VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Thời gian và địa điểm thực hiện khóa luận tốt nghiệp
Thời gian: 03/2016 - 05/2016 Địa điểm: Phòng thí nghiệm Công nghệ tế bào thực vật, khoa Công nghệ sinh học, Trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh, cơ sở 3, Bình Dương.
Vật liệu
II.2.1 Đối tượng nghiên cứu
Cây Cà gai leo được cấy chuyền trong môi trường MS trong 6 tuần, chọn các cây kích thước đều nhau, khỏe và không bị nhiễm nấm hay vi khuẩn Cắt đoạn thân thành các đoạn ngắn khoảng 1-1,5 cm, có mang chồi nách
II.2.2 Điều kiện nuôi cấy in vitro cây Cà gai leo
II.2.2.1 Môi trường nuôi cấy
Sử dụng môi trường nuôi cấy MS cơ bản, bổ sung một số thành phần:
- Agar con cá cơ sở Hiệp Long: 8 g/L
- Dịch chiết Hoa mười giờ cho thí nghiệm tạo rễ với các nồng độ thay đổi pH: 5,7-5,8
Sử dụng chai thủy tinh 500 ml, cho vào mỗi chai 40 ml môi trường, được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121 o C, áp suất 1 atm trong 20 phút
II.2.2.2 Điều kiện nuôi cấy
Nhiệt độ phòng: 22 o C - 27 o C Độ ẩm trung bình: 63 ± 2%
Cường độ chiếu sáng: 2500 - 3000 lux
Thời gian chiếu sáng: 12 giờ/ngày
II.2.2.3 Hóa chất dùng trong thí nghiệm
Cồn 70 o , 96 o , Methanol, chloroform, ammoniac, ascorbic acid, DPPH 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl), solasodine (>95%)
Hóa chất pha môi trường nuôi cấy thực vật MS
Chất điều hòa tăng trưởng thực vật: 3-Indol-acetic acid (IAA)
II.2.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Lò vi sóng, tủ cấy, nồi hấp, máy đo pH, cân kỹ thuật, bộ soxhlet, bếp điện, nồi inox, chai thủy tinh 500 ml, dao cắt, kẹp, đèn cồn,
Thí nghiệm
II.3.1 Tạo rễ từ đoạn thân Cà gai leo
- Mục đích: + Khảo sát khả năng tạo rễ tốt nhất từ đoạn thân Cà gai leo trong môi trường có bổ sung nồng độ khác nhau của dịch chiết Hoa mười giờ
+ Tạo nguồn vật liệu để thực hiện thí nghiêm tách chiết dịch từ rễ bất định Cà gai leo
- Vật liệu thí nghiệm: Đoạn thân Cà gai leo
Môi trường khảo sát: MS bổ sung dịch chiết Hoa mười giờ 100%
Môi trường đối chứng: MS bổ sung chất điều hòa tăng trưởng IAA 1 mg/l [3]
- Mô tả thí nghiệm: Bổ sung vào môi trường nuôi cấy dịch chiết 100% của cây Hoa mười giờ để thay thế hợp chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp là auxin, cấy đoạn thân Cà gai leo vào bình môi trường, mỗi nghiệm thức 5 bình, mỗi bình 4 mẫu
- Thời gian theo dõi: 8 tuần
- Chỉ tiêu đánh giá: Số lượng, chiều dài và khối lượng rễ tạo thành
Bảng 2.1: Khảo sát nồng độ dịch chiết hoa mười giờ ảnh hưởng đến khả năng tạo rễ từ đoạn thân Cà gai leo
Tên nghiệm thức Nồng độ dịch chiết hoa mười giờ (ml/l) ĐC (IAA 1 mg/l) 0
II.3.2 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, với 9 lần lặp lại
Kết quả thí nghiệm được xử lý bằng phần mềm Statgraphics plus 3.0 Sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 95% của các giá trị được thể hiện bởi các chữ cái kèm theo, phân dạng Duncan
II.3.3 Giải phẫu hình thái mẫu rễ bất định Cà gai leo
Vật liệu: Rễ bất định của đoạn thân Cà gai leo in vitro sau 4 tuần
Phương pháp: Giải phẫu và nhuộm mẫu rễ bằng thuốc nhuộm 2 màu
Mô tả quá trình nhuộm: Cắt mẫu bằng tay
Ngâm mẫu trong javen 10-15 phút Rửa nước nhiều lần
Ngâm mẫu trong acid acetic 45% trong 10-15 phút Rửa nước nhiều lần, thấm ráo nước
Nhuộm thuốc nhuộm 2 màu là đỏ carmin và xanh iod trong 20 phút
Rửa nước nhiều lần, làm tiêu bản và quan sát dưới
23 kính hiển vi quang học.
3.4 Định tính alkaloid
Tiến hành định tính alkanoid bằng 2 loại thuốc thử là: Thuốc thử Mayer, thuốc thử Wagner trên dịch chiết từ rễ Cà gai leo in vitro thuộc hai thí nghiệm là MS + IAA và MS + dịch chiết hoa mười giờ được thu nhận sau 1 giờ đun cách thủy với
Dịch chiết từ rễ Cà gai leo in vitro được cho vào các ống nghiệm với thể tích mỗi ống là 5ml và bổ sung 1 giọt thuốc thử sau đó quan sát hiện tượng Ống đối chứng: H 2 SO 4 1% và thuốc thử
Mục tiêu: xác định alkaloid có trong dịch chiết rễ bất định
Chỉ tiêu đánh giá: màu sắc dung dịch, có tủa
II.3.5 Xác định solasodine trong rễ bất định Cà gai leo
II.3.5.1 Quy trình chiết cao thô từ rễ cây Cà gai leo
Rễ cây Cà gai leo sau 8 tuần nuôi cấy in vitro được thu nhận (ĐC nghiệm thức đối chứng, NT là của các nghiệm thức còn lại), sấy khô ở nhiệt độ phòng đến trọng lượng không đổi, tiến hành Soxhlet trong 3 giờ sau đó cô cao
Mục đích: Tạo nguyên liệu cho thí nghiệm sắc ký
Quy trình chiết cao thô [33] :
II.3.5.2 Thí nghiệm sắc ký bản mỏng TLC
Dung môi khai triển: Chloroform : methanol (19:1) [39]
Dung dịch thử: dùng dịch chiết NT, ĐC
Dung dịch chuẩn: hòa 1 mg solasodine trong 1 ml methanol
Chấm dung dịch lên bản mỏng: kẻ một vạch thẳng nằm ngang bằng bút chì, cách mép dưới bản mỏng 1 cm làm vạch xuất phát Dùng mao quản chấm các vết dung dịch thử và dung dịch chuẩn lên đó Các vết cách nhau 1 cm
Triển khai sắc ký: đặt bản mỏng vào bình sắc ký đã bão hòa hơi dung môi, mép phía chấm mẫu được nhúng vào dung môi nhưng không được cho điểm đã chấm mẫu chạm trực tiếp vào dung môi Sau khi dung môi chạy được ba phần bốn bản mỏng, lấy ra để sấy khô
Phát hiện các vết trên bản mỏng: soi bản mỏng dưới đèn UV có bước sóng 254 nm
II.3.5.3 Xác định hoạt tính chống oxy hóa bằng thử hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH
Thuốc thử DPPH và dung dịch chuẩn
Thuốc thử DPPH: DPPH được pha trong methanol với nồng độ 0,4 mg/ml để ổn định trong tối ở nhiệt độ 4 0 C trong thời gian 30 phút sau đó được sử dụng để thử nghiệm
Dung dịch chuẩn: Ascorbic acid được pha trong nước cất 1 lần với nồng độ 0,05 mg/ml bảo quản trong tối, ở nhiệt độ phòng
Thử nghiệm kháng oxy hóa
Mẫu được pha loãng trong methanol với nồng độ 80 mg/ml cho đều vào 2 ống nghiệm được phủ giấy nhôm, với thể tích mẫu trong mỗi ống nghiệm là 4 ml
Mẫu đối chứng dương (+) là ascorbic acid nồng độ 0,05 mg/ml cho vào 1 ống nghiệm được phủ giấy nhôm với thể tích 4 ml [34]
Mẫu đối chứng âm (-) là nước cất cho vào 1 ống nghiệm được phủ giấy nhôm với thể tích 4 ml
Các mẫu được chuẩn bị như trong bảng:
Mẫu được thêm 1 ml thuốc thử DPPH sau đó ủ trong tối 30 phút ở nhiệt độ thường, mẫu trắng được chuẩn bị là methanol, cuối cùng các mẫu được đo độ hấp thụ quang bằng máy đo quang phổ ở bước sóng 517 nm
Mẫu đo 3 lần lấy số liệu trung bình của 3 mẫu, được so sánh với mẫu đối chứng dương và mẫu đối chứng âm Khả năng bẫy gốc tự do DPPH được xác định bằng % ức chế I (%) và được tính theo công thức:
- Ac: giá trị mật độ quang của dung dịch không có mẫu cao (control)
- A s : giá trị mật độ quang của dung dịch có mẫu cao (sample)
