khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình nuôi trồng nấm cordyceps militaris chay

23 3.3.2 Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt.. 314.1Kết quả thí nghiệm 1: Ảnh hưởng c

Giới thiệu về nấm Cordyceps militaris

Chi Cordyceps Hình 1.1 Nấm Cordyceps militaris Loài Cordyceps militaris

Đặc điểm sinh trưởng

Nhiệt độ

Theo Gao vs cs (2000) thì nhiệt độ môi trường có ảnh hưởng lớn đến việc tạo quả thể trong nuôi trồng nấm Các nghiên cứu cho thấy khoảng nhiệt độ 18–22 o C là tối ưu cho sự sinh trưởng sinh khối nấm và năng suất quả thể Tuy nhiên, quá trình này sẽ giảm mạnh khi tăng nhiệt độ trên 25 o C [12] Do đó, cần sử sụng máy điều hòa để ổn định nhiệt độ môi trường khi trồng nấm Cordycep militaris.

Ánh sáng

Theo Gao vs cs (2000) thì cường độ ánh sáng cũng ảnh hưởng lớn đến quá trình nuôi cấy tạo quả thể nấm Trong điều kiên che tối, việc tạo quả thể bi ức chế Các nghiên cứu cho thấy cường độ ánh sáng tối ưu cho sinh trưởng của nấm có thể dao động tùy chủng nấm, tuy nhiên từ 500 - 1000 lux được xem là điều kiên thích hợp nhất [12] Trong phòng nuôi nấm Cordycep militaris cần thiết kế các chế độ chiếu sáng phù hợp với quá trình sinh trưởng của nấm giống ngoài tự nhiên.

Ẩm độ và độ thoáng khí

Độ thoáng khı́ tốt kı́ch thích sự sinh trưởng của tơ nấm và tổng sinh khối nấm Khoảng ẩm đô thích hợp cho nấm dao đông từ 70 – 90%, tương đương với độ ẩm không khí trong tự nhiên sẽ phù hơp cho việc tạo quả thể Khi đô ẩm thấp sẽ làm môi trường khô nhanh hạn chế sự phát triển của tơ nấm cũng như quả thể Do đó, trong phòng nấm cần bổ sung ẩm bằng máy phun ẩm với nguồn nước sạch khuẩn.[4]

Dinh dưỡng nuôi trồng

Gạo lứt là cơ chất tốt nhất cung cấp hàm lượng Cacbon trong muôi trường dinh dưỡng nuôi trồng nấm Cordyceps militaris, hàm lượng gạo lứt và hàm lượng nước trong môi trường nuôi cũng ảnh hưởng đến chiều cao quả thể và trọng lượng tươi nấm/chai nuôi.[3]

Nitơ cùng là thành phần dinh dưỡng không thiểu việc bổ sung nhộng tằm vào môi trường gạo lứt nhằm tạo quả thể C militaris đã được chứng minh là tốt [3] Tuy nhiên, hầu hết các dòng C militaris yêu cầu hàm lượng đạm tương đối thấp, ở nồng độ đạm cao có thể ức chế sự hình thành quả thể (Gao et al 2000) nên năng suất nấm nuôi trên côn trùng thường thấp hơn trên ngũ cốc.[12]

Thành phần dinh dưỡng

Gạo lứt

Trong môi trường nuôi trồng nấm Cordyrceps militaris, gạo là thành phần chính Trong thành phần của gạo lứt có chứa rất nhiều dinh dưỡng gồm chất tinh bột, chất béo, chất đạm, chất xơ cùng các vitamin như B1, B2, B3, B6; các axit như paraaminobenzoic (PABA) pantothenic (vitamin B5), folic (vitamin M), phytic, các nguyên tổ vi lượng như canxi, selen, glutathion (GSH), sắt, magie, kali và natri

Bảng 1.1 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g gạo lứt theo Bộ Y Tế viện dinh dưỡng (Bảng thành phần thực phẩm Việt Nam)

Rong biển

Giới thiệu chung về rong biển

❖ Phân loại và phân bố của rong biển trên thế giới

Dựa vào thành phần cấu tạo, đặc điểm hình thái và màu sắc, rong biển có thể được chia thành 3 ngành rong chính:

Trong số 03 ngành rong trên, rong nâu là ngành rong có trữ lượng lớn nhất và phân bố đa dạng nhất với hơn 1800 loài đã được phân loại Trên thế giới hiện nay chỉ riêng các loài rong thuộc họ Sargassaseae, bộ Fucales đã phân loại được khoảng hơn 400 loài.[5]

❖ Phân loại và phân bố các loài rong nâu ở Việt Nam

Theo Phạm Đức Thịnh vs cs (2015) ở Việt Nam đến nay có khoảng 147 loài rong nâu đã được phân loại, trong đó các loài rong thuộc chi Sargassum có trữ lượng lớn nhất với khoảng 68 loài phân bố dọc ven biển Việt Nam và sản lượng ước tính trên 10.000 tấn khô/năm Theo điều tra tới năm 2011 có 39 loài rong nâu thuộc chi Sargassum phân bố ở vùng biển Khánh Hòa, tập trung nhiều nhất và có trữ lượng lớn nhất là ở vịnh Nha Trang với 21 loài phổ biến và sản lượng ước tính gần 4.800 tấn khô/năm.[5]

Thành phần hóa học có trong rong biển

Rong biển có chứa đa dạng các thành phần hoá học, chúng đều là các thành phần rất có giá trị về mặt dinh dưỡng cũng như dược liệu bao gồm: các axít amin, các axít béo nhiều nối đôi, các vitamin và khoáng chất, polyphenol, các hợp chất chứa iốt, laminaran, alginat và fucoidan với tiềm năng ứng dụng rất lớn để làm dược liệu.[5]

Bảng 1.2 Thành phần dinh dưỡng của rong biển

Nghành rong biển Khoáng Protein Glucid Muối khoáng

Tảo xoắn Spirulina platensis

Hình 1.2 Tảo Spirulina platensis nhập khẩu từ Nhật được mua tại địa chỉ số 63

Yên Đỗ, phường 1, quận Bình Thạnh, Tp.Hồ Chí Minh

Theo giáo sư Nguyễn Lân Dũng thì khi nói đến tảo xoắn Spirulina chắc nhiều người đều đã biết Loài đang được đưa vào sản xuất hiện nay là loài Spirulina platensis Thực ra đây không phải là một sinh vật thuộc Tảo (Algae) vì Tảo thuộc nhóm Sinh vật có nhân thật (Eukaryotes) Spirulina thuộc Vi khuẩn lam (Cyanobacteria), chúng thuộc nhóm Sinh vật có nhân sơ hay nhân nguyên thủy (Prokaryotes) Những nghiên cứu mới nhất cho biết chúng thuộc chi Arthrospira Tên khoa học hiện nay của loài này là Arthrospira platensis, thuộc bộ Oscilatoriales Vì chúng là nhóm vi sinh vật hình xoắn không thấy được bằng mắt thường lại có màu xanh lục nên mọi người vẫn quen gọi là tảo xoắn Spirulina Tảo Spirulina platensis là thực phẩm bổ sung có chứa 60-70% protein, nhiều hơn bất kỳ loại thực phẩm khác như thịt và cá Ngoài protein thì tảo xoắn còn chứa rất nhiêu thành phần quan trong như vitamin, beta carotene, vitamin nhóm B, vitamin E, khoáng chất vi lượng thiết yếu và gamma linolenic acid (GLA)

Bảng 1.3 Thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina theo Công ty JAPAN ALGAE – Nhật Bản.

Một số hợp chất có hoạt tính sinh học thu nhận từ Cordyceps militaris

Acid amin

Kết quả nghiên cứu của Hyun (2008) cho thấy trong quả thể nấm Cordyceps militaris có chứa lượng acid amin tổng số cao hơn trong sinh khối nấm (69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối nấm) theo Chang vs cs (2001) cho thấy phần lớn trong sinh khối nấm chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valine (2,21 mg/g) và tyrosine (1,57 mg/g) [7]

Adenosine và cordycepin

Adenosine và cordycepin là hai hợp chất quan trọng có dược tính cao trong nấm

Cordyceps militaris Adenosine chiếm 0,18% trong quả thể và 0,06% trong sinh khối nấm Đối với hợp chất cordycepin, trong quả thể có hàm lượng cao gấp 3 lần so với sinh khối (0,97% so với 0,36%).[4]

Polysaccharide

Các polysaccharide CPS-1 và CPS-2 đươc tách chiết từ nấm Cordyceps militaris cho thấy chúng có thành phần từ các đơn phân là các đường monosaccharide, mannose và galactose [4] Kết quả nghiên cứu cho thấy hai loai polysaccharide này có khả năng phục hồi các tổn thương gan do ethanol, và tác dụng này tăng lên khi tăng liều dùng chiết xuất Yan et al., 2008 cho rằng tác dụng này có thể do chức năng kháng oxy hóa của các polysaccharide từ nấm.[31]

Acid béo

Theo Hur (2008) quả thể nấm Cordyceps militaris chứa nhiều acid béo không no, chiếm 70% tổng số acid béo, trong đó lương acid linoleic chiếm đến 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Lương ̣ acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối (Bảng 1.1).[13]

Bảng 1.4 Thành phần acid béo của Cordyceps militaris (Hur, 2008)

Phần trăm acid béo tổng (%) Quả thể Sinh khối

Palmitic acid (C16:0) 24.5 21.5 Palmitoeic acid (C16:1) 2.3 2.1 Stearic acid (C18:0) 5.8 5.0 Oleic acid (C18:1) 6.0 17.7 Linoleic acid (C18:2) 61.3 33.0 Linolenic acid (C18:3) - 20.6

Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps militaris

Các hợp chất dược liệu

Trong nấm Cordyceps militaris có rất nhiều các hợp chất dược liệu được ứng dụng trong điều trị và nâng cao sức khỏe con người Trong tự nhiên nấm Cordyceps militaris rất khan hiếm Do đó loài nấm này có giá trị kinh tế cao và việc sản xuất ở quy mô lớn các chiết xuất từ nấm phục vụ nghiên cứu và điều trị bệnh từ Cordyceps militaris hiện đang là một vấn đề cấp thiết

Các hợp chất chống ung thư: Theo Shonkor vs cs (2010) hợp chất cordycepin (3′- deoxyadenosine) từ nấm cho thấy có hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngừa di căn, điều hòa miễn dịch.[28]

Hoạt tı́nh kháng oxy hóa: Các nghiên cứu của Fengyao và cs (2010) đã cho thấy hợp chất CM-hs-CPS2 chứa trong dịch chiết nấm C.militaris có tính kháng oxy hóa, hoạt tı́nh khử và tạo phức ở nồng độ (8 mg/ml) là 89%, 1,188 và 85%.[11]

Tăng số lượng tinh trùng: Nghiên cứu của Lin vs cs (2007) trên lợn cho thấy khi dùng chế phẩm từ Cordyceps militaris, số lượng tinh trùng tăng, số phần trăm tinh trùng di động và hı̀nh dạng bı̀nh thường tăng Hiệu quả này được duy trı̀ thậm chí sau 2 tuần ngưng sử dụng chế phẩm Lượng cordycepin trong tế bào tăng trong thời gian sử dụng chế phẩm nên có khả năng chất này làm tăng lượng tinh dịch và chất lượng tinh trùng ở lợn.[20]

Hạn chế vius cúm: Theo Yuko vs cs (2007) cho thấy acidic polysaccharide (APS) tách chiết từ nấm Cordyceps militaris trồng trên đậu nành nảy mầm có khả năng ứng dụng trong điều trị cúm A Chất này góp phần điều hòa hoạt động miễn dịch của các đại thực bào.[33]

Kháng khuẩn kháng nấm và kháng ung thư: Theo Young-Joon và cs (2000) hợp chất cordycepin còn cho thấy khả năng kháng vi khuẩn Clostridium Các hợp chất dẫn xuất từ nấm được mong đợi ứng dụng trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn đường ruột [32] Theo Seulmee vs cs (2009) cho thấy cordycepin còn ngăn sự biểu hiện của gen T2D chịu trách nhiệm điều hòa bệnh tiểu đường thông qua viêc ức chế các đáp ứng phản ứng viêm phụ thuộc NF-κB, do đó được hy vọng sẽ ứng dụng được như một chất điều hòa miễn dịch dùng trong điều trị các bệnh về miễn dịch.[26]

Tan huyết khối: Thoe Jae-Sung vs cs (2006) cho thấy enzyme tiêu sợi huyết tách chiết từ nấm Cordyceps militaris có hoạt tính gắn fibrin, và do đó xúc tiến việc phân hủy fibrin Enzyme này có khả năng sử dụng trong điều trị tan huyết khối tương tự như các enzym fibrinolytic mạnh khác như nattokinase và enzyme chiết từ giun đất Khi enzyme này có thể sản xuất ở quy mô lớn sẽ là một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các enzym fibrinolytic giá thành cao hiện đang được sử dụng cho bệnh tim lão hóa ở người.[14]

Tı́nh kháng viêm: Theo Wol vs cs (2010) các đại thực bào được xử lý với nồng độ khác nhau của CMWE (dịch chiết từ quả thể nấm Cordyceps militaris) làm giảm đáng kể LPS, TNF-α và IL-6 và mức độ giảm theo nồng độ của dich chiết Những ̣ kết quả này cho thấy rằng CMWE có tác dụng ức chế mạnh đến viêc sản xuất các chất trung gian gây viêm của tế bào.[30]

Các ứng dụng trên lâm sàng của nấm Cordyceps militaris: Mặc dù nấm Cordyceps sinensis được sử dụng rộng rãi hơn Cordyceps militaris, tuy nhiên các ứng dụng lâm sàng của chúng cũng khá tương tự nhau Các chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris có thể được sử dụng trong các trường hợp suy giảm chức năng phổi, ho có đờm, chóng mặt [9][25]

Đặc điểm hình thái của quả thể nấm Cordyceps militaris

Hình 1.3 Nấm Cordyceps militaris và mặt cắt dọc quả thể chứa các bào tử

Theo Paul vs cs (2008) thì nấm Cordyceps militaris là loài nấm ký sinh trên bướm và sâu bướm, quả thể có màu cam, chiều dài 8-10 cm Đầu quả thể nấm có các đốm màu cam sáng Quả thể nấm nhô lên từ xác ấu trùng hoặc nhộng, mặt cắt ngang quả thể có màu nhạt, rỗng ở giữa Các nang bào tử dài từ 300 - 510 micro mét, bề rộng 4 micro mét Các bào tử nang hình sợi, không màu và phân đoạn, kích thước 3.5-6 × 1-1.5 micro mét Các bào tử nang này trong điều kiện nghèo dinh dưỡng sẽ đứt ra và nảy chồi tạo các bào tử thứ cấp Nấm này có phân bố rộng, ở Bắc Mỹ, châu Âu và châu Á.[23]

Chu trình sống của nấm Cordyceps

Hình 1.4 Sự hình thành nấm Cordyceps sp trong tự nhiên

1 Bướm 2 Sâu bướm 3 Bào tử nấm xâm nhiễm vào sâu trưởng thành

4 Nấm Cosdyceps militaris (Nguồn: http://anchiphuong.com)

Giống như hầu hết các loài Cordyceps khác, C.militaris là một loài nấm ký sinh trên côn trùng và ấu trùng của côn trùng Loài này chủ yếu lây nhiễm ở giai đoạn nhộng của các loài bướm khác nhau, rồi nhân lên trong cơ thể ký chủ vào mùa đông Bào tử nấm phát tán trong gió xuống đất dı́nh vào bên ngoài ký chủ nhộng, sau đó từ bào tử hình thành các ống nảy mầm có các thể bám Các ống này tiết ra các enzyme như lipase, chitinase, protease làm tan vỏ ngoài của ký chủ và xâm nhập vào bên trong cơ thể Sau đó hê ̣sợi nấm hút dinh dưỡng và sinh trưởng mạnh mẽ chiếm toàn bộ cơ thể và gây bệnh cho ký chủ Đến cuối hè hoặc thu các ký chủ bị bệnh sẽ ngoi lên và chết cách mặt đất khoảng 2cm, gặp nhiệt độ thích hợp và ánh nắng kích thích sự hình thành quả thể nhô lên khỏi mặt đất rồi phát tán bào tử vào không khí [15][16]

Các nghiên cứu trong nước

Nguyễn Ngọc Trai (2017), Báo cáo tổng kết đề tài nghiên cứu khoa học cấp trường, Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh, tr 17-18

Nghiên cứu hình thành và phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris Thí nghiệm thực hiện bổ sung dinh dưỡng có thành phần hàm lượng K2HPO4 khác nhau, chỉ tiêu đánh giá quả thể/keo cho thấy ảnh hưởng của K2HPO4 là rất lớn Chỉ 40% keo nuôi hình thành quả thể khi môi trường nuôi không bổ sung hoặc bổ sung 2,5 g/l K2HPO4 Tỷ lê ̣này tăng khi lượng ̣ K2HPO4 tăng (80% ở 0,5 g/l, 90% ở 1 g/l và 100% ở 1,5 g/l) và giảm còn 60% ở nghiệm thức bổ sung 2 g/l K2HPO4 Khi tăng hàm lượng >1,5 g/l

K2HPO4 ức chết sự hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris

Thí nghiệm thực hiện bổ sung dinh dưỡng có thành phần hàm lượng D-glucose khác nhau, chỉ tiêu đánh giá số lượng quả thể/keo quả thể cũng cho thấy ảnh hưởng của là D-glucose rất lớn Xét về tỷ lệ keo nuôi có nấm hình thành quả thể, ở nghiêm thức 1 (môi trường không bổ sung glucose) và nghiêm thức 4 (30 g/l) chỉ 16 quả thể/keo Nghiệm thức bổ sung 10 g/l là 26 quả thể/keo, nghiệm thức 20 g/l là 21,6 quả thể/keo Kết quả cho thấy khi bổ sung hàm lượng đường D-glucose ≥20 g/l thì ức chế sự hình thành qua thể nấm Cordyceps militaris

1.10 Các nghiên cứu ngoài nước

Daniel L Purich and Herbert J Fromm (1972), Activation of Brain Hexokinase by Magnesium Ions and by Magnesium Ion-Adenosine Triphosphate Complex, Printed in Great Britain

Cho biết ở phản ứng 1 của quá trình đường phân là sự vận chuyển của 1 ATP đến glucose để tạo thành glucose-6-phosphat (G6P) quá trình được xúc tác bởi enzyme hexokinase Hexokinase là enzym không đặc hiệu, có trong tất cả các loại tế bào, xúc tác sự phosphoryl hóa của D-glucose, D-mannose, D-fructose và hoạt động xúc tác của enzyme hexokinase được hoạt hóa bởi ion Mg 2+

Địa điểm và thời gian thí nghiệm

- Địa điểm thực hiện: Cơ sở 3, 68 Lê Thị Trung phường Phú Lợi thành phố Thủ Dầu Một tỉnh Bình Dương.

Vật liệu

Vật liệu hóa chất sử dụng trong thí nghiệm

- Giống Cordyceps militaris lỏng được cung cấp tại cơ sở 3

- Khoai tây: Chọn những củ không nảy mầm, sạch bệnh, không chầy xước, cung cấp tại Đà Lạt

Dụng cụ, hóa chất và thiết bị

- Nồi nấu, đĩa petri, đồng hồ, hũ thủy tinh 500 ml, đèn cồn, giấy lọc, cán dao số 3, dao mổ số 12, khăn sạch, bật lửa, erlen 250 ml, becker 250 ml và 1000 ml, phễu lọc, đũa thủy tinh, ống đong 1000 ml, bình định mức 1000 ml,…

- Máy lắc tròn, bếp gas, nồi hấp khử trùng, máy đo pH, cân phân tích (OHAUS), máy sấy, máy chụp ảnh, đồng hồ,…

- Hụ̣p nhựa L-621 (ỉ 120 x 66,5 mm), xi-lanh (20 cc)

- Hóa chất: Đường D-glucose, Kalidyhydro phosphate (KH2PO4.3H2O), Magie sunphate (MgSO4.7H2O), cồn 96 o , NaOH, HCl.

Nôi dung thực hiện

Khảo sát sự ảnh hưởng của các nguyên liệu tự nhiên từ thực vật đối với quy trình nuôi trồng nấm Cordyceps militaris chay.

Các phương thực hiện

Quy trình thực hiện thí nghiệm

Hình 3.1 Sơ đồ quy trình thực hiện thí nghiệm Để thu được năng suất nấm cần khảo sát trong nghiên cứu đề tài, tôi tiến hành cấy chuyền từ giống lỏng sang các môi trường rắn (với thành phần (khảo sát), gạo lứt dịch chiết khoai tây, pH 6.0 – 6.5) ẩm độ 60 – 65% được hấp khử trùng ở 121 o C, 30 phút, 1 atm, đem bảo quản nơi thoáng mát, khô ráo để tiện dùng cho việc cấy chuyền Từ những chai giống lỏng ban đầu, hút 10 ml giống cho vào các hộp nhựa chứa môi trường dinh dưỡng rắn Nuôi tơ trong phòng tối 3 ngày ở nhiệt độ 22-25 o C khi nấm lan tơ trắng hết bề mặt thì chuyển sang nuôi sáng ở cường độ ánh sáng từ 500 -1000 lux, nhiệt độ 18 –

22 o C đến lúc thu quả thể nấm [12]

Phương pháp chuẩn bị môi trường nuôi cấy

Rong biển (khảo sát) KH2PO4.3H2O

Dịch chiết khoai tây: cân 200g khoai tây bổ sung 1000ml nước cất đun sôi trong 20 phút sau đó lọc thu dịch chiết, bổ sung thêm:

MgSO4.7H2O 0,0015% Đường D-glucose 0,005% Đường saccarozo 0,015%

Gạo lứt và hợp chất tự nhiên (rong biển và tảo) cần trộn đều với nhau sau đó thêm dịch chiết khoai tây đạt ẩm độ 60 – 65% Giá thể sau phối trộn được hấp khử trùng ở 121 o C, 1 atm trong 30 phút, kiểm nhiễm sau 24 giờ và tiến hành cấy.

Phương pháp thu chỉ tiêu trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris

Cân trọng lượng tươi trong từng hộp: Cân khối lượng đĩa nhựa M1, cắt quả thể nấm sát đế rồi bỏ lên đĩa nhựa đem đi cân M2

M2: Khối lượng cả nấm lẫn đĩa

Cân trọng lượng khô trong từng hộp: Lấy khối lượng tươi M0 của từng hộp mang đi sấy ở 40 o C trong 24h đến 2 lần cân liên tiếp có khối lượng không đổi.

Phương pháp xác định hàm lượng Protein Lowry

Hút 0,4ml dung dịch protein có nồng độ khác nhau từ trong ống nghiệm vừa pha ở trên theo thứ tự từ 1-6 vào 7 ống nghiệm sạch khác (gồm 2 ống Không và 5 ống từ 2-6) Thêm vào đó 2ml dung dịch C Lắc đều và để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm 0,2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5-10 phút, thêm nước cất cho đủ 5ml, đem đo mật độ quang ở bước sóng 360nm

Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆OD) theo nồng độ protein chuẩn (àg/ml)

⮚ Xác định hàm lượng protein trong mẫu

Hút 0,4ml dung dịch protein cần phân tích, thêm 2ml dung dịch C, lắc đều để yên ở nhiệt độ phòng trong 5 phút Sau đó thêm 2ml thuốc thử Folin, lắc đều trong 5 - 10 phút Thêm nước cất cho đủ 5ml Đem đo mật độ quang ở bước song 750nm Nên làm 3 ống nghiệm để lấy trung bình, pha loãng mẫu nếu màu vượt ngoài đường chuẩn Từ đường chuẩn suy ra hàm lượng protein cần phân tích.

Phương pháp xác định % Nitơ Kjeldahl

Tính % Nitơ khi đã xác định được % Protein từ phường pháp Lowry của nguyên liệu cần tìm

F là hệ số chuyển đổi

F rong biển và tảo biển: 6,25

Phương pháp đo năng suất sinh học BE%

Năng suất sinh học BE được tính theo công thức sau:

Phương pháp xử lý số liệu

Theo dõi chỉ tiêu về trọng lượng quả thể và số liệu được xử lý thống kê trên:

Nôi dung khảo sát

Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm

Mục đích: Chọn được loài rong biển phù hợp cho sự phát triện của quả thể nấm

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

Hình 3.2 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 1

Cấy chuyền Giống lỏng Môi trường rắn

Môi trường 1: 12% bột đậu nành (đối chứng)

Bảng 3.1 Bố trí thí nghiệm 1

3.3.1.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g)

- Đánh giá năng suất sinh học (%)

STT KÝ HIỆU THỨC NGHIỆM KHỐI LƯỢNG ( %) %NITO

Thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

Mục đích: Xác định hàm lượng rong biển Wakame tối ưu để bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

Hình 3.3 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 2

Giống lỏng Môi trường rắn

Bảng 3.2 Bố trí thí nghiệm 2

3.3.2.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g)

STT KÝ HIỆU KHỐI LƯỢNG ( %) %NITO

Thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

Mục đích: Xác định hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis tối ưu để bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

Hình 3.4 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 3

Giống lỏng Môi trường rắn

Bảng 3.3 Bố trí thí nghiệm 3

STT KÝ HIỆU KHỐI LƯỢNG (%) %NITRO

3.3.3.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g)

3.3.4 Thí nghiệm 4: Kết hợp rong biển Wakame và tảo xoắn Spirulia platensis bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

Mục đích: Tìm ra hàm lượng kết hợp giữa rong biển Wakame và tảo xoắn Spirulia platensis cho sự phát triển của nấm Cordyceps militaris tốt hơn

Bố trí thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức, 3 lần lặp lại với mỗi lần 15 hộp

Hình 3.5 Sơ đồ tiến hành thí nghiệm 4

Giống lỏng Môi trường rắn

Môi trường 1: 3,7% rong Wakame (đối chứng)

Bảng 3.4 Bố trí thí nghiệm 4

STT KÝ HIỆU NGHIỆM THỨC %NITRO

3.3.4.3 Chỉ tiêu theo dõi thí nghiệm

- Năng suất: trọng lượng tươi (g), trọng lượng khô (g).

Kết quả thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của rong biển đến năng suất quả thể nấm

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.1 Nghiệm thức A0 bổ sung 12% bột đậu nành (ĐC) vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.2 Nghiệm thức A1 bổ sung 3,7% rong Wakame vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.3 Nghiệm thức A2 bổ sung 12% rong Mơ vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.4 Nghiệm thức A3 bổ sung 9% rong Sụn vào môi trường nuôi

Bảng 4.1 Kết quả trọng lượng tươi, khô và năng suất sinh học của nấm Cordyceps militaris trên các môi trương khác nhau ở thí nghiệm 1

TRỌNG LƯỢNG TƯƠI (g)

Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Trọng lượng tươi, trọng lượng khô và năng suất sinh học của quả thể nấm

Cordyceps militaris trong các môi trường dinh dưỡng khác nhau của thí nghiệm có sự khác biệt, có ý nghĩa qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Qua bảng kết quả 4.1 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris tươi từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 12% bột đậu nành (A0) cho kết quả

19,29g tươi cao hơn các nghiệm thức còn lại

Qua bảng kết quả 4.1 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris khô từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 12% bột đậu nành (A0) cho kết quả

3,69g khô cao hơn các nghiệm thức còn lại còn lại

Năng suất sinh học của nghiệm thức bổ sung 3,7% rong Wakame (A1) cho kết quả 52,77% cao hơn các nghiệm thức còn lại trong thí nghiệm

Qua bảng 1.1 thì trong thành phần rong biển (Wakeme, Mơ, Sụn) rất giàu hàm lượng khoáng như: K, Na, Mg, Ở các nghiệm thức A1, A2, A3 bổ sung rong biển thì nồng độ các khoáng như K, Mg tăng lên (>1,5g/l) so với nghiệm thức đối chứng đậu nành (1,5g/l) nên trọng lượng tươi và khô nấm Cordyceps militaris thấp hơn so với đối chứng phù hợp với kết quả nghiên cứu của tác giả Nguyễn Ngọc Trai (2017), nghiên cứu thực hiện bổ sung dinh dưỡng có thành phần hàm lượng K2HPO4 khác nhau vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris cho thấy khi tăng hàm lượng >1,5g/l

K2HPO4 ức chế sự hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris

Xét về chỉ tiêu năng suất sinh học dùng 2,5g (3,7%) rong biển Wakame thay 8g (12%) đậu nành thì đạt hiểu quả cao hơn

Kết luận: Môi trường bổ sung rong biển Wakame phù hợp để nuôi trồng nấm

Kết quả thí nghiệm 2: Tối ưu hàm lượng rong biển Wakame bổ sung vào môi trường nuôi quả thể nấm Cordyceps militaris trên giá thể gạo lứt

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.5 Nghiệm thức T0 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.6 Nghiệm thức T1 bổ sung 5,2% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.7 Nghiệm thức T2 bổ sung 4,5% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.8 Nghiệm thức T3 bổ sung 3% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.9 Nghiệm thức T4 bổ sung 2,2% rong biển Wakame vào môi trường nuôi

Bảng 4.2 Kết trọng lượng tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trên các môi trương khác nhau ở thí nghiệm 2

Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

TRỌNG LƯỢNG TƯƠI

TRỌNG LƯỢNG KHÔ

Sinh khối tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trong các nồng độ bổ sung môi trường dinh dưỡng khác nhau của thí nghiệm có sự khác biệt, có ý nghĩa qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Qua bảng kết quả 4.2 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris tươi từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 3,7% rong biển (T0) cho kết quả

18,3g tươi cao hơn các nghiệm thức còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Qua bảng kết quả 4.2 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris khô từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 3,7% rong biển (T0) cho kết quả

3,08g khô cao hơn các nghiệm thức còn lại còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Nitơ là thành phần dinh dưỡng quan trọng để giúp nấm phát triển tốt hơn nhưng theo các nghiên cứu của Gao và cs (2000), trong môi trường nuôi cấy nấm Cordyrceps militaris nhu cầu hàm lượng nitơ tương đối thấp, nếu hàm lượng nitơ quá cao sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng hệ sợi và quá trình biệt hóa hình thành quả thể.[12]

Trong thành phần dinh dưỡng của rong biển Wakame hàm lượng nitơ chiếm 21,3% [24] Khi tăng nồng độ từ 0,6% đến 1% thì trọng lượng tươi của nấm tăng từ (14,16g đến 18,3g) Nhưng khi tăng nồng độ 1% đến 1,4% thì trọng lượng tươi giảm từ (18,3g đến 14,31g) Tương tự trọng lượng khô khi tăng nồng độ từ 0,6% đến 1% thì trọng lượng khô của nấm tăng từ (1,84g đến 3,08g) Nhưng khi tăng nồng độ 1% đến 1,4% thì trọng lượng khô giảm từ (3,08g đến 1,84g) Dựa vào kết quả trên cho thấy khi tăng tỷ lệ N trên 1% sẽ làm ức chế hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris

Kết luận: Khi bổ sung rong biển Wakame vào môi trường nuôi trồng nấm Cordyceps militaris thì bổ sung 3,7%.

Kết quả thí nghiệm 3: Tối ưu hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis bổ

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.10 Nghiệm thức L1 bổ sung 3% tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.11 Nghiệm thức L2 bổ sung 4,2% tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.12 Nghiệm thức L3 bổ sung 3,6% tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.13 Nghiệm thức L4 bổ sung 2,4% tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.14 Nghiệm thức L5 bổ sung 1,8% tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Bảng 4.3 Kết trọng lượng tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trên các môi trương khác nhau ở thí nghiệm 3

TRỌNG LƯỢNG TƯƠI

TRỌNG LƯỢNG KHÔ

Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Sinh khối tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trong các nồng độ bổ sung môi trường dinh dưỡng khác nhau của thí nghiệm có sự khác biệt, có ý nghĩa qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Qua bảng kết quả 4.3 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris tươi từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 3,6% tảo xoắn (L3) cho kết quả

18,85g tươi cao hơn các nghiệm thức còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Qua bảng kết quả 4.3 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris khô từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 3,6% tảo xoắn (L3) cho kết quả 3,45g khô cao hơn các nghiệm thức còn lại còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Nitơ là thành phần dinh dưỡng quan trọng để giúp nấm phát triển tốt hơn nhưng theo các nghiên cứu của Gao và cs (2000), trong môi trường nuôi cấy nấm Cordyrceps militaris nhu cầu hàm lượng nitơ tương đối thấp, nếu hàm lượng nitơ quá cao sẽ làm chậm quá trình sinh trưởng hệ sợi và quá trình biệt hóa hình thành quả thể.[12]

Bảng thành phần dinh dưỡng có trong 100g tảo xoắn Spirulina được cung bởi

Công ty JAPAN ALGAE – Nhật Bản cho thấy hàm lượng nitơ chiếm rất cao từ 60% -70% Ở các nghiệm thức bổ sung tảo xoắn Spirulina platensis khi tăng nồng độ từ 0,6% đến 1,2% thì trọng lượng tươi của nấm tăng từ (15,51g đến 18,85g) Nhưng khi tăng nồng độ 1,2% đến 1,4% thì trọng lượng tươi giàm từ (18,85g đến 16,85g) Tương tự với trọng lượng khô khi tăng nồng độ từ 0,6% đến 1,2% thì trọng lượng khô của nấm tăng từ (2,04g đến 3,45g) Nhưng khi tăng nồng độ 1,2% đến 1,4% thì trọng lượng khô giàm từ (3,45g đến 2,77g) Dựa vào kết quả trên cho thấy khi tăng tỷ lệ N trên 1,2% sẽ làm ức chế hình thành quả thể nấm Cordyceps militaris

Khi tăng hàm lượng tảo xoắn Spirulina platensis thì nồng độ nitơ tăng Khi nồng độ nitơ vượt quá mức chịu đựng của tế bào, sẽ ức chế sự phát triển của nấm Cordyceps militarsi kết quả thí nghiệm phù hợp với nghiêm cứu của Gao và cs (2000)

Kết luận: Khi bổ sung tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi trồng nấm Cordyceps militaris thì bổ sung 3,6%.

Kết quả thí nghiệm 4: Kết hợp rong biển Wakame và tảo soắn Spirulia

platensis bổ sung vào môi trường nuôi nấm Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.15 Nghiệm thức H1 bổ sung 3,7% rong biển Wakame vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.16 Nghiệm thức H2 bổ sung 3% rong biển Wakame và 0,6% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.17 Nghiệm thức H3 bổ sung 2,2% rong biển Wakame và 1,2% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.18 Nghiệm thức H4 bổ sung 1,5% rong biển Wakame và 1,8% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Nấm Cordyceps militaris Trọng lượng tươi Trọng lượng khô

Hình 4.19 Nghiệm thức H5 bổ sung 0,7% rong biển Wakame và 2,4% tảo xoắn

Spirulina platensis vào môi trường nuôi Cordyceps militaris

Bảng 4.4 Kết quả trọng lượng tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trên các môi trương khác nhau ở thí nghiệm 4

TRỌNG LƯỢNG TƯƠI

TRỌNG LƯỢNG KHÔ

Trong cùng một cột, các số có cùng mẫu tự không có sự khác biệt qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Nhận xét: Sinh khối tươi và khô của quả thể nấm Cordyceps militaris trong các nồng độ bổ sung môi trường dinh dưỡng khác nhau của thí nghiệm có sự khác biệt, có ý nghĩa qua thống kê ở mức nghĩa 5% qua phép thử Duncan

Qua bảng kết quả 4.4 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris tươi từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 1,5% rong biển Wakame và 1,8% tảo xoắn Spirulina platensis (H4) cho kết quả 19,26gtươi cao hơn các nghiệm thức còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Qua bảng kết quả 4.4 cho thấy trọng lượng sinh khối của quả thể nấm Cordyceps militaris khô từ môi trường dinh dưỡng có bổ sung 1,5% rong biển Wakame và 1,8% tảo xoắn Spirulina platensis (H4) cho kết quả 4,04g khô cao hơn các nghiệm thức còn lại còn lại và có sự khác biệt qua thống kê ở mức ý nghĩa 5%

Theo thí nghiệm được thực hiện bởi Lambert và cs (1933) khi nồng độ oxi cao ảnh hướng tới sự phát triển của tơ nấm trong bình nuôi trồng.[17]

Trong thành phần rong biển Wakame rất giàu hàm lượng polysaccharide 13-15% [24], nhưng khi xay rong biển Wakame ra và bổ sung vào dung dịch nuôi thì tạo độ nhớt dẫn tới nồng độ oxi hòa tan trong dung dịch giảm Nồng độ oxi hòa tan đo được của các nghiệm thức H1(43%), H2 (36%), H3 (45%), H4 (68%), H5 (73%)

Khi nồng độ oxi hòa tan (DO) từ 36% đến 68% thì trọng lượng tươi tăng từ (17,94g đến 19,26g) và trọng lượng khô tăng từ (2,8g đến 4,04g) Khi nồng độ oxi hòa tan từ 68% đến 73% thì trọng lượng tươi giảm từ (19,26g đến 18,42g) và trọng lượng khô giảm từ (4,04g đến 3,39g) Kết quả thí nghiệm cho thấy khi tăng nồng độ oxi >68% sẽ làm ức chế sự phát triển của quả thể nấm Cordyceps militaris

Kết luận: Khi bổ sung kết hợp giữa rong biển Wakame và tảo xoắn Spirulina platensis vào môi trường nuôi trồng nấm Cordyceps militaris thì bổ sung theo tỷ lệ 1,5% rong biển Wakame và 1,8% tảo xoắn Spirulina platensis

Bảng 4.5 So sánh kết quả giữa các nghiệm thức trong thí nghiệm ảnh hưởng của nguyên liệu tự nhiên đến trọng lượng tươi và trọng lượng khô

Nghiệm thức TRỌNG LƯỢNG TƯƠI

TRỌNG LƯỢNG KHÔ

1,5% rong biển Wakame và 1,8% tảo xoắn

Qua bảng 4.5 cho thấy nghiệm thức kết hợp giữa rong biển Wakame và tảo xoắn

Spirulina platensis cho kết quả trọng lượng tươi, trọng lượng khô cao hơn các nghiệm thức còn lại

PHẦN V KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Kiến nghị

Chưa mang mẫu Cordyceps militaris đi kiểm tra sự hiện diện của DNA động vật có trong kết quả thí nghiệm 4

Cần nhiều nghiên cứu và phân tích sâu hơn về các hợp chất có trong nấm

Cordyceps militaris khi trồng trên các nguyên liêu từ thực vật

[1] Chu Thị Hằng (2007), Đồ án Rong Sụn và các chế biến từ Rong Sụn

[2] Hoàng Văn Chỉnh (2016), Sử dụng bột Rong Mơ Sargasum spp trong thức ăn cho lợn lai PiDu x LY từ 35 – 70 ngày tuổi, Học viện Nông nghiệp Việt Nam

[3] Nguyễn Ngọc Trai (2017), Bước đầu nghiên cứu quy trình nuôi nấm (Cordyceps militaris) có nguồn gốc từ Nhật Bản tại Trà Vinh, Trường đại học Trà Vinh

[4] Nguyễn Thị Liên Thương, Trịnh Diệp Phương Danh và Nguyễn Văn Hiệp (2016),

“Nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris): Đặc điểm sinh học, giá trị dược liệu và các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi trồng nấm”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 44b: 9-22

[5] Phạm Đức Thịnh (2015), Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang, Luận án tiến sĩ Hóa học, Viện Hóa học, Hà Nội

[6] Phạm Quang Thu, Lê Thị Xuân, Nguyễn Mạnh Hà (2011),“Nghiên cứu đặc điểm sinh học hệ sợi trong nuôi cấy thuần khiết các chủng nấm Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)”, Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam

[7] Chang, H L., Chao, G R., Chen, C C., Mau, J L (2001), “Non-volatile taste components of Agaricus blazei”, Antrodia camphorata and Cordyceps militarismtcelia, Food Chemistry, 74:203-207

[8] Christian G.D.N E and Henry A C F (1837), Das System der Pilze: part one [9] Das S.K., Masuda M., Mikio S (2010),”Medicinal uses of the mushroom Cordyceps militaris: current state and prospects”, Fitoterapia, 81:961–968

[10] Dong JZ, Lei C, Ai XR et al (2012),”Selenium enrichment on Cordy-ceps militaris

Link and analysis on its main active components”, Applied Biochemistry and

[11] Fengyao W., Hui Y., Xiaoning M., Junqing J., Guozheng Zh., Xijie G and

Zhongzheng G (2011),“Structural characterization and antioxidant activity of purified polysaccharide from cultured Cordyceps militaris”, African Journal of Microbiology Research, 5(18): 2743-2751

[12] Gao XH, Wu W và Qian GC (2000),”Study on influences of abiotic factors on fruitbody differentiation of Cordyceps militaris”, Acta Agric Shanghai 16(93 -98)

[13] Hur H., (2008),”Chemical Ingredients of Cordyceps militaris”, Mycobiology,

[14] Jae-Sung K., Kumar S., Se-Eun P., Bong-Suk C.i, Seung K., Nguyen T H., Chun-

Sung K., Han-Seok C., Myung-Kon K., HongSung C., Yeal P., Sung-Jun K (2006),“A Fibrinolytic Enzyme from the Medicinal Mushroom Cordyceps militaris”, Journal of Microbiology, 44(6):622-31

[15] Kamble V.R and Agre D.G (2012),“Reinvestigation of insect parasite fungus

Cordyceps militaris from Maharashtra”, Bionano Frontier, 5(2):224-225

[16] Kobayasi Y (1982), “Keys to the taxa of the genera Cordyceps and Torrubiella”,

Transactions of the Mycological Society of Japan, 23:329–364 Herbal, New

[17] Lambert, E B (1933), “Effec6 t of excess carbon dioxide on growing mushrooms.” J Agric Res, 47, 599-608

[18] Li N., Song J.G., Liu J.Y., Zhang H (1995), “Compared chemical composition between Cordyceps militaris and Cordycpes sinensis”, Journal of Jilin Agriculture University 17, 80–3 (in Chinese)

[19] Li S.P., Yang F.Q., Tsim K.W.K (2006), “Quality control of Cordyceps sinensis, a valued traditional Chinese medicine”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 41, 1571–84

[20] Lin W.H., Tsai M.T., Chen Y.S., Hou R.C., Hung H.F., Li C.H., Wang H.K., Lai

M.N., Jeng K.C (2007), “Improvement in sperm production in subfertile boars by Cordyceps militaris”, The American Journal of Chinese Medicine, 35(4):631-41

[21] Liu Z.Y., Yao Y.J., Liang Z.Q (2001), ”Molecular evidence for the anamorphteleomorph connection in Cordyceps sinensis”, Mycological Research, 105: 827–32

[22] Lo HC, Chienyan H, Fang YL anh Hsu TH (2013), “A systematic review of the mysterious caterpillar fungus OphioCordyceps sinensis in Dong Chong Xia

Xao and Related Bioactive ingredients”, Joumal of Traditional and Complementary Medicine, 3(1): 16 – 32

[23] Paul M K., Paul F C., David W M and Stalpers J A., 2008 “Dictionary of the

[24] Mišurcová, L (2012), “Chemical composition of seaweeds”, Handbook of Marine

Macroalgae, Biotechnology and Applied Phycology

[25] Mizuno T (1999), “Medicinal Effects and Utilization of Cordyceps (Fr.) Link

(Ascomycetes) and Isaria Fr”, (Mitosporic Fungi) Chineese Caterpiller Fungi,

“Tochukaso” (Review) International Journal of Medicinal Mushrooms

[26] Seulmee S., Sungwon L., Jeonghak K., Sunhee M., Seungjeong L., Chong-Kil L.,

Kyunghae C., Nam-Joo H., Kyungjae K (2009), “Cordycepin Suppresses Expression of Diabetes Regulating Genes by Inhibition of

Lipopolysaccharide-induced Inflammation in Macrophages”, Immune Network 9(3):98-105

[27] Shih I.L., Tsai K.L., Hsieh C.Y (2007), “Effects of culture conditions on the mycelial growth and bioactive metabolite production in submerged culture of

Cordyceps militaris”, Biochemical Engineering Journal 33, 193–201

[28] Shonkor K D., Shinya F., Mina M and Akihiko S (2010), “Efficient Production of

Anticancer Agent Cordycepin by Repeated Batch Culture of Cordyceps militaris Mutant”, Lecture Notes in Engineering and Computer Science, 20-

[29] Stone R (2008), “Last stand for the body snatcher of the Himalayas”, Science,

[30] Wol-Soon J., Yoo-Jin C., Hyoun-Ji K., Jae-Yun L., Byung-Hyouk N., Jae-Dong L.,

SangWha L., Su-Yeong S and Min-Ho J (2010), “The Anti-inflammatory Effects of Water Extract from Cordyceps militaris in Murine Macrophage”,

[31] Yan H., Zhu D., Xu D., Wu J and Bian X (2008), “A study on Cordyceps militaris polysaccharide purification, composition and activity analysis”, African Journal of Biotechnology 7 (22): 4004-4009

[32] Young-Joon A., Suck-Joon P., Sang-Gil L., Sang-Cheol S and Don-Ha C (2000),

“Cordycepin: Selective Growth Inhibitor Derived from Liquid Culture of

Cordyceps militaris against Clostridium spp”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48: 2744−2748

[33] Yuko O., Jung-Bum L., Kyoko H., Akio F., DongKi P and Toshimitsu H (2007),

“In Vivo Antiinfluenza Virus Activity of an Immunomodulatory Acidic Polysaccharide Isolated from Cordyceps militaris Grown on Germinated

Soybeans”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55: 10194–10199

[34] Zhang Y.J., Li E., Wang C.S., 2012 “Ophiocordyceps sinensis, the flagship fungus of China: terminology, life strategy and ecology”, Mycology 3:2–10

Phụ lục 1: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 1

Phụ lục 2: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris khô trong thí nghiệm 1

Phụ lục 3: Bảng thống kê năng suất sinh học quả thể nấm Cordyceps militaris trong thí nghiệm 1

Phụ lục 4: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 2

Phụ lục 5: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris khô trong thí nghiệm 2

Phụ lục 6: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 3

Phụ lục 7: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris khô trong thí nghiệm 3

Phụ lục 8: Bảng thống kê trọng lượng quả thể nấm Cordyceps militaris tươi trong thí nghiệm 4.