TRƯỜNG ĐẠI MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ: ĐỘT BIẾN TRÊN EXON 8 GEN LDLR BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR KẾT HỢP GIẢI TRÌNH TỰ ĐỐI VỚI
TỔNG QUAN NGHIÊN CỨU
BỆNH TĂNG CHOLESTEROL CÓ TÍNH CHẤT GIA ĐÌNH (FAMILIAL
Cholesterol là thành phần chủ yếu trong cấu trúc màng tế bào, là tiền chất để gan sản xuất acid mật và ruột sản xuất lypoprotein trong tế bào nhân thật (Marais et al., 2004)
Lipoprotein là một phức hợp của lipid và protein chuyên biệt, có chức năng vận chuyển chất béo (triglyceride, cholesteryl ester…) từ gan theo hệ bạch huyết tới các tế bào đích để cung cấp năng lượng cho các quá trình sinh hóa diễn ra trong tế bào người Thêm vào đó, lipoprotein có vai trò tham gia vào cơ chế đông máu, làm lành vết thương và một số cơ chế miễn dịch (Wansan et al., 1998) Lipoprotein được chia thành các dạng như sau:
- Lipoprotein mật độ cao (High density lipoprotein – HDL) gồm 3 phân lớp HDL –
HDL-2, HDL-3 khác nhau về kích thước và tỷ lệ protein và chất béo HDL mang cholesterol dư thừa trong máu đến gan thông qua cơ chế "vận chuyển cholesterol ngược" HDL cản trở quá trình vận chuyển cholesterol đến các mô bằng cách liên kết với thụ thể LDL gan (LDLR) trên bề mặt tế bào.
- Lipoprotein mật độ thấp (Low density lipoprotein – LDL) chiếm khoảng 60 - 70% tổng lượng cholesterol trong huyết tương, là chất mang cholesterol chủ yếu trong huyết tương và có khả năng thấm qua thành mạch Khi có sự liên kết giữa LDL – Cholesterol với thụ thể LDL trên bề mặt gan và các cơ quan khác sẽ chuyển cholesterol về lại tế bào gan Thiếu hụt thụ thể LDL dẫn đến giảm sự chuyển hóa cholesterol, gây tăng bất thường lượng choleterol trong máu Do đó, khi có sự bất hoạt hoặc suy giảm chức năng của thụ thể LDL dẫn đến bệnh lý FH với các triệu chứng như nồng độ cholesterol trong máu tăng cao khoảng 350 – 500mg/dL, xuất hiện gân xanthoma và bệnh tim mạch vành (Clark et al., 1986)
- Lipoprotein mật độ rất thấp (Very low density lipoproteins – VLDL) là loại lipoprotein chính được tiết ra từ gan và có chức năng chính trong việc vận chuyển triglyceride nội sinh từ gan đến các tế bào mô trong cơ thể (Wansan et al., 1998)
- Lipoprotein mật độ trung bình (Intermediate density lipoprotein – IDL) là loại lipoprotein được hình thành bởi cholesteryl ester và triglyceride trong cơ chế vận chuyển và thoái biến triglyceride Sau đó, IDL được biến đổi và chuyển vào gan thông qua cơ chế tương tác với thụ thể LDL, hoặc biến đổi thành LDL (Wansan et al., 1998)
Familial Hypercholesterolemia (FH) là bệnh lý rối loạn di truyền, xảy ra trên nhiễm sắc thể thường, thường do các dạng đột biến tập trung trên các gen mã hóa protein chuyển hóa lipid, cholesterol trong máu Biểu hiện đặc trưng của bệnh FH là nồng độ cholesterol trong máu tăng cao bất thường (350 – 500mg/dL) (Clark et al.,
1986) Nghiên cứu đoạt giải Nobel năm 1985 của Brown và Goldstein – nhóm tác giả đầu tiên chứng minh được nồng độ LDL tăng bất thường trong huyết tương có liên quan đến đột biến trên gen LDLR (Pears et al., 2015)
Bệnh FH được xác định chủ yếu dựa vào nồng độ LDL trong máu, cụ thể nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HoFH trong khoảng 650 – 1000 mg/dL, nồng độ LDL – Cholesterol (LDL – C) ở bệnh nhân HeFH trong khoảng 350 – 550 mg/dL (Goldberg et al., 2011) Nồng độ cholesterol ở bệnh nhân FH ở độ tuổi trưởng thành (trên 20 tuổi) ≥ 190mg/dL và ở độ tuổi trẻ em ≥ 160mg/dL (Goldberg et al., 2011)
Bệnh FH thể đồng hợp (HoFH) có tần suất 1/160.000 – 300.000, trong khi FH thể dị hợp (HeFH) ảnh hưởng đến 1/200 – 250 cá nhân Nghiên cứu cho thấy bệnh nhân HeFH không được điều trị có nguy cơ mắc bệnh động mạch vành sớm cao gấp 13 lần so với người không mắc FH Do đó, nguy cơ bệnh tim mạch vành tăng cao ở những cá nhân mắc cả HoFH và HeFH.
3 sớm (Coronary Heart Disease – CHD) ở các trường hợp mắc FH cao gấp là 20 lần so với những người không mắc FH (Goldberg et al., 2011)
Công bố khoa học của Ahmad và cộng sự (2016) cho thấy có khoảng 1,5 triệu người có thể mắc bệnh lý FH tại Hoa Kỳ Theo công bố khoa học của Bellgard và cộng sự (2017), ước tính có hơn 65.000 người mắc FH ở Úc, tuy nhiên số trường hợp được chẩn đoán không nhiều Ở Đức, tần suất mắc bệnh FH khoảng 1/500 (Klose et al., 2014) Tần suất số người mắc FH kiểu dị hợp ở Nhật Bản là 1/200 –
- Nghiên cứu của Di Taranto và cộng sự (2015) xác định FH được chia làm 2 loại dựa vào kiểu hình là dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng trội trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Dominant Hypercholesterolemia – ADH), và dạng bệnh lý tăng cholesterol máu tính trạng lặn trên nhiễm sắc thể thường (Autosomal Recessive Hypercholesterolemia – ARH)
- Công trình nghiên cứu của Pears và cộng sự (2015) xác định các nguyên chính dẫn đến bệnh FH ở dạng FH – ADH bao gồm:
(1) Đột biến xuất hiện trên gen thụ thể LDL (Low Density Lipoprotein Receptor –
LDLR) dẫn đến LDLR không tương tác với LDL – C, dẫn đến cholesterol không chuyển vào gan, làm tăng nồng độ cholesterol trong huyết tương
(2) Đột biến xuất hiện trên gen Proprotein Convertase Subtilisin / Kexin type 9 (PCSK9) dẫn đến sự sai hỏng protein PCSK9, gây nên sự thoái biến các thụ thể
LDL trên tế bào gan
(3) Đột biến điểm trên gen Apolipoprotein B – 100 (APOB – 100) dẫn đến thể
Apolipoprotein bị khiếm khuyết dẫn đến sự ngăn cản liên kết giữa LDL với LDLR trong tế bào gan Hệ quả là sự gia tăng nồng độ cholesterol trong máu (Myant et al., 1993; Pears et al., 2015) Các dạng đột biến này tạo nên bệnh lý FH thuộc thể khiếm khuyết Apolipoprotein B – 100 có tính chất gia đình (Familial Defective Apolipoprotein B – 100 – FDB)
Theo công bố khoa học của Alonso và cộng sự (2018), tỷ lệ đột biến xuất hiện trên các bệnh nhân FH lần lượt là > 80% trên gen LDLR, 5 – 10% trên gen APOB và
< 1% trên gen PCSK9 (Alonso et al., 2018) Bên cạnh đó, còn có tính chất đột biến xảy ra trên một số gen ở trạng thái allele lặn dẫn đến bệnh lý FH, gồm có: Low – density lipoprotein receptor adaptor protein 1 (LDLRAP1), APOE, SREBP2, STAP1 và LIPA (Alonso et al., 2018)
GEN LOW DENSITY LIPOPROTEIN RECEPTOR (LDLR)
Gen LDLR có chiều dài là 45 kb (kilobases), bao gồm 18 exon và 17 intron, nằm trên cánh tay ngắn của nhiễm sắc thể 19p13.1 – 13.3 (Benito-Vicente et al., 2018) Các dạng đột biến trên gen LDLR là nguyên nhân di truyền chính của FH, với hơn
2000 dạng biến thể xuất hiện trên 90% ở những trường hợp mắc bệnh FH (Benito-Vicente et al., 2018) Công bố khoa học của Hobbs và cộng sự (1992) và Truong và
6 cộng sự (2018) cho thấy các đột biến trên gen LDLR được chia làm 5 loại, dựa trên sự ảnh hưởng về chức năng của từng loại đột biến:
- Loại 1: đột biến dẫn đến không biểu hiện protein LDLR
- Loại 2: đột biến dẫn đến sự sai hỏng cấu trúc protein LDLR trong quá trình vận chuyển LDLR từ mạng lưới nội chất đến bề mặt tế bào
- Loại 3: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác đặc hiệu của thụ thể LDL với
- Loại 4: đột biến dẫn đến cản trở sự tương tác giữa protein LDLR và LDL
- Loại 5: đột biến dẫn đến rối loạn quá trình tái thiết lập LDLR trên bề mặt tế bào Báo cáo khoa học của Henderson và cộng sự (2016) ghi nhận số lượng đột biến trên exon 4 chiếm tỷ lệ cao nhất khoảng 339 biến thể, bên cạnh đó còn một số exon có số lượng đột biến đáng kể như exon 8 (106 biến thể), exon 3 (125 biến thể), các exon có số lượng biến thể khoảng 100 – 110 là exon 7, 9, 10, 14…
Hình I.1 Minh họa gen LDLR (Henderson et al., 2016)
PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ĐẶC ĐIỂM PHÂN TỬ VÀ MỘT SỐ BỆNH LÝ DI TRUYỀN
Theo công bố khoa học của Madieh và cộng sự (2013), một số phương pháp sinh học phân tử phù hợp xác định tính chất đột biến trên gen mục tiêu liên quan đến các bệnh lý di truyền, gồm có:
Phương pháp PCR kết hợp giải trình tự DNA cho phép khuếch đại đoạn DNA mục tiêu để xác định các biến thể (đột biến điểm) trong trình tự của đoạn DNA đó, hỗ trợ nghiên cứu về di truyền, chẩn đoán và điều trị bệnh.
− Phương pháp Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP) là phương pháp phát hiện các đột biến chưa công bố hoặc các dạng đột biến lệch khung: xóa hoặc chèn các đoạn trình tự nucleotide (Mahdieh et al., 2013)
− Phương pháp Denaturing Gradient Gel Eletrophoresis (DGGE) là phương pháp phát hiện nhanh các đột biến điểm, dựa trên nhiệt độ nóng chảy của từng trình tự gen mục tiêu và tốc độ di chuyển trên bản gel trong kỹ thuật điện di trên bản gel gradient biến tính (Mahdieh et al., 2013)
Ngoài ra, còn các phương pháp xác định đột biến khác như Allele Specific PCR (AS - PCR), Reverse transcription polymerase chain reaction (RT - PCR)…(Mahdieh et al., 2013)
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Các trang web và phần mềm sử dụng:
- NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) và Google Scholar
Google Học thuật là một cơ sở dữ liệu cung cấp khả năng truy cập vào các bài báo nghiên cứu khoa học cho phép tìm kiếm được trình tự nucleotide mục tiêu.
- BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) là công cụ trực tuyến phân tính tương đồng giữa các trình tự, theo phương pháp sắp gióng cột
- Annhyb: phần mềm được sử dụng để kiểm tra khả năng bắt cặp của các đoạn mồi tham khảo trên trình tự gen cần khảo sát, xác định khả năng bắt mồi, tính chất của mồi và kích thước sản phẩm khuếch đại
- MedCalc®: phần mềm thống kê cho phép thực hiện phân tích tổng hợp.
PHƯƠNG PHÁP
II.2.1 Khai thác dữ liệu (Data – mining) và trích xuất dữ liệu vào phân tích tổng hợp
Thu thập bộ dữ liệu khoa học:
- Khai thác dữ liệu từ các bài báo khoa học trên các dịch vụ Pubmed, PubMed central của cơ sở dữ liệu NCBI, ngoài ra còn sử dụng dịch vụ Google Scholar
- Sử dụng một số từ khóa thu thập dữ liệu về đặc điểm phân tử bệnh FH: LDLR, Cholesterol, Familial Hypercholesterol
Để tổng hợp phân tích về đột biến điểm ở gen LDLR, các thông tin như loại mẫu nghiên cứu, kích thước mẫu, số mẫu có đột biến, loại đột biến và phương pháp sinh học phân tử dùng để xác định đột biến điểm là rất cần thiết.
- Tình hình mắc bệnh tim mạch do bệnh lý tăng cholesterol máu có tính chất gia đình ở bệnh nhân Việt Nam
- Thông tin về các phương pháp sinh học phân tử nhằm xác định đột biến trên gen
- Tổng hợp thông tin và tỷ lệ đột biến của từng exon trên gen LDLR
II.2.2 Phân tích tổng hợp (Meta – analysis)
Phương pháp phân tích tổng hợp (Meta – analysis) được tiến hành dựa vào các thuật toán thống kê trên nguồn dữ liệu gồm hai hoặc nhiều công bố khoa học có cùng đối tượng nghiên cứu, được ứng dụng trong lĩnh vực khoa học trong y học, tâm lý học…(Ling., 2002)
Phương pháp phân tích tổng hợp được tiến hành nhằm xác định sự tương quan giữa tính chất đột biến trên gen LDLR và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình thông qua một số tham số định lượng như tần số đột biến trên gen LDLR trên tổng mẫu nghiên cứu và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình, chỉ số “Proportion”, viết tắt là PR% với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – CIs), phản ánh mức độ xuất hiện đột biến trên gen LDLR trên bộ mẫu bệnh phẩm có chỉ số cholesterol cao trong máu thông qua công cụ thống kê Medcalc
Các bước để thực hiện phân tích tổng hợp (Basu., 2017):
- Xây dựng tiêu chí trích xuất dữ liệu theo thang chuẩn “PICO – Participant – Intervention – Comparator – Outcomes”, Participant được hiểu theo nghĩa đối tượng nghiên cứu, Intervention là sự tác động đến đối tượng nghiên cứu, Comparator là so sánh các đối tượng dưới những tác động khác nhau và cuối cùng là Outcomes: giải quyết, đưa ra kết quả
- Thu thập nguồn thông tin qua các ngân hàng dữ lệu như NCBI, Google Scholar
- Đọc phần tiêu đề và tóm tắt và của các bài nghiên cứu để nắm rõ được trọng tâm của nghiên cứu
- Sau đó đọc thông tin toàn văn của công trình nghiên cứu để chọn lọc và trích xuất dữ liệu Trong khi đó, tiến hành kiểm tra chất lượng (độ tin cậy) của bài nghiên cứu dựa vào tổng quan nghiên cứu, mục tiêu nghiên cứu, hướng tiếp cận nghiên cứu, cỡ mẫu, loại mẫu… Đánh giá sự khác biệt giữa các bài nghiên cứu, thông qua việc xác định tính bất đồng nhất của bộ dữ liệu Dựa vào thuật toán Chi bình phương, xác định chỉ số bất
10 đồng nhất (Index of Heterogeneity: I 2 ) theo thang giá trị: 0 – 100% (Thorlund et al., 2012) và hệ thống Cochrane:
- Tính bất đồng nhất thấp: 0% < I 2 < 40%
- Tính bất đồng nhất vừa: 30% < I 2 < 60%
- Tính bất đồng nhất cao: 50% < I 2 < 90%.
- Tính bất đồng nhất rất cao: I 2 > 75%
Dựa vào giá trị của I 2 , từ đó xác định mô hình phân tích theo dạng mô hình ảnh hưởng ngẫu nhiên (Random effects meta – analysis, R) và mô hình ảnh hưởng cố định (Fixed effects meta-analysis, F), theo tiêu chí nhị phân (a dichotomous outcome) với khoảng tin cậy 95% (Confidence intervals – CIs) nhằm đánh giá tính tương quan giữa yếu tố nguy cơ (tính chất đột biến trên gen LDLR) và nguy cơ mắc bệnh tăng cholesterol có tính chất gia đình (Hunter và Schmidt., 2000) Thông thường, việc lựa chọn mô hình dựa vào tiêu chí của Cochrane (2014) thể hiện ở bảng II.1
Bảng II.1 Tiêu chí chọn mô hình thống kê (Cochrane., 2014)
Mô hình Chỉ số bất đồng nhất Chỉ số đồng nhất
Phân tích tổng hợp ảnh hưởng bất biến
(Fixed effects meta – analysis) theo phương pháp của Mantel-Haenszel
Phân tích tổng hợp ảnh hưởng ngẫu nhiên
(Random effects meta – analysis) theo phương pháp của DerSimonian
Xuất biểu đồ tương ứng với loại mô hình mẫu nghiên cứu phù hợp thông qua phần mềm MedCalc Các bước trích xuất dữ liệu từ các nghiên cứu khoa học được thực hiện như sau:
Hình II.1 Sơ đồ quy trình trích xuất dữ liệu trong phân tích tổng hợp II.2.3 Phương pháp khảo sát trên máy tính ( In silico )
Khảo sát trên máy tính (In silico) với mục đích xác định bộ mồi phù hợp với phương pháp PCR kết hợp giải trình tự nhằm xác định đột biến nổi trội trên các exon thuộc gen LDLR Các bước thực hiện gồm có:
- Thu thập dữ liệu về bộ gen LDLR (phiên bản cập nhật mới) từ cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI)
- Thu thập và thống kê trình tự bộ mồi dùng trong phản ứng PCR từ các bài báo khoa học được công bố trên thế giới
- Khảo sát thông số vật lý và độ đặc hiệu của bộ mồi bằng một số công cụ tin sinh học: OligoAnalyzer 3.1 (IDT) và phần mềm Annhyb 4.946, BLASTN (NCBI) dựa vào các chỉ số: chiều dài mồi, nhiệt độ nóng chảy, % GC, năng lượng hình thành các cấu trúc thứ cấp (cấu trúc kẹp tóc, Self – dimer, Hetero – dimer), vị trí khuếch đại sản phẩm trên trình tự mạch khuôn… Trong quá trình phân tích, chúng tôi tham
12 khảo tiêu chí thiết kế mồi cho phương pháp PCR trong tài liệu Giáo trình Ứng dụng tin học trong Công nghệ sinh học (Lê Huyền Ái Thúy; 2016):
- Chiều dài mồi: thông thường chiều dài mồi nằm trong khoảng 17 – 28 nucleotide, tối thiểu 15 nucleotide
- Sản phẩm PCR có chiều dài khuếch đại nằm trong khoảng 100 – 600 bp
- Tỷ lệ GC (%) nên nằm trong khoảng 40 – 60%
- Nhiệt độ nóng chảy của hai mồi khác biệt không quá 5ºC, giới hạn thường gặp từ 50ºC đến 65ºC
II.2.4 Phương pháp thực nghiệm
Thiết bị và hoá chất:
Xác định tương quan giữa tính chất đột biến điểm trên đoạn mã hóa (exon) của gen thụ thể LDL (LDLR) và khả năng mắc tăng cholesterol máu gia đình ở người Việt Nghiên cứu gồm một số nội dung thực nghiệm: phân tích đột biến gen LDLR của bệnh nhân tăng cholesterol máu gia đình và nhóm chứng, phân tích mối liên quan giữa đột biến gen LDLR và nồng độ cholesterol máu, và xây dựng mô hình dự đoán khả năng mắc tăng cholesterol máu dựa trên đột biến gen LDLR.
(1) Tách chiết DNA bộ gen của bộ mẫu bệnh phẩm (mẫu máu) bằng phương pháp Phenol/Chloroform (Chomczynski & Sacchi; 1987)
- Thu nhận 50 μl mẫu bệnh phẩm vào một eppendorf (1,5 ml)
- Bổ sung 500 àl dung dịch ly giải, gồm cú NaCl 0,45M, Tris HCl 10mM (pH=8,2), EDTA 1M (pH = 8), SDS 10%
- Bổ sung 5 μl proteinase K (20 mg/ml), trộn đều Ủ ở nhiệt độ 56 o C trong 1 giờ
- Bổ sung một thể tích dung dịch phenol: chloroform (tỉ lệ 1:1), trộn đều Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung một thể tích Chloroform tương đương với thể tích mẫu Ly tâm ở nhiệt độ phòng, 13.000 vòng/ phút trong 3 phút và thu dịch nổi
- Bổ sung 0,25 lần thể tích Amonium Acetate 5M và 2,5 lần thể tích Ethanol tuyệt đối (trữ lạnh) Ly tâm 13000 vòng/phút trong 20 phút ở 4 o C và thu tủa
- Bổ sung một thể tích Ethanol 70%, ly tâm 13.000 vòng/phút trong 5 phút ở 4 o C
- Thu cặn, xử lý để làm khô mẫu DNA bộ gen và bảo quản trong 20 – 50 μl dung dịch Tris-EDTA (pH=8), ở –20 o C
(2) Xác định chất lượng DNA bộ gen bằng phương pháp đo quang phổ: Hàm lượng DNA có thể xác định được nhờ sự hấp thụ mạnh ánh sáng ở bước sóng 260nm và độ tinh sạch của DNA được đánh giá qua tỷ lệ A 260 /A 280 DNA thu nhận đã tinh sạch khi giá trị này dao động từ 1,8 – 2
- Công thức xác định nồng độ DNA:
C: giá trị nồng độ DNA (μg/ml)
A 260 : độ hấp thụ của dung dịch DNA ở bước sóng 260 nm
A 280 : độ hấp thụ cực đại của protein ở bước sóng 280 nm d: độ pha loãng (thường từ 30 – 50 lần)
Chúng tôi tiến hành thực hiện phản ứng PCR khuếch đại vùng trình tự exon 8 gen
LDLR bằng cặp mồi LDLR_F2 và LDLR_R2 được tham khảo bởi nghiên cứu của
Cheng và cộng sự (2018) Thành phần phản ứng và chu trình luân nhiệt được thể hiện ở bảng II.2 và II.3
Bảng II.2 Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tớch (àl)
Bảng II.3 Chu trình luân nhiệt trong phản ứng PCR với cặp mồi
Bước Nhiệt độ ( o C) Thời gian Số chu kì
(4) Phương pháp điện di trên gel agarose
- Chuẩn bị khuôn gel đun gel tan
- Rót gel vào khuôn, chờ gel đông, rút lược
- Hòa trộn sản phẩm PCR với dung dịch nạp mẫu có bổ sung Gel Red
- Nạp mẫu vào giếng Chạy điện di ở hiệu điện thế 70 Vol với thời gian thích hợp khoảng 30 phút
- Đọc kết quả bằng máy đọc gel (Gel Doc XR) Dưới tác động của tia UV lên thành phần của dung dịch Gel Red, DNA (sản phẩm PCR) hiển thị thành băng sản phẩm Kích thước của DNA (sản phẩm PCR) được xác định nhờ vào thang phân tử (50 bp hoặc 100 bp)
Chúng tôi tiến hành gửi giải trình tự đối với các sản phẩm PCR cho kích thước dự kiến trong khoảng 300 – 400 bp Sau đó, chúng tôi thực hiện phân tích các kết quả giải trình tự với trình tự tham chiếu: NC_000019.10 (11.089.362 – 11.133.830), NM_000527.4 (“CDS – coding sequence: trên hệ thống LOVD) và sử dụng phần mềm Chromas Lite phiên bản 2.6.6 và CodonCode, Aligner phiên bản 8.0.2 nhằm xác định các dạng biến thể (tính đa hình/đột biến) xuất hiện trên vùng trình tự mục tiêu (exon 8) của gen LDLR của trên một số mẫu bệnh phẩm máu của người Việt Nam
