kiểm tra mức độ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí escherichia coli và salmonella spp trên các mẫu thịt tươi

TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM

BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

Tên đề tài:

KIỂM TRA MỨC ĐỘ NHIỄM TỔNG SỐ VI SINH

VẬT HIẾU KHÍ, Escherichia coli VÀ Salmonella spp

TRÊN CÁC MẪU THỊT TƯƠI

KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ

CBHD: ThS Nguyễn Văn Minh ThS Trần Thị Ánh Nguyệt

SVTH: Trương Thị Hồng Duyên

MSSV: 1253010064 Khóa: 2012 - 2016

Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016

LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất đến ThS Nguyễn Văn Minh và ThS Trần Thị Ánh Nguyệt đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, truyền đạt kinh nghiệm, giúp đỡ em trong quá trình thực tập và hoàn thành bài báo cáo thực tập tốt nghiệp, khóa luận tốt nghiệp

Em xin chân thành cảm ơn quý Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 đã tạo mọi điều kiện để em hoàn thành tốt khóa thực tập, cảm ơn tất cả các anh chị tại phòng Vi sinh – GMO đã nhiệt tình chỉ dạy em trong suốt thời gian vừa qua Đặc biệt cảm ơn chị Phan Thị Phương, chị Đỗ Thị Phượng, chị Đinh Thị Thu Hồng, chị Nguyễn Uyên Vy, anh Nguyễn Tấn Trường đã quan tâm, giúp đỡ, chỉ dạy em trong suốt thời gian vừa qua

Qua đây, em cũng xin được gửi lời tri ân các thầy cô trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện và giúp em được thực tập tốt nghiệp tại một nơi có uy tín và chuyên môn cao Đặc biệt, cảm ơn ban chủ nhiệm bộ môn công nghệ sinh học cùng tất cả các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tập tại trường

Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong hội đồng chấm bài đã dành thời gian xem xét bài báo cáo của em, em rất mong nhận được sự đóng góp ý kiến từ thầy, cô để em có thêm nhiều kiến thức và kinh nghiệm trên con đường nghiên cứu phía trước

Cuối cùng, con xin được gửi lời cảm ơn tới ba mẹ và gia đình đã luôn luôn ủng hộ, động viên, quan tâm con trong suốt quá trình học tập, cảm ơn bạn bè đã luôn ở bên giúp đỡ hết mình những lúc khó khăn

Em xin chân thành cảm ơn!

Sinh viên thực hiện

Trương Thị Hồng Duyên

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

TCVN: Tiêu chuẩn Việt Nam

TSVSVHK: Tổng số vi sinh vật hiếu khí PCA: Plate count agar

TBX: Tryptone Bile X-Glucuronide BPW: Buffered peptone water

RVS: Rappaport-Vassilliadis with soya

MKTTn: Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin XLD: Xylose - Lysine deoxycholate agar

HE: Hektoen enteric agar h: giờ

GMO: Genetically Modified Organism

ISO: International Organization for Standardization

E coli: Escherichia coli

QCVN: Quy chuẩn Việt Nam

QUATEST 3: Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng 3 PCR: Polymerase Chain Reaction

(-): Âm tính (+): Dương tính Đ: Đạt

KĐ: Không đạt

DANH MỤC HÌNH ẢNH

Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli qua kính hiển vi điện tử 17

Hình 1.2: Vi khuẩn Salmonella qua kính hiển vi điện tử 19

Hình 1.3: Nguyên tắc hoạt động của PCR 22

Hình 3.1: TSVSVHK trên môi trường PCA 54

Hình 3.2: E coli trên môi trường TBX 56

Hình 3.3: Salmonella trên môi trường XLD 60

Hình 3.4: Kết quả thử sinh hóa Salmonella dương tính 60

Hình 3.5: Salmonella trên môi trường MKTTn 61

Hình 3.6: Khuẩn lạc Salmonella trên môi trường NA 61

Hình 3.7: Salmonella trên môi trường RVS 62

Hình 3.8: Salmonella trên môi trường HE 62

Hình 3.9: Phản ứng kháng huyết thanh O của Salmonella 63

Hình 3.10: Kết quả điện di Salmonella spp trên gel agarose 2% 63

DANH MỤC SƠ ĐỒSơ đồ 2.1: Quy trình chung trong kiểm nghiệm mẫu 26

Sơ đồ 2.2: Kiểm tra TSVSVHK đối với mẫu thịt tươi 30

Sơ đồ 2.3: Kiểm nghiệm E coli đối với mẫu thịt tươi 33

Sơ đồ 2.4: Kiểm nghiệm Salmonella spp đối với mẫu thịt tươi 38

Sơ đồ 2.5: Kiểm nghiệm Salmonella spp đối với mẫu thịt tươi theo phương pháp PCR 42

DANH MỤC BẢNGBảng 1.1: Số vụ ngộ độc thực phẩm từ năm 2011 đến 2015 ở Việt Nam 16

Bảng 2.1: Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu thịt tươi 27

Bảng 2.2: Bảng các chỉ tiêu vi sinh vật được quy định kiểm nghiệm đối với mẫu thịt tươi 28

Bảng 2.3: Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện Salmonella spp 40

Bảng 2.4: Chương trình nhiệt trên máy PCR 40

Bảng 3.1: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt heo tươi 44

Bảng 3.2: Kết quả kiểm nghiệm E coli trên các mẫu thịt heo tươi 38

Bảng 3.3: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp trên các mẫu thịt heo tươi 47

Bảng 3.4: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt bò tươi 49

Bảng 3.5: Kết quả kiểm nghiệm E coli trên các mẫu thịt bò tươi 50

Bảng 3.6: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp trên các mẫu thịt bò tươi 52

Bảng 3.7: Kết quả kiểm nghiệm TSVSVHK trên các mẫu thịt gà tươi 53

Bảng 3.8: Kết quả kiểm nghiệm E coli trên các mẫu thịt gà tươi 55

Bảng 3.9: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp trên các mẫu thịt gà tươi theo phương pháp PCR 57

Bảng 3.10: Kết quả kiểm nghiệm Salmonella spp trên các mẫu thịt gà tươi theo phương pháp truyền thống ( thử sinh hóa) 58

DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 3.1: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối với các mẫu thịt heo tươi 45

Biểu đồ 3.2: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E coli đối với các mẫu thịt heo tươi 46

Biểu đồ 3.3: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella spp đối với các mẫu thịt heo tươi 47

Biểu đồ 3.4: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối với các mẫu thịt bò tươi 49 Biểu đồ 3.5: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E coli đối với

các mẫu thịt bò tươi 51 Biểu đồ 3.6: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella

spp đối với các mẫu thịt bò tươi 52 Biểu đồ 3.7: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu TSVSVHK đối

với các mẫu thịt gà tươi 54 Biểu đồ 3.8: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu E coli đối với

các mẫu thịt gà tươi 55 Biểu đồ 3.9: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % đạt và % không đạt về chỉ tiêu Salmonella

spp đối với các mẫu thịt gà tươi 58 Biểu đồ 3.10: Biểu đồ thể hiện tỷ lệ % không đạt về các chỉ tiêu vi sinh giữa các

MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ 9

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11

1 TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT 3 12

1.1 Giới thiệu chung 12

2.2 Tổng quan về tổng số vi sinh vật hiếu khí 16

2.3 Tổng quan về Escherichia coli 17

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli 17

2.3.2 Điều kiện nuôi cấy 17

2.3.3 Môi trường nuôi cấy 17

2.3.4 Tính chất sinh hóa 18

2.3.5 Kháng nguyên và độc tố 18

1.1 Mẫu kiểm nghiệm 24

1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện 24

1.4.2 Môi trường (xem chi tiết phần phụ lục) 25

2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26

2.1 Quy trình kiểm tra chung 26

2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật 27

2.2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí 28

2.2.2 Định lượng E coli bằng phương pháp đếm đĩa 30

2.2.3 Định tính Salmonella spp 33

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch nuôi cấy ban đầu cho bước tăng sinh 33

2.2.4 Định tính Salmonella spp theo phương pháp PCR 39

2.2.4.1 Chuẩn bị mẫu, tiền tăng sinh và tăng sinh chọn lọc 39

2.2.4.2 Chuẩn bị DNA khuôn 39

2.2.4.3 Sàng lọc bằng phương pháp PCR 39

2.2.4.4 Trình tự mồi .40

2.2.4.5 Điện di trên gel agarose 40

PHẦN 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44

ĐẶT VẤN ĐỀ

Ngày nay cùng với sự phát triển của xã hội, đời sống con người ngày càng được nâng cao thì nhu cầu dinh dưỡng trong bữa ăn hàng ngày được cải thiện và vấn đề an toàn vệ sinh thực phẩm cũng được quan tâm nhiều hơn Trên thị trường, thực phẩm có mặt ngày càng đa dạng để đáp ứng nhu cầu thiết yếu của xã hội Tuy nhiên, không phải loại thực phẩm nào cũng đảm bảo chất lượng và hợp vệ sinh, sử dụng những loại thực phẩm này là một trong những nguyên nhân dẫn đến các vụ ngộ độc thực phẩm

Thịt là một trong những thực phẩm đem lại giá trị dinh dưỡng cao không thể thiếu trong những bữa ăn hàng ngày của người dân Việt Nam.Theo số liệu tính toán của Sở Công thương ước tính sản phẩm Theo số liệu tính toán của Sở Công thương ước tính sản phẩm thịt gia súc gia cầm đã sử dụng của Hà Nội năm 2013 là 272.000 tấn (745,2 tấn/ ngày), trong đó thịt lợn là 179.652 tấn (492,2 tấn/ ngày), dự tính năm 2015 là 314.000 tấn (tăng 13% so với năm 2013) (872,2 tấn/ ngày), trong đó thịt lợn là 205.970 tấn (572,1 tấn/ ngày), thịt trâu bò là 36.011 tấn (100 tấn/ ngày), thịt gia cầm là 72.021 tấn (200,1 tấn/ ngày) [27] Để đáp ứng được nhu cầu tiêu thụ lớn trên thị trường, các cơ sở sản xuất, chế biến tự phát, nhỏ lẻ bày bán tràn lan ra đời mỗi ngày mà không có giấy phép sản xuất, điều này dẫn đến tình trạng mất kiểm soát an toàn, thịt đến tay người tiêu dùng không đạt chất lượng [28] Hơn nữa, thịt chứa nhiều chất dinh dưỡng là môi trường thuận lợi cho vi sinh vật có hại sinh sống và phát triển, nếu sử dụng phải những loại thịt này sẽ dẫn đến tình trạng ngộ độc thực phẩm làm ảnh hưởng tới sức khỏe và tính mạng người tiêu dùng

Theo Bộ Y tế, trong 10 tháng đầu năm 2015 cả nước ghi nhận 150 vụ ngộ độc thực phẩm, làm 4.077 người mắc và 21 người tử vong Nguyên nhân ban đầu của các vụ ngộ độc thực phẩm là do vi sinh vật, độc tố tự nhiên và hóa chất, còn lại là chưa xác định được nguyên nhân gây ngộ độc [23] Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), năm 2015, số ca tử vong do vi khuẩn Salmonella gây nên là 52.000, số ca tử vong do vi khuẩn E coli là 37.000 [24]

Xuất phát từ những vấn đề nêu trên, nhằm đánh giá mức độ đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm trong sản phẩm và bản thân tôi có một sự quan tâm đặc biệt đến

tình trạng vệ sinh trong thực phẩm hiện nay, với niềm đam mê, mong muốn được học hỏi, thực hiện và trải nghiệm các phương pháp, kỹ năng trong thực tế Đồng thời, được sự đồng ý của khoa Công nghệ sinh học trường Đại học Mở thành phố Hồ Chí Minh và sự cho phép của Ban lãnh đạo Trung tâm Kỹ thuật Tiêu chuẩn Đo

lường Chất lượng 3, tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Kiểm tra mức độ nhiễm

tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và Salmonella spp trên các mẫu thịt tươi” dựa trên QCVN 8-3:2012/BYT

- Mục tiêu tổng quát

Kiểm tra mức độ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và

Salmonella spp trên các mẫu thịt tươi được thu tại các chợ tỉnh Đồng Nai từ 22/02/2016 đến 29/04/2016

- Nội dung thực hiện

Tìm hiểu về tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và phương pháp định lượng, Salmonella spp và phương pháp định tính

Khảo sát tỉ lệ nhiễm tổng số vi sinh vật hiếu khí, Escherichia coli và

Salmonella spp trên các mẫu thịt tươi được thu tại các chợ tỉnh Đồng Nai từ 22/02/2016 đến 29/04/2016

PHẦN 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1 TỔNG QUAN VỀ TRUNG TÂM KỸ THUẬT TIÊU CHUẨN ĐO LƯỜNG CHẤT LƯỢNG 3 (QUATEST 3)

1.1 Giới thiệu chung

QUATEST 3 là tổ chức khoa học công nghệ thuộc Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng – Bộ Khoa học và Công nghệ, được thành lập từ tháng 5 năm 1975 trên cơ sở Viện Định chuẩn Quốc gia trước đây

QUATEST 3 có đội ngũ chuyên viên, kỹ thuật viên được đào tạo chuyên sâu và có nhiều kinh nghiệm, hệ thống phòng thí nghiệm với trang thiết bị hiện đại theo chuẩn mực quốc tế

QUATEST 3 áp dụng hệ thống quản lý chất lượng theo tiêu chuẩn ISO 9001 cho hoạt động điều hành, hoạt động tư vấn đào tạo và Trang thiết bị thí nghiêm, lĩnh vực thí nghiệm được công nhận phù hợp với tiêu chuẩn ISO/IEC 17025, lĩnh vực giám định hàng hóa được công nhận phù hợp với ISO/IEC 17020, lĩnh vực chứng nhận sản phẩm được công nhận phù hợp với ISO/IEC Guide 65 và lĩnh vực cung cấp dịch vụ thử nghiệm thành thạo theo ISO/IEC 17043

Qua hơn 35 năm hoạt động, QUATEST 3 đã được biết đến như một đơn vị hàng đầu tại Việt Nam trong lĩnh vực cung cấp dịch vụ kỹ thuật về tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng và đánh giá sự phù hợp

Với nỗ lực nâng cao năng lực kỹ thuật của các phòng thử nghiệm để được thừa nhận quốc tế và khu vực Phòng thử nghiệm Vi sinh – GMO của QUATEST 3 được các nước ASEAN chọn là phòng thử nghiệm đối chứng ( ASEAN Reference Laboratory – ARL) theo chương trình EC – ASEAN và Phòng thử nghiệm Điện được các nước ASEAN thừa nhận kết quả thử nghiệm đối với các sản phẩm điện gia dụng theo thoả thuận thừa nhận lẫn nhau trong lĩnh vực thử nghiệm điện và điện tử (ASEAN EE MRA)

QUATEST 3 đang triển khai chương trình mở rộng sự thừa nhận của khu vực và quốc tế cho các lĩnh vực thử nghiệm khác [22]

1.2 Địa chỉ liên lạc

‐ Kiểm tra, giám định và thẩm định kỹ thuật về chất lượng, vệ sinh, an toàn của sản phẩm, hàng hóa, vật liệu, cấu kiện công trình

‐ Thử nghiệm vật liệu, sản phẩm, hàng hóa

‐ Kiểm định, hiệu chuẩn và đánh giá phương tiện đo

‐ Chứng nhận sự phù hợp của sản phẩm với tiêu chuẩn và qui chuẩn kỹ thuật, chứng nhận rau, quả và chè an toàn phù hợp với VietGAP

‐ Kiểm định và đánh giá an toàn công nghiệp

‐ Khảo sát, quan trắc, phân tích, đánh giá thực trạng và tác động môi trường ‐ Khảo sát, đánh giá các điều kiện kỹ thuật, thực trạng công nghệ, chuyển giao

công nghệ

‐ Đào tạo và tư vấn năng suất chất lượng, ứng dụng kỹ thuật mã số - mã vạch ‐ Đào tạo nghiệp vụ, chuyên môn và kỹ thuật về tiêu chuẩn đo lường chất

lượng

‐ Nghiên cứu, chế tạo và cung cấp các chuẩn đo lường, mẫu chuẩn và các phương tiện đo Trang bị và cung cấp dịch vụ bảo trì, bảo dưỡng và sửa chữa các phương tiện đo lường, thử nghiệm, thiết bị kỹ thuật

‐ Tiếp nhận đăng ký và tư vấn ứng dụng mã số, mã vạch

‐ Cung cấp thông tin, tiêu chuẩn và các tài liệu liên quan đến tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng [22]

1.4 Các lĩnh vực hoạt động của Trung Tâm

‐ Dịch vụ thử nghiệm ‐ Dịch vụ đo lường ‐ Dịch vụ giám định ‐ Kiểm tra

‐ Chứng nhận ‐ Dịch vụ tư vấn

Các thiết bị để thử nghiệp thực phẩm biến đổi gen như PCR Real Time, máy ly tâm lạnh, máy điện di ngang, thiết bị nhân gen, tủ lắc ổn nhiệt, hệ thống giải trình tự gen, hệ thống ELISA… [22]

1.6 Chính sách chất lượng

QUATEST 3 cam kết luôn làm hài lòng khách hàng khi cung cấp các dịch vụ kỹ thuật tiêu chuẩn, đo lường, chất lượng theo nguyên tắc: [22]

‐ Chính xác ‐ Khách quan ‐ Kịp thời ‐ Hiệu quả

Ngộ độc tích luỹ: là trạng thái mà cơ thể nhiễm độc với liều lượng thấp, chưa gây ra triệu chứng liền mà phải trải qua một thời gian dài chất độc tích luỹ trong cơ thể làm biến đổi các quá trình sinh lý, sinh hoá lâu dài rồi mới gây ra triệu chứng [19]

2.1.3 Tình hình ngộ độc thực phẩm

Theo báo cáo hằng năm của Bộ Y tế Cục An toàn vệ sinh thực phẩm, tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta từ năm 2011 đến 2015 diễn biến phức tạp, trung bình mỗi năm có 167 vụ ngộ độc xảy ra, số người mắc là 5.109 người gây ra 31 ca tử vong

Bảng 1.1: Số vụ ngộ độc thực phẩm từ năm 2011 đến 2015 ở Việt Nam [23,29]

(Vụ)

Số người mắc (Người)

Số người chết (Người)

2.2 Tổng quan về tổng số vi sinh vật hiếu khí

Vi khuẩn hiếu khí là những vi sinh vật tăng trưởng và hình thành khuẩn lạc trong điều kiện có oxy tự do, tổng số vi khuẩn hiếu khí là chỉ thị mức độ vệ sinh của thực phẩm [10]

Vi khuẩn hiếu khí thường có mặt nhiều trong thực phẩm, sữa, nước uống, tổng số vi khuẩn hiếu khí hiện diện trong thực phẩm càng nhiều cho thấy thực phẩm đó càng bị nhiễm bẩn, có thể gây nguy hiểm cho người dùng và thực phẩm đó hư hỏng càng nhanh Đặc biệt vi khuẩn được chú ý kiểm tra trên thịt tươi và các sản

phẩm thịt do nó dễ nhiễm từ môi trường vào thịt trong quá trình giết mổ, vận chuyển và bày bán [8]

2.3 Tổng quan về Escherichia coli

Hình 1.1: Vi khuẩn Escherichia coli qua kính hiển vi điện tử [26]

2.3.1 Đặc điểm vi khuẩn Escherichia coli

E coli là trực khuẩn hình gậy, ngắn, kích thước 2 - 3 × 0.6 μm Trong cơ thể có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng lẻ, có khi xếp thành hình chuỗi ngắn [6]

Là trực khuẩn Gram âm, không sinh bào tử Trực khuẩn có thể có vỏ, có lông, di động (một số chủng không di động) [2]

2.3.2 Điều kiện nuôi cấy

E coli phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, là trực khuẩn hiếu khí và yếm khí tùy tiện, có thể sinh trưởng ở nhệt độ 5 - 40°C, nhiệt độ thích hợp là 37°C

Khoảng pH thích hợp là từ 7,2 - 7,4 và có thể phát triển được ở pH 5 - 8 [5]

2.3.3 Môi trường nuôi cấy

Trên môi trường TBX: khuẩn lạc điển hình có màu xanh lơ Trên môi trường EMB: khuẩn lạc có màu tím đen và có ánh kim Trên môi trường Endo: khuẩn lạc có màu đỏ

Trên môi trường nước thịt: sau thời gian nuôi cấy 37°C trong 24 h, vi khuẩn E

coli phát triển rất nhanh, môi trường rất đục, có cặn màu tro trắng nhạt lắng xuống

đáy, đôi khi hình thành màng mỏng xám nhạt trên bề mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối (phản ứng Indol dương tính)

Trên môi trường thạch thường: vi khuẩn phát triển, sau 24 h tạo thành những khuẩn lạc tròn trơn nhẵn, đường kính 2 - 3 mm, màu xanh nhạt

Trên môi trường Macconkey: sau khi nuôi cấy 24 h ở 37°C, hình thành khuẩn lạc màu đỏ cánh sen (do lên men đường lactose sản sinh axit), xung quanh có vùng mờ sương (do lên men đường lactoza, sinh hơi)

Trên môi trường thạch Brilliant Green: sau 24 h nuôi cấy ở 37°C, khuẩn lạc có màu vàng chanh

Trên môi trường thạch máu: sau 24 h nuôi cấy ở 37°C, vi khuẩn E coli hình

thành khuẩn lạc to, ướt, lồi, viền không gọn màu sáng, kích thước từ 1 - 2 mm Khuẩn lạc có thể dung huyết hoặc không dung huyết tùy vào chủng

Trên môi trường thạch Deoxycholate citrat: vi khuẩn E coli không mọc do

không sử dụng được nguồn cacbon từ citrat [15]

2.3.5 Kháng nguyên và độc tố

Kháng nguyên: E coli có khoảng 150 yếu tố O, 100 yếu tố K, 50 yếu tố H và

được chia thành rất nhiều tuýp huyết thanh khác nhau

E coli được chia thành 5 nhóm chủ yếu:

ETEC (Enterotoxingenic E.coli): E coli sinh độc tố ruột EAEC (Enteroaggregative E coli): E coli kết tập ở ruột

EHEC (Enterohaemorrhagic E coli): E.coli gây xuất huyết ruột EIEC (Enteroinvarive E Coli): E coli xâm lấn niêm mạc ruột EPEC (enteropathogenic E Coli): E coli gây bệnh đường ruột [1,7]

2.3.6 Khả năng gây bệnh

E coli gây bệnh tiêu chảy theo phân ra ngoài và có thể gây thành dịch Truyền bệnh chủ yếu qua thức ăn hay nước uống bị nhiễm vi khuẩn hay truyền từ người này qua người khác [1]

Trên môi trường thạch TSI: phần thạch nghiêng có màu đỏ, phần đáy ống nghiệm có màu vàng, có hoặc không có H2S, vi khuẩn sinh hơi làm nứt thạch có khi đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm

Trên môi trường Endo: khuẩn lạc có màu vàng

Trên môi trường XLD: khuẩn lạc có màu hồng trong suốt, có hay không có

tâm đen Một số dòng Salmonella có thể có tâm đen bóng rất lớn có thể chiếm gần

Trên môi trường BPLS: khuẩn lạc có màu hồng nhạt, trong suốt, xung quanh khuẩn lạc môi trường chuyển màu đỏ

Trên môi trường SS: xuất hiện khóm trắng có tâm đen

Trên môi trường BGA: khuẩn lạc nhỏ có màu hồng nhạt, tròn, bóng, tâm hơi khô, đường kính khuẩn lạc từ 1 - 4 mm [8,10,20]

2.4.3 Đặc tính sinh hóa

Salmonella cho kết quả các phản ứng: ‐ TSI: đỏ/ vàng, có hay không có H2S ‐ Indol (-)

‐ VP (-) ‐ LDC (+) ‐ Urea (-)

‐ β-galactosidase (-)

Salmonella lên men đường glucose và mannitol sinh acid nhưng không lên men saccharose và lactose, không sinh indole, không phân giải ure, không có khả năng tách nhóm amine từ tryptophane, hầu hết các chủng đều sinh H2S

Salmonella có khả năng tạo ngưng kết với kháng huyết thanh đa giá O, H, Vi [10]

2.4.4 Khả năng gây bệnh

Salmonella chủ yếu gây bệnh thương hàn ở người Bệnh thương hàn có thể gây biến chứng chủ yếu là xuất huyết tiêu hóa và thủng ruột Một số biến chứng ít gặp hơn như viêm màng não, viêm tủy xương, viêm khớp, viêm thận [1,6]

- Bước 2: ( bắt cặp ) trong bước này nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực

nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 °C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây.

- Bước 3: ( kéo dài ) nhiệt độ được tăng lên 72 °C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại này có thể được tính như sau:

Tổng lượng DNA khuếch đại = m x 2n m: là số bản sao của chuỗi mã hóa n: là số chu kỳ

Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao [18]

Hình 1.3: Nguyên tắc hoạt động của PCR [30]

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

1 VẬT LIỆU

1.1 Mẫu kiểm nghiệm

Số lượng mẫu: 60 mẫu

Mẫu được ký hiệu H1 đến H20 là mẫu thịt heo tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Mẫu được ký hiệu B1 đến B20 là mẫu thịt bò tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Mẫu được ký hiệu G1 đến G20 là mẫu thịt gà tươi thu tại các chợ ở tỉnh Đồng Nai từ ngày 22/02/2016 đến ngày 29/04/2016

Loại mẫu: thịt heo tươi, thịt bò tươi, thịt gà tươi

1.2 Địa điểm và thời gian thực hiện

Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh – GMO trung tâm Quatest 3, số 7, đường số 1, khu công nghiệp Biên Hoà 1, Đồng Nai

Thời gian thực hiện: từ 22/02/2016 đến 29/04/2016

1.1.2 Thiết bị

‐ Tủ ấm, tủ lạnh, tủ cấy vô khuẩn ‐ Nồi hấp tiệt trùng

‐ Buồng UV ‐ Lò viba

‐ Cân

‐ Máy vortex ‐ Máy ly tâm ‐ Máy PCR ‐ Buồng điện di

1.4 Hoá chất và môi trường

1.4.1 Hoá chất và thuốc thử

‐ Cồn ‐ Nước cất

‐ Nước muối sinh lý ‐ ONPG

‐ Thuốc thử Kowacs ‐ KOH 40%

‐ Creatine ‐ α-naphtol

‐ Anti – O serum ‐ Anti – Vi serum ‐ Anti – H serum ‐ TAE

1.4.2 Môi trường (xem chi tiết phần phụ lục)

‐ Plate count agar

‐ Tryptone Bile X-Glucuronide (TBX) ‐ Xylose - Lysine deoxycholate agar (XLD) ‐ Hektoen enteric agar (HE)

‐ Muller-Kauffmann tetrathionate-novobiocin (MKTTn) ‐ Triple sugar iron agar (TSI)

‐ Urea broth

‐ Dung dịch đệm phosphate ‐ MR-VP medium (Clark-Lubs)

‐ Buffered peptone water (BPW)

‐ L-Lysine decarboxylase (LDC) medium

‐ Rappaport-Vassilliadis with soya (RVS broth) ‐ Tryptone/ Tryptophan medium

‐ Nutrient agar (NA)

2.1 Quy trình kiểm tra chung

⮚ Lưu trữ và bảo quản mẫu

Mẫu thịt tươi nếu chưa được phân tích thì lưu giữ ở 0°C đến 20°C, phân tích mẫu sau không quá 24 h

Đối với các mẫu sau khi phân tích cũng cần lưu giữ ở nhiệt độ như trên

2.2 Phương pháp phân tích vi sinh vật

Theo Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với ô nhiễm vi sinh vật trong thực phẩm (QCVN 8-3:2012/BYT) ngày 01 tháng 03 năm 2012 của Bộ trưởng Bộ Y tế, thịt tươi được kiểm tra theo tiêu chuẩn sau:

Bảng 2.1: Bảng phương pháp kiểm nghiệm vi sinh vật trong mẫu thịt tươi [11]

TSVSVHK ISO 4833 – 1: 2013

E coli TCVN 7924-2:2008 (ISO 16649-2:2001)

Salmonella spp

TCVN 4829:2005 Sửa đổi lần 1 : 2008 (ISO 6579 : 2002 AMENDMENT 1: 2007),

QTTN/KT3 069 : 2013 QTTN/KT3 069 : 2013

Bảng 2.2: Bảng các chỉ tiêu vi sinh vật được quy định kiểm nghiệm đối với thịt tươi [11]

Tên chỉ tiêu

Kế hoạch lấy mẫu

Giới hạn tối đa cho phép

(CFU/mL) Phân loại chỉ tiêu

TSVSVHK 5 2 5×105 5×106 B

n: số đơn vị mẫu được lấy từ lô hàng cần kiểm tra

c: số đơn vị mẫu tối đa có kết quả nằm giữa m và M, tổng số mẫu có kết quả nằm giữa m và M vượt quá c là không đạt

m: là mức giới hạn mà các kết quả không vượt quá mức này là đạt, nếu các kết quả vượt quá mức này thì có thể đạt hoặc không đạt

M: là mức giới hạn tối đa mà không mẫu nào được phép vượt quá Chỉ tiêu loại A: bắt buộc phải thử nghiệm để đánh giá hợp quy KPH: không phát hiện

2.2.1 Định lượng tổng số vi sinh vật hiếu khí bằng phương pháp đổ đĩa theo ISO 4833 – 1: 2013

2.2.1.1 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu và bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [3]

‐ Sử dụng ít nhất 2 dung dịch pha loãng thập phân liên tiếp để cấy vào đĩa petri sao cho thu được số khuẩn lạc từ 10 đến 300 trên mỗi đĩa

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL môi trường PCA ở (44 - 47)oC đã đun chảy vào mỗi đĩa petri Thời gian từ lúc chuẩn bị huyền phù ban đầu đến khi đổ môi trường không quá 45 phút

‐ Trộn mẫu bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đông tự nhiên

‐ Để tránh khuẩn lạc mọc lan đổ thêm một lớp 4 mL PCA lên bề mặt môi trường đã cấy mẫu

‐ Lật úp các đĩa và đặt vào tủ ấm ở ( 30 ± 1 )oC / (72 ± 3) h [3]

2.2.2.2 Kết quả

Chỉ đếm các đĩa có khuẩn lạc từ 15 – 300 khuẩn lạc

Các khuẩn lạc mọc lan rộng được coi là các khuẩn lạc đơn lẻ, nếu ít hơn một phần tư đĩa mọc dày lan rộng thì đếm số khuẩn lạc trên phần đĩa còn lại và tính số tương ứng cho cả đĩa Nếu quá một phần tư mọc dày lan rộng thì bỏ đĩa đó và

không đếm

Tính tổng số vi sinh vật có trong 1 g (hay 1 mL) mẫu (X) theo công thức:

= ∑

× × ( + 0,1 ), CFU/g (һоặс mL) ‐ Trong đó:

X: tổng số vi khuẩn hiếu khí, số khuẩn lạc/g (mL)

∑C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên tất cả các đĩa n1: số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ nhất

n2: số đĩa được đếm ở độ pha loãng thứ hai d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng thứ nhất V: thể tích cấy trên mỗi đĩa

Nếu tất cả các đĩa không có khuẩn lạc nào mọc, X< 1/d CFU/g (mL) [3]

Kiểm nghiệm tổng số vi sinh vật hiếu khí được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.2: Kiểm tra TSVSVHK đối với mẫu thịt tươi

2.2.2 Định lượng E coli bằng phương pháp đếm đĩa theo TCVN 7924-2:2008 2.2.2.3 Chuẩn bị dung dịch ban đầu và pha loãng

Cân x (g) mẫu, bổ sung 9x mL dung dịch đệm photphate, đem đồng nhất Chuẩn bị dãy dung dịch pha loãng thập phân đến nồng độ mong muốn từ mẫu ban đầu [15]

Thực hiện ở các độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Ủ đĩa ở ( 30 ± 1 )oC / (72 ± 3) h.

Đọc kết quả Mẫu ban đầu

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10-1

, 10-2, 10-3, Đồng nhất mẫu

1 mL 1 mL

‐ Rót khoảng từ (12 – 15) mL môi trường TBX đã đun chảy để vừa nguội đến khoảng 44 - 47oC vào mỗi đĩa petri Thời gian giữa quá trình cấy mẫu và đổ môi trường không quá 15 phút

‐ Trộn đều mẫu với môi trường bằng cách xoay đĩa và đặt đĩa lên mặt phẳng ngang để đông đặc hoàn toàn

‐ Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44oC / (18 -24) h [15]

2.2.2.5 Kết quả a Trường hợp 1

‐ Trong trường hợp có từ (15 -150) khuẩn lạc đặc trưng ΣC

X =  , CFU / mL ( hoặc g) V.( n1+0,1 n2).d

Trong đó:

X: tổng số E coli dương tính β- glucuronidase

ΣC: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa ở hai nồng độ liên tiếp n1: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ nhất

n2: số đĩa đếm ở độ pha loãng thứ hai

d: hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu tiên để đếm khuẩn lạc V: thể tích cấy (1 mL)

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng trên hai đĩa ở huyền phù ban đầu nhỏ hơn 15 CFU, kết quả được tính như sau:

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc màu xanh và không đặc trưng trên 2 đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) > 300 CFU và có khuẩn lạc xanh rõ rệt và nếu trên 2 đĩa ở nồng độ tiếp theo (d2) có số khuẩn lạc <300 CFU mà không có khuẩn lạc màu xanh được đếm thì kết quả được tính như sau:

dXd < <

‐ Trong trường hợp số khuẩn lạc đặc trưng và không đặc trưng trên 2 đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) >300 CFU và không có khuẩn lạc xanh rõ rệt và nếu trên 2 đĩa ở nồng độ tiếp theo (d2) có số khuẩn lạc < 300 CFU mà không có khuẩn lạc màu xanh được đếm thì kết quả được tính như sau:

dX <

‐ Nếu số khuẩn lạc đặc trưng đếm được ở tất cả các độ pha loãng đều lớn hơn 150 màu xanh thì kết quả được tính như sau:

X > 150/d Trong đó: d là độ pha loãng cuối cùng

‐ Trong trường hợp chỉ có 2 đĩa ở độ pha loãng thấp nhất ( nồng độ cao nhất) chứa nhỏ hơn 150 khuẩn lạc đặc trưng, tính kết quả theo công thức:

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) nằm trong khoảng từ 150 đến 167 ( khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) tính theo công thức:

= ∑

× ( + 0,1 ) × , CFU/mL (һоặс g)

+ Nếu số khuẩn lạc trên mỗi đĩa ở nồng độ pha loãng đầu tiên (d1) cao hơn 167 (khoảng trên giới hạn tin cậy của 150) thì lưu ý chỉ đếm khuẩn lạc ở độ pha loãng d2 và tính kết quả theo công thức: [15]

X= Σ

, số khuẩn lạc / mL ( hoặc g) Kiểm nghiệm E coli được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Sơ đồ 2.3: Kiểm nghiệm E coli đối với mẫu thịt tươi

2.2.3 Định tính Salmonella spp theo ISO 6579 : 2002 amendment 1: 2007

Salmonella có thể được phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình gồm 4 bước: tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định Salmonella thường có mặt trong mẫu với số lượng nhỏ, bị tổn thương, hiện diện chung với một số lượng lớn các loại vi khuẩn thuộc họ Enterobateriaceae có tính cạnh tranh mạnh

và ức chế sự tăng trưởng của Salmonella [8]

2.2.3.1 Chuẩn bị dịch nuôi cấy ban đầu cho bước tăng sinh

Rót khoảng 12 – 15 mL TBX lắc đều, để nguội tự nhiên

Đọc kết quả Mẫu ban đầu Đồng nhất mẫu

Pha loãng mẫu đến các nồng độ cần thiết 10-1

, 10-2, 10-3,

1 mL 1 mL

Thực hiện ở các nồng độ pha loãng tiếp theo (nếu cần) Lật ngược đĩa đã cấy mẫu và ủ đĩa petri ở 44°C /(18 - 24) h

Cân 25 g mẫu thịt đã đồng nhất cho vào bao nilon vô trùng và bổ sung 225 mL môi trường BPW cho vào tủ ấm ủ ở (37 ± 1)oC / (18 ± 2) h [12]

2.2.3.2 Tăng sinh chọn lọc

Dùng pipet vô trùng hút 0,1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường RVS broth, ủ ở (41,5 ± 1)oC / (24 ± 3) h đồng thời hút 1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MKTTn broth

Các khuẩn lạc Salmonella spp đặc trưng trên môi trường:

Trên XLD: Salmonella cho khuẩn lạc có hoặc không có tâm đen, có quầng

trong sáng hoặc hơi đỏ ( nếu lên men lactose (+) khuẩn lạc sẽ có màu vàng)

Trên HE: Khuẩn lạc có màu xanh dương đến xanh lá, có hoặc không có tâm [12]

2.2.3.4 Chọn khuẩn lạc để khẳng định

Chọn các khuẩn lạc điển hình từ mỗi môi trường phân lập, sử dụng que cấy tròn cấy ria trên đĩa môi trường NA, ủ các đĩa ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h sao cho thu được các khuẩn lạc rời

Dùng các khuẩn lạc này tiến hành thử khẳng định sinh hóa và huyết thanh

Các chủng Salmonella cho kết quả thử nghiệm sinh hóa: TSI ( đỏ/vàng, có

hoặc không có H2S ), urea (-), LDC (+), β-galactosidase (-), VP (-), Indole (-) [12]

2.2.3.5 Khẳng định sinh hóa a Trên TSI

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ NA lên môi trường TSI agar (cấy ria phần nghiêng và cấy đâm ở phần đáy)

Ủ các ống ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h

Trên TSI, 90% Salmonella cho:

Phản ứng kiềm ở phần nghiêng (màu đỏ): lactose và sucrose âm tính

Phản ứng acid ở phần đáy (màu vàng): glucose dương tính, sinh hơi (khoảng 90%), có hoặc không có H2S [12]

b Trên Urea agar

Cấy các khuẩn lạc nghi ngờ từ NA vào phần nghiêng ống urea agar Ủ ống ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h

Phản ứng (+): môi trường chuyển màu sang màu hồng tươi Phản ứng (-): không làm đổi màu môi trường [12]

c Trên L-Lysine decarboxylation medium (LDC)

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ từ NA vào môi trường L-Lysine decarboxylation medium

- Sử dụng đĩa giấy O.N.P.G

Cấy 1 vòng sinh khối vi khuẩn lấy từ khuẩn lạc nghi ngờ trên môi trường NA vào ống nghiệm chứa 0,5 mL nước cất

Cho đĩa giấy O.N.P.G vào ống nghiệm

Đọc kết quả sau khi ủ ở 37oC / 1h trong bể điều nhiệt Phản ứng (+): môi trường có màu vàng

Phản ứng (-): môi trường không đổi màu [12]

Phản ứng (-): môi trường không có màu đỏ hồng

Phản ứng (+): môi trường có màu đỏ hồng trong 15 phút [12]

f Phản ứng indol

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ vào ống nghiệm chứa 5 mL môi trường tryptone hoặc tryptophane

Ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h Nhỏ 1 mL thuốc thử Kovacs

Phản ứng (-): môi trường có vòng màu vàng trên bề mặt Phản ứng (+): môi trường có vòng màu đỏ trên bề mặt [12]

g Phản ứng kháng huyết thanh

⮚ Loại trừ chủng tự ngưng kết

Nhỏ 1 giọt nước muối sinh lý lên bề mặt của 1 phiến kính

Hòa vào đó 1 vòng sinh khối vi khuẩn tạo thành 1 địch đục và đồng nhất Lắc phiến kính trong (30-60) giây

⮚ Kiểm tra O-antigens:

Nhỏ 1 giọt anti-O serum lên bề mặt của 1 phiến kính Hòa vào đó 1 vòng sinh khối vi khuẩn không tự ngưng kết Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục ở phiến kính [12]

⮚ Kiểm tra Vi-antigens:

Nhỏ 1 giọt anti-Vi serum lên bề mặt của 1 phiến kính Hòa vào đó 1 vòng sinh khối vi khuẩn không tự ngưng kết Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục [12]

⮚ Kiểm tra H-antigens:

Cấy khuẩn lạc nghi ngờ, không tự ngưng kết lên môi trường semi-solid NA Ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h

Nhỏ 1 giọt anti-H serum lên bề mặt của 1 phiến kính Hòa vào đó 1 vòng sinh khối vi khuẩn

Lắc phiến kính trong (30 - 60) giây

Phản ứng dương tính khi xuất hiện sự vón cục [12]

2.2.3.6 Đọc kết quả

Mẫu được xem là nhiễm Salmonella khi có phản ứng sinh hóa và phản ứng

huyết thanh phù hợp với Phụ lục 2 [12]

Kiểm nghiệm Salmonella spp được tóm tắt theo sơ đồ sau:

Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:

Trên KIA/ TSI: đỏ/ vàng, có/ không có H2S, sinh hơi/ không sinh hơi

Urea: (-); LDC: (+); β –galactosidase: (-); VP: (-); Indol: (-) Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: O, H, Vi Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trên 25 g mẫu

Cấy phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 đĩa môi trường XLD và HE

Lật ngược các đĩa và ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.

Chuyển 1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MKTTn broth, ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h

Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA Ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.

Chuyển 0,1 mL canh trùng sau ủ sang ống nghiệm chứa 10 mL môi trường RVS, ủ ở 41,5 ± 1) oC / (24 ± 3) h

Mẫu ban đầu

Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 mL môi trường BPW, ủ ở (37 ± 1) oC / (18 ± 2) h