kiểm tra mức độ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí escherichia coli và salmonella spp trên các mẫu thịt tươi

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

VẬT LIỆU

Mẫu được ký hiệu H1 đến H20 là mẫu thịt heo tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Mẫu được ký hiệu B1 đến B20 là mẫu thịt bò tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Mẫu được ký hiệu G1 đến G20 là mẫu thịt gà tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Loại mẫu: thịt heo tươi, thịt bò tươi, thịt gà tươi

1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh – GMO trung tâm Quatest 3, số 7, đường số 1, khu công nghiệp Biên Hoà 1, Đồng Nai

Thời gian thực hiện: từ 22/02/2016 đến 29/04/2016

1.3 Dụng cụ và thiết bị

Dụng cụ thuỷ tinh: đĩa petri, ống đong, cốc đong, chai thuỷ tinh, becher, ống nghiệm, lame

Các dụng cụ khác: đèn cồn, que cấy, pipet, kéo, đầu típ pipet các loại, bút lông dầu, bông thấm nước, kéo, túi đựng mẫu vô trùng, găng tay vô trùng, khẩu trang, eppendorf,…

‐ Tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy vô khuẩn

SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 25

1.4 Hoá chất và môi trường

1.4.1 Hoá chất và thuốc thử

1.4.2 Môi trường (xem chi tiết phần phụ lục)

‐ Xylose - Lysine deoxycholate agar (XLD)

‐ Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn)

‐ Triple sugar iron agar (TSI)

‐ MR-VP medium (Clark-Lubs)

‐ Rappaport-Vassilliadis with soya (RVS broth)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ghi nhận mẫu Đồng nhất mẫu

Lưu trữ, bảo quản Đọc kết quả

Sơ đồ 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu

- Mẫu được thu lấy tại chợ Long Bình Tân tỉnh Đồng Nai bao gồm các loại: thịt heo tươi, thịt bò tươi và thịt gà tươi

Đựng mẫu trong bao nilon vô trùng và cho vào thiết bị trộn Trộn đều mẫu để vi sinh vật phân bố đồng đều trong thời gian không quá 3 phút trước khi phân tích mẫu.

⮚ Lưu trữ và bảo quản mẫu

Mẫu thịt tươi nếu chưa được phân tích thì lưu giữ ở 0°C đến 20°C, phân tích mẫu sau không quá 24 h Đối với các mẫu sau khi phân tích cũng cần lưu giữ ở nhiệt độ như trên

2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật

Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm (QCVN 8-3:2012/BYT) ngày 01 tháng 03 năm 2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế, thịt tươi được kiểm tra theo tiêu chuẩn sau:

Bảng 2.1: Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu thịt tươi [11] Đối tượng kiểm nghiệm Phương pháp

TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần 1 : 2008 (ISO 6579 : 2002 AMENDMENT 1: 2007),

Bảng 2.2: Bảng các chỉ tiêu vi sinh vật được quy định kiểm nghiệm đối với thịt tươi [11]

Giới hạn tối đa cho phép

(CFU/mL) Phân loại chỉ tiêu n c m M

Salmonella 5 0 KPH A n: số đơn vị mẫu được lấy từ lô hàng cần kiểm tra c: số đơn vị mẫu tối đa có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vượt quá c là không đạt m: là mức giới hạn mà các kết quả không vượt quá mức này là đạt, nếu các kết quả vượt quá mức này thì có thể đạt hoặc không đạt

M: là mức giới hạn tối đa mà không mẫu nào được phép vượt quá

Chỉ tiêu loại A: bắt buộc phải thử nghiệm để đánh giá hợp quy

2.2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa theo ISO 4833

– 1: 2013 2.2.1.1 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu và bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất

Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [3]

‐ Dùng pipet vô trùng hút 1 mL dung dịch mẫu thử ban đầu vào 2 đĩa petri vô trùng

‐ Làm các thao tác tương tự với những nồng độ pha loãng kế tiếp

‐ Sử dụng ít nhất 2 dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp để cấy vào đĩa petri sao cho thu được số khuẩn lạc từ 10 đến 300 trên mỗi đĩa

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL môi trường PCA ở (44 - 47) o C đã đun chảy vào mỗi đĩa petri Thời gian từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi đổ môi trường không quá 45 phút

‐ Trộn mẫu bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đông tự nhiên

‐ Để tránh khuẩn lạc mọc lan đổ thêm một lớp 4 mL PCA lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu

‐ Lật úp các đĩa và đặt vào tủ ấm ở ( 30 ± 1 ) o C / (72 ± 3) h [3]

Chỉ đếm các đĩa có khuẩn lạc từ 15 – 300 khuẩn lạc

Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ, nếu ít hơn một phần tư đĩa mọc dày lan rộng thì đếm số khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa Nếu quá một phần tư mọc dày lan rộng thì bỏ đĩa đó và không đếm

Tính tổng số vi sinh vật có trong 1 g (hay 1 mL) mẫu (X) theo công thức:

X: tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc/g (mL)

∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n 1 : số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất

V: thể tích cấy trên mỗi đĩa

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, X< 1/d CFU/g (mL) [3]

Kiểm nghiệm tổng số vi sinh vật hiếu khí được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.2: Kiểm tra TSVSVHK đối với mẫu thịt tươi

2.2.2 Định lượng E coli bằng phương pháp đếm đĩa theo TCVN 7924-2:2008 2.2.2.3 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu, bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất

Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [15]

‐ Dùng pipet vô trùng hút 1 mL dung dịch mẫu thử ban đầu vào 2 đĩa petri vô trùng

‐ Làm các thao tác tương tự với những nồng độ pha loãng kế tiếp

Rót khoảng 12 – 15 mL PCA lắc đều, để nguội tự nhiên sau đó đổ thêm 4 mL PCA

Thực hiện ở các độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Ủ đĩa ở ( 30 ± 1 ) o C / (72 ± 3) h. Đọc kết quả

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 , Đồng nhất mẫu

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL môi trường TBX đã đun chảy để vừa nguội đến khoảng 44 - 47 o C vào mỗi đĩa petri Thời gian giữa quá trình cấy mẫu và đổ môi trường không quá 15 phút

‐ Trộn đều mẫu với môi trường bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đông đặc hoàn toàn

‐ Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44 o C / (18 -24) h [15]

‐ Trong trường hợp có từ (15 -150) khuẩn lạc đặc trưng ΣC

X: tổng số E coli dương tính β- glucuronidase ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở hai nồng độ liên tiếp n1: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ nhất n2: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu tiên để đếm khuẩn lạc

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng trên hai đĩa ở huyền phù ban đầu nhỏ hơn 15 CFU, kết quả được tính như sau:

, số khuẩn lạc / mL ( hoặc g)

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng trên 2 đĩa ở huyền phù ban đầu không chứa khuẩn lạc:

Trong trường hợp tổng số khuẩn lạc màu xanh và không đặc trưng trên hai đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) lớn hơn 300 CFU, đồng thời có sự xuất hiện của khuẩn lạc màu xanh rõ rệt, thì nếu hai đĩa ở nồng độ tiếp theo (d2) có tổng số khuẩn lạc nhỏ hơn 300 CFU và không có khuẩn lạc màu xanh, kết quả đếm khuẩn sẽ được tính theo công thức cụ thể.

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng trên 2 đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) >300 CFU và không có khuẩn lạc xanh rõ rệt và nếu trên 2 đĩa ở nồng độ tiếp theo (d 2 ) có số khuẩn lạc < 300 CFU mà không có khuẩn lạc màu xanh được đếm thì kết quả được tính như sau:

‐ Nếu số khuẩn lạc đặc trưng đếm được ở tất cả các độ pha loãng đều lớn hơn

150 màu xanh thì kết quả được tính như sau:

X > 150/d Trong đó: d là độ pha loãng cuối cùng

‐ Trong trường hợp chỉ có 2 đĩa ở độ pha loãng thấp nhất ( nồng độ cao nhất) chứa nhỏ hơn 150 khuẩn lạc đặc trưng, tính kết quả theo công thức:

, số khuẩn lạc / mL ( hoặc g) b Trường hợp 2

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc màu xanh cao hơn 150 cho 2 đĩa ở nồng độ đầu tiên (d 1 ), với số khuẩn lạc màu xanh là dưới 15 cho 2 đĩa ở nồng độ kế tiếp (d2)

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d 1 ) nằm trong khoảng từ 150 đến 167 ( khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) tính theo công thức:

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d 1 ) cao hơn 167 (khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) thì lưu ý chỉ đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng d2 và tính kết quả theo công thức: [15]

, số khuẩn lạc / mL ( hoặc g) Kiểm nghiệm E coli được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.3: Kiểm nghiệm E coli đối với mẫu thịt tươi

2.2.3 Định tính Salmonella spp theo ISO 6579 : 2002 amendment 1: 2007

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương, hiện diện chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella [8]

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch nuôi cấy ban đầu cho bước tăng sinh

Rót khoảng 12 – 15 mL TBX lắc đều, để nguội tự nhiên Đọc kết quả

Mẫu ban đầu Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10 -1 , 10 -2 , 10 -3 ,

Thực hiện ở các nồng độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44 ° C /(18 - 24) h

Cân 25 g mẫu thịt đã đồng nhất cho vào bao nilon vô trùng và bổ sung 225 mL môi trường BPW cho vào tủ ấm ủ ở (37 ± 1) o C / (18 ± 2) h [12]

Dùng pipet vô trùng hút 0,1 ml canh trùng vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường RVS broth, ủ ở (41,5 ± 1) oC / (24 ± 3) giờ Đồng thời, hút 1 ml canh trùng vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trường MKTTn broth và ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) giờ.

Lấy canh khuẩn sau khi đã được tăng sinh chọn lọc, sử dụng que cấy tròn cấy ria sang 2 đĩa môi trường XLD và HE

Lật ngược các đĩa và ủ ở (37 ± 1) o C / (24 ± 3) h

Các khuẩn lạc Salmonella spp đặc trưng trên môi trường:

Trên XLD: Salmonella cho khuẩn lạc có hoặc không có tâm đen, có quầng trong sáng hoặc hơi đỏ ( nếu lên men lactose (+) khuẩn lạc sẽ có màu vàng)

Trên HE: Khuẩn lạc có màu xanh dương đến xanh lá, có hoặc không có tâm [12]

2.2.3.4 Chọn khuẩn lạc để khẳng định

Định dạng
Số trang	84
Dung lượng	1,42 MB