các vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện và sự đề kháng kháng sinh tại bệnh viện nhân dân gia định

Nhìn chung, vi khuẩn Gram âm gâyVPBV thường Ďa kháng thuốc Ďược Ďịnh nghĩa là kháng với ít nhất ba nhómkháng sinh trở lên 4 cũng như kháng với các loại thuốc quan trọng nhưcephalosporins

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Viêm phổi bệnh viện 3

1.2 Vi khuẩn thường gây viêm phổi bệnh viện và một số kiểu gene Ďề khángkháng sinh 7

1.3 Phân bố vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện 13

1.4 Tình hình Ďề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện 15

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20

2.1 Thiết kế nghiên cứu 20

2.2 Đối tượng nghiên cứu 20

2.3 Thời gian và Ďịa Ďiểm nghiên cứu 21

2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu 21

2.5 Các biến số Ďộc lập và phụ thuộc 22

2.6 Phương pháp và công cụ Ďo lường, thu thập số liệu 23

2.7 Quy trình nghiên cứu 23

2.8 Phương pháp phân tích dữ liệu 31

2.9 Đạo Ďức trong nghiên cứu 36

Chương 3 KẾT QUẢ 37

3.1 Đặc Ďiểm chung của mẫu nghiên cứu 37

3.2 Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện Ďược phân lập 39

3.3 Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện 43

3.4 Phân bố các gene Ďề kháng kháng sinh 49

Chương 4 BÀN LUẬN 55

4.1 Đặc Ďiểm chung của mẫu nghiên cứu 55

4.2 Tác nhân vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện 57

4.3 Đề kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện 63

4.4 Phân bố các gene Ďề kháng kháng sinh 67

KẾT LUẬN 73

KIẾN NGHỊ 75TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam Ďoan Ďây là công trình nghiên cứu của riêng tôi Các kếtquả nghiên cứu Ďược trình bày trong luận văn là trung thực, khách quan vàchưa từng Ďược công bố trong bất kỳ công trình nào khác.

NGUYỄN SỬ MINH TUYẾT

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A baumannii Acinetobacter baumannii

AFB Acid-Fast Bacilli

AmpCAmpicillin Class C beta-lactamases

ATCC American Type Culture Collection

BAL Bronchoalveolar lavage Dịch rửa phế quản phế nang

E coli Escherichia coli

ESBL Extended-spectrum lactamase

MALDI-TOF Matrix-Assisted Laser DesorptionIonization/Time of Flight

NDM-1 New Delhi metallo-β-lactamase

OUCRU Oxford University ClinicalResearch Unit

Đơn vị nghiên cứu lâm sàngĐại học Oxford

TSB Tryptic Soy Broth

VIM Verona integron-encodedmetallo-β-lactamase

VPBV Hospital-acquired pneumonia Viêm phổi bệnh viện

VPLQTM Ventilator-associated pneumonia Viêm phổi liên quan thở máyVRE Vancomycin-resistant

Enterococci kháng vancomycin

XDR Extensively drug-resistant Kháng mở rộng

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1: Các biến số nghiên cứu 22

Bảng 2.2: Quy trình nghiên cứu 23

Bảng 2.3: Tiêu chuẩn phiên giải kết quả nhạy cảm Ďối với tigecycline 26

Bảng 2.4: Trình tự mồi Ďặc hiệu của các vùng gene nghiên cứu 30

Bảng 2.5: Nhóm kháng sinh và kháng sinh Ďược sử dụng trong phân loạiMDR, XDR và PDR Ďối với S aureus 32

Bảng 2.6: Nhóm kháng sinh và kháng sinh Ďược sử dụng trong phân loạiMDR, XDR và PDR Ďối với Enterobacteriaceae 33

Bảng 2.7: Nhóm kháng sinh và kháng sinh Ďược sử dụng trong phân loạiMDR, XDR và PDR Ďối với P aeruginosa 34

Bảng 2.8: Nhóm kháng sinh và kháng sinh Ďược sử dụng trong phân loạiMDR, XDR và PDR Ďối với Acinetobacter spp 35

Bảng 3.1: Phân bố người bệnh theo các nhóm tuổi 37

Bảng 3.2: Phân bố người bệnh theo giới 38

Bảng 3.3: Số loài vi khuẩn phân lập trên mỗi người bệnh 38

Bảng 3.4: Phân bố vi khuẩn thường gây VPBV 39

Bảng 3.5: Phân bố vi khuẩn gây VPBV theo khoa lâm sàng 40

Bảng 3.6: Phân bố vi khuẩn Ďa kháng thuốc gây VPBV theo nhóm tuổi 42

Bảng 3.7: Phân bố vi khuẩn Ďa kháng thuốc gây VPBV theo khoa lâm sàng 42

Bảng 3.8: Nồng Ďộ ức chế tối thiểu Ďối với colistin 47

Bảng 3.9: Phân bố gene mã hoá ESBL ở vi khuẩn Gram âm 49

Bảng 3.10: Phân bố gene mã hoá carbapenemase ở vi khuẩn Gram âm 50

Bảng 3.11: Phân bố gene kháng thuốc ở vi khuẩn theo khoa lâm sàng 53

Bảng 3.12: Phân bố gene kháng ở vi khuẩn Ďa kháng thuốc 54

Bảng 4.1: So sánh tỷ lệ % các vi khuẩn gây VPBV 58

DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ

Biểu Ďồ 3.1: Phân bố vi khuẩn gây VPBV theo Ďặc Ďiểm kháng thuốc 41

Biểu Ďồ 3.2: Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của Escherichia coli (n=12) 43Biểu Ďồ 3.3: Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của Klebsiella pneumoniae (n=41) 44Biểu Ďồ 3.4: Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của Pseudomonas aeruginosa (n=30) 45Biểu Ďồ 3.5: Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của Acinetobacter baumannii (n=142) 46Biểu Ďồ 3.6: Tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của Staphylococcus aureus (n=9) 48

Biểu Ďồ 3.7: Phân bố gene mã hoá ESBL hoặc carbapenemase ở vi khuẩnGram âm 51

Biểu Ďồ 3.8: Phân bố gene kháng methicillin và vancomycin ở S aureus (n=9) 52

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler 8

ĐẶT VẤN ĐỀ

Viêm phổi mắc phải tại bệnh viện (VPBV) là một vấn Ďề thách thứctrong hệ thống chăm sóc sức khỏe trên toàn thế giới VPBV xảy ra với tỷ lệ từ5 Ďến 10 trên 1000 ca nhập viện và Ďược coi là nguyên nhân phổ biến nhấtgây nhiễm khuẩn bệnh viện ở châu Âu và Hoa Kỳ 1,2 Gần 90% các Ďợt viêmphổi xảy ra tại các khoa Hồi sức tích cực (HSTC) trên người bệnh Ďặt nội khíquản và thở máy 3.

Các tác nhân gây VPBV phổ biến bao gồm trực khuẩn Gram âm

Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae,Acinetobacter spp và cầu khuẩn Gram dương Staphylococcus aureus, Ďặcbiệt S aureus kháng methicillin 1,2 Nhìn chung, vi khuẩn Gram âm gâyVPBV thường Ďa kháng thuốc (Ďược Ďịnh nghĩa là kháng với ít nhất ba nhómkháng sinh trở lên 4) cũng như kháng với các loại thuốc quan trọng nhưcephalosporins thế hệ 3, carbapenems và colistin, làm hạn chế các lựa chọnĎiều trị 5

Tại Việt Nam, các công bố từ các trung tâm y tế lớn trong cả nước cho

thấy tác nhân gây VPBV thường gặp là A baumannii, P aeruginosa, K.pneumoniae, E coli và S aureus Các vi khuẩn gây VPBV có Ďề kháng khángsinh cao và trên 50% là vi khuẩn Ďa kháng A baumannii và P aeruginosa Ďềkháng trên 70% với hầu hết các kháng sinh K pneumoniae Ďề kháng trên

60% Ďối với phần lớn các kháng sinh sử dụng 6–11

Bệnh viện Nhân Dân Gia Định là một trong những bệnh viện Ďa khoatuyến cuối tại thành phố Hồ Chí Minh, là Ďơn vị tiếp nhận Ďiều trị các trườnghợp vượt tuyến chuyên môn, bệnh lý nặng từ các cơ sở y tế tuyến dưới Tìmhiểu tính kháng kháng sinh của các tác nhân gây VPBV ở Ďây sẽ cung cấpnhững dữ liệu quan trọng Ďể xây dựng các hướng dẫn Ďiều trị kháng sinh kinh

nghiệm ban Ďầu và cải thiện các biện pháp phòng chống nhiễm khuẩn bệnhviện.

Xuất phát từ những vấn Ďề trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu “Các vi

khuẩn gây viêm phổi bệnh viện và sự đề kháng kháng sinh tại bệnh việnNhân Dân Gia Định” với các mục tiêu:

1 Xác Ďịnh tỷ lệ các vi khuẩn E coli, K pneumoniae, P aeruginosa, A.baumannii, và S aureus gây VPBV

2 Xác Ďịnh tỷ lệ Ďề kháng kháng sinh của các vi khuẩn gây VPBV Ďượcphân lập như trên.

3 Xác Ďịnh tỷ lệ các gene mã hoá ESBL và carbapenemase ở E coli, K.pneumoniae, P aeruginosa, A baumannii và các gene kháng methicillinvà vancomycin ở S aureus.

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU1.1 Viêm phổi bệnh viện

Viêm phổi trong nghiên cứu này Ďược Ďịnh nghĩa là có ít nhất mộtchủng vi khuẩn gây bệnh có liên quan về mặt lâm sàng, Ďược phân lập từ mộttrong các bệnh phẩm (Ďàm, dịch rửa phế quản, dịch hút nội khí quản) thuĎược từ người bệnh có triệu chứng lâm sàng viêm phổi.

Viêm phổi bệnh viện (VPBV) còn gọi là viêm phổi mắc phải bệnh viện(hospital-acquired pneumonia) là viêm phổi xuất hiện sau khi vào viện 48 giờmà không có biểu hiện hoặc ủ bệnh tại thời Ďiểm vào viện.

Viêm phổi liên quan thở máy (VPLQTM) (ventilator-associatedpneumonia) là viêm phổi xuất hiện sau khi Ďặt ống nội khí quản 48 giờ.

Viêm phổi bệnh viện và viêm phổi liên quan thở máy Ďược coi là hainhóm bệnh riêng biệt.

Tuy nhiên, cả VPBV và VPLQTM Ďều xảy ra trong thời gian nằm Ďiềutrị tại bệnh viện, nguyên nhân gây bệnh thường do các vi khuẩn bị lây nhiễmtrong bệnh viện Do vậy, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng viêm phổibệnh viện bao gồm cả hai nhóm trên.

1.1.2 Tỷ lệ mắc VPBV

Viêm phổi bệnh viện chiếm 22% tổng số ca nhiễm khuẩn bệnh việntrong các cuộc khảo sát ở Hoa Kỳ và châu Âu 2 VPLQTM Ďóng góp gần 50%các trường hợp VPBV và là nguyên nhân chính làm gia tăng tỷ lệ mắc bệnhvà tử vong Tỷ lệ tử vong do VPLQTM dao Ďộng từ 13 Ďến 15% ở cả cácnước phát triển và Ďang phát triển 12

Tuy nhiên, có sự khác biệt Ďáng kể về

tần suất mắc VPLQTM tại các khoa HSTC ở Hoa Kỳ và châu Âu Tần suấtVPLQTM trung bình ở châu Âu là 8,9/1000 ngày thở máy cao hơn Ďáng kể sovới ở Hoa Kỳ 1-2,5/1000 ngày 13.

Ở châu Á, theo nghiên cứu của Muhammad Imran và cộng sự 14

tạikhoa HSTC Shifa International Hospital thuộc Islamabad, Pakistan từ01/2013-01/2014, tần suất mắc VPBV là 25,4% Tỷ lệ tử vong do VPBV là47,7%.

Tại Trung Quốc, theo kết quả các nghiên cứu Ďã cho thấy tần suất mắcVPBV 13,9/1000 ngày, trong Ďó tần suất mắc cao nhất tại khoa HSTC30,1/1000 ngày Tỷ lệ tử vong trong 30 ngày do VPBV 18,5% và VPLQTM42,5% 15,16.

Ở vùng Đông Nam Á, theo tổng quan từ 24 bài báo Ďăng tải từ01/2000-9/2020 17 Ďã cho thấy tỷ lệ VPLQTM là 2,13-116/1000 ngày thởmáy, tỷ lệ này thay Ďổi giữa các nước khác nhau trong khu vực, thấp nhất ởHàn Quốc và cao nhất ở Ấn Độ Tỷ lệ tử vong cao Ďáng kể 16,2-74,1%, tỷ lệtử vong cao nhất Ďược ghi nhận tại Ấn Độ.

Theo nghiên cứu của Vũ Đình Phú và cộng sự, khảo sát từ 09/2013 tại 15 Ďơn vị HSTC của các bệnh viện trong cả nước cho thấy tỷ lệVPBV chiếm 79,4% các trường hợp nhiễm khuẩn bệnh viện, trong Ďó 48,4%là viêm phổi mắc phải trong thời gian Ďiều trị tại khoa HSTC 18.

10/2012-Theo báo cáo từ Hội Hô hấp Việt Nam, Hội Hồi sức cấp cứu và chốngĎộc Việt Nam, từ năm 2011-2015, tỷ lệ VPLQTM tại các khoa HSTC bệnhviện Bạch Mai, Chợ Rẫy và Nhân Dân Gia Định là 30,0 - 55,3% Tần suất

VPLQTM ở khoa HSTC bệnh viện Bạch Mai năm 2015 là 24,8/1000 ngàythở máy 11.

- Có ít nhất một trong các dấu hiệu sau:

 Nhiệt Ďộ > 38ºC hoặc < 36ºC

 Tăng bạch cầu (≥ 12000/mm3

) hoặc giảm bạch cầu (≤ 4000/mm3)

 Thay Ďổi ý thức ở người bệnh cao tuổi (≥ 70 tuổi).- Và có ít nhất hai trong các dấu hiệu sau:

 Đàm mủ hoặc thay Ďổi tính chất của Ďàm hoặc tăng tiết Ďàm hoặc tăngnhu cầu hút Ďàm

 Ho hoặc ho tăng lên, hoặc khó thở hoặc thở nhanh

 Khám phổi có ran

 Xét nghiệm khí máu xấu Ďi: giảm oxy máu, tăng nhu cầu oxy hoặc cầnthở máy.

Tổn thương mới xuất hiện hoặc tổn thương tiến triển trên phim phổi vàkhông mất Ďi nhanh, có thể chụp X-quang phổi hoặc chụp cắt lớp vi tính phổi.Các dạng tổn thương trên phim phổi có thể gặp là: thâm nhiễm, Ďông Ďặc, tạohang.

Các tác nhân gây VPBV thường gặp: A baumannii, P aeruginosa, K.pneumoniae, E coli và S aureus.

Nuôi cấy vi khuẩn từ dịch tiết Ďường hô hấp dưới bằng kỹ thuật cấyĎịnh lượng hoặc bán Ďịnh lượng.

Cấy Ďịnh lượng các bệnh phẩm xâm nhập bao gồm các kỹ thuật qua nộisoi phế quản (dịch rửa phế quản phế nang, chải Ďàm có bảo vệ) và lấy mẫuphế quản mù; và bệnh phẩm không xâm nhập (dịch hút nội khí quản) với tiêuchuẩn chẩn Ďoán VPBV:

- Bệnh phẩm lấy bằng phương pháp chải Ďàm có bảo vệ (protectedspecimen brush-PSB): số lượng vi khuẩn ≥ 103 CFU/mL

- Dịch rửa phế quản phế nang (bronchoalveolar lavage-BAL): số lượng vi

Nuôi cấy bán Ďịnh lượng bệnh phẩm không xâm nhập có thể thực hiệnnhanh hơn, ít biến chứng hơn, và Ďòi hỏi ít nguồn lực hơn so với cấy Ďịnhlượng bệnh phẩm xâm nhập Do Ďó, trong Hướng dẫn quản lý VPBV năm2016, Hiệp hội Bệnh truyền nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Society ofAmerica) và Hiệp hội Lồng ngực Hoa Kỳ (American Thoracic Society) Ďãkhuyến cáo sử dụng kỹ thuật cấy bán Ďịnh lượng bệnh phẩm không xâm nhậptrong chẩn Ďoán, Ďiều trị VPBV.

1.2 Vi khuẩn thường gây VPBV và một số kiểu gene đề kháng khángsinh

Theo Hiệp hội Bệnh truyền nhiễm Hoa Kỳ (Infectious Diseases Societyof America) và Hiệp hội Lồng ngực Hoa Kỳ (American Thoracic Society),

các tác nhân gây VPBV thường gặp bao gồm: P aeruginosa, E coli, K.pneumoniae, Acinetobacter spp và S aureus 1 Tỷ lệ VPBV do các tác nhânĎa kháng thuốc Ďã gia tăng Ďáng kể, Ďặc biệt ở các khoa HSTC 20,21

và phầnlớn tử vong do các tác nhân vi khuẩn Ďa kháng này 22

Cơ chế kháng thuốc ở những vi khuẩn này Ďã phát triển nhanh chóngdo sự hiện diện của áp lực chọn lọc Cơ chế bảo vệ của vi khuẩn chống lạikháng sinh liên quan Ďến việc sản xuất các enzyme vô hiệu hóa kháng sinh,chẳng hạn như một số loại β-lactamase (Hình 1.1) hoặc các enzyme biến Ďổiaminoglycosides, thay Ďổi Ďích gắn kết kháng sinh và giảm nồng Ďộ khángsinh nội bào, bằng cách hạn chế sự xâm nhập của kháng sinh hoặc tạo Ďiềukiện cho việc bơm Ďẩy kháng sinh ra khỏi tế bào 23

Ambler Ďã dựa vào cấu trúc protein chính của enzyme, phân loạienzyme beta-lactamase thành bốn lớp A, B, C, D Vị trí hoạt Ďộng củaenzyme lớp A, C, D chứa serine cần thiết Ďể thủy phân vòng beta-lactam,trong khi enzyme lớp B Ďòi hỏi Ďồng yếu tố kẽm Ďể hoạt Ďộng (do Ďó gọi làmetallo-β-lactamase) 23.

Hình 1.1 Phân loại enzyme beta-lactamase theo Ambler

“Nguồn: Antibiotics, 2021”23

1.2.1 Escherichia coli

E coli là trực khuẩn Gram âm, thuộc họ vi khuẩn Ďường ruột

(Enterobacteriaceae) 24, là tác nhân gây bệnh kháng thuốc thường Ďược phânlập nhất ở châu Âu trong năm 2015, gây ra hơn 307.000 ca nhiễm khuẩn và

9828 ca tử vong, vượt hơn cả số ca nhiễm khuẩn và tử vong do S.aureus và P.aeruginosa cộng lại Trong Ďó, hơn 297.000 ca nhiễm khuẩn và 9000 ca tửvong do chủng E coli kháng cephalosporins thế hệ thứ ba gây ra Ngoài ra,7156 ca nhiễm khuẩn và 621 ca tử vong là do vi khuẩn E coli kháng colistin

và thêm 2619 ca nhiễm khuẩn và 141 ca tử vong do các chủng khángcarbapenems 22.

Các chủng E coli sản sinh ra nhiều loại β-lactamase, bao gồm ESBL,

AmpC và nhóm carbapenemase lớp A, B và D ESBL Ďầu tiên Ďược xác Ďịnh

ở E coli trong những năm 1980 là các biến thể của SHV-ESBL và ESBL Tuy nhiên, sự phân bố ESBL ở E coli Ďã thay Ďổi kể từ Ďó, với CTX-

TEM-M-ESBL trở thành biến thể chiếm ưu thế 25.

Sự Ďề kháng ngày càng tăng Ďối với các cephalosporins thế hệ thứ ba,do sự gia tăng tỷ lệ các chủng sản xuất ESBL và AmpC Ďã dẫn Ďến việc sử

dụng các kháng sinh carbapenems ngày càng tăng trong nhiễm khuẩn do E.coli Điều này Ďã dẫn Ďến sự xuất hiện của các chủng kháng carbapenems.

Mặc dù một số trường hợp Ďề kháng carbapenems có thể xảy ra qua việc sảnxuất bơm Ďẩy kháng sinh hoặc thông qua sự kết hợp của Ďột biến kênh porinvới sự biểu hiện quá mức của ESBL hoặc AmpC, trong phần lớn các trườnghợp, tình trạng kháng thuốc xảy ra thông qua việc sản xuất carbapenemase 26

.Các biến thể carbapenemase phổ biến nhất ở Enterobacteriaceae là

Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) thuộc loại A, NDM, VIM vàIMP thuộc loại B và OXA-48 thuộc loại D Ở E coli, các carbapenemase phổ

biến nhất là NDM và OXA-48 23

1.2.2 Klebsiella pneumoniae

K pneumoniae là trực khuẩn Gram âm, thuộc họ vi khuẩn Ďường ruột

(Enterobacteriaceae) 24, một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất ởcác Ďơn vị chăm sóc sức khỏe Vi khuẩn có khả năng hình thành các màngsinh học và bám dính vào cả bề mặt và ký chủ người cho phép nó tồn tại vàlây lan nhanh chóng trong môi trường bệnh viện và chiếm cư trên người bệnh.

Hơn nữa, khả năng thu nhận các plasmid kháng thuốc Ďã khiến K.pneumoniae Ďa kháng kháng sinh trở thành một vấn Ďề toàn cầu; một số quốcgia Ďã báo cáo rằng hơn một nửa số ca lâm sàng do K pneumoniae có khả

năng kháng lại tất cả các loại kháng sinh hiện có 5 Ở châu Âu, chủng K.pneumoniae Ďề kháng kháng sinh gây ra gần 92.000 ca nhiễm khuẩn và 7500ca tử vong trong năm 2015 K pneumoniae Ďề kháng cephalosporins thế hệ

thứ ba là nguyên nhân gây ra 68.588 ca nhiễm khuẩn và 3687 ca tử vong,

trong khi các chủng kháng carbapenems và colistin gây ra lần lượt là 15.947và 7450 ca nhiễm và 2118 và 1635 ca tử vong 22

K pneumoniae Ďề kháng tự nhiên với các penicillins, chẳng hạn như

ampicillin, do sản xuất một số β-lactamase thế hệ thứ nhất như SHV-1 vàTEM-1, và có thể thu Ďược Ďề kháng cephalosporins thế hệ thứ nhất và thứhai thông qua quá trình sản xuất các men β-lactamase phổ rộng Đề kháng vớicephalosporins thế hệ thứ ba và thứ tư xảy ra thông qua việc sản xuất ESBLhoặc AmpC 26

Đề kháng các kháng sinh carbapenems là loại kháng β-lactam Ďáng chú

ý nhất ở K pneumoniae, xảy ra thông qua các cơ chế khác nhau Một số loạicarbapenemase có thể Ďược tìm thấy ở K pneumoniae, chẳng hạn như KPCvà NDM, cả hai Ďều Ďược phân lập lần Ďầu tiên ở K pneumoniae, cũng như

các men carbapenemase loại OXA 27,28.

1.2.3 Pseudomonas aeruginosa

P aeruginosa là một trong những trực khuẩn Gram âm Ďa kháng khángsinh quan trọng nhất, Ďứng thứ hai chỉ sau E coli về số ca nhiễm khuẩn và tửvong P aeruginosa Ďa kháng thuốc gây ra hơn 72.000 ca nhiễm khuẩn và

hơn 4800 ca tử vong ở châu Âu hàng năm Trong số này, ước tính có 61.892ca nhiễm khuẩn và 4155 ca tử vong do các chủng kháng carbapenems, trongkhi 1262 ca nhiễm khuẩn và 84 ca tử vong là do chủng kháng colistin 22.

P aeruginosa có cả cơ chế Ďề kháng tự nhiên và thu Ďược kháng lại các

β-lactam Cơ chế Ďề kháng tự nhiên bao gồm bơm Ďẩy kháng sinh, cũng như

sản xuất một số men lactamase Đặc biệt, P aeruginosa có các men

β-lactamase AmpC và ESBL Ďược mã hóa trên nhiễm sắc thể Vi khuẩn sảnxuất nhiều loại ESBL loại A khác nhau như TEM, SHV và các ESBL loại Dnhư β-lactamase loại oxacillinase (OXA-type β-lactamase) Cơ chế Ďề kháng

β-lactam thu Ďược ở P aeruginosa bao gồm Ďột biến kênh porin, sự biểu hiện

quá mức của các enzyme thủy phân như AmpC; sự biểu hiện quá mức của cácbơm Ďẩy; biến Ďổi protein gắn penicillin (penicillin-binding proteins, PBPs),và cuối cùng là thu Ďược các β-lactamase khác, chẳng hạn như carbapenemaseloại B 29,30

Trên thế giới, có 10% Ďến 50% chủng phân lập P aeruginosa khángcarbapenems Đề kháng carbapenems ở P aeruginosa Ďược thực hiện qua

nhiều cơ chế, khiếm khuyết kênh porin hoặc sự biểu hiện quá mức của bơm

Ďẩy là phổ biến, trong khi sự hiện diện các men carbapenemase ít gặp hơn P.aeruginosa sản xuất các loại carbapenemase serine, chẳng hạn như

carbapenemase loại OXA, và phần lớn các carbapenemase

metallo-β-lactamase (Ambler loại B) bao gồm IMP, VIM và NDM; P aeruginosa Ďược

xem là ổ chứa chính của các metallo-carbapenemase này 31.

Ďề kháng thuốc nhanh Các chủng phân lập A baumannii ngày càng trở nên

Ďa kháng kháng sinh, 50-70% số chủng phân lập trên toàn cầu Ďề khángcarbapenems 32 Một thuộc tính quan trọng khác của A baumannii là khả

năng sống sót trên các bề mặt của bệnh viện, chẳng hạn như thanh chắngiường và các nút của thiết bị ở các phòng HSTC, Ďóng vai trò là ổ chứa quan

trọng cho các Ďợt bùng phát nhiễm khuẩn do A baumannii tại bệnh viện 33

Tại châu Âu, trong năm 2015, số ca nhiễm do các chủng A baumannii kháng

kháng sinh Ďã vượt hơn 30.000 ca, dẫn Ďến hơn 2500 ca tử vong Phần lớn các

ca nhiễm khuẩn là do Acinetobacter spp kháng carbapenems (27.343 ca),

2181 ca nhiễm khuẩn do chủng Ďa kháng thuốc (kháng với aminoglycosidesvà fluoroquinolones), trong khi 1084 ca bệnh nhiễm khuẩn khác là do cácchủng kháng colistin 22

A baumannii sản xuất nhiều loại β-lactamase Tất cả các chủng A.baumannii Ďều tạo ra cephalosporinsase AmpC Ďược mã hóa trên nhiễm sắcthể A baumannii cũng sản xuất nhiều loại β-lactamase khác, bao gồm β-

lactamase loại TEM-1, SHV và CTX-M 29 Hơn nữa, một số chủng chứa

ESBL, chẳng hạn như các biến thể TEM, chiếm 59% chủng A baumannii

1.2.5 Staphylococcus aureus

S aureus là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng nhất về khả

năng Ďề kháng kháng sinh Vi khuẩn có thể phát triển các cơ chế Ďề kháng với

gần như tất cả các loại kháng sinh Ďược sử dụng S aureus kháng methicillin(methicillin resistant Staphylococcus aureus, MRSA) là vi khuẩn Ďề khángkháng sinh chiếm ưu thế trong số các chủng S aureus; theo ước tính Ďã gây

nhiễm hơn 148.000 ca và 7000 ca tử vong ở châu Âu vào năm 2015 22

Đề kháng methicillin do vi khuẩn thu nhận gene mecA mã hóa

penicillin-binding proteins (PBPs) mới PBP2a làm thay Ďổi cấu trúc PBP gâygiảm khả năng gắn kết hoặc ức chế hoàn toàn sự gắn kết của thuốc 36,37.

Sự Ďề kháng với vancomycin Ďã trở thành một vấn Ďề lớn ở enterococci

(vancomycin-resistant enterococci, VRE) và ở S aureus (MRSA) Sự khángthuốc qua trung gian các gene vanA, vanB dẫn Ďến những thay Ďổi trong cấu

trúc của tiền chất peptidoglycan làm giảm khả năng gắn kết của vancomycin

Enterococci có gene kháng vancomycin ở mức Ďộ cao và cũng có khảnăng trao Ďổi thông tin di truyền nên khả năng lan truyền gene khángvancomycin sang các vi khuẩn Gram dương khác gây ra mối Ďe dọa nghiêm

trọng cho sức khỏe cộng Ďồng Trên thực tế, sự xuất hiện của S aureus kháng

vancomycin từ các chủng phân lập lâm sàng Ďã Ďược ghi nhận 39,40.

1.3 Phân bố vi khuẩn gây viêm phổi bệnh viện1.3.1 Trên thế giới

Tại Hoa Kỳ, theo báo cáo của Mạng lưới an toàn chăm sóc sức khỏequốc gia (National Healthcare Safety Network) tại Trung tâm kiểm soát vàphòng ngừa bệnh (Centers for Disease Control and Prevention) về giám sátcác tác nhân kháng thuốc từ năm 2011-2014 Ďã cho thấy các tác nhân gây

VPLQTM thường phân lập là S aureus 24,7%, P aeruginosa 16,5%,Klebsiella spp 10,2%, Enterobacter spp 8,3%, và E coli 5,4% 20.

Ở châu Âu, một nghiên cứu VPBV tại 27 Ďơn vị HSTC ở 9 quốc giachâu Âu 3 Ďã cho thấy Enterobacteriaceae, S aureus, P aeruginosa, và A.baumannii là bốn tác nhân thường phân lập trong VPBV Tác nhân chiếm ưuthế ở Tây Ban Nha, Pháp, Bỉ và Ireland là S aureus; ở Ý và Bồ Đào Nha là P.aeruginosa; ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ là Acinetobacter spp.; và ở Đức là E.coli.

Theo nghiên cứu Ďa trung tâm ở Czech Republic từ 5/2013-12/2014trên 201 người bệnh VPBV nhập khoa HSTC 41

, tác nhân gây bệnh thường

gặp là K pneumoniae 20,4%, P aeruginosa 20,0%, E coli 10,8%,

Enterobacter spp 8,1%, S aureus 6,2% Những người bệnh mắc VPBV sớmthường do S aureus với tỷ lệ cao hơn các tác nhân gây nhiễm khác.

Ở châu Á, một nghiên cứu Ďa trung tâm tại Hàn Quốc trên 381 ngườibệnh VPBV hoặc VPLQTM nhập khoa HSTC từ tháng 8/2012 Ďến tháng6/2015 42 cho thấy các tác nhân thường gây VPBV hoặc VPLQTM là A.baumannii (n = 89; 35,6%), tiếp theo S aureus (n = 59; 23,6%), K.pneumoniae (n = 25; 10%) và P aeruginosa (n = 22; 8,8%).

Tại Ấn Độ, trong một nghiên cứu từ năm 2013-2015 trên người bệnhviêm phổi liên quan Ďến chăm sóc y tế và viêm phổi mắc phải bệnh viện 43,

trong 153 người bệnh VPBV hoặc VPLQTM, tác nhân thường gây bệnh là A.baumannii 41%, P aeruginosa 14%, E coli 11% và K pneumoniae 10%.

Trong một nghiên cứu tại bệnh viện Tianjin Medical UniversityGeneral Hospital, Trung Quốc, 62 người bệnh VPBV nhập khoa HSTC từtháng 1/2017 Ďến tháng 5/2019 44, các tác nhân thường gây bệnh là A.baumannii 30,8%, kế tiếp là K pneumoniae 20,3%, P aeruginosa 15,4%,Stenotrophomonas maltophilia 13,3% và E coli 0,5%.

1.3.2 Tại Việt Nam

Ở miền Bắc, theo kết quả nghiên cứu của bệnh viện Phổi Trung ươngtừ tháng 1/2014 Ďến tháng 12/2015 trên 127 người bệnh VPBV 6, tác nhân

gây bệnh thường gặp 94,8% là các trực khuẩn Gram âm, trong Ďó A.baumannii 43,3%, P aeruginosa 29,9%, K pneumoniae 14,2%, E coli 3,0%,vi khuẩn Gram dương gặp với tỉ lệ thấp S aureus 5,2%.

Tại miền Nam, theo kết quả nghiên cứu trên 87 người bệnh thở máy tại

khoa HSTC bệnh viện Nhân Dân Gia Định từ tháng 1 Ďến tháng 9/2011 7, tác

nhân gây bệnh phần lớn là do A baumannii 69%, Klebsiella spp 11,5%,Enterobacter spp 11,5% và P aeruginosa 8%.

Nghiên cứu trên 64 người bệnh viêm phổi mắc phải bệnh viện có phânlập Ďược tác nhân vi sinh, nhập vào khoa HSTC bệnh viện Nguyễn TriPhương từ 01/01/2013 Ďến 31/12/2014 8

, tác nhân gây bệnh thường gặp là A.baumannii 63%, P aeruginosa 4%, S aureus 9%, K pneumoniae 8% và E.coli 8%.

Nhìn chung, các tác nhân gây VPBV thường Ďược phân lập là A.baumannii, P aeruginosa, K pneumoniae, E coli, và S aureus Tần suất của

các loài vi khuẩn gây bệnh khác nhau giữa các khu vực, các nước, các bệnhviện và thay Ďổi cùng với thời gian.

1.4 Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn gây VPBV1.4.1 Trên thế giới

Tại Hoa Kỳ, theo báo cáo giám sát của Trung tâm kiểm soát và phòngngừa bệnh Ďối với các tác nhân kháng thuốc gây VPLQTM từ năm 2011-2012

Ďã cho thấy 42,4-46,1% S aureus kháng methicillin; 21,0-23,2% Klebsiella

spp Ďề kháng Ďối với các cephalosporins phổ rộng (cefepime, cefotaxime,ceftazidime, ceftriaxone); 10,1-11,5% kháng với các kháng sinh carbapenems(imipenem, meropenem, doripenem) và có 12,8-15,9% vi khuẩn Ďa kháng

thuốc Đối với E coli, có 15,0-16,7% kháng với các cephalosporins phổ rộng;

30,8-38,9% kháng với các fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin,moxifloxacin); 1,1-2,2% kháng với các carbapenems và 7,7-9,7% vi khuẩn Ďa

kháng thuốc Đối với P aeruginosa, có 18,2-23,3% kháng với các

aminoglycosides (amikacin, gentamicin, tobramycin); 25,7-29,4% kháng vớicác cephalosporins phổ rộng (cefepime, ceftazidime); 31,8-31,9% kháng vớicác fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin); 27,6-28,4% kháng với các

carbapenems; 19,1-19,4% kháng với piperacillin và piperacillin-tazobactam;

có 19,9-20,8% vi khuẩn Ďa kháng thuốc Đối với A baumannii, có Ďến

55,5-63,5% các chủng kháng với các carbapenems và 53,8-63,3% vi khuẩn Ďakháng thuốc Đến năm 2015-2017, báo cáo giám sát cho thấy xu hướng giatăng Ďề kháng kháng sinh của các tác nhân gây VPLQTM 21

, 53,3% S aureuskháng methicillin; 34,1% Klebsiella spp không nhạy cảm Ďối với cáccephalosporins phổ rộng và 20,4% vi khuẩn Ďa kháng thuốc P aeruginosa

không nhạy cảm 44,7% với các cephalosporins phổ rộng (cefepime,ceftazidime); 45,8% với các fluoroquinolones (ciprofloxacin, levofloxacin);61,4% với các carbapenems; 34,8% với piperacillin và piperacillin-tazobactam; có 39% vi khuẩn Ďa kháng thuốc Đáng lo ngại là có Ďến 75,9%

các chủng A baumannii kháng với các carbapenems và 75% vi khuẩn Ďa

kháng thuốc.

Trong một nghiên cứu tại 12 bệnh viện thuộc 5 quốc gia (Hoa Kỳ,Pháp, Đức, Ý và Tây Ban Nha) năm 2013 45

trên 740 người bệnh VPBV do P.aeruginosa Ďã cho thấy 30,5% người bệnh nhiễm vi khuẩn Ďa kháng thuốc;

trong Ďó Đức (44,2%) và Tây Ban Nha (43,4%) có tỷ lệ vi khuẩn Ďa khángthuốc cao nhất, tiếp theo là Pháp (33,3%), Ý (22,2%) và Hoa Kỳ (20,5%) Độnhạy cảm kháng sinh thấp hơn trong nhóm vi khuẩn Ďa kháng thuốc.

Một nghiên cứu ở bệnh viện Lithuanian University of Health SciencesKauno Klinikos từ tháng 01/2014 Ďến tháng 12/2015 trên 60 người bệnh

VPLQTM do A baumannii kháng thuốc tại khoa HSTC-phẫu thuật 46, tỷ lệ vikhuẩn Ďa kháng thuốc (multidrug-resistant-MDR), kháng mở rộng(extensively drug-resistant-XDR), và toàn kháng (pandrug-resistant-PDR) là13,3%, 68,3% và 18,3%.

Ở châu Á, theo nghiên cứu tại bệnh viện Seoul National UniversityHospital, Hàn Quốc từ năm 2007-2016 47, có 232 người bệnh khoa Thần kinh

mắc VPBV Kết quả nghiên cứu cho thấy vi khuẩn Gram âm gây VPBV (K.pneumoniae, A baumannii, P aeruginosa, và Enterobacter aerogenes) Ďã gia

tăng tỷ lệ không nhạy cảm Ďối với các kháng sinh imipenem,

piperacillin-tazobactam, cefepime, ciprofloxacin, và ceftazidime Đặc biệt, tỷ lệ A.baumannii không nhạy cảm Ďối với các kháng sinh carbapenems gia tăng từ

VPBV 97,1% là do vi khuẩn Gram âm Kết quả Ďã cho thấy A baumannii Ďề

kháng cao (>90%) với piperacillin-tazobactam, cefepime, ciprofloxacin Tuynhiên, chúng còn nhạy cảm với tigecycline (100%) Hầu hết các chủng

Klebisella spp là Ďa kháng kháng sinh (65,5%) P aeruginosa còn nhạy cảmvới amikacin (100%) Các tác nhân Gram dương S aureus (4 chủng) có tỷ lệ

Ďề kháng methicillin (MRSA) là 50%, tuy nhiên tất cả Ďều nhạy cảm vớilinezolid, tigecycline và vancomycin.

1.4.2 Tại Việt Nam

Ở miền Bắc, theo kết quả nghiên cứu tại khoa Cấp cứu bệnh viện BạchMai trên 30 người bệnh VPLQTM từ tháng 9/2009 Ďến tháng 8/2011 49

cho

thấy tác nhân gây VPBV thường gặp A baumannii và P aeruginosa Ďa kháng

kháng sinh A baumannii có tỷ lệ Ďề kháng cao Ďối với ampicillin-sulbactam

(58,3%), carbapenems (58,3%), amikacin (66,7%), ceftazidime (75%) và

ciprofloxacin (75%) P aeruginosa Ďề kháng cao Ďối với ceftazidime (50%),

ciprofloxacin (50%) và amikacin (62,5%).

Nghiên cứu của bệnh viện Phổi Trung ương năm 2014-2015 6, A.baumannii và P aeruginosa là hai tác nhân thường gây VPBV Chúng Ďề

kháng cao >70% với hầu hết các kháng sinh, tuy nhiên vi khuẩn còn nhạy

cảm 100% với colistin K pneumoniae Ďề kháng >60% Ďối với phần lớn cáckháng sinh ngoại trừ carbapenems, amikacin (Ďề kháng <50%) S aureus Ďề

kháng 100% với các kháng sinh nhóm fluoroquinolones và gentamicin, nhạycảm 100% với vancomycin, teicoplanin, linezolid.

Ở miền Nam, Theo nghiên cứu tại khoa HSTC bệnh viện Nhân DânGia Định từ tháng 1/2011 Ďến tháng 9/2011 7

, A baumannii là tác nhân gâyVPLQTM thường Ďược phân lập A baumannii Ďề kháng với nhóm

carbapenems gần 78%, nhóm quinolones 85% và aminoglycosides 90%.Nghiên cứu tại khoa HSTC bệnh viện Nguyễn Tri Phương 8 từ năm

2013-2014 cho thấy P aeruginosa và A baumannii gây VPBV có tỷ lệ Ďềkháng carbapenems cao (94%) Đối với P aeruginosa và A baumannii kháng

carbapenems, trên 80% vi khuẩn kháng hầu hết tất cả kháng sinh, chỉ cònnhạy cảm với colistin 100% và cefoperazone-sulbactam 98% Kiểu hình

kháng mở rộng chiếm ưu thế (72%) trong nhóm P aeruginosa và A.baumannii.

Theo kết quả nghiên cứu tại bệnh viện Chợ Rẫy năm 2013-2014 9, A.baumannii gây VPBV Ďề kháng rất cao >98% với các kháng sinh imipenem,

meropenem, ciprofloxacin, levofloxacin, piperacillin-tazobactam, thậm chí

cefoperazone-sulbactam cũng có sự gia tăng Ďề kháng nhanh chóng (86%) P.

aeruginosa cũng có tỉ lệ Ďề kháng cao với nhóm carbapenems (imipenem 72

% và meropenem 74%), nhóm fluoroquinolones (levofloxacin 50% vàciprofloxacin 50%) và beta-lactam ± ức chế beta-lactamase (ceftazidime 46%,piperacillin-tazobactam 20% và cefoperazone-sulbactam 72%).

Một nghiên cứu tại Bệnh viện Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minhnăm 2014-2015 10

, phần lớn tác nhân gây bệnh là vi khuẩn Ďa kháng; với hầu

hết là các vi khuẩn Gram âm như A baumannii, Klebsiella spp., P.aeruginosa Các vi khuẩn gây VPBV có Ďề kháng kháng sinh cao 58,6% là vi

khuẩn Ďa kháng, trong Ďó 41,6% là MDR, 53,6% là XDR, 4,8% là PDR.

Một nghiên cứu Ďa trung tâm từ năm 2012-2014 ở hai bệnh viện tại HàNội (Nhiệt Đới Trung Ương và Bạch Mai) và ba bệnh viện tại thành phố HồChí Minh (Nguyễn Tri Phương, Nhân Dân Gia Định và Chợ Rẫy) 50 trên 1433

người bệnh VPBV hoặc VPLQTM do A baumannii và P aeruginosa, kết quảcho thấy A baumannii Ďề kháng cao >90% Ďối với các kháng sinh

cephalosporins, β-lactam/ ức chế β-lactamase, carbapenems vàfluoroquinolones; Ďề kháng >80% Ďối với các aminoglycosides Chỉ còn

colistin và tigecycline có hoạt tính chống lại A baumannii Đối với P.aeruginosa giảm nhạy cảm với các kháng sinh cephalosporins 42,3%-60,1%,

β-lactam/ ức chế β-lactamase 56,1%, fluoroquinolones 51,8-55,0% vàaminoglycosides 56,5-81,7% Theo dõi xu hướng Ďề kháng Ďối với các kháng

sinh carbapenems cho thấy P aeruginosa có tỷ lệ không nhạy cảm tăng dần

theo mỗi năm nghiên cứu.

Từ các kết quả nghiên cứu cho thấy sự Ďề kháng kháng sinh của các vikhuẩn gây VPBV khác nhau giữa các quốc gia, các khu vực, các vùng Ďịa lý,thậm chí khác nhau giữa các bệnh viện và các khoa Ďiều trị Vi khuẩn ngàycàng có xu hướng Ďề kháng kháng sinh nhanh hơn, nhiều hơn và Ďề kháng

Ďồng thời nhiều kháng sinh ở mức Ďộ cao Do Ďó, thường xuyên nghiên cứuvề tác nhân gây bệnh và tình hình Ďề kháng kháng sinh là cần thiết Ďể xâydựng các chiến lược Ďiều trị kháng sinh hợp lý và có biện pháp phòng ngừa sựgia tăng Ďề kháng kháng sinh.

Chương 2 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU2.1 Thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu mô tả cắt ngang.

2.2 Đối tượng nghiên cứu

E coli, K pneumoniae, A baumannii, P aeruginosa và S aureus phân

lập trên người bệnh Ďược chẩn Ďoán VPBV Ďiều trị tại bệnh viện Nhân DânGia Định từ 01/2022 – 12/2022.

2.2.1 Tiêu chuẩn chọn vào

2.2.1.1 Tiêu chuẩn chẩn đoán viêm phổi bệnh viện

Viêm phổi trong nghiên cứu này Ďược Ďịnh nghĩa là có ít nhất mộtchủng vi khuẩn gây bệnh có liên quan về mặt lâm sàng, Ďược phân lập từ mộttrong các bệnh phẩm (Ďàm, dịch rửa phế quản, dịch hút nội khí quản) thuĎược từ người bệnh có triệu chứng lâm sàng viêm phổi.

VPBV là viêm phổi xuất hiện sau khi vào viện 48 giờ mà không cóbiểu hiện hoặc ủ bệnh tại thời Ďiểm vào viện 1.

2.2.1.2 Phân lập vi khuẩn gây bệnh

- Vi khuẩn gây bệnh Ďược phân lập từ một trong các bệnh phẩm Ďường hôhấp dưới của người bệnh VPBV gồm: Ďàm, dịch rửa phế quản, dịch hútnội khí quản.

- Các loài vi khuẩn mục tiêu:

 Vi khuẩn Gram âm: E coli, K pneumoniae, A baumannii, P.aeruginosa

 Vi khuẩn Gram dương: S aureus

- Chủng phân lập Ďầu tiên của từng loài vi khuẩn trên mỗi người bệnh.

2.2.2 Tiêu chuẩn loại ra

- Vi khuẩn phân lập từ người bệnh không có sẵn các dữ liệu lâm sàng và visinh.

- Vi khuẩn phân lập từ người bệnh có xét nghiệm AFB dương tính.

2.3 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Thời gian: 01/2022-12/2022

- Địa Ďiểm: Bệnh viện Nhân Dân Gia Định

2.4 Cỡ mẫu nghiên cứu

Chúng tôi Ďặt mục tiêu nghiên cứu ước tính khoảng 250 chủng vikhuẩn từ người bệnh mắc VPBV với dữ liệu vi sinh và lâm sàng có sẵn, phùhợp với tiêu chuẩn chọn vào và không thuộc tiêu chuẩn loại ra từ 01/2022-12/2022.

2.5 Các biến số độc lập và phụ thuộc

Bảng 2.1 Các biến số nghiên cứu

Tên biến số Phương pháp đánh giá Tiêu chí kết luậnĐặc điểm chung của người bệnh VPBV

Mã số nhập việnSố hồ sơ bệnh ánKhoa lâm sàngNgày nhập viện

Đặc điểm vi khuẩn gây VPBV và đề kháng kháng sinh

Số hồ sơ bệnh phẩmLoại mẫu bệnh phẩmNgày thu mẫu bệnh phẩm

Kết quả Ďộ nhạy cảmkháng sinh của tất các cácchủng vi khuẩn Ďượcchọn

Nhạy cảm (S)/ Trung gian(I)/ Ďề kháng (R)

Tỷ lệ %

Nồng Ďộ ức chế tối thiểu(MIC) Ďối với colistin

Nồng Ďộ (µg/mL) MIC50MIC90Khoảng MICCác gene mã hoá ESBL Có/ không Tỷ lệ %Các gene mã hoá

Gene kháng methicillin Có/ không Tỷ lệ %Gene kháng vancomycin Có/ không Tỷ lệ %

2.6 Phương pháp và công cụ đo lường, thu thập số liệu

- Từ dữ liệu Ďiện tử tại Khoa Vi sinh- Từ hồ sơ bệnh án Ďiện tử của Bệnh viện

2.7 Quy trình nghiên cứu

Bảng 2.2 Quy trình nghiên cứuCác bước

thực hiện

Bệnh viện NhânDân Gia Định

OUCRU2 Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh

3 Sàng lọc các chủng phân lập lâm sàng4 Mã hoá các chủng vi khuẩn

5 - Chuẩn bị, bảo quản chủng vi khuẩn- Vận chuyển chủng vi khuẩn

6 Tái nuôi cấy và Ďịnh danh vi khuẩn OUCRU7 Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh Ďối

với các kháng sinh bổ sung8 Tách chiết axít nucleic

9 Xét nghiệm PCR Ďể phát hiện các genekháng kháng sinh phổ biến

2.7.1 Phân lập vi khuẩn

Thực hiện cấy phân lập, Ďịnh danh vi khuẩn từ các bệnh phẩm Ďườnghô hấp dưới ngay khi tiếp nhận Qui trình thực hiện theo các bước như sau:- Quan sát Ďại thể bệnh phẩm:

 Đàm: có máu, nhầy, nhầy mủ, mủ.

 Dịch rửa phế quản: nhuốm hồng, có máu, Ďục hoặc trong.

- Làm phết tiêu bản nhuộm Gram, Ďánh giá chất lượng bệnh phẩm Ďàm,dịch hút nội khí quản, quan sát vi thể về các Ďặc Ďiểm của vi khuẩn.

- Bệnh phẩm Ďàm Ďạt chất lượng khi có lớn hơn 25 bạch cầu Ďa nhân trungtính và ít hơn 10 tế bào biểu mô trên một vi trường Ďược xem là Ďạt tiêuchuẩn Ďưa vào cấy phân lập vi khuẩn.

- Nuôi cấy vi khuẩn 19:

Cấy bệnh phẩm vào môi trường nuôi cấy: thạch máu (blood agar, BA),

thạch Mac-Conkey (MC) và thạch chocolate (CA) Mỗi Ďĩa thạch cấy 4 vùngĎể có khuẩn lạc riêng rẽ (chia Ďĩa thạch thành 4 phần tương Ďối, mỗi góc phầntư là 1 vùng):

Vùng 1: cho 1 lượng bệnh phẩm (Ďầy 1 khuyên cấy 10μl) vào 1 góc của phầntư thứ nhất, cấy ria, Ďốt khuyên cấy.

Vùng 2: chạm vùng 1 từ 2 Ďến 3 Ďường cấy, cấy ria, Ďốt khuyên cấy.Vùng 3: chạm vùng 2 từ 2 Ďến 3 Ďường cấy, cấy ria, Ďốt khuyên cấy.Vùng 4: chạm vùng 3 từ 2 Ďến 3 Ďường cấy, cấy ria, Ďốt khuyên cấy.

Ủ ấm môi trường nuôi cấy:

Ủ ấm thạch BA và CA ở 35-37oC trong khí trường 5% CO2/ 24-48 giờ.Ủ ấm thạch MC ở 35-37oC trong khí trường thường/ 24-48 giờ.

Đọc đĩa thạch sau khi ủ ấm: Quan sát bằng mắt thường sự phát triển

của vi khuẩn sau 24 giờ trên tất cả các Ďĩa thạch Nếu không thấy vi khuẩnphát triển, tiếp tục ủ ấm thêm Nếu thấy vi khuẩn phát triển:

 Ước tính số lượng vi khuẩn gây bệnh (bán Ďịnh lượng):Nếu mọc ở vùng thứ 1 thì số lượng vi khuẩn 1+: vi khuẩn mọc rất ítNếu mọc ở vùng thứ 2 thì số lượng vi khuẩn 2+: vi khuẩn mọc ítNếu mọc ở vùng thứ 3 thì số lượng vi khuẩn 3+: vi khuẩn mọc nhiềuNếu mọc ở vùng thứ 4 thì số lượng vi khuẩn 4+: vi khuẩn mọc rất nhiều

 Vi khuẩn Ďược coi là gây bệnh khi:

Mọc với số lượng tương ứng 3+, 4+ và chiếm ưu thế hơn so với vi hệ thườngtrú.

Mọc với số lượng tương ứng 1+, 2+ nhưng phù hợp với hình ảnh trên tiêu bảnnhuộm Gram, có bạch cầu Ďa nhân trung tính và không có hoặc có rất ít vi hệthường trú Ďường hô hấp.

 Tiến hành Ďịnh danh vi khuẩn:

Dựa vào hình thái khuẩn lạc, tính chất trên tiêu bản nhuộm Gram Ďểthực hiện các xét nghiệm Ďịnh danh vi khuẩn bằng hệ thống tự Ďộng Vitek 2(BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) Sử dụng các kit Ďịnh danh vi khuẩnGram âm (GN), vi khuẩn Gram dương GP.

2.7.2 Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh

Thực hiện thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh bằng hệ thống tự ĎộngVitek 2 (BioMérieux, Marcy l’Etoile, France) như sau:

- E coli, K pneumoniae: Thẻ kháng sinh Ďồ Gram âm AST-N67 gồm các

kháng sinh Ďược sử dụng cho các vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceaetheo tiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI,năm 2022) 51

như: ampicillin, ampicillin-sulbactam, tazobactam, cefazolin, cefepime, ceftriaxone, ceftazidime, ertapenem,imipenem, gentamicin, tobramycin, amikacin, ciprofloxacin, levofloxacin,trimethoprim-sulfamethoxazole.

piperacillin A baumannii: Thẻ kháng sinh Ďồ Gram âm AST-N67 gồm các kháng sinhĎược sử dụng cho vi khuẩn Acinetobacter spp theo tiêu chuẩn CLSI (năm

2022) 51 như: ampicillin-sulbactam, piperacillin-tazobactam, ceftazidime,cefepime, ceftriaxone, imipenem, gentamicin, amikacin, ciprofloxacin,levofloxacin, trimethoprim-sulfamethoxazole.

- P aeruginosa: Thẻ kháng sinh Ďồ Gram âm AST-N240 gồm các kháng

sinh Ďược sử dụng theo tiêu chuẩn CLSI (năm 2022) 51 như: tazobactam, ticarcillin-clavulanic acid, ceftazidime, cefepime, imipenem,meropenem, gentamicin, tobramycin, amikacin, ciprofloxacin,levofloxacin.

piperacillin S aureus: Thẻ kháng sinh Ďồ Gram dương AST-P592 gồm các kháng sinh

Ďược sử dụng theo tiêu chuẩn CLSI (năm 2022) 51

như: penicillin,oxacillin, vancomycin, teicoplanin, gentamicin, erythromycin,tetracycline, ciprofloxacin, moxifloxacin, clindamycin, trimethoprim-sulfamethoxazole, linezolid, tigecycline.

Đánh giá kết quả thử nghiệm theo khoảng giá trị nồng Ďộ ức chế tốithiểu (minimum inhibitory concentration, MIC) với ba mức Ďộ nhạy cảm(susceptible, S), trung gian (intermediate, I) và Ďề kháng (resistant, R) theotiêu chuẩn của Viện Tiêu chuẩn Thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI, năm 2022)

51 Đối với các kháng sinh CLSI không có tiêu chuẩn, chúng tôi sử dụng tiêuchuẩn Ďược FDA (Food and Drug Administration, cơ quan Quản lý Thựcphẩm và Dược phẩm của Hoa Kỳ) chấp nhận (Bảng 2.3) 52.

Bảng 2.3 Tiêu chuẩn phiên giải kết quả nhạy cảm đối với tigecycline

2.7.4 Mã hóa các chủng vi khuẩn

Kỹ thuật viên xét nghiệm sẽ gắn một Mã số cho từng loài vi khuẩntrong nghiên cứu Mã số bao gồm: Mã nghiên cứu-mã bệnh viện-số thứ tự củacác loài vi khuẩn Ďược thu thập Ví dụ: 36EN-24-001.

2.7.5 Chuẩn bị, bảo quản và vận chuyển chủng vi khuẩn

- Sử dụng que cấy hoặc tăm bông lấy Ďúng các khuẩn lạc Ďược phân lập tốtĎể tránh việc xét nghiệm các vi khuẩn nuôi cấy hỗn hợp Trong trường hợpkhông có khuẩn lạc Ďược phân lập tốt, tiến hành nuôi cấy thứ cấp vi khuẩnvào một Ďĩa mới Chọn 3-5 khuẩn lạc trên Ďĩa thạch Ďể cho vào ống chứamôi trường Tryptic Soy Broth (TSB).

- Các chủng Ďược bảo quản ở nhiệt Ďộ -70oC hoặc -80oC.

- Tất cả các vật liệu cần thiết Ďể Ďóng gói và vận chuyển (Ďá khô, bao bì vậnchuyển lạnh) do nhân viên Phòng thí nghiệm OUCRU (Oxford UniversityClinical Research Unit, Đơn vị nghiên cứu lâm sàng Đại học Oxford) thựchiện.

2.7.6 Tái nuôi cấy và định danh vi khuẩn

Tất cả các chủng vi khuẩn Ďược chọn sẽ chuyển Ďến phòng thí nghiệmcủa OUCRU Ďể thử nghiệm.

Đầu tiên, các chủng vi khuẩn Ďược thu thập cho nghiên cứu sẽ Ďượcnuôi cấy lại trên môi trường thạch Luria-Bertani (LB) hoặc môi trườngchuyên biệt và Ďịnh danh lại khi cần thiết bằng cách sử dụng phương phápkhối phổ MALDI-TOF Các chủng vi khuẩn có kết quả khác biệt khi Ďịnhdanh lại sẽ Ďược kiểm tra bằng phương pháp PCR với mồi chuyên biệt choloài vi khuẩn.

2.7.7 Thử nghiệm tính nhạy cảm đối với các kháng sinh bổ sung

Thử nghiệm tính nhạy cảm kháng sinh của các tác nhân gây bệnh sẽĎược thực hiện cho các loại thuốc không nằm trong danh sách các kháng sinhĎược xét nghiệm thường quy tại bệnh viện:

- Ceftazidime-avibactam: Phương pháp Ďo nồng Ďộ ức chế tối thiểu (MIC)bằng E-test

- Ceftaroline: Phương pháp Ďo nồng Ďộ ức chế tối thiểu (MIC) bằng E-test- Colistin:

 Đối với E coli, K pneumoniae, P aeruginosa: Phương pháp Ďo nồng

Ďộ ức chế tối thiểu (MIC) bằng E-test

 A baumannii: Phương pháp Ďo nồng Ďộ ức chế tối thiểu (MIC) bằng vi

pha loãng

Các phương pháp sẽ Ďược thực hiện theo hướng dẫn do Viện Tiêuchuẩn Thí nghiệm và Lâm sàng (CLSI, năm 2022) 51 tại OUCRU.

Kiểm soát chất lượng sẽ Ďược thực hiện vào mỗi ngày thử nghiệm bằng

cách sử dụng các chủng chứng ATCC thích hợp (chẳng hạn như E coliATCC 25922, P aeruginosa ATCC 27853, S aureus ATCC 25923 và K.pneumoniae ATCC 700603) theo CLSI và hướng dẫn của nhà sản xuất Kết

quả sẽ chỉ Ďược phân tích khi kết quả kiểm soát chất lượng tương ứng phùhợp với hướng dẫn CLSI.

2.7.8 Tách chiết axít nucleic

Sau khi nuôi cấy và Ďịnh danh lại vi khuẩn, DNA sẽ Ďược tách chiết từtất cả các chủng vi khuẩn bằng bộ kit Wizard Genomic DNA Extraction(Promega, Fitchburg, Hoa Kỳ) Đây là phương pháp tiêu chuẩn sử dụng trongphòng thí nghiệm tại OUCRU Chất lượng và nồng Ďộ DNA sẽ Ďược kiểm tra

dựa trên phương pháp quang phổ Nano-drop trước khi thực hiện khuếch ĎạiPCR.

2.7.9 Xét nghiệm PCR để phát hiện các gene kháng kháng sinh phổ biến

Tất cả các mẫu DNA Ďược tách chiết sẽ Ďược thực hiện các xét nghiệmbằng phương pháp multiplex PCR (SensiFASTTM HRM Kit, Bioline, HoaKỳ).

Đối với vi khuẩn Gram âm, phân tích các gene mã hoá ESBL (blaTEM,blaSHV, blaCTX-M-1, blaCTX-M-9) và carbapenemase (blaKPC, blaIMP, blaNDM,

blaOXA-23, blaOXA-48).

Đối với vi khuẩn Gram dương, Ďược phân tích các gene kháng

methicillin (mecA) và vancomycin (vanA/B).

Các gene Ďề kháng này Ďược tìm thấy nhiều nhất từ các tác nhân vikhuẩn gây nhiễm khuẩn ở Việt Nam và hầu hết các nơi trên thế giới 36–38,53,54.

Trình tự mồi Ďặc hiệu của các vùng gene nghiên cứu Ďược trình bày ởBảng 2.4.