khảo sát tính chất và hoạt tính kháng khuẩn của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen trên thực phẩm

Vì bản chất của tinh dầu nói chung và tinh dầu tiêu nói riêng là dễ bay hơi và khó phân tán đều trong môi trường thực phẩm, để cải thiện vấn đề này hệ nhũ tương nano là một lựa chọn tố

TỔNG QUAN

Nhũ tương

Nhũ tương là một hệ phân tán của hai chất lỏng không tan lẫn hoặc tan rất ít vào nhau, một trong hai chất lỏng đó phân tán vào chất lỏng kia dưới dạng nhỏ giọt, kích thước giọt chất lỏng biến đổi trong phạm vi rộng Dạng nhũ tương phụ thuộc vào tỉ lệ các pha sử dụng, loại chất nhũ hoá, nhiệt độ Nếu pha lỏng nào dễ hòa tan chất nhũ hóa sẽ có xu hướng trở thành pha liên tục Trong một nhũ tương kích thước các giọt không đồng nhất Kích thước giọt phụ thuộc vào phương pháp chế tạo nhũ và nồng độ chất nhũ hóa Cũng như các hệ phân tán khác, nhũ tương là hệ không bền nhiệt động, do đó để duy trì nhũ tương tạo được phải cho vào chất bảo vệ (chất nhũ hóa) Hệ nhũ tương đơn giản gồm có hai thành phần nước và dầu

Các chất lỏng hoặc là có thể hòa tan tốt vào nước (chất lỏng ưa nước) hoặc là có thể hòa tan tốt vào dầu (chất lỏng kỵ nước) Nguyên nhân là do các phân tử nước chỉ tạo thành các lực liên kết hydro trong khi các phân tử dầu lại tạo các liên kết kị nước Chất nhũ hóa như xà phòng có thể liên kết các chất lỏng này Chúng có tính chất này vì các phân tử của chất nhũ hóa có một phần phân cực và một phần không phân cực Phần phân cực có thể tạo liên kết hydro và liên kết với các chất lỏng ưa nước trong khi phần không phân cực của phân tử tạo liên kết với các chất kỵ nước Điều này giải thích tác dụng tẩy rửa của xà phòng: Xà phòng làm giảm sức căng bề mặt của nước và tạo điều kiện rửa các chất chỉ tan trong dầu mỡ bằng cách cho thêm nước vào…

Phân loại dựa vào pha khuyếch tán:

Thực tế tồn tại hai loại nhũ tương là: Nhũ tương dầu trong nước hay gọi là nhũ tương thuận, đây là loại nhũ tương mà pha phân tán là dầu còn pha liên tục là nước Nhũ tương nước trong dầu hay gọi là nhũ tương nghịch trong đó pha phân tán là nước còn pha liên tục là dầu

Phân loại theo nồng độ thể tích mà pha phân tán chiếm:

Nhũ tương loãng là nhũ tương có pha phân tán chiếm tỷ lệ từ 0,1% đến 0,2%, tùy thuộc vào bản chất của hai pha Nhũ tương loãng có dạng giọt có đường kính nhỏ khoảng 0,1μm Nhũ tương loãng có các tính chất của hệ keo điển hình, có thể mang điện tích và cũng tuân theo quy tắc keo tụ Điện tích xuất hiện trên bề mặt của các giọt pha phân tán do quá trình hấp phụ các ion của những chất điện ly vô cơ trong môi trường Do nồng độ pha phân tán nhỏ nên nhũ tương loãng có độ bền lớn.

Nhũ tương đặc: Với nhũ tương đặc pha phân tán chiếm khoảng 0,2% đến 74% thể tích hệ Đường kính giọt trong nhũ tương đặc vào khoảng 0,1 đến 1μm Nhũ tương đặc rất kém bền, trong hệ thường có chất nhũ hóa để bảo vệ Nhũ tương đặc dễ sa lắng hoặc nổi lên trên, nếu pha phân tán có khối lượng riêng lớn hơn khối lượng riêng của môi trường thì các giọt sẽ sa lắng và ngược lại

Nhũ tương đậm đặc: Pha phân tán chiếm 74% đến 99% thể tích hệ Nhũ tương loại này chỉ tồn tại khi có chất nhũ hóa tốt Dung dịch chất nhũ hóa nằm giữa các giọt của pha phân tán dưới dạng những màng rất mỏng, độ dày của màng trong các nhũ này mỏng tới 100A hoặc bé hơn Các giọt dầu biến dạng thanh các hình đa diện và được ngăn cách với nhau bằng các màng mỏng của chất nhũ hóa và pha ngoài (pha liên tục) trong một số trường hợp hệ tạo thành khối gel, có ranh giới phân chia pha phức tạp

1.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới sự tạo nhũ:

Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo nhũ như: Thiết bị sử dụng cho quá trình tạo nhũ, cường độ của năng lượng cung cấp, nhiệt độ trong quá trình tạo nhũ, sự có mặt của chất hoạt động bề mặt, sự có mặt của oxy, bản chất của dầu, hàm lượng protein hòa tan và các nhũ tương hóa của protein, độ hòa tan và khả năng trương hóa của protein có quan hệ tỷ lệ thuận Các loại protein không hòa tan có khả năng tạo nhũ tương thấp, ngoài ra pH, lực ion cũng gây ảnh hưởng đên quá trình tạo nhũ

1.1.4 Các biến đổi xảy ra trong quá trình tạo nhũ:

Biến đổi vật lý : Đồng hóa làm giảm kích thước của các hạt phân tán trong hệ nhũ tương hoặc huyền phù, nhằm hạn chế hiện tượng tách pha trong quá trình bảo quản sản phẩm Kích thước của các hạt phân tán càng nhỏ thì khả năng bị tách pha của huyền phù hoặc nhũ tương càng khó xảy ra Đối với hệ nhũ tương, sau khi đồng hóa các chất lỏng trong hệ thì độ nhớt của hệ sẽ lớn hơn độ nhớt của hệ ban đầu

Kết quả đồng hóa chất lỏng làm cho sự tiếp xúc lẫn nhau giữa các cấu tử được tăng lên và các cấu tử này có thể xảy ra các phản ứng hóa học với nhau Việc sử dụng áp lực cao để thực hiện quá trình đồng hóa sẽ làm tăng nhiệt độ của nguyên liệu Kết quả thực nghiệm cho thấy nếu như áp lực sử dụng tăng 40 bar thì nhiệt độ nguyên liệu sẽ tăng 1 C Trong công nghiệp thực phẩm, giá trị áp lực sử dụng thường dao động trong khoảng 200 – 300 bar tương đương với khoảng tăng nhiệt độ nguyên liệu trong quá trình đồng hóa là 5 – 7,5°C Như vậy, mức độ làm tăng nhiệt cho nguyên liệu là không lớn

Biến đổi hóa lý: Đồng hóa làm tăng diện tích bề mặt tiếp xúc giữa hai pha phân tán và pha liên tục trong hệ nhũ tương hoặc huyền phù Khi đó các giá trị như năng lượng bề mặt và sức căng bề mặt trong hệ phân tán sẽ thay đổi Khi có sử dụng chất nhũ hóa, chúng sẽ phân bố tại vị trí bề mặt tiếp xúc pha trong hệ phân tán, nhờ đó mà độ bền pha phân tán của sản phẩm sẽ gia tăng.

Hệ nhũ tương nano

1.2.1 Giới thiệu hệ nhũ tương nano:

Hệ nhũ tương nano là hệ nhũ tương với pha phân tán có kích thước giọt từ 20 đến 500nm (Gupta và cộng sự, 2016)

Nhũ tương nano do kích thước giọt nhỏ của chúng làm cho chúng ổn định hơn Mặc dù nhũ tương nano tương phản với các vi nhũ tương ổn định nhiệt động lực học là do hệ thống cân bằng không trải qua quá trình keo tụ, kết tụ Tuy nhiên, với việc lựa chọn thích hợp các thành phần và phương pháp thích hợp thì có thể đạt được nhũ tương nano có độ ổn định động học cao

Hệ nhũ tương nano tiêu biểu chứa pha dầu, pha nước và chất nhũ hóa Chất nhũ hóa rất cần thiết để tạo thành giọt nhỏ vì chất nhũ hóa làm giảm sức căng bề mặt giữa pha dầu và pha nước Chất nhũ hóa còn đóng vai trò ổn định hệ nhũ tương nano thông qua tương tác đẩy tĩnh điện (repulsive electrostatic interactions) và tạo sự cản trở không gian (steric indrance) Chất nhũ hóa thường dùng là chất hoạt động bề mặt, nhưng protein và lipid cũng cho hiệu quả trong quá trình tạo nhũ tương nano

Hệ nhũ tương nano thường dùng để mang và phân tán các hợp chất có hoạt tính sinh học Hiện nay nhiều hợp chất chức năng có lợi cho sức khỏe như ngăn chặn và điều trị bệnh thường có trên thị trường ở dạng thuốc hay thực phẩm chức năng Tuy nhiên, các hợp chất này đôi khi thể hiện hoạt tính sinh học kém Nguyên nhân chủ yếu là do nhiều hợp chất chức năng không ưa nước Kỹ thuật nano nói chung hay hệ nhũ tương nano nói riêng thường được sử dụng giúp cải thiện khả năng hòa tan và tăng hoạt tính sinh học của các hợp chất chức năng ưa béo Hệ nhũ tương nano là một ứng dụng phù hợp vì hệ nhũ nano giúp mang hay phân phối hợp chất ưa béo như chất dinh dưỡng, thuốc, hương, chất chống oxy hóa và chất kháng khuẩn (Silva và cộng sự, 2012)

Hệ nhũ tương nano có đặc điểm chung là kích thước giọt nhỏ (khoảng 100nm, nhỏ hơn bước sóng ánh sáng nhìn thấy được), ổn định cao và trong suốt Những đặc tính này giúp hệ nhũ tương nano được ứng dụng rộng rãi trong các lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm, dược phẩm và phân phối thuốc Kích thước giọt có thể được điều chỉnh để hệ nhũ chuyển từ trong suốt sang dạng trắng sữa Hệ nhũ tương nano có độ ổn định cao, có thể lên đến nhiều năm.

Với kích thước giọt phân tán nhỏ, hệ nhũ tương nano siêu ổn định dưới tác động trọng lực nhờ hiệu ứng chuyển động Brown Hoạt tính sinh học của hợp chất bao bọc trong hệ nhũ tương cũng được cải thiện đáng kể nhờ sự tăng diện tích bề mặt so với thể tích Cũng nhờ kích thước giọt phân tán nhỏ mà sự vận chuyển hợp chất chức năng này qua màng cũng tăng theo (Nirmal, 2018)

Hạn chế của hệ nhũ tương nano là sự mất ổn định trong thời gian bảo quản dài do hiện tượng tách pha sau khi giọt nhũ đông tụ, kết tụ hay do hiện tượng chín Ostwald Tuy nhiên sự mất ổn định này có thể được khắc phục nhờ sử dụng chất nhũ hóa với tỷ lệ cao Chất nhũ hóa thực phẩm thường dùng tạo nhũ nano như lecithin, polysorbate, ester đường hay polymer sinh học (tinh bột biến tính, gum tự nhiên, protein động thực vật) Các hợp chất này làm ảnh hưởng đến tính lưu biến, lực tĩnh điện, lực đẩy không gian của hệ (Nirmal, 2018)

Chất nhũ hóa có thể là không ion, lưỡng tính, cation hoặc anion Thành phần của hệ nhũ nano có thể gây độc Sử dụng lượng lớn chất nhũ hóa có thể gây kích ứng hệ tiêu hóa hoặc da Do đó, lựa chọn chất nhũ hóa phù hợp là rất quan trọng Sử dụng tối thiểu chất nhũ hóa thường được khuyến nghị Chất nhũ hóa không ion thường ít độc hơn chất nhũ hóa có ion và thường có nồng độ micelle tới hạn (CMC) thấp hơn Hệ nhũ dầu trong nước dùng để uống hoặc dùng ngoài thường sử dụng chất nhũ hóa không ion, vì chúng ổn định hơn và ít gây tác dụng phụ cho cơ thể (Chime, 2014).

Một thông số quan trọng khác để lựa chọn chất nhũ hóa là độ cân bằng ưa nước - ưa dầu (hydrophile-lipophile balance / HLB) Chất nhũ hóa thường tập trung ở bề mặt phân cách hai pha dầu - nước, làm giảm năng lượng tạo nhũ tương và cải thiện sự ổn định hệ Để tạo nhũ tương dầu trong nước, giá trị HLB thường lớn hơn 10 Trộn lẫn hai loại chất nhũ hóa có HLB thấp và cao thường tạo nên nhũ tương bền khi hòa tan trong nước (Chime, 2014).

Loại và bản chất chất nhũ hóa cũng là yếu tố ảnh hưởng đáng kể, chất nhũ hóa không ion thường được chọn vì ít bị ảnh hưởng bởi pH và sự thay đổi lực ion, thường an toàn (GRAS) Sự hòa tan của dầu và chất nhũ hóa cũng là yếu tố quan trọng Chất nhũ hóa không cần thiết phải hòa tan tốt với cả hợp chất chức năng và dầu Sự hòa tan chất nhũ hóa và dầu bước đầu có thể xác định khả năng hình thành hệ nhũ nano

Chất đồng nhũ hóa (cosurfactant) được cho thêm vào để tạo hệ nhũ nano với nồng độ chất nhũ hóa thấp Rượu có độ dài mạch từ ngắn – trung bình đến dài (C3– C8) thường được cho vào với vai trò đồng nhũ hóa để làm giảm sức căng bề mặt và tăng độ lỏng (fluidity) của mặt phân cách Chúng làm tăng tính linh động của đuôi hydrocarbon và cho phép thấm dầu vào vị trí này Alcohol có thể làm tăng sự hòa tan của nước và dầu vì tạo phần trung gian giữa hai pha Đồng nhũ hóa dùng trong hệ nhũ nano như Transcutol P, glycerin, ethyleneglycol, ethanol, propanol, ethanol, isopropyl alcohol, n-butanol, PEG 400, Carbitol, và propylene glycol (Chime, 2014)

Hiện nay hệ nhũ tương nano trong thực phẩm dùng để phân tán các loại hợp chất màu tự nhiên hay các chất có hoạt tính sinh học cao như carotene, lycopene, curcumin,…hay các loại chất tạo hương vị kém tan trong nước như các loại tinh dầu, với vai trò tăng giá trị dinh dưỡng, cảm quan sản phẩm hay bảo quản sản phẩm Trong đó, tinh dầu là nhóm lipid kỵ nước chứa hỗn hợp chất hương, là những hợp chất trao đổi chất thứ cấp của tế bào giúp sinh vật chống lại các yếu tố có hại từ ngoại cảnh như vi sinh gây bệnh, động vật ăn cỏ, côn trùng hay tia UV Thành phần cơ bản tinh dầu gồm terpen, terpenoid, phenylpropanoid và nhiều hợp chất khác Nhiều nghiên cứu cho thấy tinh dầu có khả năng kháng khuẩn như tinh dầu xả, tinh dầu xạ hương, tinh dầu quế, tinh dầu đinh hương,…Tuy nhiên việc sử dụng tinh dầu trong thực phẩm có hạn chế do sự kém ổn định của tinh dầu và hương vị tinh dầu làm ảnh hưởng tính chất cảm quan thực phẩm Do đó, bao bọc tinh dầu trong hệ nhũ tương nano làm tăng hoạt tính tinh dầu và hạn chế ảnh hưởng đến mùi vị sản phẩm (Nirmal, 2018) Rất nhiều nghiên cứu để tạo thành hệ nhũ tương nano tinh dầu và ứng dụng chế phẩm này trong thực phẩm được thực hiện

Hệ nhũ tương tinh dầu Salvia multicaulis được tạo thành thông qua phương pháp đánh siêu âm, sở hữu kích thước hạt 89,45nm Nghiên cứu của Gharenaghadeh et al (2017) chỉ ra rằng, sau 60 ngày, hệ nhũ tương này vẫn duy trì được trạng thái ổn định.

Tinh dầu tỏi là nguyên liệu thực phẩm phổ biến, vừa tăng hương vị vừa có tác dụng bảo quản do khả năng kháng khuẩn của nó Nghiên cứu của Katata-Seru và các cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng hệ nhũ tương nano chứa tinh dầu tỏi có hiệu quả kháng khuẩn cao hơn tinh dầu tỏi thông thường Trong thử nghiệm với vi khuẩn E coli O157, hệ nhũ tương nano cho đường kính vòng kháng khuẩn lớn hơn 2mm so với tinh dầu không tạo nhũ nano.

Tinh dầu tầm ma (nettle oil) tạo nhũ nano bằng phương pháp đồng hóa áp suất cao có khả năng kháng khuẩn tương đương kháng sinh kanamycin 50μg/ml với các nồng độ thành phần phù hợp với 2,5% tinh dầu theo khối lượng, hàm lượng chất nhũ hóa Tween 40 và Tween 80 bằng lượng tinh dầu (Gharibzahedi và cộng sự, 2016)

Tinh dầu Eugenia brejoensis được dùng để tạo nhũ nano và thử hoạt tính kháng khuẩn của hệ nhũ tương này Kết quả ghi nhận được kích thước vòng kháng khuẩn của hệ nhũ tương nano tinh dầu tạo thành với kích thước hạt 143,13nm có khả năng ức chế tương tự dung dịch chứa chất kháng sinh chloramphenicol 1000ppm (Mendes và cộng sự, 2018)

Tinh dầu tiêu

1.3.1 Giới thiệu về tinh dầu:

Theo Baser và cộng sự, 2010 thì tinh dầu là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất dễ bay hơi tạo thành từ tế bào sống và phân tách bởi các phương pháp vật lý như ép hay chưng cất từ toàn bộ thực vật hay một bộ phận của thực vật Các thành phần chính của tinh dầu được sinh tổng hợp từ ba con đường:

Con đường mevalonate tạo sesquiterpenes

Con đường methyl-erithrytol tạo mono và diterpene

Con đường shikimic acid tạo phenylpropene

Tinh dầu tên tiếng Anh là Essential Oil, là dạng lỏng tập trung của các chất dễ bay hơi tự nhiên trong thực vật có mùi thơm Người ta ví tinh dầu là nhựa sống của cây, mang sức sống và năng lượng tinh khiết nhất Chúng mạnh hơn 50 đến 100 lần các loại thảo dược sấy khô Các phân tử tinh dầu có xu hướng thay đổi nhanh chóng từ trạng thái lỏng hoặc rắn sang khí ở nhiệt độ phòng Bằng cách bay hơi nhanh chóng này tinh dầu dễ dàng tương tác trực tiếp đến khứu giác Vì vậy khi mở nắp tinh dầu bạn sẽ cảm nhận được mùi hương rất mạnh ở một khoảng cách nhất định Đa số các loại tinh dầu đều trong veo, nhưng cũng có một số có màu vàng hoặc hổ phách như: Tinh dầu sả chanh (lemongrass), tinh dầu cam ngọt (orange), tinh dầu hoắc hương

Từ thời trung cổ, các loại tinh dầu đã được sử dụng rộng rãi trong việc diệt khuẩn, diệt virut, diệt nấm, chống nhiễm trùng, diệt côn trùng, cả trong dược phẩm và mỹ phẩm đặc biệt là hiện nay trong các ngành công nghiệp dược phẩm, mỹ phẩm, nông nghiệp và thực phẩm Tùy vào cách tách chiết, tinh dầu chủ yếu được tách chiết bằng chưng cất từ thực vật thơm, chúng chứa nhiều loại phân tử thơm dễ bay hơi như terpen và terpenoid, thành phần thơm có nguồn gốc phenol và thành phần aliphatic Xét nghiệm hóa lý trong ống nghiệm hầu hết chúng là các chất chống oxy hóa Tuy nhiên, nghiên cứu gần đây cho thấy trong các tế bào nhân chuẩn, tinh dầu có thể hoạt đông như các chất chống oxy hóa ảnh hưởng đến màng tế bào bên trong và các bào quan như ty thể Tùy thuộc vào từng loại và nồng độ khác nhau, tinh dầu thể hiện tác dụng của chúng trên các tế bào sống nhưng thường không gây độc

Trong hàng nghìn năm qua, tinh dầu thực vật đã được sử dụng rộng rãi với nhiều mục đích, từ nước hoa, hương liệu đồ uống (Lawless, 1995) cho đến chất bảo quản lương thực (Mishra và Dubey, 1994) Đặc biệt, tính kháng khuẩn của tinh dầu đã tạo cơ sở cho nhiều ứng dụng trong bảo quản thực phẩm, dược phẩm, thuốc thay thế và liệu pháp tự nhiên (Reynold, 1996; Lis-balchin và Deans, 1997).

Một số loại dầu được sử dụng trên cơ sở đặc tính chống vi khuẩn đã được ghi nhận rõ ràng trong phòng thí nghiệm, một số dữ liệu đã được công bố (Morris và cộng sự 1979; Ross và cộng sự 1980; Yousef và Tawil 1980; Dean và Ritchie 1987; Hili, 1997) Một số nghiên cứu chỉ tập trung vào một loại dầu hoặc một loại vi sinh vật Mặc dù các số liệu này rất có ích nhưng các báo cáo này không thể dùng để so sánh trực tiếp do sự khác biệt về phương pháp cũng như lựa chọn cách chiết xuất, vi sinh vật thử nghiệm và phương pháp thử nghiệm kháng khuẩn (Janssen, 1987) Tinh dầu nguyên chất: Là tinh dầu được chiết xuất 100% từ thực vật, không thêm bất cứ thành phần hóa học nào khác Tinh dầu nguyên chất an toàn cho sức khỏe, có thể dùng để ăn uống được ở hàm lượng nhất định theo hướng dẫn của bác sĩ Trừ một số loại tinh dầu nguyên chất từ dược thảo không ăn uống được như: tinh dầu bách, tinh dầu lộc đề xanh Wintergreen, Nếu không đủ tinh khiết từ thiên nhiên thì tinh dầu không thể dùng để ăn uống được

Tinh dầu không nguyên chất là loại tinh dầu được tạo thành bằng cách pha loãng tinh dầu nguyên chất với các thành phần hóa học khác hoặc được chiết xuất từ thực vật nhưng không đạt được độ tinh khiết cần thiết để phát huy các lợi ích sức khỏe.

Tinh dầu không nguyên chất vẫn giữ được mùi hương của tinh dầu Vì vậy, ngay cả các chuyên gia cũng không thể đánh giá được chất lượng, độ tinh khiết của tinh dầu bằng cách nhìn hoặc ngửi Tinh dầu tổng hợp còn gọi là hương liệu, dầu thơm hóa tổng hợp có tên tiếng Anh là: Perfume / Perfume Oil / Fragrance Oil / Scented Oil Tinh dầu tổng hợp là tinh dầu được tổng hợp từ hương liệu bắt chước mùi thơm của tinh dầu Chúng còn tạo ra mùi thơm của các loại cây không có tinh dầu (như táo, dâu tây,…) hay mùi hương mới (mùi biển Hawaii,…)

Tinh dầu tổng hợp thường được dùng để tạo hương trong ngành mỹ phẩm, xà phòng, thuốc lá, sản phẩm vệ sinh,…

1.3.2 Giới thiệu về tinh dầu tiêu đen:

Tinh dầu là một loại chất lỏng chứa các hợp chất thơm có mùi đặc trưng tùy thuộc vào nguồn gốc nguyên liệu Phần lớn tinh dầu có nguồn gốc từ thực vật và số ít từ động vật Tinh dầu không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ và khối lượng riêng thường nhỏ hơn nước Đa phần tinh dầu có điểm sôi thấp, rất dễ bay hơi Ở thực vật, tùy vào loài để cho nguồn nguyên liệu thu tinh dầu khác nhau Đối với bạc hà, sả, hương nhu… thường thu tinh dầu từ lá, cành; gừng, nghệ… thu tinh dầu từ củ, rễ; cam, chanh, quýt… thu tinh dầu từ vỏ; hồi, mùi, tiêu… thu tinh dầu từ quả, hạt; hoa hồng, hoa nhài… thu tinh dầu từ hoa Dựa vào đặc điểm nguyên liệu để lựa chọn phương pháp trích ly thu tinh dầu, và các phương pháp khác nhau cũng ảnh hưởng đến chất lượng của chúng Một số phương pháp trích ly thu thu tinh dầu như [26]: Phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, phương pháp cơ học, phương pháp trích ly bằng dung môi dễ bay hơi, phương pháp hấp phụ rắn, phương pháp trích ly bằng CO2

Tinh dầu nguyên chất là hỗn hợp của hơn 200 thành thành phần gồm Hydrocacbon, Alcohol, Phenol, Aldehyde, Xetol, Ester và một số chất khác [15]

Các hydrocacbon thường gặp trong tinh dầu là những terpen (C10H16)n mạch hở hoặc vòng

Các monoterpene mạch hở: tiêu biểu là miaxene, oximene (có trong tinh dầu hoa houblon, nguyệt quế)

Maxene Oximene Các dẫn xuất chứa oxi của chúng là linalool, geraniol, citronelol…

- Các monoterpene một vòng: phổ biến là limonene (có trong tinh dầu cam, chanh, thông…)

Limonene Các dẫn xuất chứa oxi của chúng là menthol, piperitol, carvone

- Các monoterpene hai vòng: tiêu biểu là pinene (có trong tinh dầu thông) và camphene (có tinh dầu chanh, oải hương)

Các sesquiterpene mạch thẳng và vòng tiêu biểu là farnesene (trong tinh dầu cam, chanh), gingiberene (trong tinh dầu gừng), humulene (trong tinh dầu houblon), caryophyllen (trong tinh dầu đinh hương, hồ tiêu, hương thảo)

Farnesene β - Caryophyllene Các dẫn xuất chứa oxi của sesquiterpene có farnesol, nerolidol…

Một số alcohol quan trọng trích từ tinh dầu thường gặp như methol (trong tinh dầu bạc hà), borneol (trong tinh dầu cam, tùng hương, oải hương), terpinol (trong tinh dầu tràm, kinh giới, thông)

Môt số hợp chất phenol trích từ các loại tinh dầu như thymol (có trong tinh dầu bách lí hương), estragol (trong tinh dầu hung quế), anethol (trong tinh dầu hồi), eugenol (trong tinh dầu đinh hương, hương nhu, húng quế…)

Một số aldehyde có trong các loại tinh dầu như andehit cuminic (trong tinh dầu thì là, hoa nhục quế), citral (trong tinh dầu sả chanh, mã tiền thảo), citronella được trích ly từ nguyên liệu thiên nhiên

Cũng giống như alcohol và aldehyde, ketone cũng là một thành phần quan trọng trong tinh dầu Một số ketone như methyl heptenon (trong tinh dầu sả chanh), pulegon (trong tinh dầu bạc hà), carvon (trong tinh dầu phòng phong…)

Ester bốc hơi nhanh tạo độ ngát hương cho tinh dầu Một số ester có trong tinh dầu như isoamyl acetate (có trong chuối, hạt cacao), ethyl anthranolate (có trong nho), benzyl propionate (có trong dầu)

Ngoài các hợp chất nói trên, trong các loại tinh dầu còn có các hợp chất thuộc nhóm oxit (eucalyptol), các amino acid (acid anteranilic), các lacton (coumarin, ambretolic), các hợp chất có lưu huỳnh (anlyl isosulfocyannat), hợp chất có nito (methyl antranilat)

1.3.3 Thành phần hóa học của tinh dầu tiêu đen:

Tổng quan về chủng vi sinh vật

-Tên khoa học: Escherichia coli (E coli)

Escherichia coli còn được gọi là trực khuẩn đại tràng, sống trong ruột người và một số động vật Vi khuẩn được phát hiện vào năm 1885 và được nghiên cứu chi tiết vào năm 1886 E coli là trực khuẩn Gram âm Tế bào hình que, hai đầu tròn, kớch thước dài ngắn khỏc nhau, khoảng 2-3àm ì 0,4-0,7àm, thường đứng riờng lẻ từng tế bào, cũng có khi ghép từng đôi một, có khi kết với nhau thành từng đám hoặc chuỗi ngắn Vi khuẩn không sinh bào tử, có chu mao nên có khả năng chuyển động E coli được nuôi cấy trên môi trường thạch thường trong điều kiện kị khí hay hiếu khí tùy tiện Có thể mọc được ở 5-40 0 C, song phát triển tốt ở nhiệt độ 37 0 C Sống được ở pH 5,5-8 và thích hợp nhất ở pH 7-7,2 Khuẩn lạc có màu trắng đục Ở môi trường dịch thể, sau 1-2 ngày nuôi cấy thường làm đục môi trường, có váng trên bề mặt hoặc dính quanh thành ống tạo thành cặn lắng xuống đáy

E coli có khả năng lên men đường lactose, trong khi một số nhóm vi khuẩn đường ruột khác không có khả năng này Ngoài ra E coli còn có khả năng lên men đường glucose, galactose…, sinh khí làm sủi bọt môi trường

Phần lớn các chủng thuộc loài E coli vô hại trừ một vài chủng như O157:H7 có thể nhiễm độc với con người qua thực phẩm Những chủng vô hại là một bộ phận của khu hệ đường ruột, chúng có ích cho vật chủ do sản sinh ra các vitamin, đặc biệt là vitamin K2 và có vai trò ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh khác trong đường ruột Các chủng E coli độc có thể gây ra bệnh viêm dạ dày- ruột, nhiễm đường tiết niệu Trong một số trường hợp, chủng độc gây ra hội chứng tiểu tiện ra máu, viêm màng bụng, viêm phổi, viêm màng não Một số chủng độc như E coli O157:H7 và E coli O104:H21 sinh ra độc tố mạnh có thể gây tử vong E coli thường lây sang người qua thức ăn nhiễm bẩn chưa được thanh trùng, rửa sạch, nấu chín đúng cách như trong sữa tươi chưa được thanh trùng, rau củ bón phân hữu cơ chưa được rửa và chế biến sạch Cách điều trị bệnh do E coli gây nên cũng gặp nhiều khó khăn vì E coli kháng lại nhiều loại kháng sinh nên phải chọn kháng sinh khi điều trị cho phù hợp với từng loại bệnh mà E coli gây nên [22]

Salmonella là vi khuẩn Gram âm, có dạng hình que, vi khuẩn hiếu khí không bắt buụ̣c Vi khuẩn cú kớch thước khoảng 0,7-1,5 ì 2-5àm, thường sống đơn lẻ hoặc kết thành chuỗi Vi khuẩn có long mao nên có khả năng di chuyển được, không sinh bào tử Salmonella phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 37 0 C trên môi trường nuôi cấy thông thường pH thích hợp nhất là 7,6 Ở môi trường dịch thể, vi khuẩn làm đục môi trường trong thời gian ngắn Ở môi trường thạch agar, vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc tròn, lồi, màu trắng

Salmonella có khả năng lên men đường glucose, sinh ra khí Vi khuẩn này có khả năng tồn tại trong nước, trong phân bệnh nhân tới vài tháng, 2-3 tháng trong nước đá và vài tuần trong nước thường Chúng chết nhanh ở nhiệt độ cao, 50 0 C trong 1 giờ, 60 0 C trong 20 phút, 100 0 C trong 5 phút Salmonella sinh ra nội độc tố

Vi khuẩn nhạy cảm với một số chất sát trùng, nhưng kháng được một số thuốc nhuộm

Salmonella thường lây nhiễm qua đường tiêu hóa, gây ra bệnh thương hàn

Sau khi vi khuẩn theo đường ăn uống vào bên trong cơ thể, qua dạ dày rồi vào ruột non, qua các niêm mạc ruột, tới các hạch bạch huyết thì dừng lại và phát triển Ở hạch bạch huyết, một số vi khuẩn bị phá vỡ và giải phóng nội độc tố Các độc tố này kích thích hệ thần kinh gây sốt thương hàn hoặc bị đầy hơi đi lỏng, làm sung loét hoặc hoại tử các mảng peyer dẫn đến chảy máu ruột hoặc làm thủng ruột Từ hạch, một số vi khuẩn có thể vào máu rồi đi đên cơ quan bên trong như gan, lách… Các nội độc tố vi khuẩn được giải phóng ra ngoài, một số vi khuẩn theo phân ra ngoài

Sau 10-14 ngày ủ bệnh, nhiệt độ cơ thể tăng cao trong khoảng 39-40 0 C, người cảm thấy lạnh Người bệnh suy nhược nhanh chóng, chán ăn, mệt mỏi, gan và lá lách to dần, xuất huyết ngoài da, lượng bạch cầu giảm Sau ba tuần, bệnh giảm Hiện nay, có thể điều trị bệnh bằng kháng sinh [21]

Giới thiệu về thịt

Thịt tươi sống là thịt của gia súc, gia cầm, chim thú sau khi giết mổ ở dạng nguyên con, cắt miếng hoặc xay nhỏ và được bảo quản ở nhiệt độ thường hoặc nhiệt độ từ 0°C đến 4°C.

Thịt nói chung và thịt gà nói riêng là loại thực phẩm có giá trị dinh dưỡng cao, chứa nhiều dưỡng chất như acid amin, lipid, vitamin và các chất khoáng thiết yếu cần cho sự phát triển của con người và là thức ăn chính yếu trong bữa ăn hàng ngày Thịt gia cầm phù hợp cho những người ăn kiêng sử dụng vì lượng chất béo trong thịt gia cầm ít hơn so với các loại thịt khác nhưng nó vẫn cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể Do đó, nhu cầu về số lượng cũng như chất lượng của thịt gia cầm sẽ không ngừng gia tăng Chất lượng thịt phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như kỹ thuật chăm sóc và nuôi dưỡng, điều kiện môi trường giết mổ và điều kiện bảo quản, vận chuyển, bày bán thịt Các loại thịt sau giết mổ rất dễ nhiễm vi sinh vật như vi khuẩn hiếu khí, Coliforms, E coli, Staphylococcus aureus và Salmonella, các vi sinh vật này nhiễm vào thịt theo hai con đường là nội sinh và ngoại sinh Thịt gia súc và gia cầm khỏe thường có ít vi sinh vật

1.5.2 Yêu cầu cảm quan của thịt tươi:

Dựa vào TCVN 7046-2009, tiêu chuẩn này áp dụng cho các loại thịt tươi được dùng làm thực phẩm

Bảng 1.3: Yêu cầu cảm quan của thịt tươi

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

Trạng thái Bề mặt khô sạch, không dính lông và tạp chất lạ

Có độ đàn hồi, ấn ngón tay vào thịt không để lại dấu ấn trên bề mặt khi bỏ tay ra

Tủy bám chặt và thành ống tủy ( nếu có)

Màu sắc Đặc trưng của sản phẩm

Mùi Đặc trưng của sản phẩm, không có mùi lạ,

Nước luộc thịt Thơm, trong, váng mỡ to, khi phản ứng với đồng Sulfat cho phép hơi đục

1.5.3 Các chỉ tiêu hóa lý cho phép trong thịt tươi:

Bảng 1.4: Các chỉ tiêu hóa lý của thịt tươi

Tên chỉ tiêu Yêu cầu

2 Phản ứng định tính Hydro Sulfur ( H2S) Âm tính

3.Hàm lượng amoniac, mg/100g, không lớn hơn 35

CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Vật liệu

2.1.1 Địa điểm và thời gian thực hiện:

Trường Đại Học Mở T.P Hồ Chí Minh cơ sở 3 Bình Dương 68 Lê Thị Trung, phường Phú Lợi, T.P Thủ Dầu Một, Bình Dương

2.1.2 Vật liệu và hóa chất:

- Tinh dầu tiêu đen Việt Nam

Hình 2.1: Tinh dầu tiêu đen An Phong

Nguồn gốc: Công ty Cổ phần Đầu tư và XNK An Phong, thôn 10, xã Nâm N’Jang, huyện Đăk Dong, tỉnh Đăk Nông

Bảng 2.1: Chỉ tiêu hóa lý của tinh dầu tiêu Việt Nam

STT Tên chỉ tiêu Đơn vị Mức

Không màu Thơm đặc trưng của hạt tiêu

(Nguồn: Phân tích tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn đo lường chất lượng 2)

Nguồn gốc: Công ty Bio basic, Canada

Dung dịch có màu vàng óng trong suất, không mùi, dạng sệt, không tan trong nước

2.1.3 Dụng cụ và thiết bị:

- Máy khuấy từ gia nhiệt ARE-VELP

Hình 2.3: Thiết bị máy khuấy từ gia nhiệt

- Bộ chưng cất tinh dầu

- Thiết bị đo độ nhớt: Nhớt kế

- Cân phân tích (DJ-A500), bếp điện, tủ cấy,

- Các dụng cụ thông thường sử dụng trong phòng thí nghiệm như: Pipet, becher 50ml, becher 100ml, becher 500ml, buret, que cấy…

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Các quy trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

2.2.1.1 Quy trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen bằng phương pháp EIP:

Hình 2.4: Sơ đồ tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu bằng phương pháp EIP

Thuyết minh quy trình: Tỉ lệ của nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen được làm bằng phương pháp EIP có tỉ lệ 10% tinh dầu, 15% Tween 80 và 75% nước Tinh dầu và Tween 80 đựng trong becher được trộn đều bằng cách đặt trên bếp khuấy từ, khuấy trộn đều với vận tốc 2000 vòng/ phút, khuấy trộn trong vòng 5 phút Tiếp theo cho nước vào buret, điều chỉnh tốc độ nhỏ giọt của giọt nước xuống becher với vận tốc 1 ml/s Sau khi nước trong buret chảy hết, mẫu nhũ tương được khuấy thêm

15 phút Mẫu nhũ tương đó được để yên ổn định ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ mới có thể đem đi làm các thí nghiệm Tổng thể tích mẫu làm có thể từ 30 - 50ml

2.2.1.2 Quy trình tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen bằng phương pháp PIT:

Hình 2.5: Sơ đồ tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu bằng phương pháp PIT

Thuyết minh quy trình: Tỉ lệ của nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen được làm bằng phương pháp PIT có tỉ lệ 10% tinh dầu, 15% Tween 80 và 75% nước Chuẩn bị nước đựng trong becher 250ml đặt trên máy khuấy từ tiến hành khuấy, sau đó cho từ từ hỗn hợp tinh dầu và Tween 80 vào nước, vừa cho vừa khuấy gia nhiệt đến

50 o C, tiếp tục khuấy trong vòng 15 phút với tốc độ 2000 vòng/phút Sau khi khuấy tiến hành gia nhiệt tối đa đến 85 o C mẫu nhũ tương bắt đầu chuyển sang trạng thái trong suốt cho đến khi đạt điểm PIT Tiếp tục gia nhiệt thêm 5 phút Sau khi gia nhiệt, cho mẫu vào cốc nước đá khoảng 5 o C để hạ nhiệt trong vòng 30 phút (vừa hạ nhiệt vừa khuấy trộn trên bếp từ) Sau khi khuấy ổn định thu được hệ nhũ tương nano tinh dầu đen Để yên ổn định mẫu ở nhiệt độ phòng, sau 24 giờ mới có thể đem đi làm các thí nghiệm

2.2.2 Khảo sát tính chất của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

2.2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của sự thay đổi nhiệt độ đến tính chất của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Mục tiêu: Xác định khả năng chịu nhiệt và sự ổn định cấu trúc, hoạt tính chống oxi hóa của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen

Mô tả thí nghiệm: Sau khi tạo hệ nhũ tương nâng nhiệt độ hệ nhũ tương lên

100 C sau đó hạ nhiệt còn 30 C, tiến hành thực hiện 3 lần chu kì nâng hạ nhiệt độ Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Cách đánh giá: Sau mỗi chu kì tiến hành đo các thông số độ hấp thu ở bước sóng 600nm, độ nhớt và hoạt tính chống oxi hóa

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với

3 lần lặp lại Yếu tố khảo sát: Chu kì xử lí nhiệt

Bảng 2.2: Bố trí thí nghiệm 1

Chỉ tiêu đánh giá Độ hấp thu Hoạt tính chống oxi hóa (%) Độ nhớt (c.P)

2.2.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ bảo quản đến tính chất của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Mục tiêu: Kiểm tra độ ổn định và hoạt tính chống oxi hóa của hệ nhũ tương dưới tác động của nhiệt độ bảo quản

Mô tả thí nghiệm: Sau khi tạo hệ nhũ tương bằng phương pháp EIP ta tiến hành cho các mẫu ở 3 nhiệt độ cần nghiên cứu là 30 C, 5 C và ở nhiệt độ đông lạnh (-10 C) Theo dõi kéo dài trong vòng 1 tháng với 3 lần lặp lại

Cách đánh giá hiệu quả của các hợp chất được thực hiện thông qua việc đo các thông số:- Độ hấp thu ở bước sóng 600nm- Hoạt tính chống oxy hóa tại các thời điểm cụ thể: - Sau 7 ngày - Sau 14 ngày - Sau 21 ngày

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với

3 lần lặp lại Yếu tố khảo sát: nhiệt độ bảo quản

Bảng 2.3: Bố trí thí nghiệm 2

Nhiệt độ bảo quản Chỉ tiêu đánh giá

- Hoạt tính chống oxi hóa

2.2.2.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng chế độ ly tâm đến tính chất của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Mục tiêu: Thí nghiệm nhằm mục tiêu kiểm tra độ ổn định của hệ nhũ tương nano dưới tác động của tốc độ ly tâm

Mô tả thí nghiệm: Sau khi tạo hệ nhũ tương nano, các mẫu được cho vào ống ly tâm và tiến hành ly tâm trong thời gian cần nghiên cứu

Cách đánh giá: Mẫu được đem đi đo độ hấp thu ở bước sóng 600nm và độ nhớt sau khi ly tâm

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với

3 lần lặp lại Yếu tố khảo sát: Chế độ ly tâm

Bảng 2.4: Bố trí thí nghiệm 3

STT Nghiệm thức Độ hấp thu Độ nhớt

2.2.2.4 Thí nghiệm 4: Khảo sát khả năng bao bọc tinh dầu trong hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Mục tiêu: Thí nghiệm nhằm mục đích tính được hiệu suất nhốt tinh dầu trong hệ nhũ tương qua các mốc thời gian khác nhau Nhằm đánh giá khả năng giữ các giọt dầu trong hệ nhũ tương.

Mô tả thí nghiệm: Sau khi tạo hệ nhũ bằng phương pháp EIP ta tiến hành chưng cất băng phương pháp lôi cuốn hơi nước để thu hồi tinh dầu sau các khoảng thời gian 24 giờ, 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần, 4 tuần bảo quản Ghi nhận lượng tinh dầu sau chưng cất

Cách đánh giá: Sau chưng cất tiến hành tính hiệu suất thu hồi tinh dầu nhằm đánh giá khả năng giữ các giọt dầu trong hệ nhũ tương

Công thức tính phần trăm tinh dầu thu hồi:

% Tinh dầu thu hồi Trong đó: x là tinh dầu thu hồi sau khi chưng cất v là thể tích mẫu nhũ tương

Bố trí thí nghiệm: Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với

Bảng 2.5: Bố trí thí nghiệm 4

2.2.3 Khảo sát khả năng kháng khuẩn của nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen bằng phương pháp khuếch tán trên thạch:

2.2.3.1 Thí nghiệm 5: Khảo sát khả năng kháng khuẩn của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Mục tiêu: Kiểm tra, so sánh khả năng kháng khuẩn của nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen trên các loài vi khuẩn E.coli, Salmonella

Mô tả thí nghiệm: Sau khi tạo hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen được làm bằng hai phương pháp PIT và EIP bảo quản sau 24 giờ tiến hành đem chưng cất thu hồi tinh dầu Lượng tinh dầu của nhũ EIP là 6,49 % Lượng tinh dầu của nhũ PIT là 4,75% Ta nghiệm thu lượng tinh dầu của 2 phương pháp chọn lượng tinh dầu nhiều nhất để làm đối chứng dương

Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào ống nghiệm chứa huyền phù vi khuẩn 10 6 CFU/ml và trang đều lên đĩa thạch môi trường Để khô trong 5 phút trước khi đục các giếng Dùng micropipet hút lần lượt nhũ tương, tinh dầu 6,5% trong DMSO, DMSO (dimethyl sulfoxic) vào lần lượt từng giếng, mỗi chất một giếng (Thay đổi đầu típ khi hút chất này qua chất khác)

Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lặp lại

STT Nghiệm thức Hàm lượng tinh dầu tiêu trong mẫu (%)

Bảng 2.6: Bố trí thí nghiệm 5 Đường kính vòng kháng khuẩn (mm)

Vi khuẩn EIP PIT Tinh dầu 6,5% trong DMSO

Khả năng kháng khuẩn được đánh giá dựa trên đường kính vòng ức chế vi khuẩn trên đĩa thạch Những vi khuẩn sẽ không phát triển được trong vòng tròn này.

2.2.4 Khảo sát khả năng ứng dụng bảo quản thịt bằng nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

2.2.4.1 Quy trình bảo quản mẫu thịt tươi bằng nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen:

Hình 2.6: Quy trình bảo quản thịt tươi bằng nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen

Thuyết minh quy trình: Thịt sẽ được rửa bằng nước vô trùng rồi để ráo trên rây, có màn đậy ở nhiệt độ phòng trong khoảng 20 phút Sau đó được cắt thành từng miếng đồng nhất,có kích thước là 0,5x3x4 cm, tiếp theo là nhúng vào dung dịch bảo quản gồm nano tinh dầu tiêu đen được tạo thành bằng hai phương pháp PIT và EIP, dung dịch nước muối 0,9% Tiếp tục để ráo trên rây, có màn đậy ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Dùng kẹp gắp vào chén giấy, đậy kín bằng màng bọc thực phẩm Rồi cho vào hộp có nắp đậy, cuối cùng là bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh, (nhiệt độ khoảng 5 o C) Sau mỗi 2, 4, 6 ngày lấy mẫu đi kiểm tra mật độ vi sinh vật hiếu khí có trong thịt

2.2.4.2 Thí nghiệm 6: Khảo sát khả năng bảo quản thịt tươi của hệ nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen sau các khoảng thời gian 2, 4, 6 ngày:

Mục tiêu: Kiểm tra lượng vi sinh vật trong các mẫu thực phẩm có và không có bổ sung nhũ tương nano tinh dầu tiêu đen

Mô tả thí nghiệm: Thí nhiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên gồm

4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại, mỗi lần lặp lại gồm 3 đĩa petri tương ứng với các nồng độ pha loãng là 10 -4 ,10 -5 , 10 -6

Bảng 2.7: Bố trí thí nghiệm 6

1 Nhũ tương nano tinh dầu PIT

2 Nhũ tương nano tinh dầu EIP

3 Dung dịch nước muối vô trùng 0,9%

4 Nước cất vô trùng (đối chứng)