PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp phân tích vi sinh vật
2.2.4. Định tính Salmonella spp. theo phương pháp PCR
Cân 25 g mẫu đã được đồng nhất cho vào bao nilon vô trùng và bổ sung 225 mL môi trường BPW, ủ (37 ± 1) oC / (18 ± 2) h.
Thử nghiệm sinh hóa cho kết quả:
Trên KIA/ TSI: đỏ/ vàng, có/ không có H2S, sinh hơi/ không sinh hơi.
Urea: (-); LDC: (+); β –galactosidase: (-); VP: (-); Indol: (-).
Thử nghiệm ngưng kết kháng huyết thanh: O, H, Vi.
Kết luận: Salmonella dương tính/ âm tính trên 25 g mẫu.
Cấy phân lập khuẩn lạc đơn trên 2 đĩa môi trường XLD và HE.
Lật ngược các đĩa và ủ ở (37 ± 1)oC / (24 ± 3) h.
Chuyển 1 mL canh trùng cho vào ống nghiệm chứa 10 mL môi trường MKTTn broth, ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.
Chọn khuẩn lạc đặc trưng cấy sang NA.
Ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.
Chuyển 0,1 mL canh trùng sau ủ sang ống nghiệm chứa 10 mL môi trường RVS, ủ ở 41,5 ± 1) oC / (24 ± 3) h.
Mẫu ban đầu
Đồng nhất 25 g mẫu trong 225 mL môi trường BPW, ủ ở (37 ± 1) oC / (18 ± 2) h.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 40
Chuyển 0,1 mL từ môi trường tiền tăng sinh sau khi ủ vào 10 mL môi trường RVS ủ ở (41,5 ± 1) oC / (24 ± 3) h hoặc chuyển 1 mL từ môi trường tiền tăng sinh sau khi ủ vào 10 mL môi trường MKTTn ủ ở (37 ± 1) oC / (24 ± 3) h.
Thực hiện tương tự với mẫu đối chứng âm và mẫu đối chứng dương [16].
2.2.4.2. Chuẩn bị DNA khuôn
Chuyển 1 mL dung dịch sau khi tăng sinh vào eppendorf 1,5 mL tiệt trùng.
Ly tâm ở 11.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi để thu tủa.
Hòa tan hoàn tủa trong 1 mL dung dịch PBS hoặc nước vô trùng.
Ly tâm ở 11.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi để thu tủa.
Hòa tan hoàn tủa trong 1 mL dung dịch PBS hoặc nước vô trùng.
Ly tâm ở 11.000 vòng/ phút trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi để thu tủa.
Hòa tan hoàn toàn tủa trong 200 µL đệm TE bằng cách vortex trong 10 giây.
Đun các eppendorf đựng mẫu ở 100 oC trong 15 phút.
Làm lạnh nhanh các eppendorf đựng mẫu trong bể nước đá trong 15 phút.
Vortex trong 10 giây.
Ly tâm ở 11.000 vòng/ phút trong 10 phút ở 4 oC.
Thu ( 50 – 100) µL phần dung dịch trên sang một tube mới.
Tiến hành thực hiện phản ứng PCR hoặc bảo quản ở - 20 oC cho tới khi sử dụng [16].
2.2.4.3. Sàng lọc bằng phương pháp PCR
Chuẩn bị các tube chạy PCR (bao gồm cả đối chứng dương và đối chứng âm) với thể tích 25 µL.
Thành phần phản ứng PCR với nồng độ cuối được trình bày trong bảng sau:
SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 41
Bảng 2.3: Nồng độ các thành phần phản ứng PCR phát hiện Salmonella spp.
Thành phần Nồng độ cuối
PCR buffer ( không chứa MgCl2) MgCl2 25 mM
dNTP 10 mM Mồi xuôi 10 µM Mồi ngược 10 µM
Taq DNA polymerase 5 IU/ µL
1x 2,0 mM 0,4 mM 0,6 mM 0.6 mM 1 IU
DNA khuôn (50 – 100) ng
Trộn đều bằng micropipet và ly tâm trong 10 giây.
Chuyển tất cả các ống vào máy luân nhiệt.
Chương trình nhiệt trên máy PCR được trình bày trong bảng sau:
Bảng 2.4: Chương trình nhiệt trên máy PCR Hoạt hóa và biến tính ban đầu 95 oC / 5 phút
Khuếch đại số chu kỳ 94 oC / 20 chu kỳ
55 oC / 30 chu kỳ 72 oC / 30 – 35 chu kỳ
Kết thúc 72 oC / 7 phút
Sau khi PCR hoàn thành, phân tích sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose.
Nếu cần, sản phẩm khuếch đại có thể được bảo quản ở 4 oC cho tới khi phân tích [16].
2.2.4.4. Trình tự mồi
St11: 5’ –GCCAACCATTGCTAAATTGGCGCA- 3’
ST15: 5’ –GGTAGAAATTCCCAGCGGGTACTGG- 3’
2.2.4.5. Điện di trên gel agarose
Chuẩn bị gel agarose 2,0% (w/v) chứa 2 µL dung dịch ethidium bromide ( 10 mg/
mL)/ 40 mL dịch agarose trong 0,5 X TBE buffer.
Áp nguồn điện 100 V và chạy 50 phút hoặc cho tới khi thuốc nhuộm chỉ thị chạy được khoảng 2/3 chiều dài của gel.
SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 42
Lấy gel ra khỏi khay và quan sát các vạch DNA bằng đèn UV ( bước sóng ngắn).
Bảng gel có thể được ghi hình bằng máy ảnh hoặc thiết bị chụp ảnh điện di để tiện khi phân tích và cho mục đích lưu giữ hồ sơ [16].
Sơ đồ thực nghiệm:
SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 43
Sơ đồ 2.5: Kiểm nghiệm Salmonella spp. đối với mẫu thịt tươi theo phương pháp PCR
Điện di Đọc kết quả
Thêm 200 µL đệm TE, vortex 10 giây Đun eppendorf ở 100 °C, 15 phút
Thu 50-100 µL dịch sang tube mới Ly tâm 11000 vòng/ phút, trong 10 phút, 4 °C
Phản ứng PCR
Làm lạnh nhanh trong 15 phút, vortex 10 giây Hút 1 mL dịch sau tăng sinh vào eppendorf 1,5
mL vô trùng
Ly tâm 11000 vòng/ phút, trong 10 phút, bỏ dịch thu tủa
Hòa tan tủa trong 1 mL nước vô trùng
Ly tâm 11000 vòng/ phút, trong 10 phút, bỏ dịch thu tủa
Ly tâm 11000 vòng/ phút, trong 10 phút, bỏ dịch thu tủa
Hòa tan tủa trong 1 mL nước vô trùng
SVTH: TRƯƠNG THỊ HỒNG DUYÊN Trang 44