449 33 Compound summary for CID 5280805 : Rutin.PubChem compound Database June 24,2005 April 29,2023 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/5280805 34 Bộ y tế Dược điển Việt Nam II Tập 3, NXB Y học, Hà Nội 1994 35 Beatriz Gullón, Thelmo A Lú-Chau, María Teresa Moreira, et al Rutin: A review on extraction, identification and purification methods, biological activities and approaches to enhance its bioavailability Trends in food science & technology 2017; 67:220-235.doi: 10.1016/j.tifs.2017.07.008 36 Adaze Bijou Enogieru, William Haylett, Donavon Charles Hiss, Soraya Bardien, Okobi Eko Ekpo Rutin as a potent antioxidant: Implications for neurodegenerative disorders Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2018; 2018.doi: 10.1155/2018/6241017 37 Kamalakkannan N, P Stanely Mainzen Prince Rutin improves the antioxidant status in streptozotocin-induced diabetic rat tissues Molecular and cellular biochemistry 2006; 293(1-2):211-219.doi: 10.1007/s11010-006-9244-1 38 Jianxiong Yang, Juan Guo, Jiangfeng Yuan In vitro antioxidant properties of rutin", LWT - Food Science and Technology 2008; 41(6):1060-1066 doi:10.1016/j.lwt.2007.06.010 39 Ghorbani Ahmad Mechanisms of antidiabetic effects of flavonoid rutin Biomedicine & Pharmacotherapy doi:10.1016/j.biopha.2017.10.001 2017; 96:305-312 40 Ganeshpurkar A, Ajay K Saluja The pharmacological potential of rutin, Saudi Pharmaceut Saudi pharmaceutical journal 2017; 25(2):149-164 doi:10.1016/j.jsps.2016.04.025 41 Teresita Guardia, Alejandra Ester Rotelli, Américo Osvaldo Juarez, Lilian Eugenia Pelzer Anti-inflammatory properties of plant flavonoids Effects of rutin, quercetin and hesperidin on adjuvant arthritis in rat Il farmaco 2001; 56(9):683687.doi: 10.1016/s0014-827x(01)01111-9 42 Eleanor E Deschner, Jeanne Ruperto, George Wong, Harold L Newmark Quercetin and rutin as inhibitors of azoxymethanol-induced colonic neoplasia Carcinogenesis 1991; 12(7):1193-1196.doi: 10.1093/carcin/12.7.1193 43 Angel Josabad Alonso-Castro, Fabiola Domínguez, Alejandro GarcíaCarrancá Rutin exerts antitumor effects on nude mice bearing SW480 tumor Archives of medical doi:10.1016/j.arcmed.2013.06.002 research 2013; 44(5):346-351 44 Farnoud Nasiri, Gorkem Kismali, Merve Alpay, et al Rutin enhances the antiproliferative effect of 5-FU and oxaliplatin in colon cancer cells ed: AACR, 2016; 76:2177.doi: 10.1158/1538-7445.AM2016-2177 45 Compound summary for CID 689043 : Caffeic acid.PubChem compound Database September 16,2004 April 29,2023 https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/689043 46 Kaio Murilo Monteiro Espíndola, Roseane Guimarães Ferreira, Marta Chagas Monteiro, et al Chemical and Pharmacological Aspects of Caffeic Acid and Its Activity in Hepatocarcinoma Oxidative Medicine and Cellular Longevity 2019; 9:541.doi: 10.3389/fonc.2019.00541 47 Ekeuku SO, Pang KL, Chin KY (2020), “Effects of Caffeic Acid and Its Derivatives on Bone: A Systematic Review” Drug design, development and therapy 2021; 15:259 – 275.doi: 10.2147/DDDT.S287280 48 Bộ y tế Dược liệu học Tập 1, NXB Y học, Hà Nội 2007: 75-76 49 Saroj Kumar Pradhan, Raghbir Chand Gupta, Rajesh Goel & Raman Preet Simultaneous Determination of Chlorogenic and Caffeic Acid in Siegesbeckia orientalis L (Xi Xian) by a Validated High-Performance Thin-Layer Chromatographic Method Journal of Planar Chromatography - Modern TLC 2017; 30(6):516-520.doi: 10.1556/1006.2017.30.6.9 50 Raha Orfali,Shagufta Perveen, Hanan Y Aati, et al High-Performance ThinLayer Chromatography for Rutin, Chlorogenic Acid, Caffeic Acid, Ursolic Acid, and Stigmasterol Analysis in Periploca aphylla Extracts MDPI Journal Separation 2021; 8(4): 44.doi:10.3390/separations8040044 51 Chayanon Chaowuttikul, Chanida Palanuvej, Nijsiri Ruangrungsi, et al Quantification of chlorogenic acid, rosmarinic acid, and caffeic acid contents in selected Thai medicinal plants using RP-HPLC-DAD Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences 2020; 56.doi: 10.1590/s2175-97902019000317547 52 Lucía Gayoso, An-Sophie Claerbout, María Isabel Calvo, et al Bioaccessibility of rutin, caffeic acid and rosmarinic acid: Influence of the in vitro gastrointestinal digestion models Journal of Functional Foods 2016; 26: 428 – 438.doi: 10.1016/j.jff.2016.08.003 53 Di Wu, Zhengtao Wang, Mian Zhang Simultaneous determination of rutin, isoquercitrin and chlorogenic acid in Farfarae Flos by HPLC China journal of Chinese materie medica 2010; 35(20): 2722 – 2725 54 Michael W.Dong Modern HPLC for Practicing Scientists A John Wiley & Sons, Inc.,Publication 2006; 20–25.doi: 10.1002/0471973106.CH4 55 International Conference on Harmonization Topic Q2A: Validation of Analytical Methods: Definitions and Terms ICH Harmonised Tripartite Guideline 1994 56 International Conference on Harmonization Topic Q2B: Validation of Analytical Procedures: Methodology ICH Harmonised Tripartite Guideline 1996 57 AOAC International Guidelines for Dietary Supplements and Botanicals AOAC Official 2013 58 Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh thực phẩm quốc gia Thẩm định phương pháp phân tích hóa học vi sinh vật, NXB Khoa học Kỹ thuật 2010 59 J M T Chu, A Abulimiti, B S H Wong, et al Sigesbeckia orientalis L Derived Active Fraction Ameliorates Perioperative Neurocognitive Disorders Through Alleviating Hippocampal Neuroinflammation Frontiers in Pharmacology 2022; 13